FACTIBILIDAD TCNICA PARA LA REPRODUCCIN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATGENOS PARA EL CONTROL DEL PSLIDO ASITICO EN LA HUASTECA

HIDALGUENSE.

MEMORIA PRESENTADA COMO REQUISTO PARA OBTENER EL TTULO DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGA

AUTOR: AARN CRUZ HERNNDEZ ASESOR ACADMICO: ING. CUAUHTMOC HERNNDEZ CUELLAR ASESOR INDUSTRIAL: ING. EDI ARROYO CRUZ

HUEJUTLA, HGO

ABRIL DEL 2012

FACTIBILIDAD TCNICA PARA LA REPRODUCCIN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATGENOS PARA EL CONTROL DEL PSLIDO ASITICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.

Memoria presentada Por AARN CRUZ HERNNDEZ

Ante la Universidad Tecnolgica de la Huasteca Hidalguense como requisito parcial para optar al ttulo de

INGENIERO EN BIOTECNOLOGA Abril de 2012

DATOS GENERALES DE LA EMPRESA

EMPRESA CESAVEH (COMISIN ESTATAL DE SANIDAD VEGETAL DEL ESTADO DE HIDALGO)

SECTOR PBLICO

DIRECCIN CARRETERA HUEJUTLA-CHALAHUIYAPA, Km. 3.5 BARRIO TEPOXTEQUITO

PROYECTO FACTIBILIDAD TCNICA PARA LA REPRODUCCIN MASIVA DE CUATRO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATGENOS PARA EL CONTROL DEL PSLIDO ASITICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE.

ASESOR INDUSTRIAL ING. EDI ARROYO CRUZ

CARGO DEL ASESOR COORDINADOR DE CAMPAA

iv DEDICATORIAS

A mi angelito hermoso:

A veces llega un momento en la vida en que las cosas parecen ya no tener sentido, que todo el mundo se viene abajo y las personas impiden que seas feliz. En esos momentos no existe mayor preocupacin que la nada, y la importancia hacia la vida desaparece. No puedo expresar el dolor, impotencia y rabia que me causa ver que cosas pasen delante de mis ojos, sin poder hacer nada. T le diste una esperanza a mi vida, un haz de luz a la penumbra en mi alma y me diste motivos para seguir viviendo cada da con felicidad.

Ests siempre conmigo; en mi alma, en mi mente y en mi corazn. Te amo.

A mi princesa:

Es curioso como el destino une a las personas.

Ese da estabas radiante. El mirarte ah sentada inund mi corazn de felicidad y mi estmago de nauseas; los rayos de sol penetraban el follaje de un rbol y hacan resplandecer tus ojos -cafs, profundos y llenos de vida-. Me enamor, como solo un loco puede hacerlo y supe que sera por toda la eternidad.

T me diste la fuerza que necesitaba para seguir adelante; cuando estaba agonizante en m soledad, me diste el regalo ms hermoso que jams habra recibido, me diste tu amor incondicional. Solo en ese momento me di cuenta que vivir vala la pena, si era por ti. Rub Snchez Palacios. En un beso, sabrs todo lo que he callado. Pablo Neruda (1904-1973) Poeta chileno.

v AGRADECIMIENTOS Agradezco infinitamente a esa gran mujer que en cada accin derramaba un rio de amor incondicional, que con sacrificios, fuerza y determinacin me dio las armas para seguir adelante, a la mujer que estuvo all desde que nac, que cuando estoy feliz re, y cuando estoy triste llora. A esa mujer de voluntad inquebrantable. A esa mujer de coraje y valor. Gracias por todo tu amor. Lilia Hernndez Ramrez.

Gracias padre mo, de ti aprend a enfrentar la vida y sobreponerme a las dificultades que se presentan en la vida, me educaste como solo los hombres formidables pueden hacerlo, la disciplina y trabajo que en mi inculcaste son un regalo maravilloso. Gracias por tu amor, trabajador incansable. Arnulfo Cruz Alvarado.

Hermana, eres muy importante para m. Somos la misma carne y sangre. Cuando sufres sufro. Infinitamente gracias por estar conmigo en todo momento, eres mi pilar y mi fuerza. Te amo hermana. Gracias por tu amor incondicional. Liliana Cruz Hernndez.

A mis amigos. Aunque no se los dije antes; los quiero mucho.

A mi familia. Gracias por todo.

A todos mis profesores que en el deber de su trabajo se comprometieron de todo corazn conmigo e hicieron posible un logro ms en mi vida. Gracias.

A la Universidad Tecnolgica de la Huasteca Hidalguense. Gracias.

Expreso mi gratitud al Comit Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Hidalgo, en especial al Ing. Edi Arroyo Cruz y al Ing. Moiss Alvarado Martnez, por su amistad y apoyo. A todas las personas que conoc ah, gracias.

vi NDICE INDICE DE CONTENIDO Pgina DEDICATORIAS............................................................................................iv AGRADECIMIENTOS...............................................................................................v INDICE DE CONTENIDO.........................................................................................vi INDICE DE FIGURAS..............................................................................................ix INDICE DE TABLAS....x INDICE DE GRAFICAS..xi RESUMEN...xii ABSTRACT.xiii I. INTRODUCCION...............................................................................................1 II. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA...2 2.1.1 Datos generales de la empresa.................2 2.1.2 Descripcin de la empresa..3 III. PLANTEAMIENTO DE LA PROBLEMTICA...4 3.1Justificacin....4 3.2 Objetivos.5 3.2.1 Objetivo general.5 3.2.2 Objetivos especficos.5 3.3 Metas...5 3.4 Duracin del proyecto...5 IV. FUNDAMENTOS TERICOS.....6 4.1 Huanglongbing (citrus greening)......6 4.1.1 Antecedentes..6 4.1.2 Definicin.....6 4.1.3 Formas de transmisin del HLB...7 4.1.4 Vectores que trasmiten la enfermedad...7

vii

4.2 Vectores del HLB...8 4.2.1 Pslidos que trasmiten la enfermedad........................................8 4.2.2 Diaphorina citri.......8 4.2.3 Caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de Diaphorina citri..9 4.3 Hongos entomopatgenos....11 4.3.1 Generalidades..11 4.3.2 Clasificacin de los hongos entomopatgenos...13 4.3.3 Mecanismo de infeccin de los hongos entomopatgenos..13 4.3.3.1 Adhesin y germinacin de la espora en la cutcula del insecto..14 4.3.3.2. Penetracin dentro del hemocele..15 4.3.3.3. Desarrollo del hongo que resulta en la muerte del insecto..15 4.4 Medio de cultivo...17 4.4.1 Definicin..17 4.4.2 SABORAU.18 V. HIPTESIS19 VI. DESARROLLO DEL PROYECTO20 6.1 Metodologa..20 6.2 Desarrollo.21 6.2.1 Desarrollo del experimento.21 6.2.1.1 Materiales utilizados.21 6.2.1.2 Seleccin de cepas...22 6.2.1.3 Lavado de cristalera y esterilizacin de reas materiales22 6.2.1.4 Preparacin del medio de cultivo...23 6.2.1.5 Vaciado en cajas Petri.....24 6.2.1.6 Siembra..24 6.2.1.7 Incubacin..26

viii

6.2.2 Desarrollo del proceso de produccin masiva..........................29 6.2.2.1 Materiales...29 6.2.2.2 Desinfecciones de cristalera y limpieza de las reas de produccin...30 6.2.2.3 Preparacin de la solucin..30 6.2.2.4 Lavado de arroz.31 6.2.2.5 Embolsado de arroz..32 6.2.2.6 Esterilizacin..32 6.2.2.7 Inoculacin.33 6.2.2.8 Crecimiento34 6.2.2.9 Deshumificacin34 6.2.2.10 Cosecha....................................................................35 6.2.3 Determinacion de concentracion de esporas libres36 6.2.3.1 Materiales...36 6.2.3.2 Desarrollo...36 VII. RESULTADOS....44 7.1 Interpretacin de resultados..44 VIII. CONCLUSIONES.50 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.51 X. ANEXOS52

ix

INDICE DE FIGURAS Figura A.9 Figura B...11 Figura C..14

Figura 1 Pesando los ingredientes para el medio de cultivo..53

Figura 2 Preparacin del medio de cultivo....53 Figura 3 Esterilizacin de materiales y medio de cultivo 54

Figura 4 Vaciado del medio de cultivo en cajas Petri..54 Figura 5 Cajas Petri con cinco das de inoculadas..55

