Grasas y Aceites Vol. 54. Fasc.

1 (2003), 1-6

I N V E S T I G AC I N
Estudio del contenido en triglicridos de aceites monovarietales elaborados a partir de aceitunas producidas en la regin extremea
Por Emilio Osorio Bueno*, Jacinto J. Snchez Casas, Manuel Martnez Cano y Alfonso M. Montao Garca Instituto Tecnolgico Agroalimentario. Direccin General de Comercio. Junta de Extremadura. Carretera de Cceres s/n. 06007 Badajoz. Espaa. E-mail: eosorio@eic.juntaex.es
RESUMEN Estudio del contenido en triglicridos de aceites monovarietales elaborados a partir de aceitunas producidas en la regin extremea.
Se ha analizado el perfil de triglicridos en 315 muestras de aceite de oliva virgen procedente de aceitunas de las variedades Extremeas: Carrasquea, Cacerea, Cornezuelo, Corniche, Morisca, Picual y Verdial de Badajoz. Se ha realizado la identificacin de 16 picos, agrupados segn los ECN, que corresponden a los diferentes triglicridos encontrados. Se ha encontrado variabilidad en el contenido de triglicridos atendiendo a la variedad y estado de maduracin. El anlisis discriminante paso a paso ha permitido explicar ms del 88 % de la varianza con las dos primeras funciones. El modelo permite clasificar en funcin de la variedad el 83,5 % de las 273 muestras analizadas. El mtodo validado con otras 42 muestras reduce la clasificacin al 69 %.

PALABRAS-CLAVE: Aceite de oliva virgen Anlisis discriminante Extremadura Monovarietales Triglicridos.

SUMMARY Study of the triglyceride content in monovariety oils elaborate as of olives produced in the extremea region.
Main triglyceride composition from 315 samples of virgin olive oils originating in olive of the varieties Extremeas: Carrasquea, Cacerea, Cornezuelo, Corniche, Morisca, Picual and Verdial de Badajoz, were evaluated. The identification of 16 peaks has been carried out, grouped according to the ECN, which correspond to the different triglyceride found. Variability has been found in the content of triglyceride depending on the variety and state of ripening. The stepwise discriminant analysis explains more than the 88 % of the variance with the two first functions. Using this model, 83,5 % of the 273 observations were correctly classified. The validated method with 42 samples reduces the classification at 69 %.

KEY-WORDS: Disc ri mi na nt a na ly sis Ex tre mad ura Monovariety Triglyceride Virgin olive oil.

1. INTRODUCCIN En el estudio global de caracterizacin de los aceites elaborados a partir de las principales varie-

dades de aceituna producidas en la regin extremea, desarrollado a raiz de un convenio establecido entre la Junta de Extremadura y el Sector, se incluye como tema prioritario el perfil de triglicridos, cada da mas aceptado por cientficos y tecnlogos como componentes muy determinantes de la naturaleza y calidad de stas. Es conocido que la medida de la pureza de un aceite de oliva, viene determinado en parte por su contenido en cidos grasos, as como por cada uno de ellos que esterifican la posicin de sus triglicridos. La estructura glicerida de los aceites est constituida especialmente por los triglicridos, diferenciados por el grado de insaturacin y su distribucin en las diferentes molculas. As mismo, los porcentajes de estos residuos en posicin suelen variar poco en los aceites de oliva y parecen estar ocupados preferentemente por cidos grasos insaturados, los cuales pueden ser modificados ante cualquier alteracin o manipulacin. En base a esto, el conocimiento de ciertos niveles de triglicridos, agrupados por el mismo nmero de tomos de carbono equivalentes (ECN), especialmente la trilinoleina (LLL), ha sido un instrumento bsico utilizado para la deteccin de fraudes en la comercializacin de aceites de oliva virgen, dada la presencia mayoritaria de este triglicrido en otros tipos de aceites utilizados en esas adulteraciones. (C.O.I., 1981; Salivares, 1992). En esta lnea, a partir del mtodo establecido para conocer los niveles de triglicridos con ECN 42, se proponen adecuaciones del mtodo para resolver las complejas mezclas de trigliceridos, separndolos en dichos grupos ECN. Ms an, se han llegado a concretar tericamente sus niveles, a partir de la composicin en cidos grasos y el conocimiento de la regla de distribucin de estos en las diferentes posiciones de la glicerina. (Cortesi, 1993; Cortesi et al., 1990). El conocimiento de este perfil de contenido en los diferentes trigliceridos se ha utilizado para caracteri-

