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ABSTRACT: Over the last 30 years, therapeutic monoclonal antibodies have become an increasingly important component of pharmacotherapy. Methods to generate monoclonal antibodies to antigens of neoplastic cells have revolutionized our understanding of cancer cell growth and differentiation, diagnosis, and treatment. Monoclonal antibodies have been critical reagents for the discovery and characterization of many key molecules involved in the behavior of neoplastic cells. Currently, monoclonal antibodies are widely used in the differential diagnosis of cancer and are key elements in the treatment of many forms of cancer. This review will focus on the roles that monoclonal antibodies play in the treatment of hematological malignancies. In particular, will be focused on acute myeloid leukemia and mature Bcell neoplasms. Key Words: monoclonal antibody, hematological malignancies, lymphoma, leukemia.

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RESUMO: Nos ltimos 30 anos, os anticorpos monoclonais para fins teraputicos tornaram-se componentes cada vez mais importantes na farmacoterapia. Os mtodos para gerar anticorpos monoclonais para antgenios de clulas neoplsicas tm revolucionado a nossa compreenso sobre o crescimento e a diferenciao de clulas cancergenas, o seu diagnstico e tratamento. Os anticorpos monoclonais foram reagentes crticos para a descoberta e caracterizao de muitas molculas chave envolvidas no comportamento de clulas neoplsicas. Atualmente, os anticorpos monoclonais so amplamente utilizados no diagnstico diferencial do cancro e so elementos chave no tratamento de muitas formas de cancro. Esta reviso vai-se focar nas funes que os anticorpos monoclonais, aprovados at data, desempenham no tratamento de doenas hematolgicas. Em particular, vai-se focar na leucemia mielide aguda e neoplasias das clulas B maduras. Palavras-chave: Anticorpos monoclonais, neoplasias hematolgicas, linfoma, leucemia.

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NDICE 1 Introduo ---------------------------------------------------------------------------------------- --4 2 Mtodos--------------------------------------------------------------------------------------------5 3 Anticorpos Monoclonais -----------------------------------------------------------------------6 3.1 Definio ---------------------------------------------------------------------------------------6 3.2 Obteno --------------------------------------------------------------------------------------9 3.3 Mecanismo de Ao -----------------------------------------------------------------------19 3.4 Aplicao em Neoplasias Hematopoieticas-------------------------------------------21 3.4.1 Leucemia Mielide Aguda--------------------------------------------------------------22 3.4.2 Linfoma No-Hodgkins------------------------------------------------------------------26 3.4.3 Leucemia Linfocitica Crnica ---------------------------------------------------------36 3.5 Vantagens e Inconvenientes -------------------------------------------------------------43 3.6 Perspectivas Futuras de Utilizao -----------------------------------------------------45 4 Concluso --------------------------------------------------------------------------------------47 5 Bibliografia ------------------------------------------------------------------------------------48 6 Agradecimentos ------------------------------------------------------------------------------53

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1 INTRODUO Nas ltimas 3 dcadas, os Anticorpos monoclonais (AcsM) tornaram-se cada vez mais importantes para a farmacoterapia e tiveram um impacto significativo sobre a descoberta de frmacos e no desenvolvimento de processos. Estima-se que mais de 500 AcsM esto actualmente em desenvolvimento, e que cerca de 30 AcsM encontram-se aprovados pela Food and Drug Administration (FDA). A maioria dos que j esto aprovados so para indicaes oncolgicas, mas a aplicao teraputica est a alargar-se para doenas auto-imunes, respiratrias, metablicas e do sistema nervoso central. Uma consequncia importante da expanso da terapia com AcsM a sua coadministrao com regimes farmacoteraputicos estabelecidos.(1) At data, existem seis AcsM aprovados pela FDA para o tratamento de neoplasias hematolgicas, o seu uso teraputico levou melhoria dos resultados e a uma diminuio da toxicidade relativamente aos regimes de quimioterapia convencionais. A reduo da toxicidade resulta da sua especificidade para as clulas neoplsicas afetando pouco as clulas no neoplasicas.(2) Este trabalho vai-se focar principalmente nos AcsM aprovados pela FDA para uso teraputico nas neoplasias hematolgicas, nomeadamente na leucemia mielide aguda e neoplasias das clulas B maduras.

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2. MTODOS: Nesta reviso, os suportes bibliogrficos utilizados consistem em artigos cientficos, livros e Web sites. A obteno de artigos foi possvel atravs de pesquisas no PubMed com vrias combinaes de diversas palavras-chave, nomeadamente, Antibody, Monoclonal antibody, Hematological malignancy, Lymphoma, Non-Hodgkin lynphoma, follicullar lymphoma, Leukemia, Acute myeloid leukemia, Chronic lymphocitic leukemia, CD20, CD33, CD52 Rituximab, Ofatumumab, Alemtumumab, Gemtuzumab, Lintuzumab, Ibritumomab Tiuxetan, Tozitumomab, Brentuximab, Campath, Mylotard, Zevalin, Rituxan, Bexxar, Adcetris, Radioimmunotherapy, immunoconjugate. Nos artigos obtidos com este mtodo, certificou-se a existncia de publicaes relevantes e/ou Web sites nas suas bibliografias e, nesse caso, procedeu-se pesquisa para obter o artigo, no PubMed ou Google. Quando o acesso ao artigo completo foi restrito, considerou-se o resumo do mesmo, apesar da informao ser limitada. Alguns Web sites tambm remeteram para outros. Para justificar a falta de qualquer contribuio relevante, note-se que este procedimento foi conduzido desde a segunda quinzena de Agosto de 2011 at ltima semana de Dezembro de 2011.

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3 ANTICORPOS MONOCLONAIS: 3.1 DEFINIO Os anticorpos (Acs) so molculas de imunoglobulina bivalente com forma de Y do sistema imunitrio dos vertebrados (Figura 1), que exibem um nvel extremamente elevado de diversidade na especificidade de ligao a antignios (Ags) alvo. Isto devese ao seu domnio varivel (V), que consiste numa sequncia de aminocidos nica presente nas suas cadeias leves e pesadas, que reconhece diferentes Ags e que so gerados por inmeros rearranjos do DNA cromossomal durante a maturao dos linfocitos B.(3)

Fig. 1- Estrutura geral de IgG e suas regies crticas para cada funo.