Figura 6 Cajas Petri con quince das de inoculadas...55

Figura 7 Siembra...56 Figura 8 Conteo de colonias...56

Figura 9 Laboratorio.57 Figura 10 rea de crecimiento de la produccin masiva ..57

x INDICE DE TABLAS

Tabla 1.1.26 Tabla 1.2.27 Tabla 1.3.27 Tabla 1.4.27 Tabla 1.5.28 Tabla 2.1.37 Tabla 2.2.37 Tabla 2.3.38 Tabla 2.4.38 Tabla 2.5.38

xi INDICE DE GRAFICAS

Graficas A45 Graficas B46 Graficas C...47 Graficas D...48 Graficas E49

xii RESUMEN FACTIBILIDAD TCNICA PARA LA REPRODUCCIN MASIVA DE CINCO CEPAS DE HONGOS ENTOMOPATGENOS PARA EL CONTROL DEL PSLIDO ASITICO EN LA HUASTECA HIDALGUENSE. ABRIL 2012 AARN CRUZ HERNNDEZ INGENIERO EN BIOTECNOLOGA UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE ASESOR ACADMICO: ING. CUAUHTMOC HERNNDEZ CUELLAR ASESOR INDUSTRIAL: ING. EDI ARROYO CRUZ El presente proyecto de investigacin se llev a cabo en el laboratorio Bio-Huas, perteneciente al Comit Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Hidalgo (CESAVEH), con el objetivo de evaluar el factor crecimiento de cinco diferentes cepas de hongos entomopatgenos conservados en el propio laboratorio como referencia para la determinacin de la factibilidad de inocular dichos hongos a nivel masivo. Las cepas evaluadas en la siguiente fueron: Beauveria bassiana, por excelencia de los hongos entomopatgenos mayormente utilizados en la regin por su fcil reproduccin y abundante esporulacin, esta cepa presenta una coloracin blanca a la hora de esporular; la cepa del hongo Metarhizium anisopliae (Ma59), al igual que la anterior una de las cepas mayormente utilizadas en la regin, que fue adquirida del laboratorio de Sanidad Vegetal del Estado de Puebla y presenta un color verde soldado en su etapa de esporulacin; las cepas de Isaria fumosorosea en sus variedades Pf14, Pf16 y Pf20, la diferencia entre cada cepa pudiese ser la procedencia de la cepa, insecto de la que fue aislada, humedad e incluso la hora en que fue colectada de campo, estas cepas presentan en la esporulacin un color blanco amarillento. El experimento se realiz con el fin de determinar que cepa creca mas rpidamente para utilizarla como inoculo ideal en la produccin masiva y comercializacin. Para ello se utilizaron cinco repeticiones de sembrado por cada cepa en cajas Petri con medio de cultivo SABOURAUD y con las mismas condiciones de humedad, temperatura, asepsia y condiciones terciarias.

Palabras clave: Hongos entomopatgenos, cepas, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, SABORAUD

Beauveria

bassiana,

xiii ABSTRACT TECHNICAL FEASIBILITY FOR MASS REPRODUCTION OF FIVE STRAINS OF FUNGI ENTOMOPATHOGENIC CONTROL OF THE ASIAN PSYLLID IN THE HUASTECA HIDALGUENSE. APRIL 2012 AARON CRUZ HERNNDEZ ENGINEER IN BIOTECHNOLOGY TECHNOLOGICAL UNIVERSITY OF THE HUASTECA HIDALGUENSE ACADEMIC ADVISOR: ING. CUAUHTMOC HERNANDEZ CUELLAR INDUSTRIAL ADVISOR: ING. EDI ARROYO CRUZ This research project was conducted in the laboratory Bio-Huas, belonging to the State Plant Health Committee of the State of Hidalgo (CESAVEH) in order to evaluate the growth factor of five different strains of entomopathogenic fungi preserved in their own laboratory for determining the feasibility of such fungi inoculated on a massive scale. The strains were evaluated as follows: Beauveria bassiana, for excellence of entomopathogenic fungi mostly used in the region for easy playback and abundant sporulation, this strain appears white when sporulate, the strain of the fungus Metarhizium anisopliae (Ma59 ), like the previous one strain mostly used in the region, which was acquired from the laboratory of Plant Protection of the State of Puebla and is green soldier in his stage of sporulation, strains of Isaria fumosorosea varieties in Pf14 , and PF20 Pf16, the difference between each strain could be the origin of the strain, that bug was isolated, humidity and even the time it was collected in the field, these strains present in the yellowish-white sporulation. The experiment was conducted to determine which strain grew more rapidly for use as inoculum ideal for mass production and marketing. This was accomplished by five repetitions of each strain seeded in Petri dishes with SABOURAUD medium with the same conditions of humidity, temperature, aseptic and tertiary conditions.

Keywords: Entomopathogenic fungi, strains, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, SABOURAUD

1 I. INTRODUCCIN

El uso excesivo de plaguicidas provoca efectos negativos en el suelo, el agua y el ambiente. Adems ha contribuido a aumentar los problemas de plagas debido al desarrollo de resistencia y a la destruccin de los enemigos naturales. Muchos plaguicidas tambin afectan la salud de las personas. Para reducir estos efectos se procura la implementacin de sistemas agrcolas sostenibles, basados en el conocimiento de las relaciones entre los cultivos, el ambiente y los organismos presentes en el campo. Una de las alternativas es el uso de organismos entomopatgenos, los cuales tienen la capacidad de reducir las poblaciones de plagas. Existen varios tipos de organismos entomopatgenos, tales como virus, hongos, bacterias y nematodos. Actualmente, se han identificado y estudiado diversas especies de hongos que afectan plagas de cultivos de importancia econmica; muchos de ellos son utilizados exitosamente en programas de control biolgico. Algunos de estos entomopatgenos son reproducidos masivamente y se venden comercialmente.

Estos hongos se encuentran en la naturaleza, en rastrojos de cultivos, estircol, en el suelo, las plantas, etc. Logran un buen desarrollo en lugares

frescos, hmedos y con poco sol. Los hongos entomopatgenos constituyen el grupo de mayor importancia en el control biolgico de insectos plagas. Prcticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos hongos. Se conocen aproximadamente 100 gneros y 700 especies de hongos entomopatgenos. Entre los ms importantes estn: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium. De ah la importancia para el desarrollo del siguiente proyecto basado en un anlisis de factibilidad para determinar la cepa que mejor se desarrollo para nuestro fin.

2 II. ANTECEDENTES DE LA EMPRESA 2.1.1 DATOS GENERALES DE LA EMPRESA

El Comit Estatal de Sanidad Vegetal

(CESAVEH) es un organismo

auxiliar de la Secretaria de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin (SAGARPA) conformada por una Asociacin de productores de Ctricos para el desarrollo e implementacin de medidas fitosanitarias en la regin Huasteca del Estado de Hidalgo que atiende los municipios de Orizatln, Jaltocn, Huejutla, Atlapexco, Huautla, Yahualica, Chapulhuacn y Pisaflores.

El Comit Estatal de Sanidad Vegetal en Coordinacin con el Gobierno del Estado y la SAGARPA activan el programa emergente contra la langosta Schistocerca piceifrons piceifrons (walker), para el control de la misma

llevndose a cabo acciones de exploracin, muestreos y control qumico.

La campaa contra la broca del caf, se inici en el estado de Hidalgo en julio de 1995, una vez que se localiz la plaga en la localidad de San Antonio el Grande, municipio de Huehuetla, Hgo, y se confirm por la Direccin General de Sanidad Vegetal que se trataba de Hypothenemus hampei (Ferr.).

A partir de este ao, se han realizado muestreos, capacitacin, divulgacin, control qumico y control biolgico en las zonas afectadas, as como actividades de prevencin en las zonas libres del Estado.

Esta junta se establece el 11 de mayo de 1997 con la finalidad de controlar las poblaciones de moscas de la fruta nativas, las cuales causan grandes prdidas en la produccin de ctricos en la regin.

2.1.2 DESCRIPCIN DE LA EMPRESA. Mision: Prestar servicios a los productores y coadyuvar con las autoridades en la prevencin, control y erradicacin de plagas para mejorar la produccin y productividad agrcola a travs del cumplimiento de los programas de trabajo fitosanitarios. Filosofa: Trabajar para el beneficio de los productores, as como tambin mejorar la calidad fitosanitaria de los productos agrcolas de la regin. Visin: Alcanzar la sanidad, calidad e inocuidad, cumpliendo con las normas que les permitan a los agricultores comercializar sus productos en el mercado nacional e internacional. Valores: tica profesional Respeto Humildad Lealtad Honestidad Bien comn

Objetivos: Prevenir, controlar y/o erradicar plagas y enfermedades que atacan a los cultivos de la regin, las cuales ocasionan prdidas econmicas a los productores.

4 III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

3.1JUSTIFICACIN

La regin de la Huasteca Hidalguense tiene como fuente importante de ingresos la venta de productos agrcolas, uno de estos casos es la comercializacin de ctricos a nivel local y regional; siendo la naranja y la mandarina los cultivos ms demandados.

En fechas recientes, el cultivo de estos, est siendo amenazado por una enfermedad por el momento incurable conocida como HLB (Huanglongbing) que es causada por la bacteria Candidatus liberibacter spp., sta enfermedad produce la muerte exponencial de las plantas de ctricos y acaba con el cultivo total en pocos aos, dando origen a una gran prdida econmica para los productores.

Por tal motivo el CESAVEH; junto con diferentes organizaciones pblicas y privadas, toma medidas relacionadas con la inocuidad de los ctricos, ya que el HLB es prioridad por su devastador modo de infeccin; y a sapiencia de la no cura de la enfermedad, se opta por el control quimico y biolgico del principal insecto vector (Diaphorina citri o pslido asitico).

