DETERMINACIN DE AMINAS BIOGENAS (HISTAMINA) Mtodo HPLC Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin PRT-711.

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1.

OBJETIVO

Determinar histamina y otras aminas bigenas por HPLC con detector UV. 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

El mtodo es aplicable a los alimentos sospechosos de contener histaminas y otras aminas bigenas, principalmente productos hidrobiolgicos frescos o procesados, harina de pescado, quesos y cecinas, recepcionados en la Seccin Qumica de Alimentos. 3. FUNDAMENTO

Extraccin de aminas bigenas en cido tricloroactico, derivatizacin precolumna mediante cloruro de dansilo y posterior anlisis de los respectivos derivados dansilados por HPLC con detector UV. 4. REFERENCIAS

Norma Chilena NCh 2637.Of 2001 Productos hidrobiolgicos Determinacin de histamina y otras aminas bigenas- Mtodo HPLC con detector UV. 5. 5.1 TERMINOLOGA Aminas bigenas: compuestos alergnicos generados por la degradacin de aminocidos que estn contenidos en pescados y otros alimentos como derivados lcteos, cecinas, hgado de vacuno y ave, cacao, vinos y cerveza, los que al ser consumidos pueden causar reacciones alrgicas o cuadros de intoxicacin. HPLC : Cromatografa lquida de alta resolucin

5.2

6.

MATERIALES INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 MATERIALES Y EQUIPOS Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado a continuacin est disponible e idealmente disponer de los materiales en el mesn de trabajo: 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 Equipo HPLC con detector UV de longitud de onda variable. Balanza analtica 0.0001 g. Balanza de precisin 0.01 g Agitador mecnico de tubos

DETERMINACIN DE AMINAS BIOGENAS (HISTAMINA) Mtodo HPLC Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin 6.1.5 6.1.6 6.1.7 6.1.8 6.1.9 Bao termorregulado a 60 C Centrfuga 2000 a 3000 rpm Tubos de centrfuga con tapa rosca de 50 mL Micropipetas de 100 1000 L Papel filtro Whatman N 1, 4 o equivalente PRT-711.04-070

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6.1.10 Filtros de membrana de 0.22 m 6.1.11 Viales con tapa de 2 a 3 mL 6.1.12 Columna C-18 fase reversa, 125-4 (5 m) o equivalente 6.1.13 Equipo de filtracin con filtro de membrana de 0.45 m 6.2 REACTIVOS

Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado a continuacin est disponible e idealmente disponer de los materiales en el mesn de trabajo: 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 Acetona p.a. Solucin de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84). Pesar 5.25 g de NaHCO3 y llevar a un matraz de 250 mL, aforando con agua desionizada filtrada. Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Pesar 50 mg de cloruro de dansilo y llevar a un matraz de 5 mL aforando con acetona p.a. Guardar refrigerado en envase mbar bien cerrado. Solucin de cido tricloroactico (TCA) al 5% con estndar interno de efedrina 250 ppm. Pesar 25 g de TCA en un matraz aforado de 500 mL, agregar 0.125 g de efedrina p.a. y aforar con agua para anlisis. Fase mvil: metanol HPLC y agua desionizada y filtrada (se usa gradiente). Estndares: Aminas bigenas: Putrecina Cadaverina Tiramina Histamina Espermidina.

6.2.5 6.2.6

6.2.6.1

Preparar una solucin patrn de 1000 mg/L de cada una de las aminas bigenas: Pesar 50 mg de cada una y aforar a 50 mL con solucin de TCA 5% con estndar interno.

DETERMINACIN DE AMINAS BIOGENAS (HISTAMINA) Mtodo HPLC Seccin Qumica de Alimentos y Nutricin 6.2.6.2 PRT-711.04-070

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Preparar a partir de las soluciones patrones, una mezcla que contenga al menos 3 niveles desde 50 a 500 ug/mL para la curva de calibracin. Aforar cada vez con TCA 5% con estndar interno.

7.

DESARROLLO

Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto materiales, insumos y reactivos est disponible. A continuacin se describe el mtodo analtico, es crucial si no se dispone de prctica con el mtodo leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar. Es necesario utilizar guantes para este trabajo analtico como medida de bioseguridad. Profesional Jefe de Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas es responsable de supervisar y/o preparar estndares y fortificados, supervisar tratamiento de la muestra, analizarla e informar los resultados. Tcnico Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas es responsable de efectuar las distintas etapas del procedimiento analtico. 7.1 7.1.1 7.1.2 RECEPCIN DE LA MUESTRA Chequear que antecedentes de la muestra en gua de ingreso coincidan con los rotulados en la muestra. Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el anlisis lo ms pronto posible. En caso de ser necesario postergar el anlisis, sta se debe mantener a 18 C si la muestra proviene de producto congelado; entre 0 C y 4 C si la muestra corresponde a un producto fresco refrigerado, no debiendo superar ms de 36 h en esta condicin y a temperatura ambiente si la muestra corresponde a pescado seco, harina de pescado u otro producto con baja humedad. Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo permite, almacenar aproximadamente 20 g de muestra como contramuestra y eliminar lo restante en bolsa de eliminacin de desechos de laboratorio (Bolsa roja y/o amarilla). Anotar fecha de eliminacin de la muestra en los antecedentes de la misma en Registro 711.00-074 Registro de ingreso de muestras al Laboratorio de Toxinas Marinas y Micotoxinas PREPARACIN DE MUESTRA Conservas: Si el lquido de cobertura es comestible, se recomienda homogeneizar todo el contenido del envase de lo contrario drenar el producto y homogeneizar en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.

