Vous êtes sur la page 1sur 12

Les diffrentes stratgies de quantification :

Ce chapitre prsente les 2 principales stratgies de quantification relative utilise classiquement : la mthode des droites standards et celle des Ct. Les modles mathmatiques la base des mthodes sont dtaills. Une comparaison des 2 mthodes sur un exemple simple et leurs avantages et inconvnients respectifs sont prsents. Plus prcisment, nous illustrons des exemples de biais introduits par la mthode des Ct si celle-ci est mal utilise. Consultez la page WEB : http://www.gene-quantification.info/ voir Relative quantification

1/ Introduction
Vous pouvez vous rfrer au Technical Note LC10/2000 de Roche. La PCR quantitative en temps rel sappuie sur des mesures faites pendant la phase dite exponentielle de la PCR. Les principes de la quantification par PCR en temps rel sappuient sur deux concepts de base diffrents : - la quantification absolue : en sappuyant sur des dilutions standards de concentration connue, la concentration absolue du gne cible est dtermine : ce type de quantification est utilis pour dterminer le nombre absolu de particules infectieuses (virus, bactries) dans des chantillons biologiques. On y distingue une quantification absolue faite avec et sans standards externes. - la quantification relative ou comparative : la concentration du gne cible est exprime par rapport un gne rfrence (obtenu partir du mme chantillon biologique) : pas besoin de standards de concentration connue. Cette mthode est recommande pour les expressions de gnes et pour le dosage de gne. On y distingue une quantification relative sappuyant sur des courbes standards de calibration (mthode des droites standards) et lautre sappuyant sur les efficacits respectives des gnes rfrence et cible et les Cp obtenus pour les chantillons et le calibrateur, sans courbe de calibration (mthode des Ct).

2/ La quantification absolue :
La concentration de la cible est exprime en valeur absolue dtermine partir du standard. Consultez la page WEB : http://www.gene-quantification.info/ voir Absolute quantification A laide dun standard externe mais sans contrle interne : Vous pouvez vous rfrer au Technical Note n LC11/2000 de Roche. Le standard externe permet de crer une courbe standard partir duquel est calcule la concentration en molcules cibles des chantillons. Lefficacit PCR doit tre la mme sur le standard ou sur les chantillons. A laide dun standard externe mais avec contrle interne : Vous pouvez vous rfrer au Technical note n LC12/2000 de Roche.

Le principe est identique la mthode ci-dessus avec en plus un ARN synthtique, ajout aprs lextraction de lchantillon pour contrler dventuels effets inhibiteurs de la PCR et donc ventuelle dtection de faux ngatifs. Les squences de la cible sur ce contrle interne et dans lchantillon biologique leur permet dtre co-amplifis avec le mme couple damorces. Cependant, la dtection simultane et la diffrenciation du contrle interne et de lchantillon sont possibles laide de sondes dhybridation diffrentes.

3/ La quantification relative
Vous pouvez vous rfrer au Technical Note LC13/2001 de Roche. Consultez surtout la page WEB : http://www.gene-quantification.info/ voir Relative quantification La quantification relative fait intervenir un gne de mnage (Housekeeping gene HKG) qui va servir de normalisateur : ce gne est en effet considr comme stable dans le modle prsent, il ne subira pas de changement dexpression en fonction des conditions analyses. Ce gne de contrle va permettre de compenser dventuels biais de PCR provenant de : - variations dans la quantit et la qualit des chantillons - rendement dextraction diffrent entre chantillons - variations dans les erreurs de pipetage - variations defficacit de RT La mthode des droites standard (quantification relative avec des standards externes) : Cette mthode ncessite ltablissement dune droite standard par gne. Cette droite talon va servir quantifier les concentrations inconnues dchantillons biologiques partir dchantillons standards (produit de PCR clon ou non), passs en mme temps que les chantillons inconnus. On va contrler lefficacit PCR de chaque couple, dterminer une gamme de mesure pour chaque couple permettant de quantifier tous les chantillons. Concept gnral : Pour chaque chantillon, on va donc dterminer la concentration en gne cible (Ncible) et la concentration en gne de mnage (ou rfrence : Nrf) en sappuyant sur les droites standards de chaque gne (Si, bien sur, les efficacits PCR des gnes cible et de mnage sont diffrentes). On va normaliser la mesure du gne cible par celle du gne rfrence (Ncible / Nrference) pour chacun des chantillons. Le logiciel Data Analysis effectue automatiquement le calcul des concentrations de la cible et du gne rfrence. Le calcul du rapport cible/rfrence doit tre fait manuellement ou en utilisant une feuille de calcul de type Excel.

