IMUNODIAGNSTICO DA TOXOPLASMOSE ASPECTOS CLNICOS, PARASITOLGICOS E EPIDEMIOLGICOS Zoonose de feldeos causada pelo Toxoplasma gondii, a toxoplasmose universalmente disseminada,

, infectando principalmente aves e mamferos e, notadamente, o ser humano com nveis elevados de prevalncia. A gravidade do quadro clnico depende da virulncia da cepa parasitria e da resistncia do hospedeiro. As formas graves incluem: comprometimento ocular, forma congnita por transmisso placentria, forma de reativao observada entre indivduos imunocomprometidos. O contgio se d, predominantemente, pela ingesto de oocistos, eliminados pelas fezes de gatos ou de outros feldeos, e que podem permanecer viveis no solo por longo tempo, resistindo a variaes de temperatura e dessecao, o que torna provvel a infeco por inalao de poeiras contaminadas. Ocorre tambm pelo consumo de alimentos de origem animal, especialmente de carnes mal cozidas, contendo cistos (bradizotas) do parasito. Quando digeridos liberam respectivamente esporozotas ou taquizotas. Estes penetram nas clulas do hospedeiro reproduzindo-se rapidamente e, disseminando-se por via hematognica, localizam-se nos mais variados rgos e tecidos. A transmisso pode ocorrer, ainda, pelo transplante de rgos de doador soropositivo para receptor soronegativo, mas de maior importncia clnica a transmisso placentria e a conseqente infeco fetal. No imunocompetente a toxoplasmose, normalmente, assume carter benigno, despercebida, com sintomas brandos, pois que o rpido desenvolvimento da imunidade humoral e celular restringe eficientemente a ao patognica do parasito. Os toxoplasmas so segregados em microcistos, assumindo a forma cstica de resistncia que caracteriza a latncia do processo em sua forma crnica, habitualmente permanente por toda a vida. Deste modo, comum que a fase aguda da infeco se mantenha em nveis subclnicos, ou apenas com manifestaes semelhantes s da mononucleose, de pouca expresso clnica, embora possam ocorrer formas meningoenceflicas, pulmonares, renais, de hepatite,

miocardite, etc. A forma ocular da toxoplasmose, na fase crnica da infeco, est relacionada com a presena das formas csticas na retina, assim como fenmenos de natureza imunolgica. No imunocomprometido, porm, libertandose da ao imunolgica que o cerceia, o toxoplasma invade rgos e tecidos, onde se reproduz como taquizotas, causando as formas graves da toxoplasmose, observadas na sndrome da imunodeficincia adquirida, nas imunodepresses medicamentosas, nos transplantes, nas doenas debilitantes e, ainda, nos imunologicamente imaturos, como o feto e o recm-nascido. A reativao pode ocorrer, pois o hospedeiro uma vez infectado torna-se portador de cistos intracelulares mantidos sob controle por mecanismos inflamatrios celulares, e durante o estado de imunodeficincia o parasito pode reverter para formas de taquizotas invasivos, causando quadros graves de retinocoroidites e meningoencefalites muitas vezes fatais. A forma ocular pode manifestar-se em razo da presena de cistos latentes e de fenmenos de natureza imunolgica e a forma de maior morbidade nos casos sintomticos de infeco primria. Classicamente, o diagnstico laboratorial da toxoplasmose tem se baseado na pesquisa de anticorpos IgM e IgG contra o parasito tentando estabelecer perfis de infeco primria recente ou estado portador imune. Os testes so solicitados rotineiramente para gestantes e para pacientes sob risco de imunodeficincia, como HIV-positivos, transplantados e submetidos terapia antineoplsica. Para esses pacientes tambm importante conhecer o status imune de doadores de rgos/tecidos, pois as clulas podem estar infectadas. Entretanto, a evidenciao do parasita, por isolamento a partir do material do paciente, ou pela demonstrao de seus componentes, como antgenos ou segmentos do DNA, de alto valor diagnstico, especialmente nos imunocomprometidos. DIAGNSTICO LABORATORIAL Dentre os mtodos laboratoriais para diagnstico da toxoplasmose podemos citar: 1. Exame Parasitolgico: a) Pesquisa do Parasita ou de seus Componentes em amostras de sangue (camada leucocitria), sedimentos de lquido cefalorraquiano, lquido amnitico, lavado brnquico-

