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Biotecnologa agrcola

Laboratorio No. 2 Reconocimiento y produccin de entomopatgenos Prof. Diana Crdenas Caro

RECONOCIMIENTO Y PRODUCCN DE ENTOMOPATOGENOS Yenny Lorena Patio Ramrez 1610312 Luisana Cristina Villamizar Flrez 1610250 Ana Mara Arizmendy Pabn 1610319 INTRODUCCIN Existen organismos capaces de producir enfermedades en los insectos. Esto ha sido aprovechado en el control de organismos plagas mediante microorganismos como bacterias, hongos y nematodos, adems de virus, a los cuales se les denomina entonces, entomopatgenos. La identificacin de organismos entomopatgenos permiten su reconocimiento en el laboratorio y en campo, atendiendo sus caractersticas macroscpicas, sin embargo es necesario conocer sus estructuras microscpicas para la mejor descripcin de cada una de las especies que han sido trabajadas en el control biolgico de organismos plaga, dentro de los grupos fngicos bacterianos. Luego de un proceso de reconocimiento de insectos enfermos o muertos en campo con la presencia de organismos entomopatgenos, se realiza el proceso de aislamiento y caracterizacin de estos microorganismos en cultivo puro con el objetivo de producirlos masivamente en el laboratorio para luego ser inoculados en mayor nmero al campo. A estos productos obtenidos, llamados inoculantes y algunas veces biopreparados, deben realizarse procedimientos de control de calidad para asegurar la efectividad e inocuidad del producto. La calidad se define como un conjunto de propiedades y caractersticas de un producto o servicio que lo hacen apto para satisfacer las necesidades para lo cual fue creado. Los tres tipos de control de calidad que se han establecido son el control de la produccin, donde se realiza seguimiento de la ejecucin de todas las operaciones, procedimientos, equipos y condiciones ambientales de produccin con el objetivo de mantener el rendimiento, El control de Proceso, que consiste en el seguimiento de la calidad del producto no terminado, como la deteccin de contaminantes y, el Control del producto, como seguimiento de la calidad del producto final. En la calidad del producto final se analizan la cantidad de esporas, conidios o unidades infectivas la viabilidad, la virulencia, en caso de bioinsecticidas y la pureza. OBJETIVOS Reconocer las caractersticas macroscpicas y microscpicas de algunos microorganismos entomopatgenos utilizados en el control biolgico. Producir bacterias y hongos entomopatgenos en biorreactores a escala de laboratorio. Realizar metodologas de laboratorio que permitan analizar algunos parmetros de calidad de inoculantes biolgicos.

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MATERIALES Y MTODOS Bata, cofia, tapabocas, guantes, Cepas de organismos entomopatgenos (Bacillus thuringiensis, Paecilomyces fumosoroseus, Beauveria bassiana), Cajas de Agar Nutritivo y PDA, Reactivos para la tincin de Gram y esporas, Azul de lactofenol, Frascos y viales con solucin salina estril, Frascos con agua destilada estril, Rastrillos estriles, Pinzas estriles, Micropipeta de 10-100 L y 100-1000L, Puntas azules y amarillas estriles, Microscopios, Cinta transparento, Portaobjetos y cubreobjetos Asa bacteriolgica recta y redonda, Media libra de Arroz, un frasco pequeo de melaza, una bomba de Acuario, un frasco de vidrio tapa plstica con capacidad de 3.75 litros, un frasco de vidrio de tapa plstica con capacidad para 1 ml, 10 frascos de compota, un rollo de tefln, una T de plstico para manguera de acuario, 1 y m de manguera para acuario, 1 venoclises, 1m de alambre dulce, un tubo Rally pequeo, un bajalenguas, 2 jeringas de 5 ml METODOLOGA Observaciones macroscpicas de los cultivos entomopatgenos: Utilizando dibujos, describa el crecimiento de las colonias de los hongos y las bacterias. Observacin microscpica de entomopatgenos: Realice tincin simple con Azul de lactofenol a los cultivos de hongos entomopatgenos, utilizando la tcnica de impronta con cinta transparente. Observe al microscopio de 40 x y describa en un dibujo las estructuras del hongo: hifas, 2

