Validacin de los mtodos microbiolgicos CARACTERISTICAS DE LOS RESULTADOS DE MEDICION DE METODOS MICROBIOLOGICOS

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos de la clase
Conceptos de precisin, veracidad o justeza y exactitud en mtodos microbiolgicos. Estudios de intercomparacin: tipos, caractersticas generales. Incertidumbre de medicin: Concepto, clculo, expresin en le resultado.

La naturaleza y la forma en que se comportan los microorganismos determina las caractersticas de los resultados obtenidos por los mtodos microbiolgico. En general la distribucin de los microorganismos podra describirse mediante modelos estadsticos, como cantidad de microorganismos por unidad de volumen o peso ( Distribucin de Poisson)

 Qu caractersticas tienen los resultados de medicin mtodos microbiolgicos cuantitativos cuando los repito? Qu caractersticas Tienen que tener?

Caractersticas de los resultados de medicin METODOS MICROBIOLOGICOS CUANTITATIVOS

ISO 5725 (trueness and precision) of measurement methods and results

PRECISIN: proximidad entre resultados de mediciones independientes del mismo mensurando, bajo condiciones estipuladas.

PRECISIN:
Repetibilidad (r): Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en las mismas condiciones de medicin. (ISO Vocabulario internacional de trminos bsicos y generales de la metrologa: 1993) Reproducibilidad (R): Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en diferentes condiciones de medicin. (ISO Vocabulario internacional de trminos bsicos y generales de la metrologa: 1993).

PRECISIN:

Resultados precisos

Resultados imprecisos

JUSTEZA O VERACIDAD (TRUENESS): Grado de concordancia entre el promedio de una gran serie de mediciones y el mesurando (ISO 5725). Proximidad entre el promedio de una gran serie de mediciones y el valor de referencia.

SESGO (bias): resultado de la medicin menos el valor de referencia o valor asignado.

Valor verdadero: valor en consistencia con la definicin de una magnitud Concepto abstracto, no realizable en la prctica.

Error de medicin: resultado de la medicin menos el valor verdadero.

EXACTITUD Definicin: es el grado de concordancia entre el resultado de una medicin y el valor del mensurando PRECISIN + JUSTEZA

EXACTITUD

Ejemplo: Precisin. Justeza y Exactitud

Resultados precisos y No justos: No exactos

Resultados imprecisos y justos: No exactos

Resultados imprecisos y No justos: No exactos

Resultados precisos y justos: exactos

El laboratorio microbiolgico tiene la responsabilidad de garantizar que los resultados que l produce sean exactos, validos y confiables de modo de poder tomar una decisin acerca de la inocuidad y calidad sanitaria de los alimentos.

CARACTERSTICA CUALITATIVA
JUSTEZA O VERACIDAD (TRUENESS): PRECISIN: Repetibilidad Reproducibilidad EXACTITUD

EXPRESIN CUANTITATIVA Sesgo (bias), desvio, error sistemtico Desviacin estndar

Incertidumbre

Desvio standard experimental

Es la expresin cuantitativa de la precisin.

En la prctica: Calculadora n-1 en Excel DESVEST

Cmo determino en la prctica el VALOR VERDADERO? Valor convencionalmente verdadero, o valor asignado o valor de referencia (vREF). El valor asignado o valor de referencia lo obtenemos de: Estudios intercomparacin (Ensayos de Aptitud Interlaboratorio, Estudios colaborativos) o Cepas de referencia certificadas (2da opcin es difcil de obtener en microbiologa)

DESVIO (BIAS) Clculo en la prctica es: Resultado de la medicin menos el valor de referencia o asignado. BIAS= x- vREF

Ensayos de Aptitud Interlaboratorio Mtodos cuantitativos (Proficiency Testing) :

ESTUDIOS DE INTERCOMPARACIN : La intercomparacin es una herramienta muy valiosa como evaluacin externa cuantitativa de la calidad de los laboratorios.
Ejemplo ensayos de aptitud interlaboratorio. Norma en las que se basan el laboratorio proveedor de interlaboratorio: Gua ILAC G13 o ISO 43. Anlisis de resultados de los interlaboratorios: Z-score ISO/DIS13528 Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons.

Proveedor de estudios colaborativos Prepara las muestras con diferentes niveles de analito. Establece el protocolo que deben cumplir los participantes de la intercomparacin. Instructivo de anlisis de muestra, fecha de realizacin anlisis y envo de los resultados, etc. Enva las muestras.

