Didtico Material Didtico de apoio disciplina BVE 270 Prof. Fbio M. da Matta Prof.

. Marcelo Ehlers Loureiro Participao na editorao e processamento de imagens: Marcelo Francisco Pompelli, Leonardo Carnevalli Dias

1) INTRODUO Em mdia, a matria seca que uma planta acumula composta em 96% por carbono, oxignio e hidrognio. Entre os elementos minerais, o nitrognio o elemento presente em maior concentrao, o qual situa-se em torno de 1,5% da matria seca. O nitrognio faz parte de um grande nmero de diferentes substncias as quais perfazem muitas diferentes funes na planta, como podemos ver na figura abaixo: Durante o crescimento auxotrfico das plantas, o nitrognio inorgnico assimilado na sntese de molculas orgnicas, e se encontra presente nestas principalmente na forma NH3. Duas principais formas de assimilao do nitrognio podem existir: Fixao do nitrognio molecular (N2) do ar
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Assimilao do nitrato (NO3 ) ou amnia (NH4) contido na gua ou no solo Dentre essas duas formas, a predominante a assimilao do nitrato, a qual

responsvel por 99% do nitrognio na biosfera. A assimilao na forma de amnia relativamente insignificante, exceto em solos pouco drenados ou alagados, quando essa forma de nitrognio no pode ser prontamente convertida pelas bactrias nitrificadoras presentes no solo. A amnia, contudo, continuamente adicionada naturalmente aos solos como produto final da degradao da matria orgnica dos organismos em decomposio, sendo rapidamente convertida em nitrato na maioria dos solos.

Figura 1 - Estrutura de algumas substncias que contm nitrognio e que realizam diferentes funes nas plantas.

O ciclo do nitrognio apresenta as principais origens e transformaes do nitrognio, onde ocorre um processo cclico de sua transformao da forma inorgnica orgnica, e vice-versa, dentro das cadeias trficas da biosfera. Como se pode observar a fixao biolgica muito maior do que a soma da fixao atmosfrica com a fixao industrial. Tambm podemos observar que a fixao biolgica fornece menos do que 10% do total de N adquirido pelas plantas. Outros valores no apresentados na figura abaixo correspondem, por exemplo, a voltatizao da amnia.

Figura 2 - Esquema resumido do Ciclo do Nitrognio 2) ASSIMILAO DO NITRATO

A assimilao do nitrato corresponde a 99% do nitrognio adquirido pelas plantas, e catalizada pela ao das enzimas redutase do nitrato e redutase do nitrito.A enzima redutase do nitrato (NR) uma enzima citoslica que cataliza a reao de reduo do nitrato a nitrito, enquanto a enzima redutase do nitrito (NiR) uma enzima cloroplastdica que converte o nitrito a amnio. 3) REDUO DO NITRATO A NITRITO

Cada subunidade de uma nitrato redutase (NR) das plantas superiores composta de trs grupos prostticos: FAD (dinucleotdeo da flavina-adenina), grupo heme, e de uma pterina (molcula orgnica contendo o molibdnio complexado; fig 3). Devido a importncia desse elemento mineral para a atividade dessa enzima que plantas com deficincia de molibdnio apresentam acumulao de nitrato. O domnio FAD da NR responsvel pelo captura de dois eltrons do NAD(P)H. Os eltrons passam ento para o grupo heme, chegando ento a pterina (abreviada como MoCo), aonde os eltrons so cedidos a uma molcula de nitrato, formando ento uma molcula de nitrito.

Essa enzima tambm capaz de transportar eltrons do NADPH ao Fe3-, ou do metilviolognio ao nitrato, ou do NADPH ao clorato (ClO3-), transformando-o em clorito (ClO2-), o qual txico podendo levar a planta morte. O clorato tem sido utilizado para obter mutaes que anulam ou reduzem fortemente a atividade da NR, e tem sido utilizado no passado com um herbicida no seletivo para matar plantas daninhas nas estradas de ferro.