Em 1975, os investigadores Georges Khler e Cesar Milstein conseguiram, ao fundir clulas de mieloma com linfocitos B produtores de Acs com determinada especificidade, criar um novo tipo de clula, designada por hibridoma, que se multiplica em cultura, mantendo uma linha celular imortal e produtora de Acs com

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uma determinada especificidade, os AcsM. Os AcsM so uma preparao pura de Acs que so especificos para um nico Ag. (4) Inicialmente, os AcsM eram de origem murina e eram gerados atravs da tecnologia de hibridoma. Devido s diferenas entre o sistema imunitrio humano e o do rato, estes AcsM eram geralmente (embora nem sempre) ineficazes no tratamento do cancro em humanos, devido impossibilidade de se administrar infuses repetidas. Os avanos tecnolgicos na engenharia de protenas recombinantes e ratos transgnicos levaram ao desenvolvimento de AcsM quimricos, humanizados e totalmente humanos, o que ajudou a resolver estas limitaes e acelerou o desenvolvimento de Acs com uso teraputico. (5) Os AcsM murinos derivam inteiramente de ratos usando a tecnologia do hibridoma, que envolve a fuso de clulas de mieloma imortalizadas com clulas B de ratos imunizados. Nos seres humanos, estes Acs tm utilidade clnica limitada, porque tm uma semi-vida curta quando em circulao, so imunognicos e dificilmente induzem respostas imunes efetoras nos humanos. A sua principal utilizao tem sido a de servirem como agentes alvo para radioistopos ou citotoxinas que matam as clulas tumorais alvo. Actualmente existem somente dois Acs murinos radiomarcados aprovados para uso na terapia oncolgica, o ibritumomab tiuxetan e o tositumomab.(5) O desejo de reduzir a imunogenicidade e aumentar a eficincia imunolgica dos Acs levou produo de AcsM quimricos e humanizados. Os AcsM quimricos so construdos fundindo as regies variveis de murino com as regies constantes de humano. Os AcsM humanizados foram construdos enxertando Acs humanos com

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regies de ligao a Ags de murino. A maioria dos AcsM aprovados para a teraputica do cancro so humanizados. (5) Os AcsM totalmente humanos foram desenvolvidos para reduzir ainda mais a imunogenicidade associada aos AcsM quimricos, os quais ainda mantm alguns componentes murinos. Estes so produzidos usando ratos transgnicos (animais transgnicos portadores de um sistema imunitrio "humano"). O panitumumab e o ofatumumab so dois AcsM totalmente humanos que se encontram aprovados para uso clnico.(5) Embora existam vrias classes / subclasses de imunoglobulinas em humanos, atualmente os Acs para fins teraputicos so na sua maioria do isotipo IgG1, devido sua semi-vida srica longa e a sua grande capacidade de desempenharem funes efetoras, relativamente s outras classes / subclasses.(6) A estrutura bsica da IgG1 humana um heterodmero de ~ 150 kDa, constitudo por duas cadeias leves e duas pesadas em associao covalente e no-covalente, dividido em trs partes de protenas independentes: dois domnios Fab e um domnio Fc, ligados por um polipeptido flexvel formando a regio hinge (Figura 1). Os N-terminais de cada cadeia leve e pesada encontram-se ligados s regies variveis (VL e VH), que determinam a sua afinidade / especificidade de ligao s molculas de Ag. O resto da molcula de Ac, conhecida como a regio constante, consiste num domnio CL, constituinte da cadeia leve, e um domnio CH, dividido nas regies CH1, hinge, CH2 e CH3, constituindo a cadeia pesada. Enquanto a regio varivel determina a ligao aos Ags alvo, o domnio Fc que desencadeia as funes efetoras ligando-se a recetores celulares tipo Fc (FcRI, FcRII e FcRIII) e ao componente C1q do complemento. (6)
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3.2 OBTENO O mtodo convencional de obteno de AcsM, foi descrito por Kholer & Milstein, em 1975. Este mtodo comea com a imunizao de ratinhos com um determinado Ag, a obteno das clulas B produtoras de Acs com a especificidade seleccionada e que, ao fundirem-se com um plasmcito de mieloma, vai originar hibridomas, cada um deles produtor de Acs rigorosamente iguais e com igual especificidade para um s dos epitopos (grupo qumico determinante) do Ag. Cada hibridoma, depois de isolado, vai multiplicar-se, assegurando a produo de um determinado AcM (Figura 2). Pela primeira vez foi possvel obter AcsM, homogneos, da mesma classe e com a mesma especificidade, produzidos por hibridomas que so clulas estveis, que se reproduzem em cultura, com carcter de continuidade ilimitado, o que assegura uma produo fcil e praticamente ilimitada de AcsM.(4)

Fig. 2- Mtodo convencional de obteno de AcsM.

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A produo de AcsM em clulas de mamferos consiste num longo processo que envolve as etapas de transfeo do gene de interesse para o interior das clulas, seleo de clones, a adaptao a diferentes condies de cultura, cultura em biorreatores e aumento de escala at ao nvel industrial.(7) O processo comea com o desenvolvimento duma linhagem celular adequada. Se o objetivo for a produo de pequenas quantidades de AcsM, as clulas de rim do macaco verde Africano so as mais apropriadas. No entanto, no so as mais adequadas para processos de produo em larga escala, uma vez que perdem capacidade de produo ao longo do tempo. (8) Nesse caso, as clulas mais utilizadas atualmente para esta aplicao so as clulas de ovrio de hamster chins, uma vez que tm as vantagens de serem seguras para uso em seres humanos, apresentam facilidade de transfeo, possuem um poderoso sistema de amplificao de genes, tm facilidade de adaptao para o crescimento em suspenso e em meio livre de soro, e a capacidade de crescer em altas densidades.(7) As clulas de hibridoma foram muito usadas durante vrias dcadas na produo de AcsM, no entanto, so cada vez menos usadas devido sua sensibilidade s alteraes ambientais e aos compostos txicos formados durante o crescimento celular, o que dificulta a sua cultura em grande escala. (8) A transfeo consiste na introduo do DNA nas clulas e envolve vrias etapas, desde a concepo do vetor de expresso, da definio do mtodo de transfeo (sistema de expresso e de sistema de entrega de DNA) at seleo das clulas transfetadas com as caractersticas mais desejveis.(8)