7.1.3

7.2 7.2.1

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Congelados: Descongelar dejando a temperatura ambiente por un mximo de 4 h y drenar. Productos pesqueros salados: Preparar una solucin saturada de cloruro de sodio y sumergir en ella el producto en salazn algunos segundos para retirar la sal superficial. Sacar la muestra de la solucin y secar con papel absorbente, eliminar las espinas, trozar y preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s. Productos seco-salados, apanados, ahumados, quesos y derivados crnicos: Preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s. Pescado fresco: limpiar, descamar, eviscerar y preparar el homogeneizado durante 60 s como se indica a continuacin: a) Pescados de tamao pequeo ( 15 cm): en su totalidad. b) Pescados de tamao mediano: Sacar y descartar cabeza, cola, aletas y espinas; cortar en filetes para obtener toda la carne y piel. c) Pescados de tamao grande: De cada uno de ms de tres pescados cortar tres rebanadas en sentido transversal de 2.5 cm cada una, detrs de la aleta pectoral, en el medio y despus de la abertura anal. Eliminar las espinas.

7.2.4 7.2.5

7.2.6

Mariscos frescos refrigerados y/o vivos: lavar, drenar y desconchar.

7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.4 7.4.1

EXTRACCIN Y PURIFICACIN Homogeneizar la muestra en procesadora de alimentos de alta velocidad por un minuto. Pesar 5 g en un tubo de centrfuga de 50 mL y agregar exactamente 10 mL de TCA 5% con estndar interno y tapar. Agitar por 30 min en agitador mecnico. Centrifugar a 2000-3000 rpm por 15 min. Filtrar el sobrenadante a travs de un embudo con papel filtro. Filtrar el extracto a travs de filtro 0.22 m. REACCIN DE DANSILACIN En un vial de vidrio con tapa se adicionan consecutivamente: 100 L de extracto o soluciones estndares 400 L de bicarbonato de sodio 0.25 M (pH 8 a 9)

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200 L de solucin de cloruro de dansilo 300 L de acetona p.a. 7.4.2 7.4.3 7.4.4 7.4.5 Cerrar hermticamente el vial e incubar a 60 C en bao termorregulado por 1 hora. Enfriar a temperatura ambiente. Inyectar 20 L de la muestra en HPLC. Utilizar como blanco solucin de TCA 5% con estndar interno y dansilar de igual forma que los estndares y las muestras. CONDICIONES CROMATOGRFICAS Flujo de la fase mvil: 1 mL/min Programa de gradiente de fase mvil Tiempo (min) 0 20.0 20.1 22.0 22.1 30 7.5.1 7.5.2 7.5.3 7.5.4 7.5.5 Metanol (%) 70 75 100 100 70 70 30 25 0 0 30 30 Agua (%)

7.5

Estabilizar por 15 minutos. Todas las soluciones deben sonicarse si el equipo HPLC no cuenta con desgasificados on line. Limpiar la jeringa y el inyector con agua despus de cada inyeccin. Al final del trabajo lavar la columna con: 70% metanol y 30% agua por 15 a 30 min. Los tiempos de retencin aproximados son: Amina bigena Efedrina Putrecina Cadaverina Tiempo de retencin (min) 4a6 6a7 7a9

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Tiempo de retencin (min) 12 a 14 19 a 21 22 a 25

7.6 7.6.1

EXPRESIN DE RESULTADOS Calcular el nivel de histamina en ug/mL entregado por el HPLC utilizando estndar interno usando la siguiente frmula: Cm = {(Am/Asi)-b} / m Cm Am M B Asi = Concentracin de la amina bigena en el HPLC ug/mL = rea de la amina bigena de la muestra = Pendiente de la curva de calibracin = Intercepto de curva de calibracin = rea del estndar interno

7.6.2 7.6.3

La concentracin total de aminas bigenas se realiza sumando las concentraciones de cada amina bigena. Para determinar la concentracin de cada amina bigena en la muestra, usar la siguiente frmula: C = Cm x 10 g Donde: C = concentracin de amina biognica en mg/kg, de la muestra Cm = concentracin de amina biognica de la muestra en ug/mL obtenida de la curva de calibracin g = peso de la muestra en gramos

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7.3 -

CONTROL DE CALIDAD Realizar cartas control de los resultados de recuperacin y pendiente de histamina. Participar en ensayos interlaboratorios cuando estn disponibles.

8. 8.1 8.2

REGISTRO Registro preparacin de soluciones de estndares puros Registro de control de cromatogramas

9.

ANEXOS

No Aplica