Les critres de prparation dune courbe standard sont : - au moins 4 points pour crer la droite couvrant la gamme de concentration attendue de la cible. - pour des concentrations intermdiaires et fortes (Cp infrieur 25 cycles pour la plupart des couples PCR), une seule dtermination est ncessaire pour chaque dilution ; - pour quantifier de faibles concentrations (Cp a partir de 25-30 cycles pour la plupart des couples), on doit dupliquer voire tripliquer les points de mesure pour amliorer la robustesse du calcul. Lefficacit PCR du couple choisi doit tre la mme pour le standard et pour les chantillons. Si le standard est un plasmide et les chantillons des cDNA, il peut tre utile deffectuer le calcul de lefficacit sur une dilution de cDNA afin de le vrifier.

La mthode des

Ct (quantification relative normalise par un calibrateur) :

Lexpression de gnes cibles et rfrence est fonction de lefficacit de la PCR et du Cp enregistr. Avec cette technique, pas besoin dune droite standard pour chaque run, il nest pas ncessaire de connatre la valeur absolue du nombre de copies des chantillons. Les rsultats sont exprims par un rapport cible/rfrence de chaque chantillon normalis par le rapport cible/rfrence dun chantillon appel calibrateur. Dans cette mthode, la prcision du rsultat dpend des efficacits de PCR des gnes cibles et rfrence. Ces 2 efficacits doivent tre les plus proches lune de lautre. Si elles ne le sont pas : - Sans correction de cette diffrence defficacit, le rsultat obtenu sera approximatif (introduction de biais de calcul)

la diffrence defficacit peut tre corrige pour obtenir un rsultat prcis.

La PCR est dcrite par lquation suivante : N = N0 x Ecp N : nombre de molcules au cycle Cp N0 : nombre initial de molcules E : efficacit de la PCR Cp : cycle seuil Principes : - dans une premire tape, le rapport cible/rfrence pour chaque chantillon et lchantillon calibrateur est calcul. Les biais lis aux diffrences de qualits et quantits des chantillons sont limins (le biais est le mme pour la cible et pour la rfrence et donc sannule). - Dans une seconde tape, le rapport obtenu pour chaque chantillon est divis par le rapport obtenu pour lchantillon calibrateur. Les biais lis aux diffrences de sensibilit dans la dtection du gne cible et rfrence vont alors sannuler. La normalisation par lchantillon calibrateur permet de comparer les chantillons entre eux. On pose : T (Target) pour gne Cible et R pour gne Rfrence. Au Cp respectif des 2 gnes, on a : NT = NT0 X ETCPT NR = NR0 X ERCPR On pose : S (Sample) pour chantillon et C pour Calibrateur (chantillon calibrateur) . La mthode des Ct va calculer le rapport normalis suivant :

Rapport = NT(S)/NR(S) / NT(C)/NR(C) = K(S) / K(C) = 1 En effet, au Ct, le nombre de copies dtectes des gnes cibles T et rfrence R ne sont pas tout a fait les mmes. Par contre, le rapport K = NT / NR est constant et identique pour le calibrateur et lchantillon S. Autrement dit, sur la ligne de seuil place sur les profils obtenus pour lchantillon calibrateur et pour lchantillon, le nombre de molcules de gnes cibles (ou de gne rfrence) est identique pour les 2 (mme si bien sur les valeurs des Ct sont trs diffrentes). Donc : K(S) / K(C) = 1