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Os vetores devem exibir trs caractersticas principais: nveis de expresso independentes do seu local de integrao no genoma, nveis de expresso correlacionados com o nmero de cpias do transgene integrado e a manuteno da eficincia de expresso ao longo do tempo. Devido a estes requisitos, os vetores usados so normalmente plasmdeos. Os plasmdeos so molculas circulares de DNA, que existem nas clulas bacterianas para alm do seu cromossoma principal, e como possuem pelo menos uma origem de replicao podem replicar-se dentro das clulas.(7) A capacidade de expressar genes em clulas de mamferos requer o uso de dois tipos de elementos: os promotores, que conduzem a expresso do gene recombinante, promovendo e posicionando o inicio da transcrio; e os potenciadores (enhancers), que aumentam a transcrio. Os promotores/potenciadores mais utilizados so provenientes do vrus smio 40 (VS40) e do citomegalovrus (CMV). (7) Para estabilizar e promover a translao do transcrito primrio podem ser usados sinais de poliadenilao, sequncias de Kozac e sequncias intervenientes. Os sinais de poliadenilao derivados de VS40 e da hormona de crescimento bovina so os mais usados e pensa-se que prolongam a meia-vida do RNAm no citoplasma e permitem a translao eficiente. A sequncia de Kozac ptima para circundar o codo de iniciao dos genes dos mamferos e usada para melhorar a iniciao translacional do RNAm do gene de interesse. As sequncias intervenientes consistem em intres que so includos nos vectores de expresso. (7) As molculas de plasmideo vo ser integradas aleatoriamente no genoma hospedeiro, e o local de integrao vai influenciar a taxa de transcrio do gene recombinante, um
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fenmeno conhecido como Efeito da Posio. Dependendo da cromatina circundante ao local de integrao, a expresso do produto pode ser alta, baixa ou mesmo nula. Para ultrapassar o efeito da posio, foram desenvolvidas vrias estratgias, tais como o uso de elementos anti-repressores a flanquear os vetores, a integrao de vetores em loci cromossomais especficos com cromatina aberta (altamente transcritas) ou o uso de factores regulatrios nucleares. (7;8) A introduo do gene pretendido na clula hospedeira de mamfero pode ser realizada por diversos mtodos, de forma transiente ou estvel, dependendo da aplicao pretendida e de factores tcnicos e econmicos. (7) A produo de AcsM para fins clnicos ou comerciais normalmente efectuada por transfeo estvel, uma vez que possvel obter uma expresso contnua do produto por perodos de tempo prolongados permitindo a produo de grandes quantidades (Kg/ano). (7) A transfeo estvel conseguida pela integrao do DNA no genoma da clula hospedeira. Para garantir a integrao, normalmente usa-se um gene marcador que transfetado em conjunto com o gene de interesse, e as clulas transfetadas (que produzem o AcM) so identificadas e selecionadas pelas caractersticas do produto do gene marcador. Isto , no entanto, um passo trabalhoso e demorado que envolve um investimento considervel em recursos/equipamento. (7) A transfeo transiente uma aproximao mais rpida e econmica para a produo de AcsM. muito similar estvel, mas distingue-se pela eliminao dos passos de identificao e seleo das clulas que integraram os plasmideos no genoma. Uma vez que o DNA do produto mantido/replicado como unidade extracromossomal, a
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capacidade de expresso rapidamente perdida, somente permitindo a produo de de pequenas quantidades de AcsM, pelo que no usada para produo em larga escala. (7) Devido s diferenas entre os sistemas estveis e transiente em termos de insero do plasmideo no genoma, os factores que influenciam o nvel de expresso das clulas transfetadas tambm so diferente. No sistema transiente, a eficincia da transfeo um dos factores mais importantes, consistindo na percentagem de clulas a expressar DNA. Por outro lado, nos sistemas estveis, a frequncia de integrao do DNA no cromossoma (numero de cpias) e a posio da integrao torna-se mais importante.(7) Como foi mencionado anteriormente, na transfeco estvel, transfectado um gene marcador com o gene de interesse, conferindo uma vantagem selectiva para as clulas hospedeiras. Os genes marcadores normalmente usados so a dihidrofolato redutase (DKFR) e a glutamina sintetase (GS). (7;8) O sistema de expresso da DKFR, usado com clulas de ovrio de hamster chins, baseado na codificao do gene dkfr para a enzima DKFR, que est envolvida no metabolismo de nucletidos, catalisando a converso de dihidrofolato em tetrahidrofolato. Neste sistema a vantagem selectiva dada clula transfectada a da resistncia geneticina. Ento a seleco feita cultivando as clulas em meio contendo geneticina e sem hipoxantina e timidina. Este sistema permite um processo de amplificao do gene que aumenta a capacidade de produo da celular, pelo uso de metotrexato (MTX) que inibe a enzima DKFR. Usando concentraes cada vez maiores de MTX, as clulas transfectadas contendo o gene dhfr vo ter de aumentar a sua capacidade de sintetizar DHFR, amplificando o gene dhfr, no sentido de
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sobreviverem. Como a unidade de amplificao maior que o tamanho do gene dhfr, o gene de interesse que est localizado no mesmo vector de expresso que o gene dhfr tambm amplificado. (7;8) Em contraste, o sistema GS explora o metabolismo da glutamina nas clulas de mamferos. A formao de glutamina segue uma via de biossintese enzimtica a partir do glutamato e amnia usando a enzima GS. Sem glutamina no meio de crescimento, esta enzima GS vital para as clulas de mamfero em cultura. Como algumas linhas celulares no expressam enzima GS suficiente para a sobrevivncia, possvel usar um gene GS transfetado como um marcador seletivo permitindo o crescimento num meio livre de glutamina. (7) O sistema GS mais vantajoso em termos de tempo relativamente ao sistema DHFR durante o desenvolvimento, e requer menos cpias do gene recombinante por clula, permitindo uma seleco mais rpida das linhas celulares mais produtivas. (7) Para a introduo do gene de interesse (e do gene marcador, no caso da transfeco estvel) nas clulas de mamferos, foram desenvolvidos vrios sistemas de entrega de DNA, sendo a transferncia com genes no virais o sistema mais adequado em processos produtivos. Estes mtodos incluem precipitao clcio-fosfato,

electroporao, lipofeco e transferncia mediada por polmero. (7) A precipitao clcio-fosfato (CaPO4) o mtodo de transferncia de plasmideos mais usado, e baseia-se na formao de precipitado de DNA que entra nas clulas de mamferos via uma vescula endoctica e tem a vantagem de ser econmica e de resultar em vrios tipos de clulas. Contudo, a sua eficincia e reprodutibilidade so baixas. (7)
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A electroporao um mtodo simples e rpido. O gene entregue dentro da clula por um campo elctrico que interrompe o gradiente de voltagem da membrana plasmtica, criando poros reversveis que permitem a entrada do DNA. Embora tenha menos especificidade quanto ao tipo de clulas, relativamente a outros mtodos de transfeo, os parmetros como o pico de voltagem e o tempo de descarga necessitam de ser otimizados para cada caso. Com este mtodo tambm resulta uma mais baixa viabiliade celular ps-transfecional. Consequentemente a electroporao mais usada em trabalhos pequenos que requerem nveis mais baixos e mais rpidos de produo.
(7;8)