Figura 3 - Estrutura da enzima nitrato redutase e seqncia de transporte de eltrons entre os seus grupos prostticos. O nitrato assimilado nas folhas e tambm nas razes das plantas. Na maioria das plantas herbceas, as quais possuem um crescimento relativamente rpido, a assimilao do nitrato ocorre primariamente nas folhas, embora a assimilao nas razes pode freqentemente ter um papel importante nos estgios iniciais do desenvolvimento dessas mesmas plantas. Em contraste, muitas plantas lenhosas (arbustos e rvores), e tambm legumes, podem ter a assimilao do nitrognio ocorrendo em altos nveis nas razes. As razes das plantas contm um sistema de absoro de nitrato o qual dependente indiretamente de energia (dependente do gradiente de prtons criados pela ATPase da membrana), o qual pode ter alta afinidade pelo nitrato, podendo absorver nitrognio do solo
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mesmo que em concentraes to baixas quanto 10 uM. Para cada molcula de NO3 absorvida, dois prtons so co-transportados por um carregador simporte do nitrato. Dessa forma, a absoro do nitrato altamente dependente da gerao do ATP pelas mitocndrias das clulas das razes, podendo essa absoro ser drasticamente reduzida ou mesmo anulada quando a gerao do ATP reduzida, como quando da ocorrncia da hipoxia (baixos nveis
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de oxignio) nas razes. Tambm os ons NH4 inibem a absoro de nitrato.

Figura 4 - Possveis rotas na Assimilao do nitrognio em plantas. O nitrato absorvido pelas razes pode ser armazenado temporariamente neste rgo nos vacolos de suas clulas corticais e epidrmicas. A amnia utilizada pode ser utilizada nessas clulas para a sntese de amidas (como por exemplo, da asparagina e da glutamina). Esses dois aminocidos so ento transportados para a parte area da planta atravs do xilema (fig. 5). O transporte de amidas da raiz pode coexistir com o transporte de nitrato.

O nitrato transportado at as clulas do mesfilo reduzido a nitrito pela enzima redutase do nitrato presente no citosol e ento at amnia pela enzima redutase do nitrito no cloroplasto (fig. 5).

Figura 5 - Absoro do nitrato por uma clula e as possveis rotas de seu metabolismo ou compartimentalizao. 4) REDUO DO NITRITO A AMNIA

A reduo do nitrito a amnia requer mais energia do que a reduo do nitrato a nitrito. Na reduo do nitrito requerido o uso de seis eltrons, os quais so catalizados pela enzima redutase do nitrito (NiR), a qual localiza-se exclusivamente nos plastdeos. O doador de eltrons a ferredoxina. A redutase do nitrito contm um grupo 4Fe-4S, uma molcula de FAD e um grupo siroheme. Esses trs grupos formam uma cadeia de transporte de eltrons da ferredoxina ao nitrito. A capacidade de reduo do nitrito no cloroplasto muito maior do que a capacidade de reduo do nitrato no citosol, em parte devido a alta afinidade daquela enzima pelo nitrito. Este fato importante, visto que o nitrito pode ser txico a clula vegetal

Figura 6 - Esquema mostrando a reao catalisada pela NiR e a seqncia de transporte de eltrons entre os grupos prostticos da enzima. 5) ASSIMILAO DA AMNIA:

A assimilao da amnia envolve principalmente a atividade de duas enzimas que atuam seqencialmente, a sintetase da glutamina (GS) e a sintase do glutamato (GOGAT). A enzima GS est presente nos cloroplastos e transfere a recm sintetizada molcula de amnia em glutamina, s custas de ATP e glutamato. A sintetase da glutamina tambm possui alta afinidade pela amnia, de tal forma que no ocorre acmulo desse composto que tambm pode ser bastante txico clula vegetal.

Figura 7 - Detalhes das reaes catalizadas pela GS e GOGAT na assimilao da amnia Nas plantas C3 ocorre um alto nvel de fotorrespirao. A quantidade de amnia liberada durante a oxidao da glicina cerca de 5 a 10 vezes maior do que a quantidade de amnia gerada pela assimilao do nitrato. Dessa forma somente uma pequena proporo da sintese de glutamina nas folhas diretamente envolvida na assimilao do nitrato. Existe tambm uma isoforma de sintetase da glutamina no citosol das clulas das plantas.

