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J Fr. Ophtalmol., 2006; 29, 9, 1042-1046 © 2006. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés

COMMUNICATION DE LA SFO

Dosage et cinétique de libération de mitomycine C d’un implant de collagène utilisé comme moyen d’administration lors d’une chirurgie filtrante chez le lapin

E.

Adjadj* (1), S. Roy* (1), C. Zimmermann (2), T. Shaarawy (2), J. Flammer (2), A. Mermoud (1),

J.

Drewe (2)

(1) Hôpital Ophtalmique Jules Gonin, Université de Lausanne, Suisse. (2) University Clinic Basel, Suisse. * Les auteurs ont contribué à part égale à la rédaction de ce travail. Texte ayant fait l’objet d’une présentation au congrès de la SFO 2003 et de l’ARVO 2003. Correspondance : E. Adjadj, Hôpital Ophtalmique Jules Gonin, 15, avenue de France, 1004 Lausanne, Suisse. E-mail : elias_adjadj@yahoo.fr Reçu le 9 novembre 2005. Accepté le 29 juin 2006.

Dosage and kinetics of MMC release of a collagen implant used as a delivery device in glaucoma surgery in the rabbit eye

E. Adjadj, S. Roy, C. Zimmermann, T. Shaarawy, J. Flammer, A. Mermoud, J. Drewe

J. Fr. Ophtalmol., 2006; 29, 9: 1042-1046

1042 Purpose: To determine the absorption and the release of mitomycin-C from a collagen implant and tissue impregnation in the anterior structures of the rabbit eye. Methods: Determining the quantity of mitomycin-C that a collagen implant can absorb with the difference between dry and soaked weight. Mitomycin-C release was measured in vitro using spectrophotometry. The measurement was repeated using a bioassay. Ocular tissue impregna- tion was determined in 12 eyes of six rabbits. Sclera, implant, aqueous, and ciliary body speci- mens were collected for concentration measurement using HPLC from 1 to 6 h after surgery. Results: The mean mitomycin-C quantity absorbed in the implant was 3.22 ± 0.2 μ g. In vitro release was 0.13 mg/ml after 10 min and 0.05 μ g/ml at 6 h. The bioassay showed almost no antifibrotic activity in sclera. In vivo release of mitomycin-C was high from the first to the sixth hour. Conclusion: After filtering surgery, mitomycin-C in the collagen implant is clearly released and ocular tissues are effectively impregnated.

Key-words: Collagen absorbable implants, filtering surgery, glaucoma, antimetabolites.

Dosage et cinétique de libération de mitomycine C d’un implant de collagène utilisé comme moyen d’administration lors d’une chirurgie filtrante chez le lapin

But : Déterminer l’absorption et la libération de mitomycine C d’un implant de collagène ainsi que l’imprégnation tissulaire des structures antérieures de l’œil chez le lapin. Matériels et méthodes : Détermination de la dose de mitomycine C absorbée par un implant de collagène par la différence de masse entre l’implant sec et saturé en solution de mitomy- cine C. La libération de la mitomycine C in vitro a été mesurée par spectrophotométrie à l’aide d’un modèle in vitro du segment antérieur de l’œil. Le dosage de la mitomycine C a été répété par bioassay. L’imprégnation tissulaire oculaire et de l’implant a été déterminée pour 12 yeux de 6 lapins. Des échantillons de sclère, d’humeur aqueuse, de corps ciliaire ainsi que l’implant ont été prélevés pour un dosage par HPLC à 1,3 et 6 heures postopératoires. Résultats : In vitro , la quantité moyenne de mitomycine C absorbée par l’implant était de 3,22 ± 0,2 μ g. La libération in vitro de la mitomycine C était de 0,13 mg/ml après 10 minutes de rinçage à l’eau distillée et 0,05 μ g/ml après 6 heures. La libération de mitomycine C in vivo était importante de la première à la sixième heure. Conclusion : Après chirurgie filtrante, la mitomycine C est clairement libérée par l’implant de collagène et les tissus sont imprégnés avec des doses mesurables et efficaces pour l’inhibition de la fibrose.

Mots-clés : Antimétabolites, implant de collagène, chirurgie filtrante, glaucome.