pulmonar, humor aquoso intra-ocular, triturados de bipsia ou placenta: Isolamento do toxoplasma (inoculao em camundongo, isolamento em cultura de clulas); b) Pesquisa de antgenos por tcnicas imuno-histolgicas e Reao em cadeia da polimerase (PCR). 2.Testes Sorolgicos: Teste de imunofluorescncia indireta (IF); Testes imunoenzimticos (ELISA): Teste de avidez de anticorpos IgG, IgM, IgA e IgE; Teste de Hemaglutinao; 3.Pesquisa de Imunidade Mediada Por Clulas: - Reao intradrmica toxoplasmina; PERFIS E MARCADORES SOROLGICOS O aparecimento de anticorpos para o toxoplasma, assinalado pela soroconverso dos testes sorolgicos, de negativos para positivos, traduz a resposta humoral infeco recm-adquirida. As curvas de ascenso e queda de ttulos dos diferentes anticorpos obedecem a ritmos diversos, o que vem caracterizar trs perfis sorolgicos sucessivos na evoluo da toxoplasmose. A pesquisa de IGA anti-T.gondii est associada infeco aguda e parece desaparecer antes mesmo da IgM, indicando que um bom marcador para delimitar a fase aguda. A medida do ndice de avidez dos anticorpos IgG tambm auxilia a esclarecer os casos de infeco recente. Anticorpos IgG de baixa avidez so produzidos no incio da resposta imune primria. A toxoplasmose apresenta 3 perfis distintos de marcadores humorais: O perfil I, fase aguda/recente, est presente na soroconverso recente e caracteriza-se pela presena de IgM e IgG. Pode ser til a repetio do teste com amostra coletada em intervalos de 7-20 dias para confirmar a positividade de IgM e surpreender o aumento exponencial de IgG predominantemente de baixa avidez. A deteco de IgA especfica contribui para firmar o diagnstico de fase aguda. O perfil II, de transio, apresenta elevados nveis de IgG com ndices de avidez crescentes e reduo gradativa da IgM. A IgA deve estar ausente, ou declinando a nveis indetectveis.

O perfil III, caracterstico da infeco latente ou crnica, apresenta apenas anticorpos IgG, em baixos ttulos e com elevada avidez,que em geral se mantm por toda a vida, esto ausentes os anticorpos de outros istipos, ainda que ocasionalmente se encontrem resduos de anticorpos IgM. A transio do perfil sorolgico de infeco recente para o perfil de infeco latente mais ou menos lenta, em semanas ou meses, dependendo do estado imunitrio dos pacientes. Na triagem imunolgica de gestantes, o ideal seria a realizao do ensaio antes da gravidez ou o mais precocemente possvel, facilitando a interpretao dos resultados. O teste ELISA de captura de IgM, pela elevada sensibilidade, pode mostrar positividade muito prolongada, por meses, dificultado a definio adequada da fase de infeco. Nesses casos, a ausncia de IGA, que desaparecem mais rapidamente, e o achado de elevado nvel de avidez dos anticorpos IgG podem definir o caso. Os testes diretos de deteco do parasito podem ser outra opo suplementar nessa situao. Em recmnascidos com suspeita de infeco intra-uterina, a presena de IgM pode confirmar o caso, bem como o isolamento do parasito na camada leucocitria de sangue. O diagnstico laboratorial adequado da toxoplasmose permite estabelecer a teraputica especfica, reduzindo a morbidade, letalidade e as seqelas dessa infeco. TOXOPLASMOSE CONGNITA A gravidade da toxoplasmose congnita relacionada infeco primria e idade gestacional da infeco materna, e o grau de gravidade se acentua quanto mais cedo a transmisso ocorrer na gestao. A taxa de infeco fetal de cerca de 30-40%, distribudos de acordo com a idade gestacional na ocasio da infeco materna, sendo 14-25% no 1 trimestre, 29-54% no 2os trimestre e 59-65% no 3 trimestre. A toxoplasmose durante a gravidez pode resultar em abortos e prematuros, mas os recm-nascidos em sua maioria no manifestam sinais clnicos de infeco congnita. Contudo podem apresentar seqelas mais graves mais tarde, como manifestaes oculares, hepatoesplenomegalia e as seqelas mais graves incluem microcefalia, hidrocefalia, coriorretinite, uvete, surdez e retardo no desenvolvimento psicomotor.

