TECNICAS GENERALES

EN MICROBIOLOGIA
vinificatum.blogspot.com
Jose Mara Xandri Taguea

Determinacin de
la Actividad Fermentativa
Determinacin de la
Actividad Fermentativa
Oeterminacin de la actividad fermentativa (velocidad y poder fennentati-
vo de la levadura ).- La determinacin de la rapidez de fermentacin de una levadu-
ra dada ( cantidad de azcar fermentada en un tiempo determinado) y del poder de -
fermentacin ( Cantidad total de azcar descompuesta al final de la fermentacin ) -
tiene importancia por sus aplicaciones industriales y se realiza poniendo en contacto -
una conocida y algo elevada cantidad de levadura con una solucin azucarada de de-
terminada concentracin colocandolos en condiciones en que la actividad vegetativa -
sea escasa, a ser posible nula, para tener en cuenta solamente el fenmeno de la fer-
mentacin. En aerobiosis la reproduccin es mxima y aqu lo que buscamos es lo
contrario.
Existen diversas razas de levaduras en el comercio, que poseen muy diverso
poder fermentativo. El ensayo de la rapidez y poder fermentativo nos d solamen-
te valores comparativos ( evidentemente no absolutos) entre los resultados obtenidos
con estas diversas levaduras. Estos ensayos se pueden hacer por los siguientes mto-
dos: 1.- Por gravimetra. Se toma una solucin al 10 %de azcar, se siembra con
levadura ( 1/4 a 1/5 del lquido a fermentar) se coloca en el aparato dibujado y se -
va pesando de tiempo en tiempo. El S04H2 colocado en la vlvula tiene por obje-
to retener el vapor de agua que se pudiese desprender. Una causa de error es el que
al final existe en el matraz una atmsfera de C02 para evitarlo, se puede colocar atra-
vesando el tapn, otro tubo, para inyectar por l aire muy lentamente antes de cada
pesada, con objeto de expulsar el C02 que pudiera haber en el matraz. 2.- Por el
dosado trimtrico del C02' El C02 procedente de un Erlenmeyer en donde se veri-
fica la fermentacin se recoje en una solucin decimonomal de sosa puesta al abrigo del
C02 del aire por un tubo en U que contiene piedra pomez, impregnada con solucin
Pgina 2 de 25
de sosa custica. Se termina haciendo pasar aire privado de ca2 por todo el apara-
to para recojer en la sosa todo el C02 formado, y dosificar la sosa custica que que-
da sin transformar en carbonato. Es absolutamente preciso que el aire (desprovisto
de C02 ) que desaloje el anhdrido carbnico que se recoje en la solucin de sosa -
custica barbotee en el lquido en fermentacin sin lo cual ste retendra mucho C02
disuelto.
3
Q
.- Por volumetra.- Se usa un calcmetro colocado en el matraz la solu-
cin azucarada previamente sembrada con la levadura en la proporcin de 10 grs. de
levadura por 200 cc. de solucin de azcar al 10 %. Son de rigor las precauciones -
usuales en todas las medidas exactas de volmenes gaseosos, precauciones que por ser
conocidas, no creemos preciso anotar.
Todos los anteriores mtodos, por mucha escrupulosidad con que se sigan -
no pueden dar resultados exactos (aunque si suficientes en muchos casos) porque -
aunque se tomen las precauciones de operar con lquidos azcarados bastante concen-
trados, sembrados, con abundante levadura, y no aireados hasta el final de la experien-
cia la multiplicacin celular no se anula, si bien procuramos aproximarnos a las condi-
ciones ideales de actividad fermentativa nicamente.
Mejores resultados se obtienen evidentemente, partiendo de preparados en-
zimticos obtenidos en idn,ticas condiciones, de diversas levaduras, pero ni an as -
es posible separar la actividad de la alcoholasa de las de otros enzimas contenidos -
en las cluls. Se sobreentiende que en estas ltimas determinaciones si se prolongan
Oet. tito del C02 que se desprende
durante la ferm. alcohlica.
