UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA Nombre del estudiante: Teodoro Ivn Rivera Gonzlez Fecha: Lunes 4 de Febrero del 2013 Nmero de lista 27

RBRICA DE EVALUACIN
PUNTOS FORMATO OBJETIVO FUNDAMENTO MATERIALES Y EQUIPOS PROCEDIMIENTO RESULTADOS RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA TOTAL 10 10 15 10 20 20 10 5 100 PUNTOS ACREDITADOS

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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA TTULO DE LA PRCTICA EXTRACCIN DE DNAg DE LEVADURA Pichia pastoris KM71 -Glu MEDIANTE LA TECNICA DE TSNT
Fecha

02/04/13

Elaborado por: TEODORO IVAN RIVERA GONZALEZ

Pginas

OBJETIVO Realizar la extraccin de DNA genmico a partir de la levadura Pichia pastoris KM71 -Glu mediante la implementacin de la tcnica TSNT FUNDAMENTO La tcnica TSNT es una de las tcnicas ms empleadas en biologa molecular para obtener DNA genmico de alta calidad. Su composicin ms frecuente es: Triton X, Tris-HCl, SDS, EDTA, NaCl. Esta tcnica implementada consta de 4 pasos: Homogenizacin (lisis celular) Extraccin de contaminantes (remocin de protenas y RNA) Precipitacin y lavado del DNA Solubilizacin

Y se fundamenta principalmente en la diferencia de cargas que le es conferida a la cadena de DNA por medio de las diversas soluciones empleadas en el tratamiento, comenzando por la lisis en el cual se lleva a cabo la desestabilizacin de la membrana, la disolucin de las protenas, la desnaturalizacin de protenas para as disociarlas de los cidos nucleicos y poder eliminar los lpidos contenidos en la muestra, para posteriormente emplear un agente quelante el cual se encarga de atraer iones metlicos para evitar la formacin de agregados de DNA-DNA y DNA-Protena y as obtener un buen producto de purificacin para finalmente proceder con la amplificacin y anlisis del producto. Llevar a cabo el proceso de lisis es indispensable debido a que esto lograra que el DNA se libere del interior de la clula, para lo cual se implementan los buffer de extraccin, los cuales contienen detergentes como lo es el SDS (realiza la funcin de desnaturalizar las protenas, eliminando las estructuras secundarias y terciarias, pero sin alterar los enlaces disulfuro, adems de conferir una carga negativa a la protena), Triton X-100 al 2% (disuelve protenas integrales), EDTA 1mM (puede unirse a cualquier complejo metlico en solucin, lo que trae como respuesta el desestabilizar la membrana celular e inhibir a las DNAasas), NaCl 100mM (ayuda a proteger al DNA de la degradacin debido a que el NaCl lo recubre), Tris-HCl 10mM (logra mantener estable el pH de la solucin).

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MATERIALES Y EQUIPOS Equipos Agitador vortex Autoclave Campana de humos Juego de micropipetas Incubadora a 37C con agitacin Congelador de -20C Transiluminador

Bao de agua termostatado y con agitacin Mquina de hielo Microcentrfuga pHmetro Centrifuga Refrigerador Equipos para electroforesis (accesorios, fuente de poder, cmaras horizontales)

Materiales Bolsas de plstico Contenedores para deshechos qumicos Gradillas de plstico Contenedores para deshechos de material biolgico Hieleras de plstico Cajas de plstico para guardar tubos con muestras Mechero Vasos y probetas de vidrio Tubos Eppendorff de 1.5 y 2 mL Puntillas estriles para micropipetas (azules y estriles. amarilla) Tubos de ensayo 16 X 150

Material biolgico, soluciones, medios de cultivo y reactivos Cepa de P.pastoris pPic -Glu, KM71 Medio de cultivo YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2%, Glucosa 2%) TSNT (Tritn X-100 al 2%, SDS al TE 1x (Tris-HCl 10mM pH=8 y EDTA 1mM pH=8) 1%, NaCl 100mM, Tris-HCl 10mM y EDTA 1mM pH=8) SEVAG (cloroformo: alcohol Fenol isoamlico, 24:1) Etanol al 100% Etanol al 70% RNAsa