Figura 8 - Compartimentalizao das reaes da assimilao do nitrato e da fotorrespirao em clulas mesoflicas. A amnia pode ser formada na descarboxilao da glicina na fotorrespirao (colorida em preta), ou atravs da assimilao do nitrato. O herbicida glicofosinato (Nome comercial Basta) um anlogo do glutamato, e enibe a enzima sintetase de glutamina (GS). Este herbicida, ao ser aplicado as plantas enibe a GS, levando a planta a morte devido a acumulao de amnia.

Figura 9 - Estrutura qumica do herbicida Basta (glicofusinolato), inibidor da GS. A glutamina formada no cloroplasto serve como substrato juntamente com uma molcula de -cetoglutarato, e convertida a duas molculas de glutamato atravs da enzima sintase do glutamato (tambm chamada de glutamina-oxoglutarato aminotransferase,

GOGAT), utilizando o poder redutor da ferredoxina. Algumas plantas podem conter uma outra enzima equivalente, a qual utiliza, o NADPH como redutor ao invs da ferredoxina. O -cetoglutarato, requerido para a reao catalisada pela sintase do glutamato, transportada aos cloroplastos por uma protena translocadora especfica, a qual um carregador antiporter, o qual utiliza como contraon o malato . Este transporte pode ocorrer em ambas direes, ou seja, do cloroplasto para o citosol ou vice-versa. Outra protena transportadora transporta glutamina para fora do cloroplasto, s custas do contratransporte de glutamato do citosol para essa organela. Outra reaes de assimilao de amnia a reao promovida pela enzima desidrogenase do glutamato (GDH). Essa enzima normalmente possui baixa atividade, contribuindo pouco para a sntese de glutamato em relao a enzima GOGAT (figura 10)

Figura 10 - Detalhes da reao catalisada pela enzima GDH. 6) ASSIMILAO DO NITRATO NAS RAZES.

A assimilao do nitrato pode ocorrer somente na folha, tanto na folha como na raiz, ou exclusivamente na raiz, dependendo do gentipo da planta. Enquanto o poder redutor nas folhas fornecido diretamente no local onde necessrio o maior consumo de poder redutor (reduo do nitrato a nitrito no cloroplasto), o poder redutor necessrio para promover as mesmas reaes na raiz provm da oxidao dos carboidratos transportados pelo floema (sacarose), atravs do Ciclo Oxidativo das Pentoses. Este ocorre dentro de plastdeos denominados de leucoplastos, necessitando ento do transporte de hexoses-P do citosol para dentro dessas organelas. Para ocorrer essa reduo do nitrato no leucoplasto de uma clula da raiz, necessria a atuao de uma protena carregadora antiporter, a qual contratransporta triose-P do leucoplasto para o citosol. Essa triose-P originada no prprio Ciclo das Pentoses. Esse ciclo produz ento o poder redutor necessrio para a produo de ferredoxina reduzida

(necessrio para a reduo do nitrito) e para sustentar a atividade da sintase do glutamato dependente de NADPH. A reduo do nitrato nas razes geram amidas como subprodutos (glutamina e asparagina), as quais ento so transportadas para as folhas via a corrente transpiratria do xilema.

Figura 11 - Esquema da reduo do nitrato nos leucoplastos das razes e a importncia do Ciclo das pentoses no suprimento de poder redutor 7) CUSTO ENERGTICO E REGULAO DA ASSIMILAO DO NITRATO

A assimilao do nitrognio pelas tem um alto custo energtico para as plantas. A regulao dessa rota metablica exerce-se principalmente no controle da atividade da NR e da GS.