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Figura 1 Cromatograma de los Triglicridos de un aceite de oliva virgen utilizando HPLC en rgimen isocrtico con detector de ndice de refraccin.

zar y diferenciar los aceites de oliva ya sea de otros tipos de grasas y aceites (Graciani, 1988 a; Flor et al., 1993; Barron et al., 1991), como para diferenciarlos por su zona de produccin (Graciani, 1988 b; Vacca et al., 1999; Castilho et al. 1989) o variedad de aceituna utilizada (Gouveia, 1997; Poiana et al., 2001 b). En este trabajo se pretende profundizar en el conocimiento de este perfil de contenido en triglicridos de los aceites elaborados de las principales variedades de aceituna producidas en Extremadura. Igualmente con un tratamiento estadstico adecuado, incluido un anlisis discriminante (Aparicio et al., 1988; Alessandri et al., 1999), se trata de encontrar las diferencias que por su origen o estado de maduracin puedan presentar, en va de conseguir una completa caracterizacin de cada una, conjuntamente con otros parmetros analizados. 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL 2.1. Muestras Para el desarrollo experimental propuesto se han utilizado un total de 315 muestras de aceitunas, recogidas en cultivares localizados en distintas comarcas de Extremadura y pertenecientes a las variedades Carrasquea (39), Cacerea (37), Cornezuelo (49), Corniche (49), Morisca (43) Picual (52) y Verdial de Badajoz (46), a lo largo de las campaas 1997-98, 1998-99, 1999-00 y 2000-01. La cantidad recogida ha sido de 6 Kg de aceitunas de cada una de las muestras. El muestreo se ha realizado en tres estados de maduracin definidos como verde

(I.M.<2.0), envero (I.M.= 2-3.5) y maduro (I.M.>3.5), correspondiendo 125, 112 y 78 muestras respectivamente a cada estado. 2.2. Mtodos analticos 2.2.1.

Preparacin de aceites

A partir de las muestras de aceituna recogidas se ha realizado la extraccin de su aceite de forma similar para todas por el sistema de centrifugacin de pasta Abencor, basado en una fase de trituracin mecnica, seguido de un batido de la pasta durante 30 min. a 28oC con adiccin de agua caliente y microtalco, terminando con una centrifugacin final para la separacin del aceite. Cada muestra de aceite elaborada es almacenada en frigorfico a 4oC hasta su posterior anlisis. 2.2.2.

Anlisis cromatogrfico

El anlisis de triglicridos se realiza por cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC), aplicando el mtodo oficial de la UE (Reglamento CE 2472/97) ya establecido para determinar la composicin de triglicridos en aceites de oliva expresados en su nmero equivalente de carbono (ECN). La determinacin se realiza por duplicado partiendo de una muestra de aceite de 0,5 g disuelta en acetona la cual es inyectada en una fase mvil acetona / acetonitrilo 40:60 a un flujo de 1,5 ml / min. y en condiciones isocrticas a 40 oC, a travs de una columna de acero inoxidable Lichrosorb RP 18, 5m x 4,6 x 250 mm. El equipo instrumental utilizado es la