Equation 1

A/ Si lefficacit des 2 PCR est identique (E = ET = ER), Le facteur R reprsente le facteur dexpression du gne cible dans lchantillon par rapport son expression dans le calibrateur. Rapport = E Ct = E CpT(C)-CpT(S)+CpR(S)-CpR(C) = E (CpT(C)- CpR(C)) (CpT(S)-CpR(S)) =ECtC-CtS Avec Ct = CpT-CpR La formule initiale de calcul tait : 2Ct Elle suppose que les 2 PCR cible et rfrence ont toutes deux une efficacit maximale de 100%. Il est important, pour valider cette mthode de quantification, de prouver que les efficacits de PCR de la cible et de la rfrence sont trs proches. Un moyen de le prouver est de calculer les Ct en fonction des dilutions successives dun mme chantillon. La valeur absolue de la pente Ct = f (dilution de lchantillon) doit tre infrieure 0,1. Une fois valide, on peut utiliser la mthode des Ct pour la quantification relative sans avoir crer de courbes standards en parallle. B/ Si les 2 efficacits sont diffrentes, le modle mathmatique peut scrire :

Cest une autre forme dexpression de lquation 1 ci-dessus. Cest la formule utilise par le logiciel RealQuant de Roche lorsquon tient compte des diffrences defficacits entre les 2 PCR. Un logiciel appel REST (Relative Expression Software Tool) va permettre de comparer non pas un chantillon contrle vs un chantillon inconnu mais un groupe dchantillons contrles vs un groupe dchantillons inconnus.

4/ Comparaison des 2 mthodes de quantification relative


Pour illustrer lutilisation des 2 mthodes de quantification relative (droite standard et Ct) et montrer que ces 2 mthodes aboutissent aux mmes rsultats, on va prendre lexemple suivant : On va quantifier lexpression du gne c-myc humain dans diffrents tissus (foie, poumon, cerveau, rein). Le gne rfrence choisi est la GAPDH. Le tissu calibrateur choisi arbitrairement est le cerveau. 1re mthode : les droites standards On a tabli laide de dilutions successives dun AN standard, une courbe standard pour chacun des 2 gnes. A partir de ces 2 courbes, on a pu tablir le nombre de copies de chacun des 2 gnes dans chaque chantillon. On la exprim en facteur de dilution du RNA standard :

Tissu Cerveau Rein Foie Poumon

c-myc 0,039 0,41 0,7 0,93

GAPDH 0,54 1,02 0,28 0,81

c-myc / GAPDH 0,07 0,40 2,49 1,15

c-myc / au cerveau 1 5,5 34,2 15,7

2me mthode : les Ct On a pos lhypothse que chacune des 2 PCR est efficace 100%. On note les Cp obtenus pour chaque gne dans chaque chantillon. Ct Ct = CpT-CpR Ct = CtC - CtS Tissu = C Cerveau Rein Foie Poumon c-myc = T 30,39 27,03 26,25 25,83 GAPDH = R 23,63 22,66 24,6 23,01 Ct 6,86 4,37 1,65 2,81 Ct 0 2,5 5,21 4,05 c-myc / au cerveau 1 5,6 37 16,5

Toutes les variables comme les variations dans les quantits dchantillon par exemple, sont limines par la normalisation sur une rfrence par rapport un chantillon calibrateur. On obtient des rsultats identiques pour les 2 mthodes. Quelle mthode choisir ? Lutilisation de telle ou telle mthode est dpendante en fait de la prcision exige par vos mesures. Elle dpend de votre capacit reproduire vos mesures, galement des efficacits de vos PCR, des concentrations en molcules cibles de vos chantillons inconnus.