O diagnstico fetal pode ser feito no lquido amnitico e no sangue fetal aps, respectivamente, 20 e 22 semanas de gestao. A deteco do parasito pode ser feita no lquido amnitico. No soro do cordo umbilical podem ser feitos testes sorolgicos. O isolamento do parasito a forma mais segura de diagnstico da infeco congnita e pode ser feito a partir de tecidos da placentea, lquido amnitico e de sangue. Testes moleculares podem ser feitos no lquido amnitico, no sangue ou no LCR da criana. A PCR realizada no lquido amnitico tem mostrado alta sensibilidade e especificidade, sendo a melhor forma de diagnstico intra-uterino. A deteco de IgG e /ou IGA e/ou IgE anti-toxoplasma no soro do cordo umbilical ou no sangue do recm-nascido estabelece o diagnstico sorolgico de infeco congnita. TOXOPLASMOSE OCULAR Em geral a toxoplasmose ocular ocorre em fase tardia da infeco, o paciente apresenta um perfil da fase crnica. A leso ocular pelo toxoplasma tem como uma das marcas imunolgicas, a produo intra-ocular de anticorpos antitoxoplasma: a carga de anticorpos IgG (ttulo/mg de IgG) no humor aquoso resulta maior do que a carga respectiva no soro, o que expresso por ndice de Desmonts-Witmer, dado pelo quociente entre ambas as cargas. A baixa avidez dos anticorpos IgG no humor aquoso constitui outro bom marcador de toxoplasmose ocula, no raro cm contraste com uma alta avidez no soro. A presena de IGA ou IgM para Toxoplasma, no humor aquoso, parece representar tambm um bom marcador de toxoplasmose ocular, porm, de maior valor diagnstico a avaliao comparativa de perfis de anticorpos no humor aquoso ou vtreo e no soro atravs de immunoblot. Diferentes bandas antignicas so detectadas na toxoplasmose ocular pelos anticorpos presentes no humor aquoso. Outra possibilidade a identificao do DNA intra-ocular pela PCR.

Profa. Dra. MIRIAM LEANDRO DORTA TESTE DE HEMAGLUTINAO PASSIVA Hemcias esto entre os melhores suportes de antgenos para os testes de aglutinao, pois h uma srie de antgenos que pode ser ligada sua superfcie para fornecer um sistema indicador sensvel na deteco de anticorpos. Por serem de fcil obteno, empregam-se preferentemente hemcias de carneiro ou humanas do grupo O fixadas com formaldedo ou glutaraldedo, o que resolve o problema da fragilidade e permite que sejam estocadas por longos perodos. Antgenos polissacardicos prontamente aderem a hemcias, enquanto antgenos proticos requerem pr-tratamento com cido tnico ou cloreto de cromo. Aps a sensibilizao com a concentrao adequada de antgeno, as hemcias so suspensas em solues estabilizadoras, que evitam reaes inespecficas sem diminuir a capacidade de aglutinao especfica. s diluies de soro, em cavidades de placas plsticas, adicionam-se as hemcias, que aps cerca de 1 hora mostramse aglutinadas para os soros reagentes. Os ttulos so expressos pela maior diluio reagente. O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e considerado positivo quando se verifica a formao de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em V, e negativo quando as hemcias sedimentam formando um boto compacto. O ttulo da amostra testada ser a mxima diluio em que ainda se observa a formao do tapete. Para se detectarem anticorpos IgM, repete-se o teste com os soros previamente diludos em soluo de 2-mercaptoetanol, que inativa os anticorpos IgM. Assim, uma significativa reduo do ttulo indica a presena destes. Aps a remoo de IgG das amostras, por precipitao com anti-IgG, o teste de hemaglutinao mostra maior sensibilidade para anticorpos IgM, podendo detect-los mesmo em soros com altos ttulos de anticorpos IgG, nos quais, sem esta remoo, poderia no ser relevante a diferencial de ttulos aps o tratamento com 2mercaptoetanol. O teste detecta anticorpos das classes IgG e IgM e, embora os anticorpos IgM sejam 750 vezes mais eficientes na aglutinao do que os IgG, a quantidade de antgeno necessria para se obter a mxima reatividade com IgM muito maior do que a necessria para a mxima reatividade com IgG. H vrios sistemas comerciais para a pesquisa de anticorpos que utilizam esta tcnica, entre eles os sistemas de Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, etc. TCNICA DE REAO DE HEMAGLUTINAO 1. MTODO: Hemaglutinao Indireta (HAI). 2. FINALIDADE: Detectar anticorpos contra Toxoplasma gondii por hemaglutinao indireta. Somente para uso diagnstico in vitro. Kit para determinao Qualitativa e Semi-quantitativa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii no soro por Hemaglutinao Indireta