El control del insecto antes mencionado se realiza de manera qumica, con insecticidas selectivos comerciales; y biolgica, que engloba la parasitacin del pslido con hongos entomopatgenos y con el insecto parasitoide Tamarixia radiata.

El presente proyecto opta por el mtodo de control biolgico con hongos entomopatgenos; que se reproducirn masivamente en laboratorio y los cuales darn significado al siguiente proyecto.

5 3.2 OBJETIVOS

3.2.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la metodologa y condiciones necesarias para el aislamiento y reproduccin masiva de las cepas de los hongos entomopatgenos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae (Ma59) y de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20)

3.2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

-Determinar la metodologa que conduzca a los mejores resultados de acuerdo a la respuesta de crecimiento de las cepas de hongos. -Determinar que cepa de hongo resulta mas viable reproducir masivamente para su aplicacin en campo. -Determinar que cepa tiene mayor capacidad de multiplicacin y agresividad parasitaria.

3.3 METAS

Identificar la especie ms fcilmente reproducible a nivel laboratorio y demostrar que cepa es ms factible reproducir masivamente mediante previas pruebas.

3.4 DURACIN DEL PROYECTO

El desarrollo del siguiente proyecto tiene una duracin aproximada de cuatro meses, que van del 09 de enero al 30 de abril de 2012 del periodo de estada.

IV. FUNDAMENTOS TERICOS 4.1 HUANGLONGBING (Citrus greening)

4.1.1 ANTECEDENTES El primer reporte de sntomas de HLB se dio en la India en el siglo XVIII, anteriormente, el patgeno estaba probablemente presente en plantas nativas de rutceas y cuando los ctricos se plantaron en reas nuevas, los insectos pslidos pudieron haberles transmitido la enfermedad. El HLB fue reportado por citricultores del sureste de China a finales del siglo XIX. En frica del Sur esta enfermedad fue reportada por primera vez en los aos veinte del siglo pasado. La existencia de esta enfermedad en Asia y frica propici que a travs de los aos se dispersara hacia varios pases de ambos continentes.

4.1.2 DEFINICIN

El HLB, yellow dragon, citrus greening o enverdecimiento de los ctricos es una enfermedad causada por una bacteria Candidatus Liberibacter spp., Gram negativa, vascular, limitada al floema, que no es posible cultivarla en forma aislada en medios artificiales. Es transmitida por pslidos, uno de los vectores ms importantes es el pslido asitico de los ctricos (Diaphorina citri), (Hemiptera: Psyllidae).

La bacteria es de difcil control, afecta la vida til de las plantas tanto jvenes como adultas de todos los ctricos, incluyendo a sus hbridos (Hall 2008). Aunque la bacteria se restringe al floema de las rutceaes, tiene la capacidad de multiplicarse en la hemolinfa y las glndulas salivales de los pslidos vectores. Dentro del insecto, la bacteria cruza la pared intestinal hasta llegar a las glndulas salivales, va hemolinfa, tomndose para esto de 1 a 3 semanas segn la virulencia de la cepa (Orozco 1995).

7 Se considera a esta enfermedad como una de las ms destructivas de los ctricos en el mundo, por la severidad de los sntomas, la rapidez con la que se dispersa y porque afecta a todas las especies comerciales de ctricos. Es una enfermedad que an no tiene cura.

frica y Asia se han establecido como dos orgenes diferentes del HLB por lo que se reconocen dos formas del agente causal: Candidatus liberibacter asiaticus y Candidatus liberibacter africanus.

El agente causal que afecta a la citricultura brasilea es una variante de Candidatus liberibacter asiaticus a la cual se le ha denominado Candidatus liberibacter americanus (Texeira et al. 2005).

4.1.3 FORMAS DE TRANSMISIN DEL HLB

La transmisin del HLB la realizan los insectos vectores: Diaphorina citri Kuwayama y Trioza erytreae; pero tambin puede transmitirse por yemas infectadas (injerto). La distribucin de la bacteria dentro de un rbol infectado puede ser irregular, por lo que no todas las yemas contendrn la bacteria o transmitirn la enfermedad.

4.1.4 VECTORES QUE TRASMITEN LA ENFERMEDAD

Ca. liberibacter spp. es una bacteria persistente que se reproduce dentro del insecto pero no se transmite a otras generaciones, de tal forma que la bacteria infecta al vector sin afectar los procesos fisiolgicos del insecto, este al alimentarse de la planta transmite la enfermedad. La bacteria circula por el floema de la planta impidiendo la circulacin de los nutrientes por el taponamiento de los vasos floemticos, provocando sntomas tpicos de deficiencias nutrimentales en la planta (Da Graca 1991).

8 4.2 VECTORES DEL HLB

4.2.1 PSLIDOS QUE TRASMITEN LA ENFERMEDAD

- Trioza erytreae (frica), que se adapta a climas mas fros, es muy sensible al calor y al clima seco las mejores condiciones para su desarrollo se encuentran entre los 500 y 600 msnm. - Diaphorina citri Kuwayama (Asia) esta especie tiene mayor distribucin en el mundo, se caracteriza por un corto periodo de vida y una alta fecundidad.

4.2.2 Diaphorina citri

Se limita a las rutceas, tanto las especies silvestres como en los ctricos comerciales, especialmente limones (Citrus limon), limn rugoso (Citrus jambhuri), naranja agria (Citrus aurantium), toronja (Citrus paradisi) y limas (Citrus aurantiifolia). Limonaria (Murraya paniculata) es una planta rutcea que se utiliza a menudo como ornamental, es una de las plantas preferidas de Diaphorina citri. (htpp://eppo.org/QUARANTINE)

Figura A. Planta ornamental muy comn conocida como limonaria (Murraya paniculata)

9 4.2.3 CARACTERSTICAS MORFOLGICAS Y FISIOLGICAS DE Diaphorina citri Tamao: 3 a 4 mm de longitud; color marrn claro, con moteados recubiertos de polvo ceroso. Cabeza: caf con ojos rojos. Antenas: Con 11 segmentos, pice negro con dos manchas caf claro en la parte media. Alas: Son anchas en tercio apical y transparentes con manchas marrn claro en el borde, el cual es un carcter importante para la identificacin. Huevos: Alargados de 0.3 mm de longitud, color amarillo claro a anaranjado. Ubicacin: pices de las hojas nuevas y brotes, en forma vertical. Reproduccin: La hembra oviposita hasta 800 huevos durante su vida y se reproduce en forma sexual. Ciclo de vida: Consta de 15 a 47 das dependiendo de las condiciones del clima. Los adultos pueden vivir algunos meses. Tienen 9 a 10 generaciones al ao. Ciclo de vida de Trioza erytrae: de 17 a 43 das

Las ninfas mueren a temperaturas de -1C. Los adultos a temperaturas de -10C. Las mayores densidades de poblacin se presentan en los meses secos, la cual disminuye al aumentar la precipitacin. (Mead, 1977).

El dao directo es causado por ninfas y adultos (Fig. 2) al extraer grandes cantidades de savia de las hojas y pecolos, lo cual debilita las plantas, al mismo tiempo introducen sustancias txicas en los tejidos, dejando manchas clorticas en las hojas donde se han alimentado. El mayor dao e impacto econmico de Diaphorina citri es provocado por la transmisin del HLB.

10 La bacteria se trasmite de manera persistente, hay un periodo de latencia despus de que el pslido contrae la bacteria; sta se multiplica en el insecto vector antes de que pueda trasmitirla. Dado el perodo de latencia, casi todos los pslidos capaces de transmitir el HLB son ninfas en la fase final o adultos, estos siguen siendo capaces de transmitir la enfermedad durante toda su vida despus de haber contrado la bacteria.

Las ninfas al alimentarse de plantas infectadas por 15 a 30 minutos, requieren un perodo de 21 das para incubar y transmitir la bacteria.

Los adultos son capaces de transmitir la enfermedad, con slo alimentarse durante 15 minutos de plantas enfermas.

Y la eficiencia aumenta al 100% cuando stos se alimentan por 1 hora.

Figura B: A. Adulto de Diaphorina citri. B. Estados juveniles con tbulos cerosos C. huevecillos. Tomado de R. H. Brlansky y M. E. Rogers (University of Florida-IFAS Citrus Research and Education Center)

11 4.3 HONGOS ENTOMOPATGENOS

4.3.1 GENERALIDADES

El manejo integrado de plagas (MIP), que se basa en principios totalmente ecolgicos, considera todo el agroecosistema en su conjunto. Como tal, comprende la aplicacin armnica de diferentes mtodos de control, como la lucha biolgica y las prcticas culturales que requiere el cultivo, teniendo en cuenta los niveles poblacionales de las plagas y enfermedades a controlar, la presencia de los biorreguladores naturales, las etapas fenolgicas del cultivo y las condiciones ambientales presentes.