A lipofeo e a polifeo so os mtodos mais recentes, e provavelmente os mais simples, de transfeo. A lipofeco consiste numa transferncia catinica de gene mediada por lpidos, onde lipossomas cationicos formam um complexo com o DNA carregado negativamente. Este mtodo pode ser realizado na presena ou ausncia de soro, com pouca ou nenhuma toxicidade, bem como com clulas suspensas ou ligadas. No entanto, a quantidade de DNA e de lpidos usados bem como a razo entre eles afeta a eficincia de transfeo pelo que tem de ser otimizado. (7;8) A polifeo, por seu turno, refere-se a transferncia de genes mediada por polmeros cationicos, que interagem com o DNA formando um poliplexo que protege o DNA da degradao, antes da chegada ao ncleo. Este mtodo pode ser usado em culturas em suspenso livres de soro. E tal como a lipofeo, a otimizao do protocolo tem de ser determinada empiricamente para cada cultura celular. (7;8) Aps a transfeo as clulas so sujeitas a um processo de monitorizao/seleco que dura desde a recuperao do crescimento aps a transfeo, passando pela clonagem
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de clula nica, amplificao, suspenso, adaptao sem soro, at seleco final dos clones. (7) Aps a transfeo, as clulas produtoras de AcsM so seleccionadas sendo sujeitas a condies de cultura especficas que apenas permitem a sobrevivncia e crescimento dos clones celulares que expressem o gene marcador. Estes clones so transferidos como clulas nicas para um segundo recipiente de cultura, onde as culturas so expandidas para produzir populaes de clones. Os clones so depois avaliados em termos de crescimento e ttulo do produto, e os maiores produtores so selecionados para nova cultura e anlise, para confirmar se os nveis de produtividade se mantm. (7) Estes clones inicialmente selecionados tm uma produtividade que pode no ser a tima. Para melhorar isto, as clulas podem ser sujeitas a sucessivas sesses de exposio a concentraes cada vez mais altas de inibidores dos marcadores selectivos (MTX), o que resulta na amplificao dos genes. O gene de interesse que expressa o Ac pode ser co-amplificado com o gene do marcador seletivo, resultando num aumento dos nveis de expresso a produtividade de AcsM. (7) Tradicionalmente, a amplificao realizada com uma abordagem de diluio limitante e um processo de sceening demorado e trabalhoso. De facto, a seleo e monitorizao de um clone altamente produtivo e estvel num curto espao de tempo actualmente o maior desafio. Ento, devido carga de trabalho que representa, a seleo feita baseada somente numa caracterstica o nvel de expresso. Contudo, h outras propriedades celulares que podem ser importantes no processo produtivo e que deveriam ser includas na monitorizao, tais como, a capacidade do clone crescer em meio sem soro, a resistncia apoptose, as caractersticas celulares (i.e. o tamanho
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celular tem sido considerado determinante de produtividade), estabilidade na formao do produto e a robustez geral da linha celular sob o stress e as condies do biorreactor. particularmente importante que o nvel produtivo de AcsM dos clones seleccionados se mantenha estvel por longos perodos de tempo (pelo menos 60 geraes), uma vez que o aumento de escala do processo de cultura para nveis industriais leva um tempo significativo. (7;8) Aps a obteno das clulas produtoras de AcsM, estas tm de ser sujeitas a um processo de adaptao a novas condies, o que pode impor algumas limitaes ao desenvolvimento do processo de produo. (7) A produo em larga escala de AcsM em biorreatores feita com o crescimento celular em suspenso. Isto porque a razo superfcie/volume das culturas em suspenso muito mais alta que em culturas aderentes. No entanto, a maioria das clulas de mamferos crescem naturalmente em aderncia e o seu crescimento em suspenso requer um processo de adaptao. Esta adaptao no possvel para todos os tipos celulares, o que limita a escolha da linha celular e pode ser muito demorado. (7) A adaptao das clulas que crescem em aderncia num meio contendo soro, a crescerem em suspenso faz-se normalmente usando o mesmo meio mas mudando as clulas para recipientes com agitao de 50-80 rpm. Para garantir uma adaptao bem sucedida, alguns parmetros so crticos, tais como a densidade e viabilidade do inoculo inicial. Num processo de adaptao, h uma grande proporo das clulas que no sobrevivem. Ento de extrema importncia que a baixa proporo que sobrevive seja suficiente para que expanso no demore demasiado. Por esta razo, a cultura em suspenso deve de ser iniciada com uma densidade celular adequadamente elevada.
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Deve manter-se uma monitorizao apertada da cultura durante o perodo de adaptao, com o crescimento celular e viabilidade avaliados frequentemente. Os nveis de produo tambm devem ser verificados, uma vez que mudam durante a adaptao. (7;8) O soro um componente essencial em qualquer meio de cultura para proliferao celular, mas tem muitas desvantagens, nomeadamente os altos custos e o risco de transmisso de doenas de animais a humanos. Um dos principais objetivos na cultura celular para fins comerciais o uso de meios sem soro e sem protenas, o que requer o desenvolvimento de um soro especfico para cada linhagem celular. (7) Tm-se feito esforos para identificar suplementos substitutos do soro que preencham os requisitos nutricionais complexos das clulas de mamferos, o que normalmente feito por metodologias muito demoradas. Para ultrapassar isso, o desenho experimental estatstico pode ser usado como uma forma eficiente de monitorizar um grande nmero de suplementos do meio e identificar os mais importantes para o crescimento celular e produo de AcsM, acelerando o processo de desenvolvimento do meio sem soro. (7) Mesmo aps a definio qumica do meio sem soro, a adaptao celular ao novo meio pode ser um processo longo, uma vez que ainda no est fisiologicamente bem entendido. Para esta adaptao podem-se usar dois tipos de aproximao, a direta onde o soro completamente removido num nico passo, e a gradual/sequencial onde a concentrao de soro no meio reduzida lentamente. (7)