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Tabla I
Contenido medio en triglicridos (%)
ESTADO DE MADURACIN VERDE ENVERO CARRASQUEA MADURO Media VERDE ENVERO CACEREA MADURO Media VERDE ENVERO CORNEZUELO MADURO Media VERDE ENVERO CORNICHE MADURO Media VERDE ENVERO MORISCA MADURO Media VERDE ENVERO PICUAL MADURO Media VERDE VERDIAL DE ENVERO BADAJOZ MADURO Media VERDE ENVERO MEDIA MADURO Media VARIEDAD N 17 11 11 39 16 14 7 37 19 19 11 49 18 15 16 49 17 17 9 43 19 19 14 52 19 17 10 46 125 112 78 315 LLLn 0,13 0,14 0,14 0,14 0,07 0,13 0,11 0,10 0,14 0,16 0,18 0,16 0,18 0,15 0,20 0,18 0,17 0,15 0,17 0,16 0,13 0,13 0,13 0,13 0,16 0,15 0,18 0,16 0,14 0,14 0,16 0,15 LLL 0,03 0,02 0,01 0,02 0,03 0,02 0,05 0,03 0,18 0,21 0,17 0,18 0,04 0,02 0,03 0,03 0,20 0,27 0,37 0,28 0,02 0,02 0,02 0,02 0,45 0,44 0,54 0,48 0,13 0,14 0,17 0,15 OLLn PLLn 0,14 0,16 0,12 0,14 0,12 0,13 0,17 0,14 0,36 0,38 0,34 0,36 0,18 0,16 0,20 0,18 0,36 0,36 0,49 0,40 0,13 0,12 0,13 0,13 0,39 0,41 0,45 0,42 0,24 0,25 0,27 0,25 0,04 0,03 0,01 0,03 0,03 0,03 0,04 0,03 0,13 0,12 0,07 0,11 0,03 0,01 0,02 0,02 0,13 0,12 0,14 0,13 0,02 0,02 0,03 0,02 0,13 0,07 0,11 0,10 0,0 7 0,0 6 0,0 6 0,0 6 OLL OLnO PLL 0,70 0,86 0,79 0,78 0,35 0,59 0,88 0,61 3,25 3,74 3,73 3,57 0,45 0,50 0,73 0,56 3,32 3,85 5,21 4,13 0,35 0,46 0,53 0,45 4,99 5,33 6,29 5,53 1,9 1 2,1 9 2,5 9 2,2 3 1,38 1,46 1,30 1,38 1,42 1,52 1,52 1,48 2,37 2,34 2,33 2,35 1,66 1,53 1,46 1,55 2,38 2,38 2,69 2,48 1,51 1,42 1,34 1,42 2,68 2,51 2,60 2,60 1,9 1 1,8 8 1,8 9 1,8 9 0,58 0,49 0,43 0,50 0,62 0,57 0,52 0,57 0,68 0,61 0,57 0,62 0,70 0,53 0,47 0,57 0,72 0,62 0,59 0,64 0,64 0,57 0,48 0,56 0,55 0,47 0,48 0,50 0,6 4 0,5 5 0,5 1 0,5 7 OLO PLO+SLL PPL 8,84 10,41 10,05 9,76 6,24 8,50 9,57 8,10 15,87 17,09 16,88 16,61 7,12 8,14 9,22 8,16 16,01 16,51 18,83 17,12 6,85 7,75 8,37 7,66 18,06 18,78 21,09 19,31 11 ,28 12 ,45 13 ,43 12 ,39 4,29 4,66 3,73 4,23 2,66 3,31 3,58 3,18 9,57 9,47 8,42 9,15 3,29 3,03 2,96 3,09 9,76 9,61 10,67 10,02 2,87 3,15 2,85 2,96 10,85 9,53 9,46 9,95 6,1 8 6,1 1 5,9 5 6,0 8 0,50 0,40 0,39 0,43 0,34 0,39 0,45 0,39 1,22 1,13 0,92 1,09 0,44 0,37 3,67 1,49 1,20 1,13 1,31 1,21 0,36 0,35 0,34 0,35 1,37 1,05 0,99 1,14 0,7 7 0,6 9 1,1 5 0,8 7 OOO POO 42,70 41,67 45,32 43,23 50,83 50,75 50,32 50,63 31,68 31,19 35,16 32,68 45,22 47,28 47,52 46,67 30,76 30,63 27,14 29,51 49,86 48,16 50,92 49,65 27,53 29,74 28,78 28,68 39 ,80 39 ,92 40 ,74 40 ,15 28,04 26,62 24,59 26,41 27,68 25,66 24,14 25,83 24,43 23,01 21,18 22,87 27,84 25,25 21,06 24,72 24,26 23,29 21,97 23,18 27,32 26,83 24,12 26,09 22,25 21,03 18,86 20,71 25 ,97 24 ,53 22 ,27 24 ,26 PPO 4,10 3,37 2,85 3,44 3,69 3,13 2,87 3,23 4,15 3,78 3,12 3,69 3,87 3,09 2,37 3,11 4,23 3,93 3,68 3,95 3,62 3,46 2,60 3,23 3,94 3,28 2,48 3,23 3,9 4 3,4 3 2,8 5 3,4 1 PPP 0,55 0,49 0,60 0,55 0,80 0,79 0,82 0,80 0,33 0,34 0,41 0,36 0,47 0,61 1,06 0,71 0,32 0,35 0,30 0,32 0,48 0,49 0,47 0,48 0,41 0,38 0,44 0,41 0,4 8 0,4 9 0,5 9 0,5 2 SOO SLS+POS 6,40 7,44 7,90 7,25 4,07 3,70 3,92 3,89 4,63 4,81 5,02 4,92 6,97 7,63 7,57 7,39 4,87 5,06 4,84 4,92 4,90 5,78 6,35 5,68 4,94 5,31 5,84 5,36 5,2 5 5,6 8 5,9 2 5,6 2 1,53 1,79 1,77 1,69 1,06 0,80 1,05 0,97 1,14 1,59 1,50 1,41 1,65 1,69 1,46 1,60 1,47 1,72 1,59 1,59 0,99 1,27 1,31 1,19 1,51 1,50 1,38 1,46 1,3 4 1,4 8 1,4 4 1,4 2