INTRODUCTION

Différents facteurs influencent les résultats de la chirurgie filtrante du glaucome. Les conditions préopéra- toires, l’existence et la durée d’un trai- tement anti-glaucomateux topique, les éventuels antécédents chirurgicaux, jouent un rôle crucial dans la nature de l’évolution du statut postopératoire [1- 5]. Les résultats postopératoires à long terme sont fortement dépen- dants de l’espace de filtration créé au moment de l’opération. L’une des complications les plus fréquentes de la chirurgie filtrante du glaucome est la fibrose de la bulle de filtration due à des phénomènes cicatriciels. Afin de prévenir une cicatrisation hyper- trophique, plusieurs méthodes peuvent être proposées lors de l’intervention chirurgicale. Un des moyens habituels consiste à appliquer des médicaments antimitotiques comme le 5 fluoro- uracyl (5-FU) ou la mitomycine C (MMC) au niveau du lit scléral, du vo- let scléral superficiel et de l’espace sous-conjonctival et sous-ténonien [1-5]. Cependant, des complications parfois graves ont été décrites après utilisation de ces substances, telles des perforations conjonctivales, des infections de la bulle de filtration, une scléromalacie, une endophtalmie ou un phtysis bulbi [6-11].

Vol. 29, n° 9, 2006

Dosage et cinétique de libération de mitocyne C d’un implant de collagène

Une des difficultés liée à l’utilisation de la MMC est la détermination de la quantité présente sur le site opéra- toire. La dose de MMC délivrée lors du temps opératoire est très variable, la MMC étant administrée au moyen d’un morceau d’éponge imprégnée d’une solution de

MMC de concentration connue peu avant l’application

sur la surface sclérale [12-20]. Il est donc difficile de tirer

des conclusions sur les relations dose-effet. La concen- tration de la solution de MMC ainsi que la durée de son administration dépendent des techniques opératoires ainsi que du risque de fibrose. La quantité, la durée et la méthode de rinçage jouent également un rôle non né- gligeable en éliminant, ou à l’inverse, en permettant aux agents antimitotiques de prolonger leurs actions après leur application sur les tissus oculaires. Afin d’améliorer la qualité du dosage de substances antimitotiques, un nouveau protocole est proposé dans cette étude. Cette méthode permet de contrôler l’ad- ministration de cette substance. L’évaluation de la quantité de MMC absorbée et libérée par un dispositif de drainage communément utilisé dans la chirurgie non pénétrante du glaucome est ainsi facilitée. Le but de cette étude est de déterminer in vitro l’absorption et la libération de la MMC d’un implant de collagène trempé dans une solution de 2,0 mg/ml et d’étudier la concen- tration de cette substance antimitotique dans les fluides et tissus du segment antérieur chez le lapin

MATÉRIEL ET MÉTHODE

Implant de collagène et solution de MMC

Les implants de collagène Aquaflow (Staar ® Surgical

AG, Nidau, Suisse) ont été utilisés pour l’absorption et la libération de l’antimitotique. La MMC Kyowa [2,0 mg] (Roche Pharma AG, Reinach, Suisse) a été préparée,

moins de 4 heures avant le début des expériences, avec

1 ml d’eau distillée, permettant ainsi d’obtenir une so-

lution à 2,0 mg/ml. Les implants ont ensuite été plongés

à température ambiante pendant 15 minutes dans la solution de MMC reconstituée, ceci dans la demi-heure qui précédait leur utilisation.

Quantification de la MMC dans l’implant de collagène

In vitro — Méthode physique

La quantité de MMC absorbée par un implant a été ob-

tenue en calculant la différence entre la masse de l’im-

plant saturé en solution de MMC ( m saturé ) et la masse de l’implant sec ( m sec ).

Afin d’améliorer la précision de la mesure, 10 im-

plants ont été utilisés pour chaque mesure. Les implants

ont été pesés ensemble avant et après imprégnation avec la MMC. Le résultat des pesées a ensuite été divisé par 10 afin d’exprimer la valeur moyenne par implant.

La différence de masse correspond à la quantité de so- lution imbibée dans la structure tridimensionnelle de l’implant. En connaissant la concentration de la solution de MMC ( conc MMC ), la masse de MMC réellement ab- sorbée par les implants a pu être estimée ( m MMCsat ). (m saturé – m sec )* conc MMC = m MMCsat (équation 1) [avec une masse volumique du solvant (eau distillée) de 1 g/ml].