Uno de los componentes del MIP es el control biolgico de las plagas agrcolas mediante parasitoides, predadores (entomfagos) y organismos entomopatgenos que pueden ser hongos, bacterias, virus, nematodos y protozoarios. Los hongos entomopatgenos son los que han recibido mayor atencin por la gran variedad de especies y amplio rango de hospedantes as como por su crecimiento microscpico sobre la superficie de su husped. Todos los insectos son susceptibles de ser afectados por algn hongo.

Ciertos hongos poseen caractersticas muy especiales que les permiten sobrevivir en forma parastica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposicin. El crecimiento saprofito puede dar como resultado la produccin de conidiforos, conidias y desarrollo miceliano. Esta caracterstica permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando tcnicas de produccin en masa de bajo costo.

Los hongos tienen un gran potencial para ser empleados como biocontroladores.

12 Entre los principales hongos que presentan estas caractersticas estn: Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.

Las principales ventajas de estos hongos son:

1. Presentan grados variables de especificidad, pueden ser especficos a nivel de familia o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas, pueden ser especficas a nivel de especie, sin afectar a los enemigos naturales. 2. Si el entomopatgeno encuentra las condiciones adecuadas para introducirse y colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones. 3. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatgenos con dosis sub letales de insecticidas para lograr efectos sinrgicos superiores a los logrados con aplicaciones de cada producto por separado. 4. No contaminan el medio ambiente ni afectan al hombre u otros animales superiores. 5. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se presentan efectos secundarios que alteran el normal desarrollo del ciclo de vida del insecto.

Pero tambin presentan algunas desventajas, como:

1. Sensibilidad a la variacin de las condiciones climticas como temperaturas extremas, desecacin y luz ultravioleta. Estas limitantes estn siendo

contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores solares, aceites, antidesecantes). 2. Requieren de condiciones de almacenamiento ms exigentes que las molculas inorgnicas, para evitar que pierdan su patogenicidad. 3. En general, los insecticidas biolgicos no matan instantneamente. Alcanzan buenos niveles de control entre una y tres semanas despus de la aplicacin, dependiendo de la plaga y del ambiente.

13 4.3.2 CLASIFICACIN DE LOS HONGOS ENTOMOPATGENOS

De acuerdo a la clasificacin realizada por Ainsworth (1973), los hongos son separados en dos divisiones: Myxomycota, aquellos que forman plasmodios, y Eumycota, aquellos que no forman plasmodios y son frecuentemente micelianos. Los hongos entomopatgenos se encuentran en la divisin Eumycota dentro de cinco subdivisiones: Mastigomycotina (forman zoosporas, oosporas y presentan estado perfecto), Zygomycotina (no presentan zoosporas, presentan estado perfecto y forman zygosporas), Ascomycotina (presentan estado perfecto y forman ascosporas), Basidiomycotina (presentan estado perfecto forman basiodiosporas) y Deuteromycotina (no presentan estado perfecto ni zoosporas y forman conidias).

Las clases de mayor importancia desde el punto de vista del control de plagas agrcolas son Zygomycetes e Hyphomycetes (Tanada y Kaya, 1993).

4.3.3 MECANISMO DE INFECCIN DE LOS HONGOS ENTOMOPATGENOS

La enfermedad producida por hongos se llama micosis. Tanada y Kaya (1993) mencionan que el desarrollo de la micosis puede ser separado en tres fases.

Figura C: Mecanismo de infeccin de hongos

entomopatgenos.

14 4.3.3.1 ADHESIN Y GERMINACIN DE LA ESPORA EN LA CUTCULA DEL INSECTO

El proceso de adhesin, dependiendo del hongo, puede ser un fenmeno especfico o no especfico. Mientras que la germinacin de las esporas es un proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeos tubos germinativos que al crecer y alargarse dan origen a las hifas, este proceso depende de las condiciones de humedad y temperatura ambiental. En menor grado la luz condiciona el ambiente alimenticio.

La espora que germina en el insecto forma un tubo germinativo el cual funciona como una hifa de penetracin de la cutcula. Tambin puede producir una estructura llamada apresorio, la cual ayuda a la adhesin de la espora. El xito de la germinacin y penetracin no dependen necesariamente del porcentaje de germinacin sino del tiempo de duracin de la germinacin, modo de germinacin, agresividad del hongo, tipo de espora y susceptibilidad del hospedante (Samson, et al, 1988).

Los hongos, adems, pueden infectar a los insectos a travs de las aberturas corporales como son cavidad bucal, espirculos y otras aberturas externas. Las esporas pueden germinar rpidamente en estos ambientes por ser hmedos. Cuando lo hacen en los fluidos digestivos, pueden destruir a la hifa germinativa. En este caso, el insecto no muere de micosis sino a causa de las toxinas.

15 4.3.3.2. PENETRACIN DENTRO DEL HEMOCELE

Esta penetracin por parte de la hifa es el resultado de la degradacin enzimtica de la cutcula y la presin mecnica ejercida por el tubo germinativo. Adems, depende de las propiedades de la cutcula, grosor, esclerotizacin, presencia de sustancias nutricionales y antifungosas (Charnley, 1984) y estado de desarrollo del insecto.

La digestin del integumento se produce mediante las enzimas (proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas y quitinasas). Cuando la hifa ha llegado al hemocele, se pueden producir diferentes reacciones de defensa del insecto frente a un cuerpo extrao: la fagocitosis, encapsulacin celular y la formacin de compuestos antimicrobianos como las lisozimas, aglutininas y melanizacin.

En este caso, el hongo debe vencer el sistema inmunolgico del hospedante antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto.

4.3.3.3. DESARROLLO DEL HONGO QUE RESULTA EN LA MUERTE DEL INSECTO

Luego de que llegue al hemocele, el hongo puede evitar la defensa inmune del insecto produciendo clulas parecidas a levaduras, llamadas blastosporas, que se multiplican y dispersan rpidamente, desarrollando protoplastos, elementos discretos ameboideos, sin pared celular que no son reconocidos por los hemocitos del hospedante (Prez, 2004) y produciendo micotoxinas (Tanada y Kaya, 1993).

16 La dispersin de stos en el hemocele depende de la especie del hongo. Las toxinas producidas juegan un rol muy importante en el modo de accin de los hongos entomopatgenos. La muerte del insecto se produce con mayor rapidez cuando es afectado por un hongo entomopatgeno que produce cantidades considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destruccin de los tejidos y a las deficiencias nutricionales.

A continuacin del crecimiento del hongo en el hemocele, se producen los sntomas fisiolgicos del insecto afectado como convulsiones, carencia de coordinacin y comportamientos alterados (deja de alimentarse, reduce su movimiento), entra en un estado letrgico y finalmente muere, lo que puede ocurrir relativamente rpido o en unos cuantos das. Ocurre una competencia entre el hongo y la flora intestinal. Los hongos pueden producir sustancias antibacterianas que alteran la coloracin del cadver (Ferrn, 1978).

Con la muerte del insecto termina el desarrollo parastico del hongo y empieza la fase saproftica: el hongo crece en el hemocele formando masas micelianas que salen al exterior fundamentalmente por las regiones intersegmentales esporulando sobre el cadver y produciendo inculo para infectar a otros insectos y por las aberturas naturales (espirculos, boca y ano).

La gran dependencia de la humedad es el mayor factor limitante que presentan los hongos, ya que para que se produzca la germinacin y esporulacin fuera del hospedante se requieren valores de humedad relativa superiores a 90%.

17 4.4 MEDIO DE CULTIVO

4.4.1 DEFINICIN

El medio de cultivo es una sustancia o solucin que permite el desarrollo de microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un organismo. Los medios utilizados en micologa deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo y reproduccin de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente cido (6 6.3) para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se puede aadir antibiticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras.

Los medios pueden ser slidos o lquidos. Para conseguir un medio slido se debe agregar una sustancia solidificante como el agar (gelatina vegetal) o el agar agar (polisacridos provenientes de algas), el cual no tiene valor nutritivo sino que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo ms o menos prolongado. La humedad es fundamental para el desarrollo de los hongos, porque cuando sta comienza a disminuir, la formacin de micelio tambin disminuye y el hongo tiene que asegurar su perpetuidad formando estructuras propagativas (esporas, conidias) y de conservacin (clamidosporas).

El agar empieza a derretirse a partir de 80 C y soporta temperaturas altas sin descomponerse, solidificndose entre los 35 y 50 C.

Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad de crecimiento, etc. sin embargo, son ms fciles de contaminarse. Los tubos, a pesar de tener una superficie mucho ms reducida, ofrecen seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin.

18 Se utilizan para conservar cultivos por tiempo ms o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir.

El pH recomendado para el cultivo de hongos en el laboratorio es de alrededor de 7, un pH neutro o ligeramente cido (6.8). Para seguridad del que opera y evitar contaminaciones, los medios de cultivo se deben manipular en campanas de flujo laminar.

4.4.2 SABORAUD

Es un medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales. Sirve para el aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo inclinado o caja petri. Debido a su composicin, los hongos crecen exuberantemente y esporulan bien.

Es el medio estndar para observar la morfologa tpica de los hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulacin.

