LEUCEMIAS AGUDAS CLASIFICACION, DIAGNOSTICO, TRATAMIENTO Y APORTACION DE LAS NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS

Carolina Martnez Laperche FIR 3 Ao de Anlisis Clnicos

LEUCEMIAS AGUDAS EN LA INFANCIA

NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS

CITOMETRIA DE FLUJO CITOGENETICA BIOLOGIA MOLECULAR

CITOMETRIA DE FLUJO FUNDAMENTOS:

Anlisis celular multparamtrico.

Complejidad(SSC)

Tamao(FSC)

Se analizan dos tipos de parmetros: 1.Caractersticas intrnsecas de la clula: tamao y complejidad de ncleo y citoplasma, mediante dispersin.

2.Caractersticas antignicas de cada clula (inmunofenotipo): Se determina mediante fluorescencia, esta procede de uniones Ag-Ac unido a un fluorescente fluorocromo
antiCD 10

CD 10

IMPORTANCIA DE LA CFM EN LAS LEUCEMIAS

Permite el diagnostico mas completo y una mejor tipificacin de las leucemias. Permite predecir determinadas alteraciones genticas. Identifica marcadores que implican peor pronstico. Identifica fenotipos patolgicos que permiten seguimiento y deteccin de enfermedad mnima residual.

CFM: LEUCEMIA AGUDA

POBLACION MIELOIDE

MONOCITOS

LINFOCITOS BLASTOS

VENTAJAS DE LA CITOMETRA DE FLUJO

Anlisis de mltiples parmetros en una misma clula. Rapidez: 5000 clulas /segundo. Especfico: distingue distintas poblaciones celulares. Cuantifica la intensidad antignica. Sensible ( 1 clula / 10000) y objetivo.

APLICACIONES DE LA CITOMETRA:
1.Deteccin y cuantificacin de Ag celulares:
Estudio de subpoblaciones linfocitarias Inmunofenotipaje de leucemias y linfomas. Inmunodeficiencias. Trasplante: subpoblaciones de linfocitos y recuento de progenitores hematopoyticos (CD34). Inmunofenotipaje de plaquetas. Enfermedades autoinmunes.

2.Cuantificacin de cidos nucleicos.

Cuantificacin del nmero de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV

CD4 T cells

CD8 T cells

CITOGENTICA

Estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas Causadas por una alteracin en el nmero y/o estructura de los cromosomas Tiene inters diagnstico y pronstico

ANALISIS CITOGENETICO
Citogentica convencional: Estudio de alteraciones cromosomicas en las metafases de las clulas tras el cultivo in vitro Se suele teir con Banda G ( Tripsina- Giemsa) Detecta alteraciones en todo el genoma Citogentica molecular : FISH Hibridacin de una sonda de DNA marcada con una sustancia fluorescente sobre la secuencia complementaria del genoma Metafase poca calidad o alteraciones cromosomicas crpticas

CITOGENETICA CONVENCIONAL Y FISH

Citogentica convencional Ventajas Permite anlisis de todo el genoma Tcnicamente sencillo Bajo coste Inconvenientes Cromosomas metafasicos Requiere material fresco Interpretacin personal experimentado FISH Ventajas Permite la localizacin de secuencias especificas Tcnicamente sencillo No necesita material fresco No necesita metafases, puede analizar nucleos en interfase Detecta alteraciones pequeas con cromosomas de mala calidad Inconvenientes Coste Solo aporta informacin de la regin estudiada, no sirve como tcnica de screening

PRINCIPALES ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LAL numricas

50 cromosomas Mas NUMERICAS frecuente Pronostico favorable

estructurales

ESTRUCTURALES

GENES INVOLUCRADOS EN ANOMALIAS CROMOSOMICAS

Pronostico desfavorable Mas frecuente Pronostico desfavorable

LEUCEMIA AGUDAS LINFOBLASTICAS

FAVORABLE HIPERPLOIDIA (>50) t (12;21) y del (12p) en nios HIPERPLOIDIA (47-50) CARIOTIPO NORMAL del (6q) t (1;19) t (8;14), t (2;8), t (8;22) CASI-HAPLOIDE * t (9;22) t (4;11)

INTERMEDIO

DESFAVORABLE

UTILIDAD DE LA CITOGENETICA EN LA
DIAGNOSTICO:
1.

La clasificacion de la OMS(2001) incluye algunas anomalias geneticas

PRONOSTICO:
1.

Asociacion emtre anomalias citogeneticas y grupos pronosticos

TRATAMIENTO:
1.