La quantification par le standard externe est la mthode la plus simple mettre en uvre. Une fois les primers optimiss, la droite standard doit tre reproduite chaque run de PCR. Elle peut galement tre sauvegarde et importe pour des runs ultrieurs. Mais dans ce cas, la prcision des calculs peut en ptir. En effet : - Dans le premier cas (droite refaite chaque fois), puisque standard et chantillons inconnus varient de la mme faon, il est possible de dtecter des variations dun facteur 2. - Dans le second cas (importation dune droite standard externe), des variations dun facteur 5 sont dtectables mais plus difficilement dun facteur 2. Par contre, placer des chantillons standards sur chaque carrousel entrane un surcot et occupe des places prises sur les chantillons. Des droites standard de diffrents runs vont ncessairement prsenter des variations. Ces variations dans la reproductibilit des expriences vont dpendre de certains facteurs : - Un nombre de point lev dans la droite permettra daugmenter cette reproductibilit. - Le mode de conservation du standard doit tre optimis afin dviter tout biais lis a son ventuelle dgradation. La quantification par les Ct va permettre de gagner de la place (de largent galement) en ne plaant que des chantillons sur le carrousel. Si vous travaillez avec des efficacits de PCR cible et rfrence loignes, vous pouvez introduire des biais importants (cf ci-dessous). Dans ce cas, il est possible dutiliser le logiciel RealQuant de Roche qui va tenir compte de ces diffrences pour quantifier prcisment. Son utilisation exige en contre partie un formatage prcis des expriences (cf le paragraphe RealQuant dans la seconde partie). Sinon il est possible dutiliser la formule dcrite ci-dessus (cf 3/ B) sous Excell par exemple.

5/ Les biais introduits par la PCR attention au Ct


Dans de trs nombreux cas, une raction PCR ne permet pas damplifier avec une efficacit de PCR de 100% (par exemple, le pourcentage de GC contenu dans le produit amplifi intervient largement). La formule classique de la PCR (N = N0 X Effn) permet de calculer le nombre de molcules thoriquement obtenues pour des PCR prsentant des efficacits diffrentes. Imaginons que lon parte dune seule molcule cible lorigine, on peut calculer en fonction defficacit diffrente le nombre de molcules-filles gnres au bout de n cycles en calculant (1+E)n :

Cycles Eff 100% Eff 90% Facteur cart Eff 80% Facteur cart

10 1024 613 1,7 357 2,9

15 32768 15181 2 6746 4,8

20 1048575 375899 2,8 127500 8,2

25 33,5 106 9,3 106 3,6 2,4 106 14

30 1,07 109 230 106 4,6 45 106 23

On observe que plus la diffrence defficacits entre les 2 PCR est grande, plus le facteur dcart entre lefficacit maximale et chacune des efficacits (et donc lerreur introduite) sera grand.

Afin de bien comprendre les biais que peut introduire la mthode des Ct si elle nest pas contrle, nous avons choisi lexemple suivant : Un calibrateur et 6 chantillons prsentent des rapports variables gnes cibles sur gne rfrence . Le tableau 1 ci-dessous rsume les nombres de copies de chaque gne. Gne ref 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 15000 Gne cible 5000 250000 1000 100 25000 500000 50 5000000 5 300000 1000000 10000000 Qte de cibles dans lchantillon / calibrateur 50 fois plus 5 fois moins 50 fois moins 5 fois plus 100 fois plus 100 fois moins 1000 fois plus 1000 fois moins 60 fois plus 200 fois plus 2000 fois plus