serie modular de HP modelo 1050 provista de bomba cuaternaria, horno de columna e inyector automtico y acompaado de un detector de ndice de refraccin (IR) HP 1040. La identificacin de los picos obtenidos por HPLC se muestra en la figura 1.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.1. Triglicridos

En la tabla I se indica los porcentajes medios calculados para cada variedad y estado de maduracin, con indicacin del nmero de muestras de

Tabla II
Contenido medio segn ECN (%)
9$5,('$'
&$55$648(f$

1


(&1 


(&1 


(&1 


(&1 


(&1 


(&1 


&$&(5(f$















&251(=8(/2















&251,&+(















025,6&$















3,&8$/















9(5',$/ '( %$'$-2=















0(',$















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Tabla III
Comparacin de contenido medio en triglicridos
VARIEDAD CARRASQUEA CACEREA CORNEZUELO CORNICHE MORISCA PICUAL VERDIAL DE BADAJOZ N 39 37 49 49 43 52 46 LLLn 0,14bc 0,10d 0,16abc 0,18abc 0,16a 0,13cd 0,16ab LLL 0,02a 0,03a 0,18b 0,03a 0,28b 0,02a 0,48c OLLn 0,14a 0,14a 0,36c 0,18b 0,40c 0,12a 0,42c PLLn 0,03a 0,03a 0,11bc 0,02abc 0,13c 0,02a 0,10ab OLL 0,78a 0,61a 3,57b 0,56a 4,13b 0,45a 5,53c OLnO 1,38a 1,48a 2,35b 1,55b 2,48b 1,42a 2,60ab PLL 0,50ab 0,57c 0,62cd 0,57cd 0,64d 0,56bc 0,50a OLO 9,76b 8,10a 16,61c 8,16a 17,12c 7,66a 19,31d PLO+SLL 4,23b 3,18a 9,15c 3,09a 10,02c 2,96a 9,95c PPL 0,43a 0,39a 1,09a 1,49a 1,21a 0,35a 1,14a OOO 43,23c 50,63c 32,68b 46,67d POO 26,41d 25,83d 22,87b 24,72c PPO 3,44bc 3,23ab 3,69cd 3,11a 3,95d 3,23ab 3,23ab PPP 0,55abc 0,80c 0,36a 0,71bc 0,32a 0,48ab 0,41a SOO 7,25d 3,89a 4,92b 7,39d 4,92b 5,68c 5,36bc SLS+POS 1,69d 0,97a 1,40bc 1,60cd 1,59cd 1,19ab 1,46cd

