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Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple (nmero

ms probable o NMP)
OBJETIVOS Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales. Organizar e interpretar los resultados.

GENERALIDADES Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios. Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos. La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja. Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica. Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas permiten su unin a los enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H (flagelar). Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La

enfermedad se presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas caractersticas importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerognicas. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de mono verde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que puede identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG. La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes descritas. Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patgenas ETEC EPEC EHEC EIEC Toxina Lbil/estable Shiga o vero Invasiva Intiminas Enterohemolisina Aspecto de las heces Presencia de leucocitos en heces Fiebre Aguadas + + + + -

Aguadas Aguadas muy Mucoides y sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas + + +

baja

Intestino involucrado Dosis infectiva Serotipos

Delgado Alta varios

Delgado Alta O26, O111 y otros

Colon baja O157:H7, O26, O111 y otros

Colon y parte baja del delgado Alta Varios

FUNDAMENTO La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1. Para anlisis de agua Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1. 5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentracin doble o triple con campana de Durham a. 5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb. 5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham b.

2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional) e 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons (opcional)e

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Frascos gotero con reactivo de Ehrlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e COLORANTES PARA TINCIN DE GRAMd

MATERIAL Y EQUIPO Mechero, a,b,c,d,e. Propipetaa. Gradillaa,b,c,e. Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c Lentes de seguridadc Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna. Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna. Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d Asa bacteriolgicab,c,d,e Portaobjetosd Microscopio pticod Termmetro calibradob Bao de agua a 44.5 0,1C.b Incubadora a 35 2,0Ca. Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca Autoclavea

NOTAS a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. d Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica. e Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica.

DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

37C 24 - 48 h

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) doble concentracin (2X)

CLSS + 20.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos positivos (produccin de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

2 a 3 asadas/tubo

2 a 3 asadas/tubo

37C 24 48 h

44.5C 24 48 h

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra Tubos con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /100 ml de muestra.

Tubos con 10.0 mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%

Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la bsqueda de Escherichia coli

PROCEDIMIENTO 1. Agua y hielo 1.1 Prueba presuntiva Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio

INOCULO (mL)

CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL) 10 o ms 10 20 10 50 35 20

VOLUMEN DE CALDO LAURIL MEDIO MAS TRIPTOSA INOCULO REQUERIDO g/L (mL) 11 o ms 20 30 30 150 135 120 35,6 71,2 53,4 106,8 106,8 124.6 142.4

CONCENTRACIN

1 10 10 20 100 100 100

1X 2X 1.5 X 3X 3X 3.5 X 4X

Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa produccin de gas, incubar 24 h. ms. 1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham. Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h..

Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes totales/100 mL.

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos con caldo EC. Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua con circulacin durante 24 a 48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.

Control de calidad para coliformes fecales 1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras. 1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas. Incubar las placas a 35C por 18-24 h. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). A partir de las cajas de agar cuenta estndar, selecionar una colonia, resuspenderla en 2 ml de solucin salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas. a. Produccin de indol (I) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona, incubarlo a 35C por 24 2 h. Finalizada la incubacin, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o Ehrlich. La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera como prueba positiva para la presencia de indol.

b. Produccin de cidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h. Finalizada la incubacin, adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.

c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h. Finalizada la incubacin , adicionar 0.6 mL de solucin KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2 mL de solucin alfa- naftol (VP2 )y agitar. Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilizacin del citrato (C) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35C por 96 h. El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser, se considera una prueba positiva.

NOTAS Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al medio SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacteriologca de forma recta. Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono, tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva Para evitar resultados falsos positivos, el inoculo no debe ser muy abundante, tanto en el caldo citrato como en el agar citrato de Simmons

1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)

FUNDAMENTO Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. a. Prueba confirmativa A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) tomar una asada de cada tubo que muestre formacin de gas y sembrar en un nmero igual de tubos con medio ECMUG. Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms. Finalizado el periodo de incubacin, irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar cuantos tubos presentan fluorescencia Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.

Control de calidad Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo. CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al procedimiento sealado en la tabla 1, para estimar la poblacin de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua. TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo. No. de Tubos positivos 0 1 2 3 4 5 95% de Lmite de Confianza (aproximado) Inferior Superior 0 3,0 0,05 6,3 0,3 9,6 0,8 14,7 1,7 26,4 4,0 Infinito

NMP/100 mL <1,1 1,1 2,6 4,6 8,0 >8,0

TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo. No. de Tubos Positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 95% de Lmite de Confianza (aproximado) Inferior Superior 0,0 3,0 0,03 5,9 0,26 8,1 0,69 10,6 1,3 13,4 2,1 16,8 3,1 21,1 4,3 27,1 5,9 36,8 8,1 59,5 13,5 Infinito

NMP/100 mL <1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12,0 16,1 23,0 >23,0

Todos los cultivos que: Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C. y se obtenga las siguientes combinaciones para las pruebas IMVIC: Biotipo 1(++--) Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli. Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporcin de los tubos positivos de la prueba confirmatoria en caldo EC.

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