Calibrateur Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K

On pose lhypothse que lefficacit PCR du gne rfrence (R) est de 100% et celle du gne cible (T) nest que de 80% (C pour Calibrateur et S pour Sample) En utilisant la formule : ET CpT(C)-CpT(S) X ER CpR(S)-CpR(C) Ct cible = CpT(C)-CpT(S) Ct ref = CpR(S)-CpR(C) On pose ET = 1,8 et ER = 2 avec les rsultats de Cp suivants : Ref 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 19,35 Target 24,68 18 27,42 31,34 21,95 16,8 32,52 12,9 36,4 17,7 15,65 11,75 Ct cible 6,68 -2,74 -6,66 2,73 7,88 -7,84 11,78 -11,72 6,98 9,03 12,93 Ct ref 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50,72 0,19 0,019 4,97 102,69 0,009 1016 0,001 60,5 201 1998 Ct X50 /5,26 /52,63 X4,97 X102 /111 X1016 /981 X60,5 X200 X2000 Fact

Calib Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K

Fact : facteur dexpression du gne cible dans lchantillon par rapport au calibrateur.

Avec ce calcul prcis, on obtient les vrais facteurs dexpression des chantillons. On retrouve les valeurs thoriques nonces dans le tableau 1. Si on est moins rigoureux et que lon se contente dutiliser la mme valeur defficacit (100% par exemple) pour les gnes cibles (= target) et rfrence : On pose ET = 2 et ER = 2 avec les mmes valeurs de Cp, on obtient des rsultats de facteurs dexpression diffrents : Ct cible Calib Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K 6,68 -2,74 -6,66 2,73 7,88 -7,84 11,78 -11,72 6,98 9,03 12,93 Ct ref 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ct 102 0,15 0,01 6,63 235 0,004 3517 0,0003 126 522 7804 Fact X102 /6,66 /100 X6,63 X235 /250 X3517 /3333 X126 X522 X7800

Si on compare les rsultats obtenus avec les 2 mthodes (efficacits de 80% -correcte- et de 100% -moins prcise- pour le gne cible ou target). Ainsi vraie valeur Ech A Ech B Ech C Ech D Ech E Ech F Ech G Ech H Ech I Ech J Ech K 50 5 50 5 100 100 1000 1000 60 200 2000 ET = 1,8 X50,72 /5,26 /52,63 X4,97 X102 /111 X1016 /981 X60,5 X202 X1998 ET = 2 X102 /6,66 /100 X6,63 X235 /250 X3517 /3333 X126 X522 X7804 Facteur dcart 2 1,2 2 1,3 2,3 2,5 3,5 3,3 2 2,5 3,5

Si on compare les rsultats obtenus entre les 2 mthodes, on observe : - Des carts significatifs entre les deux avec des facteurs dcart entre 1,2 et 3,5 fois - Des facteurs dcart qui augmentent avec les valeurs relatives du gne cible dans lchantillon par rapport au calibrateur. Ainsi on obtient un facteur dcart de 1,2-1,3 pour une quantit de molcules cibles 5 fois plus et moins abondante dans les chantillons B et D ; on obtinet un facteur dcart de 3,5-3,3 pour une quantit de molcules cibles 1000 fois plus et moins abondante dans les chantillons G et H.

En ne tenant pas compte de lefficacit relle de la cible, on estime mal la quantit relative du nombre de gnes cibles dans chaque chantillon. On perd galement toute possibilit dinformation entre chaque chantillon : les chantillons G et K sont diffrents dun facteur 2 en tenant compte de lefficacit correcte et dun facteur 2,2 avec une estimation de cette efficacit. Si les efficacits des gnes cibles et rfrence sont diffrentes, on peut effectuer une quantification relative exacte (avec correction de la diffrence defficacit) a laide du logiciel RealQuant de Roche.