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Apesar de ainda no existir nenhuma forma fcil de acelerar a adaptao, o uso de grandes densidades de inoculo, bem como as trocas de meio, centrifugando as clulas e ressuspendendo em meio novo, podem de alguma forma abreviar o processo. (7)

3.3 MECANISMO DE AO Os AcsM matam as clulas neoplsicas por mltiplos mecanismos, incluindo a induo da apoptose, inibio do crescimento celular, citotoxicidade mediada pelo complemento (CMC), citotoxicidade celular Ac-dependente (CCAD), e sensibilizao quimioterapia ou radioterapia. Em parte devido a este aumento da sensibilidade quimioterapia, as terapias com AcsM levam a melhores resultados quando usado em combinao com a quimioterapia. (2) Numerosos estudos, incluindo in vitro, in vivo e estudos clnicos, indicam que as funes efetoras dos Acs so mecanismos de ao particularmente importantes, nomeadamente a CCAD e a CMC, sendo que ambas so primeiramente despoletadas pela interao direta do domnio Fc do Ac com o seu ligante correspondente. (6) A CCAD um mecanismo efetor citolitico que envolve a destruio da clula cancergena revestida com Acs por recrutamento de clulas efetoras (tais como as clulas natural killer, macrfagos e neutrfilos). Esta depende da ligao do Ac ao receptor FcRIIIa e leva destruio das clulas alvo por exocitose de grnulos citoliticos constitudos pelo complexo perfurima/granzima B (Figura 3). (5;6) A CMC uma cascata citolitica conhecida como a via clssica do sistema do complemento, e mediada por uma srie de protenas do complemento (C1-C9) que
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se encontram em abundncia no soro. Esta cascata comea com a ligao de C1q ao domnio Fc das molculas do Ac ligadas superfcie das clulas cancergenas e leva citolise (Figura 3). (5;6) Os AcsM aprovados pela FDA que tm como principal mecanismo de aco a CCAD so o rituxumab e o ofatumumab, no entanto a sua actividade tambm parcialmente dependente da CMC. Em contraste, o alemtuzumab induz CMC e no CCAD. (5)

Fig. 3- Mecanismo de funes efectoras de CCAD e CMC.

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3.4 APLICAES EM NEOPLASIAS HEMATOPOIETICAS Existem atualmente seis AcsM aprovados pela FDA para o tratamento de neoplasias hematolgicas (Tabela 1). Com os tratamentos com AcsM obteve-se uma melhoria dos resultados e uma reduo da toxicidade comparativamente com os regimes de quimioterapia convencionais. (2)
Tabela 1: Anticorpos monoclonais aprovados pela FDA
(7)

NOME GENERICO Gentuzumab ozagamicin Rituximab Ibritumomab tiuxetan Tositumomab Ofatumumab Alemtuzumab

NOME COMERCIAL Mylotard Rituxan, Mabthera Zevalin

Ag ALVO CD33 CD20 CD20

TIPO Humanizado IgG4 Quimrico Murino conjugado com 90-Itrio Murino conjugado com 131-Iodo Humano IgG1 Humanizado IgG1

INDICAO TERAPEUTICA LMA LNH-B, LLC LNH-B

Bexxar Arzerra Campath

CD20 CD20 CD52

LNH-B LLC LLC

Como verdade para muitos tratamentos de cancro, os resultados obtidos com os regimes de AcsM combinados so variveis. Algumas neoplasias hematolgicas com o mesmo diagnstico respondem bem, enquanto outras mostram pouca ou nenhuma resposta. A resistncia aos AcsM, nestes tratamentos combinados, ocorre principalmente por razes desconhecidas, mas h indcios de que as diferenas que contribuem para a resistncia incluem a perda de expresso do Ag-alvo, o aumento da expresso de inibidores do complemento e a modulao das vias de sinalizao celulares associadas com a apoptose ou a regulao do crescimento celular. (2)

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3.4.1.Leucemia Mielide Aguda: A leucemia mielide aguda (LMA) a forma mais comum de leucemia em adultos. A sua incidncia aumenta com a idade e a doena manifesta-se normalmente aps os 60 anos. (9) A terapia para a LMA envolve quimioterapia de induo intensiva, que resulta numa remisso completa em cerca de 75% dos doentes com idade inferior a 60 anos. No entanto, os ndices de remisso diminuem rapidamente com a idade, e os doentes idosos apresentam co-morbilidades que os impedem de tolerar altas doses de quimioterapia. Em consequncia, a sobrevida mdia dos doentes idosos com LMA inferior a 6 meses (10) e menos de 30% dos doentes sobrevive mais de 3 anos (11) . A maioria das clulas de LMA expressam uma srie de Ags restritos, nomeadamente CD11a, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33 e CD64. O Ag CD33 muito til para a distino entre clulas mielides e clulas linfides. Estudos recentes demonstraram que uma frao relativamente grande de populaes de leucemias linfides pode expressar alguns desses Ags mielides (CD33, CD13, CD65, CD15), o que amplia o valor dos respectivos Acs no tratamento dos subtipos de leucemia. Estes Ags podem servir como alvos para a terapia mediada por AcsM usando um dos vrios mecanismos de aco. Estes incluem CMC, CCAD, e entrega de radionucldeos, produtos qumicos ou toxinas.(2) Embora exista uma infinidade de possveis Ags alvos nas clulas de leucemia mielide, apenas alguns emergiram como clinicamente relevantes com base numa variedade de fatores, incluindo a especificidade de expresso (linhagem especfica), a

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disponibilidade de AcsM clinicamente teis e, recentemente, a demonstrao de expresso nas clulas estaminais da leucemias. (2) O Ag CD33 uma glicoprotena de superfcie celular geralmente expresso em clulas mielides, incluindo nas clulas de leucemia mielide. o menor membro da famlia Siglec (cido silico de ligao de lectinas Ig-relacionados), e uma glicoprotena de 67 kDa expressa pelos percursores mielides bem como pelos moncitos maduros, e em menor quantidade pelos neutrfilos. O CD33 est envolvido nas interaces celulares dependentes do cido silico e na adeso das clulas mielides em certas fases da sua diferenciao. A cauda citoplasmtica do CD33 contm dois motivos baseados em tirosina, ambos com potencial imunolgico inibitrio. Assim, o CD33 pode servir como um receptor inibitrio. A ligao de um AcM com o CD33 induz a apoptose e inibe a proliferao das clulas mielides normais e das clulas de leucemia. (2)

