Articulo Original Unidad II: Fundamento del cultivo de microorganismos

Lurians Alexandra Daz*, Douglimar Del Valle Rangel* *Ctedra de Laboratorio de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Departamento de Biologa Celular. Universidad Central de Venezuela, Caracas Venezuela.
12 de Junio de 2012

Resumen: Palabras Clave: Introduccin Para estudiar el crecimiento microbiano, en primer lugar es necesario conocer las necesidades nutricionales de las bacterias con la que se trabaja. En lo fundamental, las bacterias necesitan una fuente de carbono, nitrgeno, fosforo, algunos minerales, vitaminas, oxgeno (proceso aerobio) u otros aceptores de electrones como nitrato sulfato (proceso anaerobio) y agua. (1). As el crecimiento microbiano puede ser definido como un aumento en el nmero de clulas microbianas de una poblacin (2), como un proceso auto cataltico, en donde los microorganismos (catalizadores) a expensas de los nutrientes en el medio de cultivo producen mas microorganismos y productos extracelulares (3). Este proceso contina hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supngase por ahora que ste no es el caso y que la primera alternativa es la vlida, Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiomtrico, por el cual la concentracin final de microorganismos obtenidos depender de la concentracin y composicin del medio de cultivo, y el otro cintico, el que dir con qu velocidad se lleva a cabo el proceso (4). Para estudiar ambos enfoques se cultivo Escherichia coli en medios de cultivo por lotes (batch) mnimo y rico, y Escherichia coli en un medio en condiciones de flujo continuo. Con el enfoque estequiomtrico que permite responder a la pregunta Cunto se forma en funcin de lo que se consume? (5), se determin el incremento de biomasa y el consumo de sustrato (glucosa) con el mtodo de Trinder, para determinar el rendimiento, usando medio mnimo, se realizaron experimentos con medio rico, pero solo para determinar biomasa final, el rendimiento no pudo ser determinado pues se desconoce la cantidad inicial de glucosa. el objetivo fue determinar la velocidad especifica de crecimiento () con la pendiente de la curva de crecimiento y el rendimiento en biomasa. Con el enfoque cintico que permite responder a la pregunta a qu velocidad ocurre el proceso? Se estimo la cantidad de microorganismos usando las tcnicas de espectrofotometra cada una hora en un medio de cultivo continuo, y plaqueo por extensin en superficie, Adems se suministraron pulsos de glucosa al medio de cultivo para

observar la variacin en el crecimiento y entender el concepto de sustrato limitante. Materiales y Mtodos Cultivo por lote: Medio mnimo: El proceso se inicia con la inoculacin de 2 ml, de cultivo bacteriano en 98 ml de medio mnimo mineral suplementado con glucosa (5g/L) en una fiola de 500 ml. Una vez inoculado, se procede a realizar diluciones seriadas de 10-7 y sembrar por el mtodo de rastrilleo 0.05 ml y 0.1ml de medio de cultivo, paralelo a esto se tomaron 3 ml del medio inoculado la cual corresponde a la condicin inicial (tiempo cero) y se le determino la DO600nm, inmediatamente la fiola con el medio de cultivo fue llevada a agitacin a una temperatura de 37 oC durante un tiempo de 60 minutos (tiempo 1) y luego de este tiempo se midi nuevamente la DO600nm, este procedimiento se repiti hasta completar el tiempo 4 (4 horas ) a partir de este tiempo se midi cada media hora la DO hasta llegar al tiempo 6. La densidad ptica del cultivo fue medida en un espectrofotmetro a la longitud de onda de 600nm (DO600nm). Determinacin de biomasa: Se toma una muestra del cultivo extrada de la fiola (biorreactor) en el ltimo tiempo (tiempo 6 horas) y se aade a un tubo de centrfuga pre-pesado y se procede a centrifugar la preparacin a 5.000 g durante 10 minutos. Una vez completada la centrifugacin se retira cuidadosamente el sobrenadante hasta su posterior uso. Al tubo de centrfuga se le extrae el sedimento (biomasa) y es colocado en un papel de aluminio pre-pesado y llevado a una estufa y secado a 60C hasta alcanzar peso constante. Determinacin de la concentracin de glucosa: La concentracin de glucosa en el cultivo fue