6/ La reproductibilit des mesures


La reproductibilit des rsultats est essentielle afin de valider les rsultats obtenus. Elle dpend des efficacits de PCR, des concentrations de vos chantillons, de la qualit des chantillons biologiques (prsence dinhibiteurs, dfauts dans leur conservation) et bien sur de la qualit des pipetages. Elle est par contre indpendante du format de fluorescence utilis. Lefficacit de PCR est un facteur important pour la reproductibilit des rsultats. Plus lefficacit PCR est grande, plus la PCR sera robuste, en particulier lorsque lon travaille avec des chantillons prsentant un faible nombre de copies. La reproductibilit est directement dpendante de la concentration en cibles initiales. Plus cette dernire est forte, meilleure sera la reproductibilit. On observe ce phnomne en dupliquant les points de mesure et en calculant les cfficients de variation obtenus sur ces mesures pour des dilutions successives. Exemple: sonde dhybridation, PCR de 131bp TNF alpha humain 6-4 rplicats par points de concentration CV, Ct 0,3% 0,4% 0,7% 1,7% CV, conc. 5,1% 8,8% 16,5% 41%

Concentration initiale 10 copies 10 copies 10 copies 10 copies


1 2 3 4

Le CV obtenu pour 10 copies est le plus lev : a ces concentrations, les distributions statistiques jouent un grand rle: ainsi, quand on pipette 10 copies par capillaires en moyenne, le nombre exact de copies dans le tube va de 7-13 (distribution de Poisson). A cause de ces distributions statistiques, on doit dupliquer ou tripliquer les points de mesure afin de pouvoir diffrencier 10 copies de 20 (plus que pour diffrencier 1000 de 2000). De manire gnrale, pensez a dupliquer vos points de mesure lorsque les Cp obtenus pour ces mesures se situent vers 25-30 cycles, en particulier si votre efficacit PCR est moyenne. Le mode de conservation des chantillons biologiques (en particulier lchantillon standard utilis rgulirement) est un lment important de la reproductibilit. Mal conservs (mauvaise temprature de conservation, trop faible concentration de conservation, cycles de

conglation-dconglation successifs), lchantillon va se dgrader au cours du temps et cela va introduire des biais entre exprience. La qualit des pipetages est bien sur une condition ncessaire la reproductibilit des mesures. En particulier pour les plus faibles volumes (10 ul), un biais de pipetage mme faible peut entraner des erreurs. Assurez vous des niveaux de chaque capillaire avant de lancer votre carrousel. En pratique, a quoi peut on sattendre ? Nous avons rcolts des donnes dune utilisatrice du dpartement dendocrinologie (Jocelyne Leclerc) qui refait une gamme standard a chaque carrousel. Elle utilise une aliquote de son ADN standard, quelle dilue extemporanment de 2 en 2, avec 5 points de gamme (nomms ici de 1 a 5). Les rsultats obtenus (sur 27 expriences) sont les suivants : Gamme : Moyenne Cp Ecart type 1 26,77 0,15 2 27,92 0,18 3 28,98 0,23 4 30,14 0,27 5 31,39 0,47

Ces rsultats ne sont pas extrapolables a toutes les expriences bien sur, mais ils donnent un ordre dide de lcart type que lon peut obtenir en travaillant dans des conditions robustes (standard concentr, aliquot) dans des valeurs de Cp comprises entre 26 et 31. Si pour ces valeurs de Cp de cet ordre, lcart type des valeurs de Cp est trs lev, on peut se poser des questions quant a la capacit a reproduire des points exprimentaux avec ce couple.

7/ La prcision des mesures :


Un cart dun facteur 2 entre 2 chantillons en utilisant une PCR 100% efficace reprsente un cart dun cycle entre leur Ct respectif. De tels carts ont t dcrits sur le Light Cycler pour des applications de dosages de gnes par exemple. Mesurer un cart rduit (donc tre le plus prcis possible) suppose : - Dutiliser des PCR efficaces, robustes et donc les plus reproductibles possibles (fragments courts par exemple). - De travailler dans des gammes de concentration en cibles levs (Ct faibles, infrieurs 25 cycles) afin dtre le plus reproductible possible (voir 6/) - De dupliquer les points de mesure afin dtre plus prcis. En particulier dans des gammes de concentrations en cibles plus faibles (Ct suprieur 30 cycles). - Dtre capable de reproduire sur plusieurs jours les mmes expriences. Cest ces conditions que vos mesures seront les plus prcises.