29,51ab 23,18b 49,65c 28,68a 26,09d 20,71a

VERDE ENVERO MADURO

125 112 78

0,14 0,14 0,16

0,13 0,14 0,17

0,24 0,25 0,27

0,07 0,06 0,06

1,91a 2,19b 2,59ab

1,91 1,88 1,89

0,64a 0,55b 0,51c

11,28a 12,45b 13,43b

6,18 6,11 5,95

0,77 0,69 1,15

39,80 39,92 40,74

25,97a 24,53b 22,27c

3,94a 3,43b 2,85c

0,48 0,49 0,59

5,25a 5,68a 5,92b

1,34 1,48 1,44

aceite analizadas (N). Se aprecia que todos los valores medios se encuentran comprendidos en los lmites referenciados por diversos autores (Graciani, 1988a; Flor et al., 1993; Gouveia, 1997; Poiana et al., 2001a y Poiana et al., 2001b) y los niveles de trilinoleina en ningn caso sobrepasan el valor del 0,5 %. Globalmente destacan, dentro de los considerados triglicridos mayoritarios, un grupo constituido por OLL (0,35 6,29 %), OLnO (1,30 2,69 %), OLO (6,24 21,09 %) y PPO (2,37 4,23 %), al igual que la suma PLO + SLL (2,66 10,85 %), que al margen de la variabilidad que presentan, son unos niveles sensiblemente ms altos en las variedades Cornezuelo, Morisca y Verdial de Badajoz. Por otro lado, dentro igualmente de los mayoritarios, los triglicridos OOO (27,14 50,92 %) y POO (18,86 28,04 %) son los que presentan los niveles ms altos en todas las variedades. Agrupados estos resultados en funcin del ECN, se obtiene un reflejo mas detallado de las diferencias encontradas, tal como se muestran en tabla II, donde se presenta los valores medios de cada grupo de ECN para cada variedad en estudio. En efecto, teniendo en cuenta los niveles de ECN 42 se observan que son muy representativos para las variedades Cornezuelo, Morisca y Verdial de Badajoz. Esto mismo ocurre para los niveles de ECN 44 y ECN 46, especialmente en esta ltima variedad. Estos valores mximos encontrados son explicados por el contenido de los triglicridos OLL (ECN 44), OLO (ECN46), as como la suma PLO + SLL, es decir un mayor contenido en cido linolico. En contraposicin, son las variedades Cacerea y Picual las que presentan valores mnimos en estos niveles referidos. Los niveles de ECN 48, los ms importantes desde el punto de vista cualitativo dada su alta proporcin, son los ms representativos en las variedades

Carrasquea, Cacerea, Corniche y Picual, destacando muy por encima de los niveles medios (68,34 %), tanto la Cacerea como la Picual, influenciados sin duda por los altos niveles en Trioleinas (OOO) que ambas presentan. La regularidad mayor se encuentra en los niveles de ECN 50 que presentan las distintas variedades, destacando tan solo la Cacerea que presenta unos niveles mnimos frente a las dems. 3.2. Anlisis estadstico Con el fin de establecer una posible tipificacin de los aceites monovarietales controlados en esta experiencia en funcin de su contenido en triglicridos, se ha realizado un anlisis de varianza de las poblaciones que constituyen los datos obtenidos, estableciendo un modelo en el que se cuenta con dos factores de variacin fijos como variedad y estado de maduracin y aplicando el anlisis MLG Factorial General Multivariantes del programa SPSS Base 10.0. Los resultados muestran diferencias significativas, a un nivel del 0,01 para todos los triglicridos a excepcin del PPL, en funcin de las variedades. De la misma forma se encuentran diferencias significativas para los OLL, PLL, OLO, POO, PPO y SOO respecto al factor de variacin estado de maduracin. Con el mismo programa estadstico y aplicando las pruebas post hoc de Tukey, se han comparado las medias resultantes para variedad y estado de maduracin en los distintos triglicridos que mostraron diferencias significativas. Los resultados, mostrados en Tabla III, adems de indicar todas las diferencias significativas entre variedades, destacan claramente que la variedad Corniche presenta unos niveles medios de OOO diferentes al resto de las variedades estudiadas; una tendencia similar de dife-

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Tabla IV
Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes cannicas
Funcin 3 4 1,909 0,08 -0,292 0,656 -0,477 -0,152 -0,684 1,063 1,402 0,534 0,52 -1,845 1,687 0,249 1,821 -1,092 0,125 1,352 1,948 -0,014 0,448 0,072 0,166 -0,244