Ejecucin de los ensayos de aptitud:

Es fundamental enviar muestras homogneas y estables Se realizan ensayos y pruebas estadsticas antes del envo para asegurar la homogeneidad y estabilidad del material enviado. Los resultados obtenidos por los laboratorios participantes deben ser enviados al organizador quien los evala. El organizador confecciona y enva un informe con informacin sobre el anlisis y evaluacin de los resultados de todos los laboratorios participantes.

Segn el objetivo que persiguen podemos tener diferentes tipos de estudios de intercomparacin : Ejercicios de ensayos de aptitud interlaboratorio. Estudios colaborativos. Estudios de certificacin.

ENSAYOS DE APTITUD INTERLABORATORIO:

Estn abiertos a todos los laboratorios que quieran participar y pueden ser obligatorios debido a procesos de acreditacin. Nos permiten evaluar la aptitud de un laboratorio para realizar el ensayo. Se usa como herramienta de ASEGURAMIENTO DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO.

ESTUDIOS COLABORATIVOS: Estn dirigidos a laboratorios especializados, con experiencia y calidad reconocida. Estos laboratorios son seleccionados por el organismo que gestiona el ejercicio. Cada laboratorio debe seguir en forma estricta un protocolo previamente consensuado para realizar el mtodo. Los estudios colaborativos permiten VALIDAR MTODOS.

ESTUDIOS DE CERTIFICACIN: Estn dirigidos a laboratorios especializados, con experiencia y calidad reconocida. Estos laboratorios son seleccionados por el organismo que gestiona el ejercicio. Los estudios de certificacin tienen como objetivo la PREPARACIN (y posterior comercializacin) DE MATERIALES DE REFERENCIA CERTIFICADOS.

Evaluacin de los resultados obtenidos en los estudios de intercomparacin mtodos cuantitativos: Eliminacin de los valores aberrantes segn Grubbs y Cochran Norma ISO-FIL 135B:1991. Prueba de Z score. ISO/DIS13528 Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons.

En microbiologa los valores de ufc/ml o g se distribuyen dando una curva asimtrica.

DISTRIBUCION NORMAL

Para normalizarla se usa logaritmo en base 10.

LOG 10 La distribucin Normal est definida por y

16% 2,25%

68% 95,5%

16% 2,25%

-2

+2

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>

ESTIMACIN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIN EN MICROBIOLOGA Definicin: la incertidumbre de medicin es un parmetro asociado al resultado de la medicin, que caracteriza la dispersin de los valores que podran ser razonablemente asignados al mesurando.

NOS PERMITE TENER CONOCER AL MESURANDO.

ESTIMACIN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIN EN MICROBIOLOGA

Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para estimar la incertidumbre de medicin. La estimacin de las incertidumbres en las medidas y resultados en los laboratorios de microbiologa de alimentos es parte importante del control de calidad interno de los resultados obtenidos. Es una indicacin cuantitativa de la calidad del resultado INDICA LA CALIDAD DE LA MEDICIN Da idea de la confiabilidad del resultado.

INCERTIDUMBRE????
Pregunta: Qu es el resultado de una medicin cuantitativa? Respuestas: 1.Un registro de calidad. 2.Un criterio de aceptacin rechazo. 3.Una comparacin. 4.Un nmero ( unidades) 5.Ninguna de las anteriores es correcta. Respuesta correcta es la 5:no es un nmero sino un intervalo de nmeros.

INCERTIDUMBRE DE MEDICIN Y CUMPLIMIENTO DE ESPECIFICACIONES

Rango de especificacin

A Declaracin de no cumplimiento con la especificacin. B C Limitarse a informar los resultados y su incertidumbre (INDETERMINADO)

D Declaracin de cumplimiento con la especificacin.

Un laboratorio de ensayo competente debe estar en condiciones de poder brindar una afirmacin sobre la incertidumbre de los resultados de los ensayos realizados

Primer Paso: IDENTIFICACIN DE LAS FUENTES DE INCERTIDUMBRE: Se enumeran las posibles fuentes de incertidumbre que pueden afectar el resultado de un ensayo: 1. TCNICAS/INSTRUMENTOS. Asociadas: al material de referencia. a la uniformidad de la distribucin de los microorganismos en la muestra a la exactitud de los equipos utilizados para establecer medida de masa y volumen. al mezclado de las muestras. al volumen usado. a la calidad de medio de cultivo a las condiciones de incubacin a la lectura e interpretacin de los resultados a las pruebas confirmatorias

IDENTIFICACIN DE LAS FUENTES DE INCERTIDUMBRE (cont) :

2. HUMANAS: Asociadas: a la lectura de placas. a la experiencia y pericia del personal en la interpretacin de los resultados. a la reproducibilidad de las determinaciones por cambio de observadores, a los instrumentos u otros elementos.