O Gemtuzumab Ozogamicina (Mylotarg; Wyeth-Ayerst, Madison, NJ) (GO), um frmaco imunoconjugado em que um AcM anti-CD33 se encontra ligado covalentemente a um derivado semi-sinttico da caliqueamicina [Oldham,2008], a NAc- caliqueamicina. (11) A caliqueamicina um antibitico citotxico muito potente originalmente isolado da Microspora echinospora ssp. Acredita-se que esse antibitico se intercala no DNA do mieloblasto, desencadeando o processo de apoptose. (12)

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O GO um AcM humanizado tipo IgG4. O Ac ligado N-acetil-gama caliqueamicina, atravs de um ligante bifuncional e 50% do Ac carregado com 4-6 moles de caliqueamicina por mole de Ac. (2) Aps a ligao ao CD33, cada molcula de GO endocitada por um mecanismo mediado por clatrina (Figura 4). Seguindo atravs da via endoctica, as molculas de GO ligadas ao recetor passam para lisossomas, onde as condies so suficientemente acidicas para facilitar a hidrlise eficiente da coliqueamicina e a reduo na sua forma citotoxica ativa. (11)

Fig. 4- Aco do Gemtuzumab ozogamicin na clula alvo.

(11)

O principal desafio de farmacocintica para o GO a sua ligao s clulas saudveis no sangue perifrico, o que diminui a sua eficcia. Tais clulas expressam nveis de CD33 suficientemente elevados para concorrerem com as clulas-alvo, que residem principalmente na medula ssea. Uma opo para superar este problema a
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administrao de vrias doses de GO. A justificao para esta abordagem que as clulas na periferia ficam saturadas com o imunoconjugado aps a primeira dose, e as doses subsequentes de tratamento vo atuar principalmente nas clulas alvo. Pelo mesmo raciocnio, o tratamento com uma dose superior permitiria saturar as clulas perifricas e actuar eficazmente nas clulas-alvo na medula ssea. Uma preocupao bvia inerente ao aumento da dosagem relativa aos efeitos txicos que podem incorrer. Por esta razo, so necessrios estudos mais aprofundados para testar estas abordagens. (11) Este frmaco foi aprovado, em 2000, pela FDA para a terapia da recidiva de LMA em doentes com mais de 60 anos, que no so candidatos aos esquemas convencionais. (2) Mas a sua aprovao foi concedida ao abrigo dos regulamentos de aprovao acelerada da FDA com base nas taxas de resposta global (TRG) registadas em trs estudos no comparativos, pelo que foram necessrios estudos clnicos posteriores. No entanto estes estudos no demonstraram evidncias dos benefcios clnicos em doentes com LMA. Um dos estudos de fase III comparou o uso do produto em doentes recentemente diagnosticados com LMA com idades entre os 18 e 60 anos, e concluiu que a adio do GO quimioterapia no melhorou a sobrevida relativamente sua no adio e que aumentou a taxa de toxicidade fatal induzida. (13) Como resultado, em Outubro de 2010, a Pfiser (que adquiriu o frmaco Wyeth) retirou voluntariamente o produto dos mercados nos Estados Unidos. Na Europa, o frmaco permanece disponvel. (13) O Lintuzumab, tambm um AcM humanizado que tem como alvo a protena CD33. Como um AcM inalterado, depende exclusivamente da sua propriedade inerente de

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mediar os efeitos diretos atravs da ligao CD33 e activar as clulas efetoras atravs do seu domnio Fc. especificamente ao
(2)

Estudos in vitro demonstraram que o lintuzumab se liga CD33 e apresenta mltiplos mecanismos de aco,

nomeadamente, induz funes efetoras atravs de CMC, fagocitose celular Acdependente, e CCAD mediada por clulas natural killer (NK). Tambm foi demonstrado que inibe a produo de citocinas inflamatrias via sinalizao direta. (10) O Lintuzumab foi testado em mais de 350 doentes e foi, em geral, bem tolerado. Mesmo em doses baixas e em monoterapia, foi obtida remisso completa em vrios doentes com LMA avanada. Alm disso, no cenrio de doena residual mnima, induziu remisso molecular em doentes com leucemia promieloctica aguda. (10) Com base na actividade antileucmica demonstrada num ensaio clnico de fase 2 com lintuzumab em monoterapia, colocou-se a hiptese do seu desenvolvimento em associao com quimioterapia. No ensaio de fase 3, com doentes em recidiva ou com LMA refractria que receberam quimioterapia com ou sem baixa dose de lintuzumab (12 mg/m2 por dia, em 4 dias consecutivos), a melhoria na taxa de remio completa atribuvel ao AcM no teve significncia estatstica (36% vs 28%, P = 0,28). (10)

3.4.2 Linfoma No-Hodgkin: A incidncia de linfoma no Hodgkin (LNH) aumentou dramaticamente desde 1970 at meados de anos 90, e de acordo com a American Cancer Society aproximadamente 65540 casos foram diagnosticados nos Estados Unidos em 2010, fazendo do LNH o 7 tipo de cancro mais comum. (14; 15)

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A classificao do LNH de Indolente (tambm designado de baixo grau ou de crescimento lento) ou Agressivo (tambm designado de alto grau ou de crescimento rpido) baseia-se na evoluo clnica do linfoma. (15) No LNH indolente, o curso clnico do linfoma lento, os doentes raramente apresentam sintomas na fase inicial, o que leva a que este no seja detetado durante algum tempo. Mesmo aps o diagnstico, os doentes podem no necessitar de tratamento imediato (por vezes durante meses ou anos). (15) Quando necessrio iniciar tratamento, este quase sempre eficaz, levando reduo e/ou ao desaparecimento da doena. No entanto, frequente a doena recidivar, o que requer novo tratamento. (15) O LNH agressivo evolui mais rapidamente, tende a apresentar mais sintomas e requer tratamento imediato na maioria dos casos. Estes linfomas tendem a responder bem ao tratamento. Na realidade, a cura completa mais provvel do que nos LNH indolentes.
(15)

O quadro seguinte apresenta os principais tipos de LNH:

Tabela 2: Principais tipos de linfoma no-Hogkin
(15)

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Os resultados do tratamento para o LHN tm melhorado significativamente ao longo da ltima dcada, especialmente devido ao desenvolvimento do AcM anti-CD20, o Rituximab (RTX). (16) Exceto para o mieloma, quase todas as neoplasias das clulas B maduras expressam CD20, o alvo do RTX (Rituxan, MabThera, Genentech, South San Francisco, CA). O RTX foi o primeiro AcM a receber aprovao da FDA, em 1997, para o tratamento do cancro, nomeadamente o linfoma folicular (LF). (2)