Figura 12 = Custo energtico da assimilao do nitrognio. O gasto de poder redutor foi transformado em ATP deforma a permitir a comparao. Este gasto no est especificado para a sntese de outros aminocidos ou substncias sintetizadas a partir desses. A reduo do nitrato e a assimilao do CO2 pelo Ciclo de Calvin so reaes competidoras pelo poder redutor e por energia (NADPH e ATP), e precisam ser bem reguladas de forma que uma no prejudique a outra. A assimilao do nitrognio dessa forma deve ser favorecida somente a partir do momento quando a planta possui nveis adequados de carboidratos, visto que o esqueleto dos aminocidos composto basicamente de carbono originado de metablitos intermedirios da respirao. O nvel de assimilao de nitrognio precisa tambm ser regulado de forma que a produo de aminocidos no exceda a demanda. Tambm importante que a reduo do nitrato no exceda a reduo do nitrito, visto que o nitrito, quando acumulado, pode ser txico a clula. Acumulao do nitrito pode ocorre r sob hipoxia, quando a reao da NiR inibida. O NADH requerido para a reduo do nitrato no citosol pode tambm ser providenciado durante a noite, via a degradao glicoltica de carboidratos. Contudo, a reduo do nitrito e a assimilao da NH4+ nos cloroplastos depende fundamentalmente da fotossntese, a qual produz poder redutor e ATP necessrios s reaes. A capacidade do Ciclo das Pentoses nas folhas em suprir o poder redutor para essas duas reaes bastante limitado. Sendo assim, durante a noite, a reduo do nitrato precisa ser fortemente reduzida ou mesmo desligada, de forma a impedir a acumulao do nitrito em nveis txicos. Uma forma de obter essa regulao a soma do efeito de duas caractersticas, como a vida curta da protena NR (vida mdia de poucas horas , a qual degradada no final do dia, e da transcrio de seus genes de forma controlada pela luz. Assim, nveis significativos dessa enzima somente sero observados durante o dia. Uma maneira de regular a assimilao do nitrognio de forma a no prejudicar outros processos metablicos , tambm pode ocorrer via a regulao da transcrio dos genes da

NR. Altos nveis de nitrato ou de carboidratos podem estimular a transcrio, de forma que a enzima esteja presente em nveis adequados ao nvel de energia disponvel da planta, bem como na disponibilidade de seu substrato (fig. 13). De maneira oposta, a transcrio pode ser inibida, quando a clula acumula altos nveis de glutamina, por exemplo, de forma que a atividade dessa enzima no leve a acumulao de aminocidos acima da demanda da clula, o que poderia levar a reduo, por exemplo, da concentrao de outros metablitos necessrios a respirao ou outros rotas bioqumicas.

Figura 13 - Regulao da atividade da NR a nvel transcripcional e atravs de sua inibio pela protena 14-3-3. A regulao a nvel de transcrio um mecanismo que pode necessitar mais do que uma hora, e pode no ser rpida para evitar efeitos quando a sua atividade est acima da demanda da clula. Outros mecanismos mais rpidos so necessrios. A fosforilao da enzima um passo essencial na reduo da atividade dessa enzima. Ela necessria para que um inibidor, a protena 14-3-3 possa ligar-se a essa enzima, resultando ento em sua inativao. A cinase da NR estimulada por ons Ca2+ e inibida por triose-P e Glicose 6-P. Outra enzima, a fosfatase da NR, necessria para desfosforilar a NR, e ento reativ-la. Esse processo lembra tambm a SPS, a qual torna-se menos ativa quando fosforilada.

8) UM GRANDE ESPECTRO DE AMINOCIDOS O PRODUTO FINAL DA ASSIMILAO DO NITRATO A sntese de aminocidos ocorre principalmente no cloroplasto. O espectro de aminocidos sintetizados depende da espcie de planta e das condies metablicas. Na maioria dos casos, so o glutamato e a glitumina a maior poro dos aminocidos sintetizados. O glutamato exportado do cloroplasto em troca pelo malato, e a glutamina na troca pelo glutamato. Tambm serina e glicina, os quais so formados como produtos da fotorespirao, podem representar uma condirvel porcal do total de aminocidos presentes em uma clula mesoflica. J em plantas C4 a alanina e o aspartato podem representar frao significativa da composio de aminocidos de clulas das folhas. O carbono assimilado pela fotossntese a fonte dos carbonos que vo compor o esqueleto dos aminocidos. A figura abaixo ilustra as origens dos aminocidos a partir dos intermedirios da gliclise ou da fotossntese.