IDENTIFICACIN DE LAS FUENTES DE INCERTIDUMBRE (cont) 3. AMBIENTALES:

Asociadas: a las condiciones atmosfricas, temperatura y humedad, polvo. a las contaminaciones biolgicas. a las vibraciones. interferencias electromagnticas.

Segundo Paso: Formas de clculo Incertidumbre :

CUANTIFICACIN DE CADA COMPONENTE DE LA INCERTIDUMBRE. CASO 1:Para la cuantificacin de la incertidumbre se tiene en cuenta los componentes tipo A y tipo B: Evaluacin tipo A: Evaluacin estadstica de la incertidumbre estndar.
Se estima una desviacin estndar, la cual se obtiene estadsticamente utilizando mediciones repetidas, actuales o previas.

Evaluacin tipo B: Evaluacin no estadstica de la incertidumbre estndar.

Se utiliza toda la informacin disponible para calcular la variabilidad de cada fuente de incertidumbre

Fuentes de informacin para el clculo:

Datos obtenidos de mediciones previas. Especificaciones del fabricante. Datos provenientes de los certificados de calibracin. Datos tomados de manuales, registros, etc. Experiencia o conocimiento general del comportamiento y propiedades relevantes de los materiales e instrumentos.

Formas de clculo Incertidumbre (cont):

CASO 2: Se calcula la incertidumbre estndar considerando los datos de validacin y aseguramiento de calidad del mtodo: La incertidumbre se estima combinando cuadrticamente la desviacin estndar repetibilidad (Sr) y de reproducibilidad (SR)

Formas de clculo Incertidumbre (cont):

Para el caso 1 y 2: La contribucin de los distintos componentes de la incertidumbre deben quedar expresados como un desvo estndar Tercer Paso: INCERTIDUMBRE COMBINADA (uc): es la raz de las varianzas totales. Ejemplo: caso 2 uc=Sr2+SR2 Cuarto Paso: INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Ue): es la incertidumbre total uc multiplicada por el factor k = 2. Ue= uc x k

Cuarto Paso (cont):

Expresin del resultado de un ensayo y su incertidumbre asociada: El resultado (Rdo) se expresa asociado a la Ue. De la siguiente manera: Rdo + Ue (es un intervalo)

Expresin de la Incertidumbre en microbiologa

x ucR 1.1 x 104 ufc/g 12% ufc/g 24% ufc/g 1.1 0.3 x 104 ufc/g 0.8 x 104 a 1.4 x 104 ufc/g 1.1 x 104 24% ufc/g
Ejemplo: Recuento total en leche en polvo

UeR Resultados

Documentos para Estimacin de la incertidumbre de medicin en microbiologa

Referencias: EURACHEM / CITAC Guide. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. CAEAL. Policy on the Estimation of Uncertainty of Measurement in Environmental Testing. NMKL Procedure N 8 (1999) Measurement of uncertainty in microbiological examination of foods. UKAS Publication ref: LAB 12. The Expression of Uncertainty in Testing. Seppo 1. Niemela Uncertainty of quantitative determinations derived by cultivation of microorganisms Publication J3/2002ADVISORYCOMMISSION FOR METROLOGY Chemistry Section Expert Group for Microbiology

Con una frecuencia establecida por el laboratorio se revisa, se incorporan nuevos datos y se recalcula la incertidumbre para cada parmetro.

Se elabora un informe conteniendo toda la informacin relacionada con el clculo y los resultados obtenidos de incertidumbre para el ensayo.

El clculo de la precisin y exactitud de un mtodo microbiolgico cuantitativo, nos indica la calidad de la medicin realizada por el laboratorio y, por lo tanto, nos da idea de la confiabilidad de los resultados. Como veremos ms adelante, dicho clculo se puede realizar usando los datos obtenidos de los estudios de validacin y aseguramiento de calidad.

Graciasporsuatencin