Extracto de malta Extracto de levadura Saboraud Agua destilada

10 g 10 g 65 g 1000 ml

19 V. HIPTESIS

De acuerdo a la literatura, la rapidez del crecimiento as como la agresividad y esporulacin de los hongos entomopatgenos dependen de varios factores; tanto climticos, biolgicos y de nutricin. En esta prctica se realizar una evaluacin y comparacin de cinco cepas de hongos (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae (Ma59) y de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20), con las mismas condiciones de crecimiento.

Se intentar demostrar que la cepa del hongo Metarhizium anisopliae es la que presenta un crecimiento mas acelerado en condiciones de laboratorio. As como la comparacin de resultados, con la produccin masiva de los mismos sobre sustrato a base de arroz.

20 VI. DESARROLLO DEL PROYECTO

6.1 METODOLOGA

En la presente se llevaron a cabo dos metodologas diferentes para el trabajo con hongos entomopatgenos en dos reas del laboratorio: la experimental y la de produccin masiva, las cuales se realizaron en el laboratorio Bio-Huas, perteneciente a las instalaciones del CESAVEH en Huejutla de Reyes, Hidalgo. Las actividades tuvieron un lapso de realizacin de cuatro meses a partir de enero de 2012.

Para ello se inici con una revisin de bibliografa para contar con referencias para la realizacin del proyecto y establecer como objetivo analizar que especie de cepa de hongo entomopatgeno tendr el ms rpido crecimiento en condiciones de laboratorio y despus hacer una comparacin con el crecimiento del hongo en condiciones de produccin masiva.

Se establecer un experimento con cinco tratamientos y cinco repeticiones. Los tratamientos sern las cepas de Metarhizium anisopliae (Ma59), de Isaria fumosorosea (Pf14, Pf16, Pf20) y Beauveria bassiana. Las unidades

experimentales sern cajas Petri con el mismo porcentaje de medio de cultivo y condiciones de esterilizacin y manejo.

Para la evaluacin de las cinco cepas de hongos entomopatgenos que se emplearn en este trabajo, se utilizaran las que pertenecen a la coleccin del centro nacional de referencias de control biolgico, estas fueron seleccionadas previamente con base a la prueba de separacin de medias de Turkey; los ensayos de laboratorio mostraron porcentajes de mortalidad de 100% en ninfas y 95.22% en adultos de D. citri.

21 6.2 DESARROLLO

6.2.1 DESARROLLO DEL EXPERIMENTO

6.2.1.1 MATERIALES UTILIZADOS

Para el desarrollo del experimento se utilizaron los siguientes materiales con el fin de facilitar la obtencin de resultados y obtener mayor comodidad en su realizacin. 25 cajas Petri de cristal Matraz Erlenmeyer de 2000 ml Probetas graduadas de 1000 ml Termociclador Balanza Granataria Campana de flujo laminar Mechero de alcohol Asas bacteriolgicas Indumentos de laboratorio (bata, cubre-bocas, cofia, guantes de asbesto) Ollas de presin Estufa Parafilm Cinta adhesiva Bolgrafo Bolsas de nylon Algodn Envases varios de cristal Estereoscopio

22 6.2.1.2 SELECCIN DE CEPAS

Se utilizaron las 5 cepas de hongos entomopatognos con las que contaba el laboratorio Bio-Huas; Beauveria Bassiana (aislada en el propio laboratorio), Metarhizium anisopliae (obtenida del laboratorio de Sanidad Vegetal de Puebla) e Isaria fumorosea en sus variedades Pf14, Pf16 y Pf20 (obtenidas del mismo laboratorio en Puebla) pertenecientes a la coleccin del centro nacional de referencias de control biolgico.

6.2.1.3 LAVADO DE CRISTALERA Y ESTERILIZACIN DE REAS MATERIALES

En este apartado se puso especial atencin a la asepsia de utensilios y reas de trabajo. Se lav con agua y jabn toda la cristalera a utilizar en el experimento, adems se esteriliz con alcohol y lo que fue posible en ollas de presin siguiendo el lineamiento del laboratorio.

Las reas de trabajo fueron aseadas con especial cuidado y en la zona de siembra se esteriliz con alcohol 95 de manera total.

El proceso de esterilizacin de materiales consisti en colocar el material a esterilizar dentro de las ollas de presin sobre fuego, hasta llegar a una presin de 150 Psi marcados en el manmetro y contabilizando 20 minutos despus de llegar a la presin idnea mantenindola constante. Dentro de la olla la temperatura llega a 120 C; los suficientes para eliminar la mayora de agentes biticos y algunas impurezas.

Los materiales que se esterilizaron fueron las 25 cajas Petri colocadas en bolsas de nylon de cinco en cinco, el matraz que contena el medio de cultivo y agua potable en envases de cristal varios. El material esterilizado fue colocado en la campana de flujo laminar para su posterior uso.

23 6.2.1.4 PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO

Se estableci un promedio de 10 ml de medio por cada caja Petri, dando un total de 250 ml necesario para cubrirlos en su totalidad y siguiendo el lineamiento ideal de preparacin siguiente se determin que:

Agua-----------------------------------------1000ml SABORAUD-----------------------------------65gr Extracto de Malta----------------------------10gr Extracto de Levadura-----------------------10gr

Se utiliz una regla de tres para la determinacin del peso de los ingredientes ideal para los 250 ml necesarios de medio de cultivo.

1000 ml agua------------------ 65

gr SABORAUD

250 ml agua------------------16.5 gr SABORAUD

1000 ml agua------------------ 10 gr Malta 250 ml agua------------------ 2.5 gr Malta

1000 ml agua------------------ 10 gr Levadura 250 ml agua------------------ 2.5 gr Levadura

Una vez establecido el peso de cada ingrediente para la solucin, se procedi a verter en un matraz con 250 ml de agua potable los ingredientes antes pesados junto con una pastilla de antibitico comercial como procedimiento establecido. El matraz fue colocado sobre el termociclador para disolver la mezcla a una velocidad en nivel 7 y temperatura en nivel 4 durante aproximadamente 30 minutos, necesarios para observar un color caramelo que indicara el punto idneo de agitacin. El matraz fue sellado con papel aluminio y esterilizado en una olla de presin.

24 6.2.1.5 VACIADO EN CAJAS PETRI

El vaciado del medio dentro de las cajas Petri se realiz dentro de la campana de flujo laminar con el indumento necesario y adecuada esterilizacin de las manos con alcohol, igualmente se esteriliz la campana de flujo laminar y con ayuda del mechero y un guante de asbesto -ya que la solucin estaba caliente- se realiz el vertido de aproximadamente 10 ml del medio en cada una de las cajas Petri con la tcnica bsica, para que posteriormente fueran selladas con cinta Parafilm.

6.2.1.6 SIEMBRA

El proceso de siembra inici nuevamente con la desinfeccin del rea de inoculacin. Los materiales previamente esterilizados y las cajas Petri a utilizar se encontraban ya en la campana de flujo, por lo que lo nico necesario fue portar vestimenta de laboratorio y esterilizar las manos para el manejo de los inculos. Las cepas a utilizar se encontraban en refrigeracin en un empaque trmico para conservarlos en buen estado y por ende se tuvieron que aclimatar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Dentro de la campana se encontraban las 25 cajas petri, asas bacteriolgicas sumergidas en alcohol, un mechero de alcohol y cinta Parafilm, sucesivamente se colocaron los sobres con la cepas de Metarhizium anisopliae (Ma59), Isaria fumosorosea (Pf14, Pf17, Pf20) y el tubo de ensaye que contena la cepa de Beauveria bassiana.

Se quito la cinta Parafilm que sellaba las cajas Petri, se activ la campana de flujo laminar, se encendi el mechero y se quemaron las asas de siembra para su utilizacin. Una vez echo esto, el proceso de sembrado dio comienzo.

25 La primera en ser sembrada fue la cepa de Metarhizium anisopliae, ms por azar que por practicidad. Se destap el sobre que contena el hongo dentro de la campana de flujo y con sumo cuidado se introdujo el asa previamente humedecida con alcohol dentro del sobre para colectar algunas esporas, una vez que las esporas estaban en el asa y la caja Petri cerca del mechero para evitar contaminantes; se trazaron 11 lneas de siembra con el fin de hacer mas fcil el conteo de las colonias.

Este proceso se realiz cinco veces con la cepa de Metarhizium anisopliae siendo cuidadosos en quemar el asa en cada ocasin para evitar residuos indeseables entre siembras. Cada caja fue sellada nuevamente con Parafilm y sealadas con cinta adhesiva por el nombre de la cepa.

Posteriormente se sembraron con el mismo procedimiento pero con diferente asa las cepas de Isaria fumosorosea en orden ascendente respecto al nombre de su variedad (Pf14, Pf16, Pf20) cada caja fue sealada con el nombre correspondiente y sellada con Parafilm.

Por ultimo se sembr desde el tubo de ensaye la cepa de Beauveria bassiana aislada en el laboratorio, siguiendo la misma metodologa, se sellaron y sealaron con el respectivo nombre cada una de las cajas.