Fig. 4- Modelo computacional da molcula de Rituximab mostrando a estrutura secundria. A estrutura primria (37) do oligosacrido est na parte superior esquerda

O RTX um Ac IG1-kappa quimrico humano/rato que incorpora regies variveis de murino e regies constantes kappa e Fc humanas para diminuir o desenvolvimento de imunoglobulinas anti-rato e possveis resistncias. (17) O CD20 uma fosfoprotena transmembranar no glicosilada com funo pouco clara, mas h evidncias de que tem a atividade dos canais de clcio e tem um papel na regulao da ativao e crescimento de clulas B. O sucesso da terapia com RTX reflete, em grande medida, determinadas caractersticas do CD20 que o tornam um

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excelente alvo para terapia com AcsM: o CD20 no internalizado aps a ligao com o Ac, permanece na superfcie celular aps a ligao e expresso em todas as fases de maturao das clulas B, mas no em clulas B precursoras na medula ssea ou noutras clulas. Infelizmente, nem todas as neoplasias de clulas B maduras expressam altos nveis de CD20 uma vez que existem evidncias de que a eficcia do RTX se correlaciona com o nvel de expresso de CD20. (2) O RTX exerce efeitos antineoplasicos atravs de mais do que um mecanismo de ao. Os mecanismos predominantes que induzem a morte celular so a CCAD, a CDC e a apoptose. (17) O RTX provoca depleo das clulas B que expressam CD20, normais e neoplsicas. O nadir da contagem de clulas B do sangue perifrico ocorre 24-72 h aps a infuso inicial e retorna aos valores normais cerca de 9 meses aps cessao da terapia. Os doentes toleram melhor a diminuio das clulas-B do que a diminuio de outros leuccitos (granulcitos ou clulas T), porque a imunoglobulina, o principal produto dos linfcitos B, tm uma meia-vida entre duas a trs semanas. As terapias com Acs para outros alvos, como CD33 ou CD52 causam diminuio dos granulcitos e aumentam o risco de infeo, o que no to facilmente corrigido. (2) Devido sua alta prevalncia o LF a neoplasia mais frequentemente tratada com RTX. Os resultados da teraputica so significativamente melhores com a quimioterapia combinada que inclui RTX em relao que no o inclui. No entanto, o RTX em monoterapia tambm demonstra atividade, induzindo a remisso completa em muitos doentes. De facto, a monoterapia com o RTX em doentes com LF teve em geral uma TRG de 43%, uma taxa de remisso completa (TRC) de 4% e um tempo
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mdio de progresso (TMP) de 8,1 meses. As situaes clnicas em que a monoterapia beneficia mais os doentes do que a terapia combinada incluem doentes que no toleram regimes teraputicos com citotxicos. No entanto, os resultados obtidos com a terapia combinada sem RTX so melhores do que a monoterapia com RTX. Os resultados tpicos do tratamento de LF com ciclofosfamida, doxorubicina, vincristine e prednisona (CHOP) so de 60-80% de TRG e 20% TRC. (2) Na maioria das neoplasias das clulas B maduras, a terapia combinada com RTX e quimioterapia aumenta a TRG, TMP e a sobrevivncia sem eventos (SSE) relativamente quimiotepia ou ao RTX individualmente. Esta concluso foi clara desde os primeiros estudos publicados comparando a quimioterapia CHOP vs CHOP mais RTX. Os doentes que receberam seis infuses de RTX com seis doses de CHOP tiveram uma TRG de 95% com 55% TRC e 40% de resposta parcial (RP), a durao da resposta e TMP no foram alcanados aps os 29 meses de observao. Num estudo com LF avanado as diferenas foram ainda mais impressionantes, os doentes tratados somente com CHOP tiveram TRG e TRC de 57% e 10% e TMP de 15 meses enquanto os resultados dos que foram tratados com CHOP e RTX foram TRG de 81%, TRC de 41% e TMP de 32 meses. (2) Alm das infeces devidas diminuio das clulas-B, a toxicidade do RTX inclui febre aguda, calafrios, nuseas, vmitos, broncoespasmo, e hipotenso. As maiorias destes efeitos secundrios so devidos a reaes imunes ao produto ou lise das clulas B neoplsicas. As reaes imunes em geral ocorrem durante ou logo aps a infuso e podem ser graves, ou mesmo fatais. As reaes mais graves tm sido rotuladas de "sndrome de libertao de citocinas". (2)

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Relatrios recentes indicam que o tratamento do LNH de clulas B com RTX pode estar associado com a reincidncia de linfoma CD20-negativo, e a frequncia da perda de CD20 aps o tratamento com RTX varia bastante (24, 56, 60 e 94%). (18) Tm sido sugeridos vrios mecanismos de resistncia ao RTX, incluindo a seleco de clones CD20-negativos como consequncia da exposio ao RTX, os epitopos CD20 serem mascarados pelo prprio RTX, ou a verdadeira perda do Ag CD20 devido a alteraes genticas e epigeneticas. (18) O RTX um bom candidato para a teraputica de manuteno devido ao seu perfil de eficcia e segurana favorveis, permitindo assim que a teraputica prolongada melhore o resultado sem comprometer a qualidade de vida. No LNH indolente, o tratamento de manuteno com RTX sugere claramente uma melhoria nas respostas seguintes aos resultados obtidos com a monoterapia inicial com RTX ou com quimioterapia. (17) Em Janeiro de 2011 a FDA aprovou o uso do RTX no tratamento de manuteno em doentes com LF avanado que responderam ao tratamento inicial com RTX mais quimioterapia (tratamento de induo). Esta aprovao, foi baseada num estudo que envolveu 1217 doentes com LF avanado e que mostrou que a administrao continua a cada dois meses, durante dois anos, em doentes que responderam ao tratamento inicial com o RTX e quimioterapia quase dobrou a probabilidade de estes viverem sem que a doena piore (sobrevivncia sem progresso ou SSP) comparativamente com aqueles que pararam o tratamento. (19)

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A Radioimunoterapia (RIT) representa outra abordagem teraputica que permite a entrega de uma dose teraputica de radiao a tumores disseminados. Atualmente os AcsM radiomarcados aprovado para o tratamento de LNH folicular so o iodo-131tositumomab (131I-TST, Bexxar ; GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC, EUA), que no est aprovado na Unio Europeia (UE) e o trio-90 ibritumomab tiuxetan (90YIT, Zevalin ; Bayer Schering Pharma AG, Berlin, Alemanha). Ambos tm como alvo o Ag CD20. A RIT uma opo no tratamento estabelecido a partir da segunda recidiva e o
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Y-IT obteve recentemente um parecer positivo da Agncia Europeia de