Algunas anomalas genticas condicionan el tratamiento

LMA con t (15;17) ATRA LAL con t(9;22) GLIVEC

BIOLOGIA MOLECULAR
Tcnicas Aplicabilidad clnica Coste Disponibilidad Uso

SOUTHERN BLOT

+++

BAJO

BAJA

TRASLOCACION

PCR convencional

BAJO

ALTA

Anlisis cualitativos
PCR TIEMPO REAL GRAN AVANCE DIAGNOSTICO DE LEUCEMIAS ++++ INTERME DIO ALTA

TRASLOCACIONES MUTACION PUNTUAL EXPRESION CUANTIFICACION EXPRESION TRASLOCACION MUTACION PUNTUAL NUEVAS MUTACIONES

Anlisis cuantitativos
SECUENCIACION Investigacin

++

ALTO

INTERMEDIA

TRATAMIENTO

CONDUCTA ANTES DE QUIMIOTERAPIA

Tratamientos de soporte: para minimizar efectos txicos inmediatos del tto.
-profilaxis y tratamiento de infecciones. -correccin de desequilibrios metablicos. -prevencin de sndrome de lisis tumoral (SLT) con hiperhidratacion con solucin glucosalina para aumentar la diuresis. -HIPERURICEMIA. -HIPERPOTASEMIA. -HIPERFOSFATEMIA -HIPOCALCEMIA

SLT

-prevencin y tratamiento de la nefropatia urtica con Rasburicasa iv de 3-7 das con suero salino fisiolgico.
Solo excepcionalmente ser necesario hemodilisis.

PRIMEROS TRATAMIENTOS
Antes aos 50: supervivencia 5 meses Aos 50: Mercaptopurina, Ciclofosfamida, corticoides 60-70: Antraciclicos, Asparraginasa, Epipodofilotoxinas 70: Skipper: Poliquimioterapia Se empezaron a aplicar protocolos de quimioterapia 80: Tratamientos cada vez mas individualizados (segn el riesgo) Supervivencia: 70% a los 7 aos

SITUACION ACTUAL
Y el 30%????? Elegir tratamiento estndar o supraintensivo Nuevos tratamientos para las recadas Analizar factores de peor pronostico
Factores que conllevan alto riesgo: 10% No alcanzan RC tras 4-5 semanas de tto >25% blastos en MO +14 < 1 Ao >200000/ul leucocitos Portadores de t (9;22) t (4;11) EMR > 1% en MO despus 5 semanas de tratamiento Uso de tratamientos supraintensivos

PROTOCOLOS DE QUIMIOTERAPIA
DOS PROTOCOLOS: PETHEMA Y SHOP. FASE DE INDUCCION: 3 drogas que intentan conseguir una remisin completa (< 5% blastos en MO).
RC: Recuperacion de la actividad medular con: -Hb > 10 g/dl. -granulocitos > 1.5 x 109/l. -plaquetas > 120 x 109/l. -MO NORMOCELULAR o < 5% blastos. -LCR sin blastos. -EMR< 1 % despus del tratamiento de induccin.

-FASE DE CONSOLIDACION/INTENSIFICACION. -FASE DE MANTENIMIENTO. -QUIMIOTERAPIA INTRATECAL

TRASPLANTE DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS

El TPH alognico en LAL se reserva solo a pacientes de muy alto riesgo que: 1.Da +14 MO :> 10% blastos en el examen citomorfolgico. 2.Da +35 MO :5 % blastos y/o EMR (punto 1)1% clulas de fenotipo leucmico. 3.Despus 1 ciclo tratamiento CI si EMR (punto 2) >0.1%. 4.Despus 2 ciclo tratamiento CI si EMR >0.01%.

Hasta encontrar donante sigue una pauta de tratamiento: REINDUCCION CON INTENSIFICACION MANTENIMIENTO CON REFUERZO.

TRASPLANTE DE CPH
1.Pasos para decidir TCPH:
Seleccin del receptor. Estudio D-R compatibilidad HLA. Tipo de trasplante y fuente de CPH. Rgimen de acondicionamiento Ejecuccin del trasplante . Seguimiento paciente trasplantado.

2.Tipos de trasplante
Alognico: HLA compatible familiar o no. Eliminar hemates y plasma (ABO) y linfocitos T ( EICH). Singnico: donante y receptor gemelos homocigotos. Autlogo o autotrasplante MO.