Ex vivo

La quantité de MMC a aussi été dosée selon son effet bactéricide sur une culture microbienne (mesure par bioassay [16]). Afin de mesurer l’activité antibiotique de la MMC, des souches de E. Coli ATCC 25922 cultivées à 37 ° C sur des milieux de culture MAC et Müller Hin- ton (BioMérieux, Genève, Suisse) ont été utilisés. Des disques de papier buvard placés sur les cultures d’ E. Coli 25 922 ont été imprégnés par 15 μ l de solutions de concentration croissante de MMC. En mesurant le dia- mètre des cercles d’inhibition, la masse de MMC a été estimée. Dix implants de collagène et 10 échantillons de 5 × 5 mm de volet scléral superficiel ont été prépa- rés. Après imprégnation, les 20 échantillons ont été pla- cés sur le milieu de culture. La masse de MMC contenue dans l’implant a été estimée d’après l’inhibition de la croissance bactérienne.

Mesure de la libération de la MMC par l’implant de collagène

In vitro

Un modèle de la chambre antérieure de l’œil a été dé- veloppé. Le modèle a été agrandi d’un facteur 10 pour simplifier les mesures et minimiser les pertes. Dix im- plants ont été placés dans une chambre de 250 μ l (en- viron 10 fois le volume de la chambre sclérale créée par l’ablation du volet profond durant la chirurgie du glau- come). Un système de siphon a assuré la constance du volume de liquide dans la chambre. Les implants ont été rincés avec un flux de 20 μ l/min d’eau distillée (10 fois le flux d’humeur aqueuse physiologique) au moyen d’une pompe à seringue SP 200i (WPI, Sarasota, Fl, États-Unis). Cette solution a été récoltée à la sortie du système à 10 et 20 minutes, puis toutes les 20 mi- nutes pendant 6 heures. La concentration de MMC a été mesurée par spectrophotométrie (Smart Spec 3000, Bio-Rad Laboratories, CA, États-Unis).

In vivo — Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

Toutes les procédures chirurgicales ont été effectuées se- lon les protocoles de l’ARVO sur les expérimentations et recherches sur animaux [21]. Des sclérectomies profondes avec implants de collagène imprégnés de MMC ont été effectuées sur 12 yeux de 6 lapins. La technique chirurgi- cale a été décrite précédemment par Mermoud et al. [22]. En résumé, les interventions ont été effectuées sous anes-

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E. Adjadj et coll.

thésie générale avec de la kétamine (Ketalar Parke-Davis,

Warner Lambert AG, Baar, Suisse) et de la xylazine (Ro- pum, Bayer Suisse, Lyssach, Suisse). La conjonctive a été ouverte au limbe. Un volet scléral superficiel de 5 × 5 mm

a ensuite été découpé avec une charnière limbique. Le ca-

nal de drainage a ensuite été exposé. Finalement un im- plant de collagène saturé par une solution de MMC à 2 mg/ml a été suturé dans le lit scléral. À 1, 3 et 6 heures postopératoire, les animaux ont été sacrifiés par injection intraveineuse de thiopental (Pentothal, Abbot AG, Baar,

Suisse) sous anesthésie générale. Les yeux ont été énucléés et le volet scléral, l’implant, un échantillon de corps ciliaire et de l’humeur aqueuse ont été prélevés. Tous les échan-

tillons ont été congelés dans de l’azote liquide pour les

dosages de MMC. Après avoir été décongelés, les échantillons de corps ci- liaire et de sclère ont été pesés avec une balance AT201 (Mettler Toledo, Suisse) et plongé dans 300 μ l de tampon de phosphate (10 mM, pH 7,0). Les spécimens ont été homogénéisés pendant 1 minute (Polytron PT2100, Kine- matika AG, Suisse) et mélangés pendant 10 minutes (Thermomixer 5436, Eppendorf, Allemagne) pour en ex- traire la MMC. Après centrifugation à 13 000 t/min pen-

dant 10 minutes, le surnageant a été filtré (Gyrodisc, 0,2 μ m, Orange Sxientific, Belgique), et 80 μ l de solution ont été injectés dans le système HPLC. L’humeur aqueuse

a été centrifugée à 13 000 t/min pendant 10 minutes, et

80 μ l ont été injectés dans le système d’analyse. Les im-

plants de collagène ont été rincés trois fois pendant 10 mi-

nutes avec 200 μ l d’une solution tampon de phosphate.