medida mediante el mtodo de Trinder (1969). Para ello se utiliza el sistema enzimtico glucosa oxidasa-peroxidasa, Se tomo el sobrenadante obtenido en la determinacin de la biomasa y se le agrego el reactivo 4-aminoantipirina, luego se llevo a la estufa por un lapso de 10 minutos y finalmente se midi la DO520nm. Para la determinacin de la concentracin de glucosa se realizo la elaboracin de una recta tomando dos puntos como valor de DO520nm. Cultivo continuo: Medida de densidad ptica: se cultivo la bacteria E.coli bajo condiciones de flujo continuo, en un medio suplementado con glucosa como nica fuente de carbono. Se midi la DO 600 cada hora (haciendo 6 tiempos), la primera medida se realizo en condiciones de glucosa limitante (antes del pulso de glucosa), luego de este tiempo (una hora) se aplico un pulso de glucosa y se sigui midiendo la DO 600 hasta llegar al tiempo 6. Con estas medidas Se evalu si bajo estas condiciones el crecimiento se limita por la fuente de carbono y energa. Resultados Crecimiento microbiano, de Escherichia coli en un medio mineral mnimo y rico por lotes en la figura 1, se muestra la cantidad de unidades formadoras de colonias en funcin del tiempo, y se observa que el crecimiento es exponencial y no decae ni se mantiene sino que continua en aumento durante 5 horas y media. Tambin se observa el crecimiento en un medio rico con un comportamiento exponencial durante 5 horas y medias, se observa en comparacin con los microorganismos crecidos en medio mineral mnimo, que la cantidad de unidades formadoras de colonias es superior, tambin se observa al igual que en el medio mineral mnimo que la

cantidad de colonias siempre es el cuadrado del numero de colonias que lo precede. En la tabla I. Se observa la variacin de microorganismos aislados al inicio y al culminar el crecimiento en ambas diluciones de medio mnimo se obtienen un incremento del 98, 66% aproximadamente durante 5 horas y media, para el medio mineral rico se observo que es incremento fue tanto que se formo un csped, o la dilucin se realizo de manera errnea. Velocidad especifica del crecimiento mximo (mx.) en un medio de cultivo por lotes, se determina como la pendiente del grafico de la figura 3, para un medio mineral mnimo y rico, donde se considera el incremento de biomasa proporcional a la absorbancia. Como se observa la velocidad especifica de crecimiento (mx.) es mayor para el medio de cultivo rico. Determinacin de la glucosa remanente en el medio de cultivo, en la figura 3 se observa que inicialmente en el medio se tena una cantidad determinada de 0,2mg de glucosa/mL posterior al crecimiento se obtuvo que los microorganismos consumieron aproximadamente 0,03 mg de glucosa/mL.

Tabla I: Cantidad de colonias aisladas en por plaqueo, al inicio y al culminar el crecimiento microbiano en medio mineral mnimo y rico. 0,05 mL Medio mineral mnimo Medio mineral rico To T5,5 To T5,5 3 240 174 csped 0,1 mL 6 416 340 csped

Figura 3: Determinacin de la velocidad especifica de crecimiento (mx.) como pendiente de la curva en un medio mnimo y rico por lotes

Figura 1: Crecimiento microbiano, de Escherichia coli en un medio mineral mnimo y en un medio mineral rico.

Figura 5: Concentracin de glucosa (mg/mL) en el medio de cultivo mnimo.

Rendimiento en biomasa.

Tabla II: Cantidad de colonias aisladas (UFC) por plaqueo, al culminar el crecimiento microbiano en medio de cultivo continuo.

Ecuacin 1: Rendimiento experimental. Crecimiento microbiano, de E. coli en un medio de cultivo continuo. Se observo que el crecimiento se mantiene dentro de cierto rango, es decir que se mantiene constante la cantidad de microorganismos dentro del bioreactor, se observa tambin que al agregarle pulsos de glucosa en un primer punto la cantidad de microorganismos que es proporcional a la absorbancia disminuye y luego al agregar el segundo pulso la cantidad de microorganismos aumenta considerablemente. La velocidad de crecimiento en el cultivo continuo en estado estacionario es igual a la tasa de dilucin, que es Cantidad de colonias aisladas por plaqueo, en medio de cultivo continuo. La cantidad de colonias crecidas lgicamente es numricamente menor para el inoculo de menor volumen (0,05mL) sin embargo para ambos casos se observa el incremento de microorganismos y un incremento mximo en el punto 4, que coincide con el segundo pulso de glucosa.

Discusin Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque es necesaria para poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se va ir acumulando el producto (5), en los medios de cultivo por lote (batch) se obtuvo que el crecimiento tanto en medio mineral mnimo (MMM) como en medio mineral rico (MMR), es exponencial (Figura 1), siendo la velocidad especifica de crecimiento (mx.) mayor en el MMR (pendiente de la regresin lineal para el crecimiento), (Figura 2) ya que en un mismo intervalo de tiempo con un inoculo de menor concentracin de microorganismos se obtuvo mayor cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC), en comparacin con el MMM, se esperaba para el cultivo de MMM que mientras crecieran los microorganismos, los nutrientes fuesen consumidos y se iran acumulando metabolitos, finalmente la multiplicacin celular cesara por la falta de nutrientes y la acumulacin de productos txicos; por lo cual se obtendran bajas densidades celulares (6). Sin embargo esto no ocurri aunque el inoculo para el cultivo de MMM era mayor que el cultivo de MMR. Debido