4
2
1
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Dispositivos para medir el desarrollo y la actividad de las levaduras en el curso de la fermentacin
( segn Riberean-Gayn y Peynaud ).
1.- Dispositivo simple que permite seguir una
fermentacin mediante pesada.
2.- Aspecto de un rectngulo de la cmara gra-
duada de MALASSEZ, correspondiente a -
0,01 mm
2
. El cuadriculado del restngulo
facilita el conteo de las levaduras:
3;- Aparato de DENYS-COCH'N que permi-
te la siembra sucesiva de medios de culti-
vo al abrigo completo del oxgeno.
4.- Ensayo de fermentacin con frascos pro-
vistos de diversos dispositivos de obtura-
cin.
1 11 111
I Y 11.- Erlenmeyer con vlvula de sulfrico. Desmontado y esquema.
111.- Aparato para fermentacin de van Iterson-Kluyver.
Pgina 4 de 25
largo tiempo deber aadirse antisptico ( toluol, cloroformo, etc. ) que sin desviar -
sensiblemente la accin enzimtica evite e! desarrollo de microorganismos.
Para determinaciones cientficas que precisan extraordinario rigor se mide -
e! gas desprendido en muy poco tiempo ( de 3' en 3' por ejemplo) valindose de apa-
ratos tales como el empleado por Harden y Young que consiste ( ver figura) en un -
Aparato de HERZFELD, para la de-
terminacin de la actividad fermenta-
tiva de las levaduras. Det. Vol del C02'
bao maria que mantiene a temperatura constante A, en e! cual est e! matraz B de -
fermentacin, cuyos gases van a parar a un tubo graduado C ( igual al de! nitrmetro
de Schiff ) llenu .1 principio de mercurio. La presin que el mercurio ejerce en B -
se mantiene constante gracias a la bola D, tubo T y vaso E que desborda a la cpsula
F y vaso G, dispositivo que forma un sifn constante cargado. En este aparato y -
puesta en marcha la fermentacin, se saca B de A, de tiempo en tiempo, se agita bien
para hacer desprender en C02 retenido por el lquido y se deja un minuto en bao -
de maria para restablecer la temperatura. Despus se lee e! volumen recogido en C,
que facilmente se corrige para llevarlo a la presin atmosfrica.
Otro aparato de precisin usado por Slater e Ivannoff: Consiste en un fras-
co de fermentacin que comunica con un manmetro de mercurio: el lquido de fer-
mentJ,,,,m se coloca en e! frasco, en el que se aaden perlas de vidrio para facilitar la
agitaclOn. La presin se reduce mucho inicialmente por medio de una trompa y los
aumentos de presin son leidos a intervalos determinados, previa agitacin de! frasco
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de fermentacin. Los aumentos de presin son proporcionales a los volmenes de -
gas producidos.
Azcar

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17 19 23 28 Toge
1 = Botrytis; 2 = Penicillum
1nf1uencia del Botrytis Cinerea y Penicillum glaucum sobre el azcar, cido y forma-
cin del nitrgeno de los mostos de uva ( Segn Mller-Thurgau ).
Prdida de peso
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- Botrytis cinerea ..... Aspergillus niger
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- - - Control
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lf:::iIl Penicillum glaucum
El influjo de micelio superficial acuoso de diversos mohos sobre la fermentacin
W:iernpos) de levaduras. El extracto de Botrytis cinerea activa, la de PeniciJIum y Ri=.-
entorpece la levadura.
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Grfico de las fermentaciones (a 25 ) de mostos de diferentes concentracio-
nes en azcar, por la levadura F-4 forma velo en los vinos de Montilla. (del folleto:
"Cont
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al Es. de levadura que forma velo de Marcilla, Alas y Feduchy".
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Temperatura periferica a 50 cm de profundidad
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Tmo
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Diferencia en la temperatura y en la marcha de la fermentacin de un mismo
mosto contenido en dos tinos, uno de cemento armado, el otro de madera (segn ex-
periencias de Lopriore).