conidiforos, filides, conidios, forma de agrupacin entre otras caractersticas. Se toma de la cepa una muestra con un escobilln estril y se extiende sobre el portaobjeto, se fija con calor al portaobjetos y se procede a la tincin de gram, para esto, agregamos cristal violeta durante un minuto y lavamos. Posteriormente adicionamos lugol por un minuto y lavamos nuevamente. Agregamos alcohol acetona durante un minuto, lavamos y adicionamos safranina y despus de un minuto lavamos de nuevo. Finalmente se deja secar y realizamos la observacin en el microscopio. Produccin de Bacillus thuringiensis Montaje del biorreactor: En un recipiente de vidrio de boca ancha con capacidad para 3.75 litros, adecuar los accesorios para construir un biorreactor a escala de laboratorio, de la siguiente forma: Abrir tres orificios en la tapa, uno grande en el centro y dos pequeos. Un orificio para la salida de gases. Para ello se introduce una manguera de acuario. Un orificio para la circulacin de aire. Un orificio para la toma de muestras. Tomamos una manguera de acuario y se ajust a manera de crculo utilizando para ello un alambre. Posteriormente se le abrieron pequeos orificios para la entrada de aire proveniente de la bomba al interior del frasco con una aguja. Luego le instalamos el filtro de gasolina con el fin de aumentar el rea de contacto

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entre las burbujas de aire y el microorganismo (Entre mas pequeo sea el orificio mejor se lleva a cabo el proceso). Despus se adapto el venoclises con el objetivo de regular el paso de aire hacia el biorreactor. Las uniones se sellaron con tefln para evitar el escape de aire y por consiguiente la contaminacin. Posterior a esta instalacin se prob la bomba y la conexin del venoclises para regular la cantidad de aire que deba ser igual a 83.3 ml aire/seg. Enseguida se conecto todo el dispositivo a la bomba, se sello con tefln y se llevo al cuarto de siembra mientras se prepararon el inoculo y el medio de cultivo para la posterior produccin de la bacteria. Produccin de medio de cultivo para Bt: Se preparan 1000 mL de caldo de cultivo segn la composicin del cuadro. El inoculo debe corresponder al 2% del volumen total de trabajo que es de 1000 mL, por lo tanto el inoculo tiene un volumen de 20 mL pero se deben preparan 40 mL para tomar muestras de concentracin inicial de la suspensin bacteriana obtenida a partir, del arrastre con asa redonda, de las clulas de la cepa de Bt esporulada, en agua destilada estril. Componente Melaza K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O Casena hidrolizada Cantidad 2gr/L (2Brix) 0.2% 0.7% 0.2% 0.05%

Inoculacin del biorreactor: A partir de una caja con B.t bien esporulada se obtiene la suspensin celular en un frasco con 90 mL se solucin salina (0.85% NaCl) arrastrando todas las colonias con la ayuda del asa y se agita suavemente hasta suspender bien las clulas. El biorreactor se inocula al 2%, es decir con 20 mL de la suspensin celular obtenida. Para esto se utiliza una pipeta e 10 mL esteril. Se homogeniza bien el caldo con el inculo y se enciende la aireacin hasta el da siguiente, aprox. 24 horas. Control de calidad del inculo. Se realiza el recuento de la concentracin celular a la suspensin y al biorreactor inoculado, para esto se hacen diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-5 del biorreactor inoculado. Una vez obtenida las diluciones se realiza la siembra en agar nutritivo utilizando la tcnica de la microgota. En el lab. se utilizara la tcnica de dos replicas para una dilucin. Con una micropipeta de 10 a 100 l. tomar 50 l de la dilucin correspondiente. Recoleccin del producto: Al da siguiente se suspende la aireacin del biorreactor, se agita suavemente el caldo para homogenizar las clulas y se toma una muestra de 30 mL en un frasco vaco estril con una pipeta estril de 10 mL. La muestra se sella con envoplast y se rotula con el nombre del grupo. Se refrigera para realizar el recuento del inoculante obtenido y determinar su pureza.

Cuadro 1. Composicin del medio de cultivo para Bt.