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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA PROCEDIMIENTO Crecimiento Celular 1. Agregar 10ml de medio de cultivo YPD en los tubos Falcn. 2. Inocular los tubos falcn con 100l de cepa KM71 de Pichia pastoris 3. Incubar a 30C, 250rpm por 24 horas, hasta alcanzar la fase exponencial. 4. Trasvasar 4ml del cultivo a los tubos Eppendorf. 5. Centrifugar por 5 10 minutos a 16,000 rpm para separar el paquete celular. 6. Decantar el sobrenadante. 7. Guardar el paquete celular a -20C para su posterior uso. Lisis Celular 8. Descongelar mediante calor corporal el tubo Eppendorf que contiene el paquete celular de Pichia pastoris. 9. Agregar al paquete celular 200l de la solucin amortiguadora de lisis TSNT, mezclar perfectamente por inversin o con pipeta. Extraccin 10. Agregar 500l de Fenol saturado y mezclar por inversin. 11. Agregar 100l de cloroformo-alcohol isoamlico 24:1 (SEVAG) 12. Agitar en el vortex por 5 minutos. 13. Agregar 200l de TE 1X pH8 y mezclar por inversin de tres a cinco veces. 14. Centrifugar 8 minutos a 14,000 rpm. 15. Traspasar la fase acuosa a otro tubo Eppendorf de 1.5ml. Precipitacin y Lavado del DNA 16. Precipitar el DNA agregando 1ml de etanol 100%. 17. Mezclar lentamente por inversin (hasta observar la precipitacin del DNA en forma de un hebra blanca). 18. Centrifugar 8 minutos a 14,000 rpm. 19. Decantar el sobrenadante teniendo cuidado de que no se desprenda la pastilla de DNA. 20. Lavar con 1000l de etanol al 70% y mezclar por inversin. 21. Centrifugar por 8 minutos a 14,000 rpm. 22. Decantar y secar temperatura ambiente de 5-10 minutos. Solubilizacin 23. Resuspender en 50l de TE 1X pH=8. 24. Almacenar a 4C para posteriormente determinar la concentracin y calidad de la muestra de DNA. 25. Calentar a 65C por 20 minutos.

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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA Electroforesis 26. Preparar el gel de agarosa al 0.8%. 27. Colocar el buffer de corrida (TBE 1X) a la cmara de electroforesis. 28. Cargar los carriles con las muestras. 29. Conectar los cables de la cmara a la fuente de poder a 100Volts, 85mA. 30. Dejar que las muestras migren por 75 minutos. 31. Retirar el gel de la cmara y observar en el transiluminador. Notas aclaratorias: Durante la realizacin de la prctica se omiti el uso de las RNAsas. Precauciones: Todas las puntillas y tubos deben ser previamente esterilizados y libres de DNAsas. Al utilizar la micropipeta para poder obtener el SEVAG es recomendable tener todo preparado y cerca debido a que el SEVAG tiende a resbalarse de las puntillas, esto con el fin de evitar la prdida de este y tener papel secante a la mano por si est se llega a derramar. Evitar estar hablando cuando se estn manipulando los tubos Eppendorf, esto con el fin de evitar contaminacin. Utilizar los guantes en toda la practica. Evitar que los tubos que contengan las muestras estn abiertos por mucho tiempo. RESULTADOS

Gel de Agarosa al 0.8% en el cual se muestran los resultados obtenidos mediante la Electroforesis, en los que se puede apreciar los patrones de bandeos (5l por muestra), utilizando DNA genmico de la cepa KM71 -Glu de Pichia pastoris.

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Se logro obtener el DNA genmico de la cepa KM71 -Glu de la levadura Pichia pastoris, logrando obtener patrones de bandeos idnticos en el gel de agarosa al 0.8%(se implemento buffer de corrimiento TBE 1X a 100 volts por 80 minutos), todas las muestras registraron una banda en los 10,000pb lo que nos indica que las muestras de los equipos posean un tamao muy similar entre si. La diferencia que se logro apreciar entre las bandas es la intensidad que cada una de estas mostr en el gel, esto indica que la concentracin de DNA genmico que cada una de estas muestras contena era diferente (ligeramente mayor). A partir de los 800pb se logran apreciar otros patrones de bandas, lo que nos podra indicar que las muestras podran estar contaminadas con molculas de RNA, debido a que en la prctica que se realizo no se implementaron RNAasas para eliminar los residuos de RNA presentes en las muestras de Pichia pastoris. RECOMENDACIONES 1. No tocar el fondo de los tubos con la micropipeta. 2. Usar siempre guantes. 3. Evitar hablar en el proceso para evitar la contaminacin de las muestras con DNAsas. 4. Al momento de extraer la fase acuosa del tubo, procurar inclinarlo para poder evitar que las puntillas toquen la interfase que se llega a formar. 5. Evitar el destruir las fases que se forman en el tubo despus de que estos se someten a centrifugacin. CONCLUSIONES La tcnica de TSNT es una tcnica sencilla y rpida de realizar siendo a su vez un mtodo muy efectivo para la extraccin de DNA genmico debido a la implementacin del buffer de lisis, el cual contiene detergente y sales. A la vez hay que mencionar el hecho de que tenemos que realizar la tcnica con mucho cuidado, esto con el fin de evitar la contaminacin de las muestras por las DNAsas debido a que el DNA puede llegar a contaminarse muy fcilmente. BIBLIOGRAFIA 1. Funcin de Solucin Buffer tris en la Extraccin de ADN. Driven by Demand Media. 1999-2013. Demand Media, Inc. http://www.ehowenespanol.com. 2. Trujillo Murillo. 2009. Extraccin y Purificacin de ADN de Clulas Eucariotas: 9-10. 3. Olazarn, M. G., Saldaa H. B., Salvado J. M. V. 2002. Modified methylotrophic Pichia pastoris yeast which secretes human growth hormone.

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