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Dias
5
Influencia de la temperatura s obre la velocidad de fermentacin y el -
poder fermentativo del extracto de levadura preparado segn el mtodo de Lebe-
dcff. Las cuatro lineas representan la marcha de la produccin del anhdrido car-
bnico en otras tantas mezclas de 20 C.c. de extracto + 8 gramos de azcar
+ 0'2 c.c. de tolueno mantenidos respectivamente a las temperaturas de 15
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Fermentacin a 36
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32 36 40 44 48 52
Produccin diaria de anhdrido carbnico en un mismo mosto hecho fer-
mentar a diversas temperaturas (segn las experiencias de MIler-Thurgau ).
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---Temperatura de fermentacin 27 o
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Dias
Marcha de la fermentacin de un mismo mosto de uva tinta con el 20'60/0
de azcar, a diversas temperaturas (segn experiencias de Fonseca).
Raza (1) con mosto normal
Raza (1) con mosto sulfitado
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Raza (2) con mosto sulfitado
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Dias
Accin del anhdrido sulfuroso ( 0,032 por 1.000 ) en el transcurso de la -
fermentacin de un mismo mosto con dos razas diversas de levadura elptica pura (1)
Y (2).
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Marcha comparativa de la formacin de alcohol ( linea A, datos expresados
en gramos ), de la glicerina ( G decigramos y del cido succnico ( S centigramos ) en
el transcurso de una fermentacin alcohlica ( segn Effront ).
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Minutos
Marcha de la descomposicin del azcar en el transcurso de la fermenta-
ci;,n alcohlica, segn se deriva de la cantidad de anhdrido carbnico producido (A)
J del azcar que todava contiene el lquido (B) en varios procesos del proceso ( se-
;';n Labedeff ).
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Influencia del cido actico sobre la marcha de la fermentacin por una raza de levadura
alemana ( Winningen). El ensayo de la fermentacin al aumentarse el contenido del cido ac-
tico:
1 = 0'2 por 1.000 de cido voltil en 1 litro.
2 = 1'05 " " "en 1 litro.
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Dias
Mosto (1) con 0.112 %0 de Nitrgeno
El mismo mosto con carbonato amnico
Mosto (I1) con 0.196 %0 de Nitrgeno
El mismo mosto con carbonato amnico
Mosto (lH) con 0.207 %0 de Nitrgeno
El mismo mosto con carbonato amnico
Marcha de la fermentacin con o sin la adiccin de ca3NH4 en tres mos-
tos de composicin qumica muy semejante pero con diverso contenido de N, obte-
niendo (1) de una uva moscatel simplemente prensado y los tros dos ( 11, nI ) de uva
pisada y desmenuzada ( segn los experimentos de Mensio ).
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Dias
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Marcha de la fermentacin de un mosto con diversas dosis de anhdrido sulfuroso. El trans-
curso de la fermentacin a diversas cantidades de S02:
1 =
O mg. de S02 en litro.
4= 200 mg. de S02 en litro.
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S = 300
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Marcha y resultado final de la fermentacin, segn diversas concentraciones de
azcar ( raza de levadura alemana Wadenswil ).
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1.70 m.
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Profundidad del mosto
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48 60
Horas
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Superficie del "Sombrero"
-- Aire del ambiente
Marcha de la temperatura del mosto a diversos niveles en un tino de 550 Hl.
Y de 3'60 m. de altura, aproximadamente, en el transcurso de una fermentacin con
sombrero constantemente flotante. En las primeras 48 horas despus de la pisa, la -
temperatura ms elevada se tiene en la superficie del sombrero, pero, a continuacin,
cuando comienza a manifestarse la actividad fermentativa de la levadura, la tempera-
tura se eleva notablemente en los estratos medio y superior del mosto, permanecien-
do siempre relativamente baja hacia el fondo del tino en donde la fermentacin es -
bastante escasa ( segn experiencias de Vivarelli ).