Figura 14 - Principais rotas de biossntese de aminocidos em folhas de plantas. O glutamato e a glutamina tambm participam em vrias reaes de transaminao na sntese de outros aminocidos (detalhe no mostrado na figura) Como pode ser observado na figura acima, o 3-PGA o precursor mais importante para a sntese de aminocidos. A enzima PEPC tambm tem importncia na sntese de aminocidos. A reao catalizada por essa enzima tambm mostrada na figura abaixo. Ela produz o oxalacetato a

partir do PEP, e o oxalacetato possui duas funes bsicas na assimilao do nitrato, ou ele convertido por transaminao a aspartato o qual precursor para a sntese de cinco outros aminocidos (asparagina, treonina, isoleucina, lisina e metionina), ou, junto com o piruvato, o precursor para a formao do -cetoglutarato, o qual convertido por transaminao a glutamato, sendo o precursor de outros aminocidos (glutamina, arginina e prolina). J o glicolato formado pela fotorespirao o precursor para a formao da glicina e serina. 9) A SNTESE DO GLUTAMATO REQUERE A PARTICIPAO DO METABOLISMO MITOCONDRIAL Como visto anteriormente, o glutamato formado a partir do -cetoglutarato, o qual pode ser fornecido pelo desvio deste intermedirio do Ciclo de Krebs. O piruvato e o oxalacetato podem ser transportados do citosol para a mitocndria por translocadores especficos (fig. 15). Parte das reaes do Ciclo de Krebs podem tambm existir no citossol das plantas devido a presena da desidrogenase do isocitrato dependente do NADP e da aconitase neste compartimento celular o qual pode ento sintetizar esse importante precursor da sntese dos aminocidos. Para que isso ocorra, o citrato tem que ser transportado para o citosol por um carregador antiporter o qual utiliza o oxalacetato como molcula contratransportada.

Figura 15 - Esquema mostrando os intermedirios da respirao e outras rotas metablicas associadas a sntese de aminocidos.

10) ALTOS NVEIS DE AMNIA OU NITRATO PODEM SER TXICOS As plantas podem armazenar significantes quantidades de nitrato em seus vacolos. Quando este armazenamento se realiza em altos nveis, quando por exemplo as plantas so cultivadas sob excesso de adubao nitrogenada, ele pode resultar em risco de morte para
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seres humanos. O nitrato (NO3 ) pode ser convertido a nitrito (NO2) no fgado. O nitrito ento pode-se ligar a hemoglobina de forma irreversvel, e torn-la incapaz de ligar o oxignio. A deficincia no transporte de oxignio derivado desse efeito pode levar a morte ou leses cerebrais, em uma doena denominada de methemoglobinemia. Outro aspecto txico do nitrato na sade humana sua converso em nitrosaminas, uma classe de compostos com alta capacidade mutagnica. Contudo, altos nveis de nitrato podem no ser txicos s plantas, principalmente devido a sua capacidade de transport-lo para o vacolo, evitando efeitos osmticos ou inicos negativos no metabolismo das clulas vegetais.

Figura 16 - Esquema representando o efeito txico da amnia na dissipao de gradiente de prtons entre as duas faces de uma membrana. Ao contrrio do nitrato, altos nveis de amnia podem ser txicos tanto para as plantas como para os animais. No caso do ltimo, um receptor olfativo presente, o qual ligado a reao de repulso ao cheiro da amnia. A toxidez da amnia deve-se ao seu poder de dissipar gradientes de prtons presentes entre as duas faces de uma mesma membrana. Na figura abaixo exemplifica-se a potencial atuao da amnia na reduo do gradiente protnico em diferentes compartimentos das clulas das plantas.

A dissipao do gradiente inico leva a reduo da gerao de ATP, da polaridade da membrana (e, portanto, leva a reduo da atividade de protenas transportadoras), resulta em alteraes de pH.