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Procedimento Operacional Padro DOSAGEM DA FOSFATASE ALCALINA

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FOSFATASE ALCALINA
FUNDAMENTO A fosfatase alcalina do soro hidrolisa o substrato de timolftalena monofosfato, liberando timolftalena e fosfato inorgnico. Pela adio de lcali, a ao enzimtica inibida e a timolftalena adquire cor azul, cuja absorbncia medida fotometricamente. A cor do produto final da reao resultante da mistura de cor azul e a cor prpria do substrato. APLICAO CLNICA A dosagem da Fosfatase Alcalina no soro empregada principalmente para avaliar doenas hepticas (hepatites, cirrose, cncer, ictercias obstrutivas) e doenas sseas. AMOSTRA Preparo do Paciente Colher sangue pela manh aps jejum de 8 horas, salvo orientaes mdicas. Amostras utilizadas Soro ou Plasma (heparina). Estabilidade e armazenamento da amostra O analito estvel por 7 dias entre 2-8C. Volume ideal utilizado para anlise (Definir o volume ideal a ser encaminhado para anlise). Volume mnimo utilizado para anlise (Definir o volume mnimo a ser encaminhado para anlise). Critrios para rejeio da amostra Fazer referncia ao manual ou POP de coleta, separao e distribuio de material. REAGENTE UTILIZADO FOSFATASE ALCALINA GOLD ANALISA DIAGNSTICA LTDA CNPJ 03.142.794/0001-16 Av. Nossa Senhora de Ftima, 2363 Belo Horizonte MG Brasil Farmacutica Responsvel: Ludmilla Parreiras Campos CRF-MG 5463 Componentes do kit Conservar em temperatura ambiente (15-25C). 1- Padro - Contm timolftalena equivalente a 45 U/L. 2- Substrato - Contm timolftalena monofosfato de magnsio 22 mmol/L. No refrigerar. 3- Tampo - Contm tampo 300 mmol/L pH 10,1. 4- Reagente de Cor - Contm hidrxido de sdio 250 mmol/L e carbonato de sdio 94 mmol/L. Notas 1- O Substrato (2) poder apresentar turvao ou precipitado, fato que no interfere na sua eficcia. Agitar antes de usar. 2- Manter os frascos do Padro (1) e do substrato (2) bem vedados para evitar a evaporao dos solventes. 3- O Tampo (3) deve ser mantido aberto o menor tempo possvel, para no ser contaminado com CO2 atmosfrico. No soprar dentro do frasco para evitar alterao do pH da soluo pela introduo de CO2. CAT. 340 MS 80022230142

Estabilidade Os reagentes so estveis at o vencimento da data de validade impressa no rtulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminao durante o uso.

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Precaues e Cuidados Especiais Aplicar os cuidados habituais de segurana na manipulao dos reagentes e amostra biolgica. Recomendamos o uso das Boas Prticas de Laboratrios Clnicos para a execuo do teste. 3- De acordo com as instrues de biossegurana, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes. 4- O Reagente de Cor (4) corrosivo. Contato com os olhos, pele ou mucosas devem ser evitados. No aspirar ou ingerir. 5- Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resolues normativas locais, estaduais e federais de preservao do meio ambiente. EQUIPAMENTOS Procedimento Tcnico Manual Espectrofotmetro (leitura em 590 nm); Banho Maria ou termostatizador na temperatura constante de 37C; Pipetas e tubos; Cronmetro. Procedimento Tcnico Automatizado Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referncia ao manual ou POP para utilizao do mesmo. Procedimento Tcnico Alternativo Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medio dos ensaios. Indicar as possveis diferenas quando os procedimentos manuais substiturem os procedimentos automatizados. Procedimento em Analisadores Automticos Mencionar o manual ou POP para utilizao do equipamento analtico. Anexar o guia de aplicao dos reagentes para o sistema automtico. Influncias Pr-Analticas Glicose e glicerol aumentam a atividade da enzima, atuando como aceptores de fosfatos. Citrato, oxalato, EDTA e fluoreto inibem a atividade da Fosfatase alcalina por formarem complexos com o magnsio, que um importante ativador da enzima. Interferncias A bilirrubina at 38 mg/dL ( triglicrides at 250 mg/dL) e hemlise (hemoglobina at 30 mg/dL) no produzem interferncias significativas. Hemlises mais acentuadas produzem resultados falsamente diminudos. Valores de triglicrides acima de 250 mg/dL produzem resultados falsamente elevados por interferncia fotomtrica. Nestes casos, empregar um Branco de Amostra. Branco de Amostra Misturar 50 L da amostra com 2,5 mL de soluo de NaCL 150 mmol/L (0,85%). Medir a absorbncia em 590 nm, acertando o Zero com gua deionizada/ destilada. Subtrair a absorbncia assim obtida da absorbncia do teste e calcular atividade enzimtica. PROCEDIMENTO Procedimento Tcnico Manual A- Condies de Reao Leitura: Comprimento de onda 590 nm Medida: Contra o Branco da reao Tipo de reao: Cintica de tempo fixo B- Dosagem no Soro ou Plasma 1-Identificar trs tubos de ensaio Branco, Teste e Padro e proceder: Tubos Branco Padro Teste Substrato (2) 50 L 50 L 50 L