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Dios
Representacin grfica de la oxidacin del alcohol ( curva izquierda) formacin de -
cidos voltiles y transpiracin de los mismos ( curva derecha) por una Raza Mycoder-
ma. El cido voltil valorado como cido tartrico.
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Las temperaturas de fermentacin de un mosto de uvas de Argelia en un tonel de 110
hectlitros. 1).- Sin enfriamiento. 2).- Enfriado cada vez cuando la temperatura ex-
cede de 30 C. Han sido necesarios tres enfriamientos para mantener la fermentacin
por debajo de 30 C.
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Dias
Influencia del Sacch. apiculatus sobre la actividad fermentativa del Sacch. -
ellipsoideus. Produccin de C02 en la fermentacin causada por el solo fermento api-
culado (A), por el solo fermento eliptico de la raza de Steinberg (S) Y Karthaus (K) y
de estas dos mismas razas unidas con el apiculado (AS yAK) (segn Mller- Thurgau).
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Dias
Influencia de la adiccin de azcar escalonada sobre la produccin de alcohol.
La curva superior: El azcar, hasta la dosis total de 270 gr por litro es adiccionada en
tres partes consecutivas, de 30 gr. por 300 C.c. ( = 90 gr. por litro) cada una. La curva
superior: desde el comienzo est fijada para el 27 %de peso.
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Sin atreaclon
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Fermentacin efectuada con aireacin y sin aireacin.
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Grs.llitro de azcar
Produccin de alcohol y cido voltil por las levaduras al disminuir el con-
tenido de azcar en el mosto.
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Seleccin de "frigo-Ievaduras". De las cuatro razas investigadas la raza -
Waldenhurg se mostr como la ms adaptada para la fermentacin en frio.
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5
Dias
Transcurs o de la fermentacin: 1.- La levadura pura sola. 2.- La levadura
pura mezclada con levadura apiculada 1: 1. 3.- Levadura apiculada sola.
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Dias
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Marcha fermentativa de diversos fermentos alcohlicos: 1.- Cultivo de le-
vaduras de la raza Champagne Hautvillierts. 2.- Saccharomycodes Ludwigil. 3.- Zi-
gosaccharomyces polymorphus. 4.- Willia anomala. 5.- Kloeckeraspora uvarum.
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Marcha de la fermentacin de una malta diluida de grosella adiccionada de
azcar 1.- Sembrada con levadura pura. 2.- Sin siembra de levadura (fermentacin
expontanea) segn Mller-Thurgau ).
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Este ensayo en el cual el nmero de las clulas de la levadura es fijada cada

24 horas, muestra que la multiplicacin de las clulas de la levadura no cesa con el co-
mienzo de la fermentacin en un mosto, sillo que desde este instante el nmero total
aumema nueve veces. El nmero de las clulas de la levadura puede llegar despus de
la terminacin de la fermentacin alcohlica en 300 C.e. de mosto hasta 17.000 millo-
nes-35.000 millones, segn sea la raza de la levadura.
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La alcoholasa: Conocimientos actuales sobre su constitucin.- Desde Uuch-
ner, Harden y Young se sabe que en el jugo de levadura pueden separarse dos partes,
una en dispersin coloidal, no dializable por lo tanto y que no filtra a presin eleva-
da a travs de bujas porosas gelatinizadas, el enzima; y otra parte dializable y filtra-
ble por los ultrafi1tros, de composicin probablemente muy sencilla, el ca-enzima.
El enzima es termolbil ( es destruido por el calor, o la ebullicin ), el co-
-enzima es termoestable. Ninguna de estas partes son capaces de provocar la fermen-
tacin por si solas, recordando en esto lo que ocurre en la hemolisis y bacteriolisis de
los sueros sensibilizados. En estos ltimos fenmenos es precisa la triada de sustan-
cias anticuerpos ( termolabil ) el complemento ( termoestable ) y el antgeno: en la -
fermentacin alcohlica son precisas el enzima ( termolabil ), el co-enzima ( termoes-
table ) y la materia fermentable azcar en presencia de fosfatos.