LLL OLLn PLLn OLnO OLO PLO+SLL OOO POO PPO PPP SOO SLS+POS

1 0,696 0,074 -0,302 0,279 -0,497 -0,734 0,35 0,348 0,107 0,476 0,184 -0,155

2 0,34 -0,161 -0,064 -0,178 0,555 1,082 1,643 1,592 -1,236 0,634 -1,409 0,644

5 -0,333 0,248 -0,075 0,989 1,436 1,363 3,064 2,355 0,41 3,376 0,867 0,356

6 -0,533 -0,898 0,207 1,203 0,867 -0,569 0,181 0,017 0,14 0,237 0,352 -0,448

AUTOVALORES Funcin Autovalor (a) % de varianza 68,2 20,2 6,6 3,1 1,5 0,3 % acumulado Correlacin cannica 0,966 0,898 0,76 0,625 0,492 0,248

14,086 68,2 1 4,183 88,4 2 1,365 95 3 0,642 98,1 4 0,32 99,7 5 0,066 100 6 a Se han empleado las 6 primeras funciones discriminantes cannicas

renciacin respecto a las restantes variedades le ocurre a la Carrasquea por sus niveles medios en la suma PLO + SLL y a la Verdial de Badajoz por sus niveles medios en OLL, OLO y POO. En general, teniendo en cuenta el factor variedad, parece apreciarse dos grandes grupos que no presentan claras diferencias entre s. Por una parte, el formado por las variedades Carrasquea, Cacerea, Corniche y Picual y por otro lado Cornezuelo, Morisca y Verdial de Badajoz. En esta misma tabla se indican las diferencias encontradas entre las medias de los datos calculados de cada triglicrido segn el factor estado de maduracin de la aceituna origen, destacando que los niveles correspondientes a los glicridos PLL, POO y PPO son los que muestran unas claras diferencias significativas entre las tres poblaciones agrupadas como verde, envero y maduro. A continuacin, y tomando como variable de agrupacin variedad, se han seleccionado 273 muestras del total de 315 analizadas para la estimacin de las funciones discriminantes con un anlisis paso a paso utilizando el mismo paquete estadstico SPSS. Base 10.0, que permita diferenciar la procedencia varietal de los aceites analizados. El resto de muestras analizadas (42) y no seleccionadas, pertenecientes a las diferentes variedades en estudio y distintos estados de maduracin, nos

permite validar los resultados con vistas a utilizar la clasificacin en un futuro. Se obtienen as las funciones lineales discriminantes con los coeficientes estandarizados que se muestran en la Tabla IV, en las que se excluyen los triglicridos LLLn, OLL, PLL y PPL. Se indica igualmente los autovalores y la explicacin de la varianza

Figura 2 Representacin de los aceites analizados en el plano de las dos primeras funciones discriminantes cannicas.

Grasas y Aceites

la cual en las dos primeras representa ya el 88,4 %. Dado el mayor nivel absoluto de estos coeficientes, se comprueba que el mayor peso discriminante lo tienen los triglicridos OLO, la suma PLO+SLL y PPP para la primera funcin, mientras que en la segunda son la suma PLO + SLL, OOO, POO, PPO y SOO. Con todo ello, los resultados de las muestras seleccionadas permiten una clasificacin correcta para las variedades Carrasquea (93,9 %), Cacerea (93,5 %), Corniche (97,7 %) y Picual (91,3 %), obteniendose una clasificacin media correcta del 83,5 % para todas las variedades. A partir de las muestras no seleccionadas, se repite una buena clasificacin (100 %) en las variedades Cacerea, Corniche y Picual, encontrando a una clasificacin muy baja para las muestras de la variedad Carrasquea (33,3 %). La clasificacin media correcta para todas las variedades, conseguida en estas muestras no seleccionadas se reduce al 69,0 %. La expresin grfica de este anlisis (Figura 2), permite apreciar como grupos bien diferenciados las variedades Cacerea, Picual, Carrasquea y Corniche, encontrando una agrupacin de las variedades Cornezuelo, Morisca y Verdial de Badajoz, difcil de discriminar. AGRADECIMIENTOS Los autores desean agradecer a AFAVEX y UNEXCA la colaboracin recibida en el marco del Convenio suscrito entre estas entidades y la JUNTA DE EXTREMADURA. Igualmente, desean agradecer a J. Hernandez Carretero y J.M. Garcia Ballestero su valiosa colaboracin en el desarrollo de este trabajo. BIBLIOGRAFA
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Recibido: Septiembre 2001 Aceptado: Mayo 2002