80 μ l de chaque solution de rinçage ont été analysés. La

concentration de MMC a été déterminée à l’aide d’une

installation HPLC (LaChrom) équipée d’un détecteur UV mesurant l’absorbance à 365 nm (chromatographe et lo- giciel — D-7000 HPLC system manager — fournis par

Merck Hitachi, Suisse). Pour cette analyse, la phase station-

naire utilisée était de type polarité inverse (Symmetry C8, 3,9 × 150 mm, Waters, Milford, Massachusetts, États- Unis). L’éluant était composé de 85 % (par volume) d’une solution tamponnée de phosphate (10 mM, pH 7,0) et de

15 % d’éthanol. Les analyses ont été effectuées à un débit

fixe d’1 ml/min et à une température constante de 30 ° C.

La calibration externe a été effectuée avec des courbes standards de 5.10 6 g/l, avec une quantification mini- male de 5 ng/ml. La quantité de MMC mesurée dans

les échantillons de corps ciliaire et de sclère a été divisée par la masse du spécimen, donnant ainsi la quantité de

MMC en ng/mg de tissu. La quantité de MMC dans

l’humeur aqueuse a été mesurée directement et expri- mée en ng/ml d’humeur aqueuse. Pour les implants de collagène, la dose cumulative de MMC libérée après la- vage a été déterminée en ng/ml.

Statistiques

Toutes les mesures de détermination de la quantité de

MMC absorbée et libérée par les implants ont été re-

produites trois fois et le résultat a été exprimé sous la

J. Fr. Ophtalmol.

forme de la moyenne des trois valeurs avec la déviation standard (moyenne ± DS).

RÉSULTATS

Quantité de MMC dans l’implant de collagène

Par la méthode physique, la masse moyenne sèche des im- plants de collagène (0,63 ± 0,002 mg) a été déterminée. En moyenne, chaque implant pouvait absorber 3,2 ± 0,2 μ g de MMC. Cette mesure a été confirmée par la quantité de MMC libérée par les implants lors de la mesure de la libération de la MMC (ci-dessous). Après rinçage complet des implants, la dose totale de MMC libérée a été calculée en multipliant l’aire sous la courbe par le flux, donnant un résultat de 3,5 ± 0,2 μ g. Dans le tableau I a été indiquée la quantité de MMC mesurée dans les implants selon les différentes méthodes physiques.

Libération de la MMC par l’implant

La figure 1 montre la quantité de MMC libérée par l’im- plant in vitro . La dose de MMC libérée est évaluée en multipliant l’aire sous la courbe par la durée de l’expé- rience (en intégrant la courbe en fonction du temps). Il apparaît que 90 % de la quantité initiale de MMC a été libérée après 150 minutes. Les résultats de la mesure par bioassay ne sont pas publiés car ils se sont révélés décevants. En effet, la sen- sibilité n’était pas suffisante pour tirer des conclusions valables. Cette expérience a cependant montré des valeurs tendant à confirmer les valeurs obtenues dans les autres expériences. Les résultats des mesures in vivo sont présentés sur la figure 2 .

DISCUSSION

Dans cette expérimentation, nous avons montré qu’un implant de collagène est un moyen d’administration ef- ficace de MMC dans la chirurgie non pénétrante du glaucome. La dose peut être administrée avec une pré- cision acceptable. La dose délivrée avec la concentration choisie dans l’expérience (2 mg/ml) est de 3 μ g. Cette

Tableau I Masse de MMC absorbée par un implant de collagène (deux méthodes).

Masse de l’implant sec

Masse de MMC mesurée par la méthode physique

Masse de MMC mesurée par HPLC

0,63 ± 0,05 mg

3,2 ± 0,1 (μg)

3,5 ± 0,1 (μg)

Vol. 29, n° 9, 2006

Dosage et cinétique de libération de mitocyne C d’un implant de collagène

Concentration (mg/ml) 0,16 0,14 Série1 Série2 0,12 Série3 Série4 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 Temps
Concentration (mg/ml)
0,16
0,14
Série1
Série2
0,12
Série3
Série4
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
Temps (min)
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
1
2

MMC (ng/mg tissu)

160 Humeur aqueuse 140 120 Implant de collagène Sclère 100 Corps ciliaire 80 60 40
160
Humeur aqueuse
140
120
Implant de collagène
Sclère
100
Corps ciliaire
80
60
40
20
Temps (h)
0
1
3
6
Humeur aqueuse
6,74
0
0
Implant de collagène
140,3
14,6
0
Sclère
19,6
1,663
0,53
Corps ciliaire
0,6
0
0

Figure 1 : Expérience in vitro montrant la cinétique de lavage de la MMC dans les implants. Figure 2 : Concentration de MMC après la chirurgie expérimentale dans les tissus biologiques et de l’implant de collagène mesurée par HPLC en équivalent de masse.