Figura 6: Crecimiento microbiano, de E. coli en un medio de cultivo continuo.

al tiempo de generacin el cual vara dependiendo de la especie microbiana y de las condiciones de crecimiento de la poblacin. Para las clulas de Escherichia coli, en condiciones optimas de pH, temperatura, y nutrientes, incluyendo las concentraciones de oxgeno es de 18 a 20 min, en el tracto intestinal de los vertebrados, en el cual los nutrientes son menos abundantes, el tiempo de duplicacin es de unas 12 horas (7),el efecto de la concentracin del sustrato (nutrientes) es el componente limitante, durante el experimento segn la ecuacin de Monod mientras mayor es S (concentracin del sustrato limitante), mayor es la velocidad de crecimiento y por lo tanto menor el tiempo de generacin, con ello en cuenta, podemos deducir que el tiempo de generacin para el MMM, es mayor y por ello el tiempo de experimentacin no fue suficiente para que observar el cese de crecimiento y en consecuencia disminucin de la absorbancia y el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC), la cantidad de colonias aisladas por el mtodo de plaqueo (Tabla I) nos permite constatar que hubo el crecimiento de las bacterias y en que medio mineral rico fue mayor, como se supona y se observan en las graficas de crecimiento se obtuvo la mayor multiplicacin de clulas en el medio rico, debido a que como hay exceso de nutrientes no hay competencias ni limitaciones para los organismos y adems el tiempo de generacin es el mnimo. La determinacin de glucosa remanente en el medio de cultivo y la determinacin de la biomasa en peso seco (gramos) nos permiti calcular el coeficiente de rendimiento en biomasa (Y ), solo para el cultico en condiciones de MMM, dando para el rendimiento un 18%, es decir la produccin de microorganismos en funcin de lo que se consumi fue de un 18% ese rendimiento en las condiciones de nutrientes mnimos muestra que el sistema es eficiente en comparacin con otro trabajo (8), donde analizan las rutas metablicas y

con ello, el rendimiento en biomasa a partir de glucosa, de Pseudomonas Aeruginosa y lo comparan con el de Escherichia coli, ambos microorganismos aerobios estrictos y obtienen que el rendimiento en biomasa para E. coli es de 0,102 g biomasa/g de glucosa lo que igual a 10,2%. Conclusiones La velocidad especifica de crecimiento (max) es decir la tasa de produccin de microorganismos y por lo tanto de compuesto extracelulares, est limitada por los nutrientes, los microorganismos crecidos en medio mnimo tienen un tiempo de generacin mayor que los crecidos en medio mineral rico, as se retarda el consumo de nutrientes y por lo tanto el agotamiento del sistema, de haber expandido el tiempo de experimentacin se esperaba obtener aumento de microorganismos en el medio rico y un cese de este crecimiento en los medios de cultivo mnimo, ya que no hay mas sustrato en el medio y adems comienza la acumulacin de desechos txicos, los resultados del incremento de biomasa y disminucin del sustrato en el medio mineral mnimo permiti calcular el rendimiento experimental, se obtuvo un 18%, es decir 0,18 g de biomasa por gramos de glucosa como sustrato consumidos, lo que es bastante eficiente al compararlo con otros trabajos (8). Referencias 1. Gebhardt, L.P.: Microbiologa. Nueva Editorial Interamericana 4ta Edicin, Mxico, 1970. p.25-34. 2. Madigan, M.T.: Brock, Biologa de los microorganismos. Pearson Pretince Hall, 10ma Edicin, USA, 2010. p.138-144. 3. Departamento de Biologa Celular de la Facultad de Ciencias UCV,: Gua Practica de Microbiologa General, Caracas, 2010. p.23-25

4. Prof. Jos Merchuk Ben Gurion University Beer Sheva, Israel. Microbiologia Industrial.http://www.science.oas.org/Simbi o/mbio_ind/all_mi.pdf 5. Antonio G. Pisabarro, Curso de ingenieros agrnomos, Microbiologa general http://www.unavarra.es/genmic/introduccion. htm 6. UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Departamento de Ciencia y Tecnologa Bioprocesos I. TRABAJO PRACTICO CULTIVO BATCH http://bioprocesos. unq.edu.ar/Biopro%20I/TP%20Cultivo%20B atch%202011.pdf 7. http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/mi crobiologia/unidades/documen/uni_02/58/text html/cap802.htm 8. Rojas, O.R, Villafaa J.R. Universidad de Guadalajara, Anlisis de rutas metablicas en Pseudomonas Aeruginosa para la produccin de Pilihidroxialcanoatos a partir de glucosa usando modos experimentales 2006. Guadalajara-Mxico. p.14-16.