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Produccin de hongos entomopatgenos. Preparacin del frasco: A un frasco de vidrio de 1 litro se le adicionan los componentes del cuadro 2. Se tapa con papel aluminio y se esterilizan en autoclave durante 15 min. Componente Arroz Agua Acido Lctico Cantidad 100 g 60 mL 5 gotas

Concentracin y pureza para hongos: A partir del inoculante obtenido, tomar 10 gr y llevar a un frasco de 90 ml de solucin salina (0.85% NaCl), agitar por 5 minutos y dejar formar la interfase. A partir de esta dilucin de 10-1 realice diluciones seriadas hasta 10-5 y realice recuento en cmara de Neubauer para determinar la concentracin final del inoculante en conidios/gr de producto. Tome la primera dilucin 10-1 y siembre en superficie (0.1 ml = 100 l) sobre agar PDA y luego extienda con la ayuda del rastrillo estril. Incube revisando todos los das hasta la formacin de colonias y observe sobre estas cajas el crecimiento de otros microorganismos y cuente laUFC/gr de producto. Viabilidad para hongos: Tome la primera dilucin (10-1) y siembre en superficie (0.1 mL=100 L) extendiendo con el rastrillo. Al cabo de 12 horas aplique azul de lactofenol para teir las colonias y corte un cuadro de ms o menos 1 cm2 y colquelo sobre un portaobjeto cubrindolo con su laminilla. En el microscopio en aumento de 40x haga el recuento de conidios germinados y no germinados en 10 campos de observacin. Al final sume todos los conidios (germinados y no germinados) y saque el porcentaje de conidios viables (germinados) . Virulencia para hongos: Enjuague los insectos en agua estril y en cada frasco de compota estril coloque uno de ellos. Aplique agua estril en algodn para mantener la humedad. A partir de la primera dilucin(10-1) tome 1 ml e inocule el insecto con esta suspensin. 4

Cuadro 2. Composicin del medio de cultivo para la produccin de hongos entomopatgenos.

Inoculacin del (biorreactor):

frasco

de

cultivo

Se obtiene a partir de una caja del hongo bien esporulada previamente cultivada. Con asa redonda estril se remueven los conidios del hongo y se transfieren a un frasco de 40 mL de agua estril y se resuspenden los conidios hasta obtener la suspensin celular o inculo con la cual se procede a la siembra de los frascos de cultivo. El frasco se inocula al 10% con la suspensin celular obtenida, es decir (10 mL) y se deja incubando durante 7 das. Control de calidad del inculo: Se realizan diluciones seriadas de la suspensin celular desde 10-1 hasta 10-5 y se realiza recuento en cmara de Neubauer para hallar la concentracin de conidios por mL. Control de producidos: calidad de inoculantes

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Observe diariamente y anote el comportamiento de los insectos, registre el da en que mueren. Concentracin y pureza para bacterias: A partir del inoculante obtenido, tome 1 mL y realice diluciones seriadas hasta 10 -8 . Tome las dos ltimas diluciones (10-7 y 10-8) y siembre segn la tcnica de la microgota por duplicado sobre el agar nutritivo. Incube revisando todos los das hasta la formacin de colonias y reporte su resultado como UFC/ml de producto. Para la evaluacin de la pureza observa sobre estas cajas el crecimiento de otros microorganismos y cuente las UFC/ml de producto. RESULTADOS Observacin macroscpica Bacillus thuringiensis Caractersticas: Color blanco, Textura algodonosa Metarhizium anisopliae

Caractersticas: Color blanco, Textura algodonosa Beauveria bassiana

Caractersticas: Color blanco, Bordes irregulares, textura cremosa Lecanicillium lecanii Caractersticas: Color Textura algodonosa verde claro,

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Paecilomyces fumosoroseus

Caractersticas: Micelio de color blanco y forma una red de hifas sobre la superficie del tejido foliar. Beauveria bassiana

Caractersticas: Color Textura algodonosa

rosado

claro,

Observacin microscpica Bacillus thuringiensis

Caractersticas: presenta micelio septado, formacin de hifas ramificadas. Metarhizium anisopliae

Caractersticas: Bacilo Gram (+) y esporulado, Presenta hifas hialinas, septadas, conidiforos hialinos y ramificados. Lecanicillium lecanii