dose est comparable aux données déjà publiées [12- 17]. La concentration sclérale mesurée par HPLC après 10 minutes est aussi comparable aux mesures publiées par Georgopoulos et al. [14]. La cinétique de la libéra- tion de la MMC montrait in vitro un pic à environ 10 mi- nutes (fig. 1) . La concentration à ce moment était légè- rement inférieure à celles utilisées lors des chirurgies « traditionnelles » avec application de MMC au moyen d’une éponge. La majorité de la dose était administrée après 60 minutes. Par la suite, la pente de la courbe diminue exponentiellement pour atteindre la limite de sensibilité après six heures. L’expérience in vivo montre des résultats similaires à l’expérience in vitro (fig. 2) . La concentration de MMC maximum était atteinte dans les tissus à 1 heure postopératoire. Les quantités de MMC mesurées dans l’humeur aqueuse et dans le corps ci- liaire étaient quasi nulles. La nature non pénétrante de la chirurgie et le flux centrifuge d’humeur aqueuse ex- pliquent cette observation. Cependant, des expérimen- tations ultérieures devront démontrer l’innocuité de cette technique ainsi que confirmer l’absence de pas- sage de MMC dans le compartiment intraoculaire. Dans la partie in vivo de cette étude, nous n’avons pas observé d’effets indésirables dans la phase post- opératoire immédiate. Chez les deux lapins avec le suivi postopératoire le plus long (6 heures), aucun signe majeur d’irritation ou de lésion oculaire n’a pu être constaté. Durant ces expériences, nous n’avons pas observé de concentrations de MMC supérieures aux concentrations des solutions de MMC couramment em- ployées en clinique pour imprégner les éponges. On peut donc supposer que l’on n’atteint jamais des concen- trations toxiques de MMC. La dose totale contenue dans l’implant est inférieure aux doses contenues dans une éponge. Bien que la dose totale de MMC délivrée par l’implant soit inférieure à la dose délivrée par les éponges employées habituellement, elle reste intégra- lement sur le site opératoire puisqu’il n’y a pas de rin- çage. De plus, la MMC y persiste pendant environ six

heures (fig. 2) . Ceci soulève le problème du temps de transit dans le site opératoire. Lors des chirurgies avec administration de MMC, on laisse l’éponge en contact avec le lit scléral entre 30 et 300 secondes. On peut comparer ces temps importants avec ceux des procédures de « sauvetage » d’une bulle de filtration fibrosée avec injection de MMC dans la bulle [5, 22-24]. Dans ces procédures, la concentration de la solution peut s’élever jusqu’à 0,5 mg/ml comme chez Shetty et al. [25], et le temps de contact entre les tissus et la MMC est aussi prolongé. Les limitations de cette étude sont de plusieurs natures. La première est liée à la précision des mesures de masse des implants. Nous avons tenté de contenir cette limi- tation en utilisant 10 implants pour ces mesures. Mal- gré cette limite de précision, nous pensons que les valeurs relevées sont significatives et correspondent à un effet détectable. La comparaison avec la mesure après lavage est relativement bien corrélée, la diffé- rence entre les deux méthodes étant inférieure à 10 %. Le petit nombre de lapins opérés et la faible durée de l’observation postopératoire ne permettent pas de tirer de conclusions définitives quant aux conséquences à long terme d’une application peropératoire d’agents antimitotiques. Des études à plus large échelle sont donc nécessaires afin de répondre à ces questions.

CONCLUSION

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Cette expérience a permis de déterminer par des mé- thodes physiques et biologiques la quantité de MMC absorbée et délivrée par un implant cylindrique de col- lagène. En utilisant une concentration 10 fois supé- rieure à celle utilisée dans la chirurgie du glaucome avec une éponge, la quantité délivrée dans un œil de lapin est comparable à la technique de l’éponge. La MMC est principalement libérée dans la première heure pos-

E. Adjadj et coll.

topératoire, la MMC n’étant plus détectable après 6 heures. Cette expérience démontre que les implants de collagène sont des dispositifs envisageables pour dé- livrer de la MMC dans l’espace scléral de filtration lors de la chirurgie du glaucome avec antimétabolites.

Remerciements : Nous voudrions remercier l’équipe du Laboratoire Polyanalytic (Lausanne, Suisse) pour leur précieuse contribution lors des manipulations bactério- logiques. Ce travail a été financé par le fond n ° 3200-0604103 du Fond National Suisse pour la Recherche.

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