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Tampo (3) 500 L 500 L 500 L Padro (1) -------------50 L 2-Homogeneizar e incubar os tubos em banho-maria a 37C por 2 minutos. O nvel da gua do banho-maria deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos. No retirar os tubos do banho- maria para adicionar a amostra. Soro ---------------50 L 3-Homogeneizar e Incubar a 37C por 10 minutos (CRONOMETRAR) Reagente de Cor (4) 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 4-Homogeneizar e fazer as leituras fotomtricas em 590nm ou em filtro laranja (580 a 590nm), acertando o zero com o Branco. A cor estvel por 120 minutos. CLCULOS Ver Linearidade. AT = Absorbncia do Teste AP = Absorbncia do Padro CP = Concentrao do Padro = 45 U/L Como a metodologia obedece a Lei de Lambert-Beer, fazer os clculos atravs do Fator de Calibrao. FC = CP AP CT = FC x AT Exemplo AP = 0,372 AT = 0,420 CP = 45U/L FC = CP AP = 45 0,372 = 121 CT = FC AT = 121 0,420 = 50, 8 = 51U/L RESULTADOS Unidade de Medida U/L Definio de Unidade: Uma unidade igual a quantidade de enzima que libera por hidrlise 1 micromol de timolftalena por minuto, por litro de soro nas condies do teste. Ateno O analista sempre deve fazer uma verificao da necessidade de ajuste do volume para o fotmetro empregado no seu laboratrio. Os volumes de amostra e de reagente podem ser modificados proporcionalmente, sem alterar o desempenho do teste e os clculos. Em caso de reduo dos volumes necessrio observar o volume mnimo de leitura fotomtrica. CONTROLE DA QUALIDADE Materiais Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e nmero de catlogo. Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados. Controle Interno Descrever a calibrao peridica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits. Citar a utilizao de soros controles (nvel normal cdigo --------- e patolgico cdigo -------) nas anlises realizadas juntamente com a freqncia da utilizao dos mesmos. Descrever o procedimento de verificao de novos lotes de controles e reagentes. Citar POP para controle interno. Controle Externo Descrever os procedimentos utilizados nas avaliaes de qualidade feitas por programas de comparao entre laboratrios ou outros controles de qualidade : PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo Definir como os dados de controle so arquivados e gerenciados. Fazer referncia ao manual ou POP de garantia da qualidade.

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VALORES DE REFERNCIA (37C) Os valores de referncia variam em funo da idade. Soro ou Plasma 1-Adultos: 13 a 43 U/L 2-Crianas at 12 anos: 56 a 156 U/L. Estes valores devem ser usados como uma orientao. recomendado que cada laboratrio estabelea seus prprios valores de referncia. SIGNIFICADO CLNICO A fosfatase alcalina compreende um grupo de enzimas fosfohidrolases que apresentam atividade mxima em pH alcalino, prximo de 10. A enzima encontrada em vrios tecidos, com maiores concentraes no fgado, no epitlio do trato biliar e no osso. A mucosa intestinal e a placenta contm tambm a fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina apresenta vrias isoenzimas, sendo que cada uma das fontes produtoras contm uma isoenzima especfica. O fracionamento das isoenzimas da ALP til para diferenciar doenas sseas de doenas hepticas. As isoenzimas so melhor estudadas pelo teste de estabilidade ao calor e pelo fracionamento eletrofortico. A isoenzima de origem heptica (ALP1) termo-estvel, enquanto que frao ssea (ALP2) inativada pelo calor. A determinao laboratorial da fosfatase alcalina (ALP) se aplica muito bem para o diagnstico de doenas do fgado e dos ossos. Valores elevados: Cirrose, obstruo biliar intra e extra-heptica, tumor primrio ou metasttico do fgado, tumor metasttico do osso, recuperao de fraturas sseas, doena de Paget, hiperparatireoidismo, fases de crescimento normal dos ossos. Valores Diminudos: Hipotireoidismo, hipofosfatemia, desnutrio, doena celaca. LINEARIDADE A reao linear at 500 U/L com cintica de ordem zero. Para valores de absorbncia acima de 2,0 proceder da seguinte maneira: a) Diluir o contedo dos tubos Teste e o Branco com o Reagente de Cor (4), b) Efetuar nova leitura fotomtrica, c) Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluio empregado. Se o valor for ainda maior que 500 U/L: Repetir o ensaio reduzindo o tempo de incubao aps a adio da amostra para 2 minutos. Multiplicar o valor obtido por 5. SENSIBILIDADE ANALTICA O limite de deteco igual a 0,125 U/L, equivalente a uma absorbncia de 0,001 utilizando a absorbncia do Padro como parmetro. LIMITAES DO MTODO Os resultados devero ser usados em conjunto com informaes disponveis da avaliao clnica e outros procedimentos diagnsticos. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1- Amador, E.: J.A.M.A., 185, 431, 1970. 2- Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook Clinical Chemistry. Philadelphia: W.B. Saunders Co. 1994;830-839. 3- Coleman C.M, Stroje RC. Clin Chim Acta 1966;13:401. 4- Kaplan A, Szabo LL, Opheim KE. Clinical Chemistry: Interpretation and Techiniques. Philadelphia: Lea & Febiger 1988:190-191. 5- King EJ. J Path Bact. 1943;55:31. 6- Lopes HJJ. Enzimas no Laboratrio Clnico-Aplicaes Diagnsticas. BH, Analisa Diagnstica, 2000. 7- Roy AV. Clin Chem 1970;16:431. 8- FOSFATASE ALCALINA, Instrues de Uso, Gold Analisa Diagnstica.

a) b) c)

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Nmero Cpias

Destino