Caractersticas: Micelio septado con produccin de hifas. La formacin de lo conidiforos se hace a partir de las hifas. Paecilomyces fumosoroseus

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Caractersticas: La estructura reproductiva es el conidiforo, tiene ramificaciones biverticiladas, las conidias se disponen en el conidiforo como cadenas y son de forma ovoide. Control de calidad del inculo (Tcnica de microgota): Biorreactor

1+1 :1 2 C=K*N*D C = 1 * 20 * 105 C = 2 * 106 UFC/ ml. Suspensin celular:

10-6 1 colonia 3 colonias 10-4 43 colonias 5 colonias 43 + 5 : 29 2 C=K*N*D C = 29 * 20 * 104 C = 5.8 * 106 UFC/ ml. 1+3 :2 2 C=K*N*D C = 2 * 20 * 106 C = 4 * 107 UFC/ ml.

10-7 0 colonias 3 colonias 3 : 1.5 2 C=K*N*D

10 1 colonia 1 colonia

-5

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C = 1.5 * 20 * 107 C = 3 * 108 UFC/ ml.

C=K*N*D C = 46 * 20 * 106 C = 9.2 * 108 UFC/ ml.

10-8 2 colonias 4 colonias 2+4 :3 2 C=K*N*D C = 3 * 20 * 108 C = 6 * 109 UFC/ ml. Recoleccin del Producto (Tcnica de microgota)

10-7 18 colonias 30 colonias 18 + 30 : 24 2 C=K*N*D C = 24 * 20 * 107 C = 4.8 * 109 UFC/ ml.

10-8 8 colonias 18 colonias 8 + 18 : 13 2 C=K*N*D C = 13 * 20 * 108 C = 2.6 * 1010 UFC/ ml.

10-6 38 colonias 54 colonias 38 + 41 : 46 2

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Produccin entomopatgenos

de

hongos

Control de calidad del inculo (Recuento en cmara de Neubauer) El recuento se realiz a partir de la dilucin 10-1 1 cuadrante: 3 2 cuadrante: 3 3 cuadrante: 4 4 cuadrante: 1 5 cuadrante: 1 C=K*N*D C = (5 * 104 )* (12)*( 101 ) C = 6 *107 conidios/ml. C=K*N*D C = (37) * (5 * 104) * C C = 1.85 * 109 conidios/gr

Pureza:

Control de calidad de inoculantes producidos:

Da 30-10-2008 31-10-2008 4-11-2008 5-11-2008 6-11-2008 7-11-2008 10-11-2008

Concentracin y pureza para hongos: Concentracin: Recuento en cmara de Neubauer (10-2 )

Crecimiento del hongo Siembra del hongo en agar Primeras seale del hongo Se observa crecimiento del hongo Crecimiento del hongo en toda le caja. Crecimiento del hongo en toda le caja. Crecimiento del hongo en toda le caja. Se observa crecimiento masivo del hongo sin peresentar contaminacin alguna.

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Cuadro 3: Crecimiento de lecanicillium lecanii en Agar PDA

Viabilidad para hongos: Ver Anexo 1: crecimiento del hongo sobre el insecto.

DISCUSION Y ANALISIS La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es un bacilo gram-positivo, flagelado y esporulado que se caracteriza por la formacin de un cuerpo paraesporal o cristal de protena, conocido como deltaendotoxina, estos cristales se forman durante la esporulacin y tienen actividad txica para larvas de insectos (Shieh, l988). Las cepas observadas microscpicamente posean un nivel de pureza y viabilidad que poda conferirle las caractersticas anteriormente mencionadas. Las conidias del hongo en contacto con el insecto entran en competencia con la microflora cuticular produciendo un tubo germinativo que tiene la capacidad de atravesar el tegumento del insecto, se ramifica dentro de su cuerpo y provoca la muerte del hospedante debido a las toxinas secretadas, momificndolo y apareciendo posteriormente una esporulacin blanquecina - sobre el

Observacin microscpca:

Viabilidad: 100%

Virulencia para hongos:

1 0

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cuerpo del mismo en condiciones de humedad relativa alta. Para Bth, la combinacin de factores nutricionales orgnicos e inorgnicos es esencial en la sntesis de la deltaendotoxina de alta toxicidad, as que el uso de materiales de bajo costo como componentes del medio de cultivo, es bsico en la optimizacin del proceso de produccin de Bth. En la preparacin del inoculante se utiliz Lecanicillium lecanii que es un hongo entomopatgeno, antagonista y nematofago , el cual es utilizado para el combate de plagas agrcolas. Los conidias del hongo en contacto con el insecto entran en competencia con la microflora cuticular produciendo un tubo germinativo que tiene la capacidad de atravesar el tegumento del insecto, se ramifica dentro de su cuerpo y provoca la muerte del hospedante debido a las toxinas secretadas, momificndolo y apareciendo posteriormente una esporulacin blanquecina - sobre el cuerpo del mismo en condiciones de humedad relativa alta. La viabilidad es un aspecto importante en la produccin de hongos entomopatgenos porque nos permite conocer la efectividad del mismo en el control de plagas de importancia agrcola. CONCLUSIONES

*Despus de realizada la prctica, podemos concluir que reconocer las caractersticas macroscpicas de algunos microoorganismos de entomopatgenos, es importante dentro del manejo del control biolgico de organismos plaga.

*Identificar estructuras microscpicas es importante para determinar qu tipo de organismo entomopatgeno se va a implementar en un control biolgico, y cules caractersticas lo hacen ser el ms adecuado.

*Producir de manera adecuada bacterias y hongos entomopatgenos a escala de laboratorio permite observar su crecimiento y comportamiento sobre insectos plaga.

*El arroz proporciona un medio nutritivo para la produccin conidial de Lecanicillium lecanii. Este hongo produce mayor cantidad de conidios cuando se cultiva en sustratos que le proporcionan

mejores condiciones para su crecimiento (Cortez, 2001)

*La ventaja del sistema de cultivo de hongos entomopatgenos a escala de laboratorio es que abarata los costos de

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produccin. Pero tiene una gran desventaja porque en estas condiciones es difcil de mantener su viabilidad por mucho tiempo.

http://www.ciat.cgiar.org/ipm/pdfs/tesis_i rina_alean.pdf IVIS FRAGAS, GEMA G. FLEITAS, HIDALGO, L. Formulacin de hongos entomopatgenos como control biolgico. Centro Nacional De Sanidad Agropecuaria. San Jos de las Lajas, La Habana, Cuba. Disponible en la World Wide Web: E:\Formulacin de hongos entomopatgenos como control biolgico Formulacin de hongos entomopatgenos como control biolgico - Agricultura - 27-2007 - Engormix_com.htm SNCHEZ YNEZ, Juan Manuel. Produccin de bioinsecticida a base de Bacillus thuringiensis. Laboratorio de Microbiologa Ambiental. Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, Morelia, Michoacn, Mxico. 1997. Disponible en la World Wide Web: http://www.monografias.com/trabajos15/ bioinsecticida/bioinsecticida.shtml ORIETTA FERNNDEZ -LARREA VEGA. Tecnologas de produccin de Bacillus thuringiensis. Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal Playa. Habana, Cuba. Disponible en la World Wide Web: http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/r ev64/fitosanitarios.pdf

El uso de hongos entomopatgenos se ha reconocido como una alternativa eficaz para controlar plagas agrcolas, adems de contar con cepas especficas para una plaga determinada; y el tener formulaciones adecuadas son factores que inciden en el xito de este tipo de control.

BIBLIOGRAFIA RIVERA BECERRIL Facundo, MIER Teresa, CAMACHO Alejandro D.y VALDS Mara. Manejo de la mosquita blanca en invernadero con Verticillium lecanii en plantas de frjol micorrizadas con Glomus intraradices Disponible en la World Wide Web: www.chapingo.mx/terra/contenido/20/2/a rt147-152.pdf ALEAN CARREO, IRINA. Evaluacin de la patogenicidad de diferentes hongos entomopatgenos para el control de la mosca blanca de la yuca Aleurotrachelus socialis Bondar (Homoptera: Aleyrodidae) bajo condiciones de invernadero. 2003 Disponible en la World Wide Web:

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