El resultado fueron cinco cajas Petri inoculadas con Metarhizium anisopliae (Ma), cinco cajas inoculadas con Isaria fumosorosea (Pf14), cinco cajas con Isaria fumosorosea (Pf16), cinco cajas Petri con Isaria fumosorosea (Pf20), y cinco mas con Beauveria bassiana; dando un total de 25 cajas inoculadas.

Despus de hacer la siembra se lav y guard el material que ya no era necesario utilizar. Las cajas Petri ya inoculadas pasaron al rea de incubacin.

26 6.2.1.7 INCUBACIN

Las muestras se colocaron en orden en el rea de incubacin a temperatura casi constante de 35C durante 15 das a partir de la siembra para su ptimo desarrollo y realizar las observaciones pertinentes.

En este proceso se realizaron observaciones del desarrollo de las cepas da a da, mostrado en los siguientes prrafos:

Cronologa

Las observaciones se realizaron continuamente excepto los fines de semana, con anterioridad se haba hecho la siembra de las cepas en medio de cultivo que fueron obtenidas del laboratorio de Puebla con resultados desalentadores, ya que todas las muestras presentaban signos de contaminacin.

Al tercer da se pudo observar el crecimiento de cada caja Petri y se contabilizaron las colonias.

Tabla 1.1 Metarhizium anisopliae (Ma59)

colonias/lnea

Da 1 0 0 0 0 0

Da 4 23 22 20 19 21

Da 7 25 23 21 22 26

Da 10 Da 13 Da 15 Observaciones 25 24 21 23 27 25 24 21 23 27 25 25 22 23 27
La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5

27

Tabla 1.2 Isaria fumosorosea (Pf14) Da 1 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 0 0 0 0 0 Da 4 7 6 2 9 11 Da 7 7 5 2 8 10 Da 10 6 5 2 8 9 Da 13 5 5 2 8 9 Da 15 5 5 2 6 9 Observaciones
La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa

Tabla 1.3 Isaria fumosorosea (Pf16) Da 1 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 0 0 0 0 0 Da 4 13 10 11 9 14 Da 7 13 8 11 8 14 Da 10 10 8 10 8 14 Da 13 10 8 9 8 14 Da 15 5 8 3 6 14 Observaciones
La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa

Tabla 1.4 Isaria fumosorosea (Pf20) Da 1 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 0 0 0 0 0 Da 4 6 5 6 5 8 Da 7 5 5 6 5 7 Da 10 3 5 6 5 7 Da 13 3 5 5 3 6 Da 15 2 3 5 1 4 Observaciones
La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa La muestra present contaminacin severa

28

Tabla 1.5 Beauveria bassiana Da 1 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 0 0 0 0 0 Da 4 41 46 52 56 46 Da 7 53 51 53 59 51 Da 10 54 51 56 63 57 Da 13 57 54 61 66 63 Da 15 61 59 63 67 64 Observaciones
La cepa se desarrollo sin contaminantes La cepa se desarrollo sin contaminantes La cepa se desarrollo sin contaminantes La cepa se desarrollo sin contaminantes La cepa se desarrollo sin contaminantes

El conteo de las colonias se hizo tomando como referencia la lnea intermedia de las cajas Petri con ayuda de un estereoscopio y es aproximado.

29 6.2.2 DESARROLLO DEL PROCESO DE PRODUCCIN MASIVA

6.2.2.1 MATERIALES

Para la produccin en masa de hongos entomopatgenos se utilizaron los siguientes materiales para optimizar el crecimiento y esporulacin de hongo. Tinas Malla mosquitera Escurridor Bolsas de nylon Engrapadora Arroz Ollas de presin Jeringa de inoculacion Solucin (a base de agua potable y antibitico de amplio espectro) Campana de flujo laminar Cinta adhesiva Marcador permanente Deshumificador Extractor de esporas Sellador Estufa Marcador indeleble Matraces Vaso de precipitados Termociclador Mortero Tijeras

30 6.2.2.2 DESINFECCIONES DE CRISTALERA Y LIMPIEZA DE LAS REAS DE PRODUCCIN

Este apartado es de gran importancia por que de el dependi el resultado de la prctica. El medio ambiente se encuentra cargado generalmente de microorganismos diversos que pueden contaminar el rea de trabajo, por ello conviene no descuidar la limpieza de los materiales, instrumentos y equipo necesario para el trabajo.

Se lav con agua limpia todo el material con agua limpia y se limpi detalladamente cada rea del laboratorio, se limpiaron los pisos, ventanas y paredes con jabn y cloro, as como la limpieza con alcohol de algunos materiales e instrumentos.

6.2.2.3 PREPARACIN DE LA SOLUCIN

Se prepar una solucin con el fin de actuar como dispersante y humectante para las esporas desecadas contenidas en los sobres. La cantidad de solucin dependi de la cantidad de bolsas con arroz a inocular, teniendo una tendencia aproximada de 10 ml (capacidad de la jeringa de inoculacin) por cada bolsa. La solucin se prepar con la siguiente formulacin:

2000 ml ----------- 1 pastilla antibitico molido

En un matraz de 2000 ml se vaco una pastilla de antibitico de amplio espectro molido en el mortero y se coloc en el termociclador para que la mezcla se volviera homognea. Una vez que estaba lista la solucin se puso a esterilizar en una olla de presin con la metodologa establecida.

31 6.2.2.4 LAVADO DE ARROZ

Se lavaron aproximadamente 20 kg de arroz en cada ocasin con el fin de eliminar la mayor cantidad de impurezas y contaminantes como polvo, insectos muertos, pelos de rata y dems contaminantes.

El proceso consisti en colocar el arroz a lavar en dos tinas separadas para hacer ms fcil su limpieza, se vaco agua en las tinas y se agito con las manos; tres repeticiones de agitacin manual y escurrimiento se utilizaron para cada tina.

Al final al arroz escurrido en cada tina, se le agreg agua potable para la desinfeccin con antibitico. En cada tina se contuvo un aproximado de 20 lt de agua y siguiendo la siguiente formulacin se mezcl el antibitico ya pesado:

1 lt --------- 2.5 gr antibitico amplio espectro 20 lt -------- 50 gr antibitico amplio espectro

Una vez mezclado el antibitico, el agua y el arroz se dej reposar durante 30 minutos, no sin realizar un movimiento manual de mezclado cada 10 minutos durante la espera para su mayor efectividad.

Posteriormente a la espera se procedi a eliminar el exceso de agua de las tinas con antibitico con ayuda de la malla mosquitera pera evitar prdidas de arroz limpio.

Consecuentemente el arroz escurrido se coloc en escurridores que consistan en mesas de metal con malla para su escurrimiento por gravedad. Este proceso se realiz en el exterior del laboratorio por el factor sol que beneficiaba el secado. En ese estado se dejo escurriendo 40 minutos ms.

32 6.2.2.5 EMBOLSADO DE ARROZ

Una vez escurrido el arroz se embols en cantidad de aproximadamente 200 gr por bolsa de nylon, cantidad medida con ayuda de un vaso marcado como referencia y colocado en tinas para su traslado a un rea mas cmoda para engraparlas.

Se utiliz un doblado especial sealado en el laboratorio para evitar el escape de aire de la bolsa, dejando adems una cantidad adecuada de aire dentro para que el intercambio de oxigeno se realizara adecuadamente. Ya engrapadas se pasaron al rea de esterilizacin.

6.2.2.6 ESTERILIZACIN

La esterilizacin por calor hmedo o a presin se obtiene con el uso de autoclave, pero en nuestro caso solo contbamos con olas de presin aunque tienen el mismo principio de funcionamiento. A mayor presin, mayor es la temperatura de ebullicin del agua: cuando la presin aumenta a 15 psi cm 2, la temperatura llega a 121C.

Pocos microorganismos toleran esta temperatura durante 20 minutos. El tiempo es el factor que permite que el calor penetre en la masa de esteriliza con y se absorba. De acuerdo a estos estndares se realiz la esterilizacin del arroz, de la solucin para la inoculacin y del material utilizado para la inoculacin.

Se colocaron dentro de la olla de presin estos artculos durante 20 minutos a fuego constante para mantener la presin de 15 psi constante igualmente. El arroz fue colocado en lotes de 20 bolsas por cada olla de presin.

33 Posterior se llevaron al rea de inoculacin para que se enfriaran y al da siguiente se realizara la siembra. El arroz esterilizado se coloco en la sala de inoculacin acomodado sobre las mesas de trabajo en un aproximado de 120 bolsas cada vez durante el proceso.

6.2.2.7 INOCULACIN

Con la solucin preparada anteriormente se mezclaron las cepas de los hongos con cantidad aproximada de 10 gr por cada 2000 ml de solucin y se agitaron para su dispersin. Se procedi al armado de la jeringa veterinaria cerca del mechero para mayor asepsia y se coloco la parte para succin dentro de la disolucin con hongos preparada.