Podra creerse, a priori, que el cofermento activo est formado por fosfa-
tos; pero ni estos ni los exosafosfatos, glicerofosfatos y otros compuestos fosfatados
de composicin conocida han dado el menor resultado positivo en presencia de enzi-
ma y materia fermentable: esto no quiere decir que pueda afirmarse que el ca-enzima
activo no sea una combinacin en que entre el fsforo y hasta Buchner, Klatte y
Hahn aventuran la hiptesis de que se trata de un ter orgnico del cido fosfrico, -
vista su destruccin ( o saponificacin) por contacto prolongado con C03K2 al 2'5%
y por enzimas lipoliticos, a ms de alguna otra reaccin de las poqusimas que se co-
nocen .y pueden dar alguna luz sobre la verdadera constitucin del ca-enzima de la -
dl<:oholasa.
Realmente es dificilsimo el estudio anterior mientras no se logre aislar el -
co-fermento de la complejsima composicin de los preparados enzimticos y hoy, si
bien se ha logrado ( por precipitacin fraccionada con acetona o por precipitacin -
con el alcohol, filtracin, tratamiento del filtrado por acetato de plomo, que precipi-
ta fosfatos y exosafosfatos, filtrado y tratamiento del lquido que pase, por SH2 ) -
eliminar los fosfatos y exosafosfatos y purificar as en parte el ca-enzima, se est an
muy lejos del aislamiento de este principio activo de la fermentacin. [ 1 ]
[ 1] Se considera al enzima como principio activante.
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Se sabe que el hidrato de hierro coloidal d, en el jugo de levadura, un pre-
cipitado que contiene la mayor parte del co-enzima; se sabe adems que el co-enzima
resiste sin alteracin la ebullucin, pero es destruido despus de cuatro horas a 130,
y por hidrolisis cida y alcalina, y, naturalmente por calcinacin del residuo seco.
y aparte estas ligeras indicaciones apuntadas, nada se sabe de la naturale-
za qumica de la alcoholasa, ni an de su cofermento.
Hiptesis sobre la multiplicidad de enzimas constituyentes de la alcoholasa.-
En el jugo de levadura obtenido por el mtodo de Buchner y en otros preparados en-
zimticos existen evidentemente mltiples enzimas; quizas oxidasas, seguramente una
proteasa endocriptasa, probablemente una antiproteasa, reductasa y quizs una hidro-
genas a que transforma el azufre en SH2' ( philothion ), adems de la alcoholasa o -
zymasa que produce la fermentacin alcohlica.
Pero aparte de esta multiplicidad de enzimas en el jugo de levaduras es su-
mamente probable que la misma alcoholasa no sea un solo enzima, sino un conjunto
de ellos. Los esquemas de Kostitschew, Harden y Young, Lebeedeff, etc., as lo su-
ponen, por ejemplo, en la hiptesis del ltimo autor citado la alcoholasa estara for-
mada por una carboxilasa, una sintetasa y una exosafosfatasa. Es ms, la hiptesis -
de la existencia d una carboxilasa tiene a su favor alguna base experimental: as, el
jugo de levadura conservad'o 36-48 horas o dializado o calentado 10' -15' a 50, o -
tratado cori antispticos ataca al cido pirvico, pero no a la glucosa y an al jugo -
normal descompone a aqul ms rapidamente que a ste.
Accin de los estmulos fsicos y qumicos sobre la alcoholasa.- Respecto
a la influencia del calor se ha establecido que la fermentacin es tanto ms rpida -
cuanto mayor es la temperatura entre ciertos lmites, pero la cantidad total de azcar
descompuesta es menor como se puede ver los grficos ms abajo indicado. A 5 -
empieza a manifestarse la actividad de la alcoholasa y se suspende a 55. En estado
seco, y anlogamente a lo que ocurre para otros enzimas, la alcoholasa resiste mayor
temperatura: desecado en el vaco a 40 resiste 6 horas 97 y no es totalmente des-
truida por una temperatura de 140, siempre que sta se sostenga solo pocos instan-
tes.