3.Fuentes de CPH
Medula sea Cordn umbilical Hgado fetal

Sangre perifrica

EN 90% T AUTOLOGOS EN 30% T ALOGENICOS.

Ventajas de SP como fuente de CPH: -Disminuye morbilidad y mortalidad. -Recuperacin hematolgica mas precoz. -Coste econmico menor.

AFERESIS: Recoleccin de CPH

Administracin de frmacos al donante que movilicen precursores a la circulacin (GCSF) 5 das Pre-Afresis: contaje CD34 en SP Afresis: Se usan separadores celulares de flujo continuo por seleccin positiva de CD34+ usando AC monoclonales contra Ag CD34+.

LABORATORIO: CONTAJE CD34 POR CITOMETRIA

Recuento rpido y reproducible de (CD34). Mnimo de clulas CD34+ que garantice repoblacin de MO 2 x 106/Kg clulas CD34: injerto estable. Relacin directa CD34+ infundidas y recuperacin hematolgica postrasplante.

PERSPECTIVAS FUTURAS:
Detectar resistencias celulares a citostticos Caractersticas farmacolgicas de citostticos Disminuir toxicidad de transplantes de progenitores hematopoyticos Disminuir toxicidad de quimioterpicos sin perder eficacia Nuevos tratamientos biolgicos

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

Persistencia de un clon anormal de clulas en niveles bajos, durante o tras finalizar tratamiento de induccin, consolidacin o mantenimiento. Estas clulas residuales deben tener un inmunofenotipo y/o citogentica igual al de las clulas al diagnostico. Esto ha llevado a un cambio en el concepto de remisin completa la cual se realiza en funcin de EMR y no de el numero de blastos en MO. La presencia de EMR postinduccin es uno de los factores pronsticos mas importantes por su asociacin a las recadas.

EMR. TECNICAS
Sensibilidad: 1 - 5/102

Morfologa Citogentica convencional

Sensibilidad: 1/103

FISH

Sensibilidad: 1/104 - 1/105

PCR : Reordenamientos especficos TCR/ IgH (LLA)

CFM

(Citometra de flujo multiparamtrica)

EMR. CITOMETRA DE FLUJO MULTIPARAMTRICA

PASOS: En el momento del diagnstico:

1. Inmunofenotipos Leucmicos (IFL) 2. Disear paneles de seguimiento especficos Durante el seguimiento: 3. Obtencin de muestras adecuadas 4. Aplicacin de los paneles de seguimiento 5. Adquisicin: Live gate

EMR. CFM
Caractersticas de la muestra
Aspirado medular Debe ser representativo de mdula sea aspirado enrgico 1,5 mL de muestra evitar la dilucin con sangre medular Procesar en < 24 horas Evitar prdidas selectivas de clulas

EMR. CMF

Inmunofenotipo leucmico al diagnstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-

EMR .CMF

Post-Induccin: 0,14% de clulas CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2).

Post-Consolidacin: EMR no detectable (histogramas 3 y 4).

Inmunofenotipo leucmico al diagnstico: CD19+CD13+.

EMR. LLA-B MLL+

Normal
CD19-PC5 CD20-PC5 CD20-PC5 CD10-FITC

SSC

CD10-FITC

IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B) EMR: 1,43%

PROTOCOLO LAL-RA
Induccin DIA + 14 TCPH? MO < 10% BLASTOS MO >10% BLASTOS TCPH?

MO >5% Y EMR >1% MO< 5% y EMR <1%

DIA + 35

Consolidacin Intensificacin 1 ciclo No RC O EMR>0,01% C+I 2 Ciclo TCPH? EMR<0,01% EMR>0,01%

RC Y EMR< 0,01%

Consolidacin Intensificacin 2 ciclo Reinduccin Mantenimiento

Estudio EMR 2 objetivos:

1.

Conocer velocidad de destruccin de la masa leucmica, factor pronostico fundamental para cambiar decisiones teraputicas Predecir cualquier recada antes de la aparicin de manifestaciones clnicas

2.

EMR en LLA. Conclusiones

La

persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronstico adverso independiente de otras variables Cantidad de EMR significativa: Post-tratamiento de Induccin: 0,1% Durante el resto del tratamiento: 0,01%

Muy mal pronstico: Pacientes con EMR 1% post-Induccin EMR persistente Muy buen pronstico: EMR- post-Induccin y post-Consolidacin EMR- precozmente (d. 19)

EVOLUCION DE LA EMR

Da + 35.

Da + 1

MUCHAS GRACIAS