3. PRINCPIOS DO MTODO: Os anticorpos especficos contidos nos soros de pessoas que tiveram contato com Toxoplasma gondii aglutinam hemcias sensibilizadas com antgenos provenientes do parasito. 4. FUNDAMENTO: Eritrcitos estabilizados de aves e sensibilizados com componentes antignicos do Toxoplasma gondii altamente purificados so aglutinados pelos anticorpos anti-Toxoplasma gondii presentes na amostra analisada. PROCEDIMENTO DO TESTE Notas 1- Usar exclusivamente a placa do kit e no reutilizar as cavidades. 2- Recomenda-se que todos os resultados positivos sejam confirmados por outro mtodo diagnstico. 3- So aceitveis variaes de um ou dois ttulos para um mesmo soro nas reaes de hemaglutinao. 4- Excesso de incubao do soro com 2-mercaptoetanol (mais de 60 minutos) facilita a gelidificao parcial do soro. 5- As amostras devem estar em temperatura ambiente antes do uso e no necessitam de qualquer tratamento prvio.

Teste Qualitativo

Objetivo: Fazer triagem e detectar os soros no reagentes. 1- Colocar a placa de microtitulao sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas. 2- Usar uma cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. 3- Diluir em tubo de ensaio: 310 L do Diluente (2) + 10 L da amostra (diluio 1/32). 4- Pipetar 25 L do Controle Positivo (P) e 25 L do Controle Negativo (N) nas cavidades A1 e A2. Ateno: No diluir os soros controles. 5- Pipetar 25 L da diluio 1/32 de cada amostra para as respectivas cavidades da placa. 6- Adicionar 25 L da Suspenso de Hemcias (1) homogeneizada em cada cavidade contendo os soros controles e as amostras de pacientes. 7- Agitar a placa por vibrao mecnica (agitador de placas) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3 a 4 minutos. 8- Deixar a placa sobre o pano mido em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibraes. 9- Fazer a leitura. LEITURA E INTERPRETAAO DOS RESULTADOS Reao Negativa: As hemcias se depositam no fundo da cavidade com um formato semelhante a um boto. Significa ausncia de anticorpos especficos anti-Toxoplasma gondii ou que estes existem abaixo do limite de deteco.

Reao Positiva: As hemcias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, s vezes com bordas irregulares. Significa presena de anticorpos especficos anti-Toxoplasma gondii.

Teste Semi-Quantitativo

Objetivo: Titular os soros que apresentaram reao positiva no teste qualitativo. 1- Colocar a placa de microtitulao sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas. 2- Preparar diluio do soro com resultado positivo no teste qualitativo a 1/32 conforme item 3 do Teste Qualitativo. 3- Pipetar 25 L do Diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa at a diluio que se pretende estudar. Exemplo: Se for diluir o soro at 1/512, pipetar 25 L do diluente nas cavidades A2, A3, A4 e A5. No pipetar na A1. 4- Pipetar 25 L da diluio 1/32 da amostra positiva na primeira e segunda cavidade (A1 e A2) da microplaca. 5- Homogeneizar bem o soro com o diluente na segunda cavidade (diluio 1/64) e transferir 25 L para a terceira cavidade (diluio 1/128) e assim sucessivamente, desprezando no final 25 L da mistura. 6- Pipetar 25 L da Suspenso de Hemcias (1) devidamente homogeneizada em todas as cavidades contendo amostras. Aps a adio das hemcias teremos diluies de 1/32 (A1) at 1/512 (A5). 7- Agitar suavemente a placa por vibrao mecnica ou batendo com os dedos nas bordas da placa durante 3 a 4 minutos. 8- Deixar a placa sobre o pano mido em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibraes. IMPORTANTE. 9- Fazer a leitura. Ver Teste Qualitativo. INTERPRETAAO DOS RESULTADOS Ttulo da Amostra -Maior diluio que apresentar uma reao positiva. O ponto final quando o tapete de hemcias cobre 50% do fundo da cavidade.