El ptimo respecto a la cantidad total de azcar descompuesto est a 15 -
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y respecto a la rapidez inicial de fermentacin est hacia 30 - 35 Y 40 empieza a -
manifestarse alguna coagulacin de albuninoides en el jugo de levadura.
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Influencia de la temperatura sobre la rapidez y sobre el poder de fermenta-
cin del jugo de levadura, preparado segn el mtodo de Lebedeff actuando 20 C.c. -
de jugo sobre 8 gramos de azcar a 0'2 c.c. de toluol.
Respecto a estmulos qumicos la influencia de concentracin del azcar es
muy sensible. El poder de fermentacin parece ser mximo en presencia de 30-40%
de azcar; la rapidez de fermentacin es mayor para concentraciones de 1-15% . El
alcohol a 20% suspende la accin de la alcoholasa,. pero ya a menores concentracio-
nes le hace ms lenta y difcil. Respecto a la accin de otras sustancias no limitare-
mos a dar las siguientes indicaciones, entre la muchas deducidas de la experiencia, ad-
virtiendo como regla general, que las sustancias antispticas ejercen su accin sobre la
alcoholasa y su actividad a concentraciones bastantes superiores a aquellas que bastan
para detener el funcionalismo de los microorganismos vivos.
SUBSTANCIAS
Acido dicloractico al 0'12 %
Acido actico .
ACCION SOBRE LA FERMENTACION CON
TUGO DE LEVADURA
Paralizacin.
Retraso y paralizacin total a dosis de 30 %'
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Acidos trtrico y ctrico ..
Acido lctico ..
Arseniatos y arsenitos ..
Fluoruro amnico 0'75 % ......
Ozono, 10'4 a 35'8 mgrs + 20cc.
Tolueno ..
Cloroformo al o' 5 % ..
Idem al 0'8 %(saturado)
1dem al 17 %(enorme exceso)
Acido fnico al 0'1 % ..
Acido fnico al 0'5 % ..
dem idem al 1'2 % .
Solo a dosis enormes (750-576 % ) paralizacin.
Solo a dosis enormes (180 % ) paralizacin.
A debiles dosis (0'0225) en concentracin molecu-
lar, gran aceleracin, a dosis poco mayores inhibi-
cin completa de la fermentacin.
Completamente destruida.
Disminucin muy marcada.
Solo a saturacin hay disminucin del 10 %.
Ligero aumento.
Ningn cambio.
Disminucin de un 64 %.
Ningn cambio.
Disminucin del 40 %.
Completamente destruido.
Finalmente debemos hacer observar que las fermentaciones con jugo de le-
vadura son forzosamente limitadas en tiempo y cantidad de azcar descompuesto: ~
alcoholasa es destruida muy pronto quizs por accin de una protesasa cuya accin -
sobre le I enzima no est cOJ;ltrarrestada por la produccin de nueva alcoholasa o por -
una antiproteasa que destruya, a la proteasa, como suponen otros. Para darnos una
idea de la limitacin de estas fermentaciones, cuyo inters es, por otra parte, tan gran-
de, diremos que si se toman 25 c.c. de jugo de levadura que corresponden al menos a
36 grs. de levadura prensada, con el 70 % de agua se v que este jugo d como maxi-
mun una fermentacin con produccin de 3 cc. de C02 en 5': la levadura viva hubie-
ra podido producir en ese tiempo 126 cc. o sea que esta segunda fermentacin es 40
veces ms rpida. La cantidad total de C02 producida por el jugo de levadura en la
experiencia citada no pasa del que pueden producir 2-3 grs. de glucosa, mientras que
la levadura viva hubiera podido fermentar una cantidad verdaderamente enorme de -
glucosa ( Harden ).
Esto explica el caracter exclusivamente cientfico que hasta hoy tienen es-
tas fermentaciones sin clulas vivas.
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