Las bolsas con arroz fueron marcadas con marcador indeleble en un punto intermedio especfico para referencia de la inoculacin. Despus se tomaron cada una de las bolsas para introducir la jeringa y vaciar su contenido dentro de la bolsa con arroz, no sin antes quemar la punta de la jeringa en el mechero, la bolsa inoculada fue sellada nuevamente con cinta adhesiva y se realiz un movimiento lateral para la dispersin del inoculo dentro de a bolsa. El material sobrante fue desechado y el material utilizado fue lavado y guardado en su respectivo sitio.

Este proceso sigui hasta consumar la inoculacin total de las bolsas de arroz estriles y posteriormente fueron colocadas en tinas para su traslado al rea de crecimiento. Cabe mencionar que este proceso se realizo da con da con cada cepa de hongos con que el laboratorio contaba para obtener una produccin continua. Los lotes fueron de 120 150 bolsas cada da aproximadamente.

34 6.2.2.8 CRECIMIENTO

El crecimiento del hongo es la etapa donde las esporas germinan en un determinado tiempo, y para esto debe reunir ciertas condiciones de humedad cercanas al 90% y a una temperatura de 27C, bajo estas condiciones fueron sometidas las bolsas para su germinacin y crecimiento durante un periodo de 15 das, las bolsas inoculadas se colocaron en un rea un tanto oscura, acomodadas sobre anaqueles de metal debidamente sealados con el nombre de la cepa y la fecha.

Cada 5 das las bolsas eran agitadas para una mejor esporulacin as como la revisin de cada bolsa, para determinar que inculos fueron contaminados y decidir su conservacin o desecho.

6.2.2.9 DESHUMIFICACIN

A los 15 das el hongo ya acab de esporular y por lo tanto debera estar listo para ser preparado para su cosecha. En este proceso se procedi a cortar cada una de las bolsas para enrollar el sobrante de bolsa y que el arroz inoculado quedara expuesto, esto con el fin de promover la deshidratacin de las esporas para realizar su cosecha ms fcil.

La apertura de las bolsas se realiz con la ropa adecuada para evitar la ingesta o aspiracin accidental de esporas. Una vez abiertas todas las bolsas, se colocaron los extractores de humedad dentro de las salas y se mantuvieron ah durante cuatro das para asegurar el secado de las esporas. En este proceso la revisin diaria fue bien aceptada ya que fue necesario eliminar las bolsas contaminadas o daadas.

35 6.2.2.10 COSECHA

Despus de llegar al punto ideal de secado de las esporas se procedi a llevar las bolsas al are a de cosecha, este proceso se realiz de manera semiautomtica con ayuda de una cosechadora mecnica, que consiste en un mecanismo que separa el arroz de las esporas, proceso que se realizo bajo las siguientes condiciones de seguridad y debido a la excesiva concentracin de esporas que pudiera ocasionar trastornos de salud

Para este proceso se uso la bata de laboratorio obligatoria, gafas de seguridad, cubrebocas doble con carbn activado y cofia. El proceso consisti en vaciar el contenido de las bolsas en la parte superior de la cosechadora, la recoleccin del arroz se uso en una apertura bajo la cosechadora en un costal reutilizado y la recoleccin de las esporas en otra apertura colectada en una bolsa de nylon para su refrigeracin y posterior uso.

Esta metodologa se repiti con cada cepa de hongo contenida en el laboratorio, y a pesar de las medidas de seguridad e higiene la mayora de los inculos obtenidos estuvieron con contaminacin, excepto la Beauveria bassiana que present una pureza aceptable.

36 6.2.3 DETERMINACION DE CONCENTRACION DE ESPORAS LIBRES

6.2.3.1 MATERIALES

Se decidi adems hacer una determinacin de concentracin de esporas libres de las cepas de hongos para ello se utilizaron los siguientes materiales. Matraz Alcohol Termociclador Algodn Balanza Cmara neubauer Microscopio Contador mecnico Calculadora

6.2.3.2 DESARROLLO

Se pesaron 0.5 gr de la cepa y se disolvieron en 500 ml de agua potable dentro del matraz, despus se coloc ste -sellado- en el termociclador durante 10 minutos para que se disolviera correctamente.

En el rea de formulacin se limpio la cmara neubauer y los cubreobjetos con alcohol, se coloco una gota de agua en cada extremo de la cmara y sobre sta un cubreobjetos, se coloc en el microscopio para enfocar los cuadrantes.

Para realizar la cuantificacin de esporas por unidad de volumen o peso, se utiliza un hemacitmetro o cmara de neubauer que esta conformado por dos reas de conteo, cuando las esporas estn suspendidas en agua se precipitan rpidamente en un aproximado de 5 minutos necesarios para empezar el conteo.

37 Para el conteo se utilizo el rea dividida por 25 celdas a su vez divididas en lneas triples, se utilizaron cinco celdas por rea, las cuatro de las esquinas y la del centro; en total se contaron diez celdas, cinco arriba y cinco abajo, debido a que se cuanta el numero de esporas contenido en el volumen de agua es necesario seguir un criterio uniforme, se inicio el conteo por la parte inferior izquierda con la consideracin de que las esporas que toquen la lnea en la parte inferior o la parte exterior por el lado izquierdo se consideran en el conteo, en cambio aun y cuando las esporas estn dentro pero en la parte superior o en el lado derecho no se consideran en el conteo.

Este proceso se realiz una vez con cada cepa de hongo arrojando que:

Tabla 2.1 Metarhizium anisopliae (Ma59)

Cuadrante 1 Primer extremo Segundo extremo Total de esporas Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5

183 220

203 263

195 183 2130

256 228

194 205

Tabla 2.2 Isaria fumosorosea (Pf14)

Cuadrante 1 Primer extremo Segundo extremo Total de esporas Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5

105 120

122 163

118 143 1244

130 128

98 117

38 Tabla 2.3 Isaria fumosorosea (Pf16)

Cuadrante 1 Primer extremo Segundo extremo Total de esporas Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5

112 143

160 208

134 172 1586

188 156

112 201

Tabla 2.4 Isaria fumosorosea (Pf20)

Cuadrante 1 Primer extremo Segundo extremo Total de esporas Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5

101 142

94 165

126 128 1300

129 141

129 145

Tabla 2.5 Beauveria bassiana

Cuadrante 1 Primer extremo Segundo extremo Total de esporas Cuadrante 2 Cuadrante 3 Cuadrante 4 Cuadrante 5

390 361

380 345

396 355 3839

360 401

425 395

39 Para la determinacin de la concentracin se realizaron una serie de operaciones para tenerla como referencia, para ello se procedi a realizar lo siguiente:

Metarhizium anisopliae (Ma59)

Numero total de esporas entre el nmero de conteos. 2130/10 = 231

El resultado se multiplica por el nmero total de celdas en la subarea. 231*25 = 5775

El resultado se multiplica por el nmero de esporas contenidas en la diezmilsima parte de un mililitro. 5775*10000 = 5.7x107 Si consideramos que se suspendi un gramo en un litro de agua se obtiene: 5.7x1010 Por lo tanto para formular una concentracin de 1.3 x 1012 Si: 1 gr/lt ---------------------5.7x1010 X ----------------------1.3x1010

Donde: X= 0.228

Por lo tanto esto se formula para una hectrea diluida en 100 litros de agua debemos realizar la siguiente operacin:

100*0.288 = 28.8 gr de esporas libre/ Ht

40 Isaria fumosorosea (Pf14)

Numero total de esporas entre el nmero de conteos. 1244/10 = 124.4

El resultado se multiplica por el nmero total de celdas en la subrea. 124.4*25 = 3110

El resultado se multiplica por el nmero de esporas contenidas en la diezmilsima parte de un mililitro. 3110*10000 = 3.1x107 Si consideramos que se suspendi un gramo en un litro de agua se obtiene: 3.1x1010 Por lo tanto para formular una concentracin de 1.3 x 1012 Si: 1 gr/lt ---------------------3.1x1010 X ----------------------1.3x1010

Donde: X= 0.419

Por lo tanto esto se formula para una hectrea diluida en 100 litros de agua debemos realizar la siguiente operacin:

100*0.419 = 41.9 gr de esporas libres/ Ht

41 Isaria fumosorosea (Pf16)

Numero total de esporas entre el nmero de conteos. 1586/10 = 158.6

El resultado se multiplica por el nmero total de celdas en la subarea. 158.6*25 = 3965

El resultado se multiplica por el nmero de esporas contenidas en la diezmilsima parte de un mililitro. 3965*10000 = 3.9x107 Si consideramos que se suspendi un gramo en un litro de agua se obtiene: 3.9x1010 Por lo tanto para formular una concentracin de 1.3 x 1012 Si: 1 gr/lt ---------------------3.9x1010 X ----------------------1.3x1010

Donde: X= 0.333

Por lo tanto esto se formula para una hectrea diluida en 100 litros de agua debemos realizar la siguiente operacin:

100*0.333 = 33.3 gr de esporas libre/ Ht

42 Isaria fumosorosea (Pf20)

Numero total de esporas entre el nmero de conteos. 1300/10 = 130

El resultado se multiplica por el nmero total de celdas en la subarea. 130*25 = 3250