DETERMINAO DE INFECO RECENTE (IgM) OU PRESENA DE ANTICORPOS INESPECFICOS Nos testes de hemaglutinao, o uso do 2-Mercaptoetanol possibilita a diferenciao de infeco recente ou presena de anticorpos inespecficos. Teste com 2-Mercaptoetanol a) Preparo do 2-Mercaptoetanol: Misturar 7 L de 2-Mercaptoetanol com 1000 L de Diluente. b) Tratamento do soro: Pipetar em um tubo de ensaio 10 L de soro inativado ou no e adicionar 310 L da soluo de 2-Mercaptoetanol diluda (corresponde a uma diluio 1/32). Incubar a mistura a 37 C por 1 hora. c) Realizar o teste do soro tratado com 2-Mercaptoetanol sempre em paralelo ao teste semi-quantitativo, seguindo o seguinte protocolo: 1- Colocar a placa de microtitulao sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas. 2- Pipetar 25 L do Diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa at a diluio que se pretende estudar. Exemplo: Se for diluir o soro at 1/512, pipetar 25 L do diluente nas cavidades A2, A3, A4 e A5. No pipetar na A1. 3- Pipetar 25 L do soro tratado com 2-Mercaptoetanol (diluio 1/32) na primeira e segunda cavidades (A1 e A2) da microplaca. 4- Homogeneizar bem o soro tratado com o diluente na segunda cavidade (diluio 1/64) e transferir 25 L para a terceira cavidade (diluio 1/128) e assim sucessivamente, desprezando no final 25 L da mistura. 5- Pipetar 25 L da Suspenso de Hemcias (1) devidamente homogeneizada em todas as cavidades contendo amostras. Aps a adio das hemcias teremos diluies de 1/32 (A1) at 1/512 (A5). 6- Agitar suavemente a placa por vibrao mecnica ou batendo com os dedos nas bordas da placa durante 3 a 4 minutos. 7- Deixar a placa em repouso sobre o pano mido por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibraes. IMPORTANTE. 8- Fazer a leitura. Ver Teste Qualitativo. INTERPRETAAO DOS RESULTADOS Ttulo da Amostra: Maior diluio que apresentar uma reao positiva. O ponto final quando o tapete de hemcias cobre 50% do fundo da cavidade. INTERPRETAAO DOS TESTES Soro no tratado e soro tratado com 2-Mercaptoetanol 1- Se os resultados dos dois (2) testes forem negativos indica que o paciente no teve contato com Toxoplasma gondii. Havendo suspeita de infeco recente, deve-se repetir o teste com nova amostra no intervalo de 15 dias. 2- Se nos dois (2) testes forem obtidos resultados com ttulos elevados indica a presena de anticorpos da classe IgG. 3- Se for observada uma queda de 2 ou mais ttulos do soro tratado em relao ao no tratado significa uma provvel infeco recente (presena de IgM).

4- Se o ttulo do soro tratado e do no tratado com 2-Mercaptoetanol forem semelhantes (menos de 2 diluies) significa uma provvel toxoplasmose pregressa. Ateno Este resultado no exclui infeco recente (presena de anticorpo IgM). Neste caso, deve-se empregar tcnicas mais sensveis (Imunofluorescncia ou ELISA) para detectar IgM. 5-Se os ttulos forem baixos no soro no tratado e negativo com o soro tratado com 2Mercaptoetanol, deve-se afastar a presena de anticorpos inespecficos, devendo repetir o teste com nova amostra aps 1 a 2 semanas e observar se ocorre aumento do ttulo.