El resultado se multiplica por el nmero de esporas contenidas en la diezmilsima parte de un mililitro. 3250*10000 = 3.2x107 Si consideramos que se suspendi un gramo en un litro de agua se obtiene: 3.2x1010 Por lo tanto para formular una concentracin de 1.3 x 1012 Si: 1 gr/lt ---------------------3.2x1010 X ----------------------1.3x1010

Donde: X= 0.406

Por lo tanto esto se formula para una hectrea diluida en 100 litros de agua debemos realizar la siguiente operacin:

100*0.406 = 40.6 gr de esporas libre/ Ht

43 Beauveria bassiana

Numero total de esporas entre el nmero de conteos. 3839/10 = 383.9

El resultado se multiplica por el nmero total de celdas en la subarea. 383.9*25 = 9597.5

El resultado se multiplica por el nmero de esporas contenidas en la diezmilsima parte de un mililitro. 9597.5*10000 = 9.5x107 Si consideramos que se suspendi un gramo en un litro de agua se obtiene: 9.5x1010 Por lo tanto para formular una concentracin de 1.3 x 1012 Si: 1 gr/lt ---------------------9.5x1010 X ----------------------1.3x1010

Donde: X= 0.136

Por lo tanto esto se formula para una hectrea diluida en 100 litros de agua debemos realizar la siguiente operacin:

100*0.136 = 13.6 gr de esporas libre/ Ht

44 VII. RESULTADOS

7.1 INTERPRETACIN DE RESULTADOS

El analisis de resultados se vi menguado por la cantidad de contaminantes presentes en cada una de las muestras, pero aun asi se trato de utilizar el metodo de conteo estratificado mas preciso posible.Cada caja petri fue observada en el estereoscopio y registrados sus datos para hacer un diseo experimental. Pero la aproximacion de los datos supuesta hizo renegar de la viabilidad de este. Por ende en el siguiente apartado se muestran la cantidad de colonias formadas en cada una y por cada una de las cepas de los hongos entomopatogenos.Se menciona ademas que en experimentos anteriores las cepas utilizadas y aun en uso fueron las siguientes:

Metarhizium anisopliae (Ma59): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio de sanidad vegetal de Puebla. Isaria fumosorosea (Pf14): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio de sanidad vegetal de Puebla. Isaria fumosorosea (Pf16): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio de sanidad vegetal de Puebla. Isaria fumosorosea (Pf20): Fue obtenida en sobres provenientes del laboratorio de sanidad vegetal de Puebla. Beauveria bassiana: Esta cepa fue aislada en el laboratorio del CESAVEH

De acuerdo al conteo de colonias en cada caja Petri durante dos semanas se obtuvieron las siguientes graficas.

45 Graficas A: Metarhizium anisopliae (Ma59)

Caja 1
30 20 10 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 1 30 20 10 0

Caja 2
Caja 2 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 3
30 20 10 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 3 30 20 10 0

Caja 4

Caja 4 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 5
30 20 10 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 5

A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aqu cuantificadas y representadas, sin embargo las grficas muestran que en un principio el crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto da las colonias mermaron su crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacan competencia por los nutrientes pero el numero de colonias se mantuvo casi constante.

46 Graficas B: Isaria fumosorosea (Pf14)

Caja 1
10 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 1 10 5 0

Caja 2
Caja 2 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 3
3 2 1 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 3 0 10 5

Caja 4

Caja 4 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 5
15 10 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 5

A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aqu cuantificadas y representadas, sin embargo las grficas muestran que en un principio el crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto da las colonias mermaron su crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacan competencia por los nutrientes, al catorceavo da las colonias contaminantes cubrieron algunas de las colonias deseadas.

47

Graficas C: Isaria fumosorosea (Pf16)

Caja 1
15 10 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 1 15 10 5 0

Caja 2
Caja 2 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 3
15 10 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 3 0 10 5

Caja 4

Caja 4 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 5
15 10 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 5

A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aqu cuantificadas y representadas, sin embargo las grficas muestran que en un principio el crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto da las colonias mermaron su crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacan competencia por los nutrientes, al catorceavo da las colonias contaminantes cubrieron algunas de las colonias deseadas.

48 Graficas D: Isaria fumosorosea (Pf20)

Caja 1
10 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 Caja 1 6 4 2 0

Caja 2
Caja 2 Da 1 Da 4 Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 3
8 6 4 2 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 6 4 Caja 3 2 0

Caja 4

Caja 4 Da 1 Da 4 Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 5
10 5 Caja 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15

A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aqu cuantificadas y representadas, sin embargo las grficas muestran que en un principio el crecimiento fue acelerado pero a partir del cuarto da las colonias mermaron su crecimiento debido a la gran cantidad de agentes contaminantes que le hacan competencia por los nutrientes, al catorceavo da las colonias contaminantes cubrieron la gran mayora de las colonias deseadas.

49 Graficas E: Beauveria bassiana

Caja 1
100 50 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da Da Da 10 13 15 Caja 1 100 50 0

Caja 2
Caja 2 Da Da Da Da Da Da 1 4 7 10 13 15

Caja 3
80 60 40 20 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15 80 60 40 20 0

Caja 4

Caja 3

Caja 4 Da 1Da 4Da 7 Da Da Da 10 13 15

Caja 5
100 50 Caja 5 0 Da 1 Da 4 Da 7 Da 10 Da 13 Da 15

A partir de la siembra; las esporas formaron colonias aqu cuantificadas y representadas, en esta cepa en particular el crecimiento fue satisfactorio, libre de contaminantes y abundante esporulacin. Las graficas muestran un crecimiento acelerado durante los primeros das y un crecimiento consecutivo pero ms lento a partir del da catorce.

50 VIII. CONCLUSIONES

Mediante los anlisis realizados se determin que en un principio, la cepa de Beauveria bassiana(Bb) creca a la par de la cepa de Metarhizium anisopliae (Ma), sin embargo la cepa de Ma comenz a presentar signos de contaminacin desde el cuarto da junto con las tres cepas de Isaria fumosorosea(Pf) y por lo tanto su desarrollo fue frenado llegando incluso a perder algunas colonias, cabe mencionar que el desarrollo de Pf fue mucho mas lento en este orden respectivamente, Pf20, Pf14 y por ultimo Pf16.

Las cajas que contenan Bb fueron las nicas que no presentaron signos de contaminacin, pero en contrapeso la lgica hizo suponer que las cepas de los hongos eran las que venan contaminadas desde su empaquetado. Esto debido a que el desarrollo del experimento tuvo lugar el mismo da de siembra, con las mismas condiciones de asepsia y dems factores. Adems la Bb fue la ltima cepa en ser sembrada y por lo tanto tenia mayor riesgo de presentar contaminacin lo que hizo dudar de la pureza de la cepa usada por este pequeo detalle. Los signos de contaminacin se presentaron el varia repeticiones e incluso al inocular para la produccin masiva.

En conclusin la cepa que mas se desarrollo a nivel laboratorio fue la de Bb, sin embargo esto fue un anlisis aproximado ya que las cepas de Ma y Pf para hacer la comparacin eran impuras.

51 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Da Graca, J. V. 1991. Citrus greening disease. Annu. Rev. Phytopathol. 29: 109-36 Orozco, S. S. 1995. Cibrian T. J 2000. Manejo integrado de plagas y control biologico ed. CECSA. Mexico. Enfermedades presentes y potenciales de los ctricos en xico, Universidad Autnoma Chapingo, Mxico. 150 p. Tanada y Kaya, 1993, Control biolgico. Sociedad Mexicana de Control Biolgico. Taller Internacional sobre Huanglongbing de los ctricos Candidatus Liberibacter spp y el pslido asitico de los ctricos (Diaphorina citri), (I, Hermosillo, Son. Mxico: 2008). Caedo Vernica, Ames Teresa, 2004. Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatgemos, (CIP). Lima. Peru. Memoria/ Ed. Por Mangussi, Da Graca, Hall. D. {et al}, CD.Texeira, D.C., J. Ayres, E.W. Kitajima, L. Danet, S. Jagoueix-Eveillard, C. Saillard, and J.M. Bov. 2005. Hernndez Velzquez, Vctor Manuel, Berlanga Padilla Anglica M., 2005, Formulacin de hongos entomopatgenos, Centro Nacional de Referencias de Control Biolgico, Colima, Mexico. First report of a huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State, Brasil and association of a new Liberibacter species, Candidatus Liberibacter americanus, with the disease. Sao Paulo, Brasil.

52 X. ANEXOS

Fig. 1 Pesando los ingredientes para el medio de cultivo.

Fig. 2 Preparacin del medio de cultivo.

53

Fig. 3 Esterilizacin de materiales y medio de cultivo.

Fig. 4 Vaciado del medio de cultivo en cajas Petri.

54

Fig. 5 Cajas Petri con cinco das de inoculadas.

Fig. 6 Cajas Petri con quince das de inoculadas.

55

Fig. 7 Siembra

Fig. 8 Conteo de colonias.

56

Fig. 9 Laboratorio

Fig. 10 rea de crecimiento de la produccin masiva.