Medicamentos (EMEA) sobre a sua utilizao como terapia de consolidao aps tratamento de primeira linha. (20) O radioistopo 90-trio (90Y) est ligado covalentemente ao AcM ibritumomab atravs do quelador de alta afinidade, o tiuxetan (Figura 5). O 90Y um emissor beta de alta energia (2,3 MeV) com uma semi-vida fsica de 64 horas. Mais de 90% da radiao emitida absorvida em 5 mm e este comprimento corresponde a um dimetro de 100 a 200 clulas, permitindo assim uma entrega altamente precisa de radiao sem a necessidade de isolamento ou blindagem do doente. A radiao provoca danos celulares tanto nas clulas alvo do linfoma como nas clulas vizinhas e pode ser eficaz nos casos de tumores pobremente vascularizados e nos que expressam Ags de forma heterognea. (20)

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Fig. 5: Y- Ibritumomab tiuxetan.

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(21)

O 90Y-IT est atualmente aprovado na UE para o tratamento de doentes adultos com LNH folicular de clulas B CD20-positivas com recidiva aps tratamento com RTX. (20) O esquema de tratamento inclui a infuso de 250 mg/m de RTX no dia 1 e 8 seguida de uma dose teraputica de 90Y-IT no dia 8 por via intravenosa durante 10 minutos . (20) O pr-tratamento com RTX feito para melhorar a biodistribuio dos radionucldeos e para reduzir a sua ligao aos CD20 em clulas B normais em circulao, na medula ssea e no bao. Devido ao
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Y ser um emissor beta puro, o radioisotopo 111-ndio

(111I), que um emissor gama, usado como um substituto para estudar a clearance e a biodistribuio, usando cmaras de imagem gama como parte dos estudos. A primeira infuso de RTX seguida de uma aplicao de 5 mCi de
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In-IT com a

finalidade de gerao de imagens. Os exames com cmaras gama so realizados dentro de 24 a 48 horas. Os estudos de dosimetria mostram que a aplicao de 90Y-IT resulta numa exposio radiao mnima dos rgos que no so alvo, mas falha em demonstrar uma correlao significativa entre a biodistribuio do AcM radioativo e a
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toxicidade hematolgica. Esta falta de correlao levou aprovao de da UE sem a necessidade de estudos de imagem. (20)

Y-IT dentro

Os ensaios clnicos de fase I / II mostraram uma melhoria na biodistribuio do radioimunoconjugado, aps pr-tratamento com rituximab, na dose de 250 mg/m. A dose mxima tolerada (DMT) determinada foi de 0,4 mCi / kg (ou 14,8 MBq / kg), para doentes com contagem de plaquetas superior a 150 mil/mL, e 0,3 mCi/kg (ou 11,1 MBq / kg) para doentes com trombocitopenia ligeira (contagem de plaquetas >150000 /mL, mas < 100000 / mL). Outro estudo confirmou a segurana do tratamento com 90YIT, em doentes com trombocitopenia, com uma dose de 0,3 mCi/kg. Os doentes com risco aumentado de toxicidade hematolgica devem ser excludos do tratamento. (20) O 90Y-IT est aprovado nos EUA desde 2002 para doentes com LF CD20+ ou LNH das clulas B transformado, refratrio ou recidivo aps rituximab. Na UE a licena restrita ao tratamento de LF CD20+ refratrio ou recidivo ao rituximab. A terapia com 90Y-I a nica aprovada na EU aps falha do tratamento com rituximab. (20)

O Tositumomab (TST) um AcM murino tipo IgG2a lambda que tem como alvo o Ag CD20. produzido em cultura de clulas de mamferos livre de antibiticos e composto por duas cadeias pesadas gama 2a de murino, de 451 aminocidos cada, e duas cadeias leves lambda, de 220 aminocidos cada. O seu peso molecular aproximado de 150 kD (Figura 6). (22)

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Fig. 6: Tositumomab

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Quando o TST est conjugado covalentemente com

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I, mais conhecido pelo seu

nome comercial, Bexxar . O isotopo 131I um emissor e um emissor . A particula tem uma energia mdia de 191,6 KeV, uma energia mxima de 0,61 mEv, e um alcance de 0,8mm nos tecidos. O raio- tem uma energia de 364,5 KeV. A semivida fsica do 131I de 8,1 dias. A emisso gama permite visualizar o Bexxar atravs de uma cmara de gama e necessria para a determinao da quantidade adequada de medicamento a ser administrado. (24) Quanto ao mecanismo de aco, este AcM tem maior capacidade de mediar a adeso homotipica do que o RTX, o que se correlaciona com sua maior capacidade de induzir a apoptose. In vitro, a induo da apoptose parece exigir o cross-linking do CD20 pelo Ac anti-CD20, quer atravs de interaes Ac-Ac quer atravs de interaes com o Fc dos receptores. Os dados in vitro e in vivo sugerem que o TST parece induzir a apoptose atravs de mecanismos adicionais independentes da regio FC. Alm disso, a apoptose induzida por TST no envolve a clssica fragmentao do DNA, ou processamento da caspase. O TST no faz activao do complemento. (25)

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I-TST est aprovado pela FDA para o tratamento do LNH das clulas B CD20+

indolente recidivo ou refratrio, incluindo a doena refratria ao RTX, ou LNH transformado. (25) A administrao de TST (Ac no marcado) com131I-TST (Ac marcado) em doentes envolve uma colaborao entre o oncologista e a medicina nuclear e envolve dois passos, o dosimtrico e o teraputico. Os doentes recebem no dia 1 uma dose de TST seguida de uma dose de
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I-TST, e seguidamente so sujeitos a vrios scans com

cmaras gama em momentos diversos ao longo da semana seguinte. Os dados obtidos permitem determinar a atividade do
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I-TST em cada doente e calcular a dose

teraputica a ser administrada a fim da exposio corporal total radiao ser de 75 cGy. (26) As contra-indicaes ao tratamento incluem alergia de iodo, gravidez, contagem de plaquetas < 100000/mL, contagem absoluta de neutrfilos <1500/mL, insuficincia renal ou heptica, medula ssea linfomatosa >25% ou soropositividade major para Acs humanos anti-rato. (26)

3.4.3 Leucemia Linfoctica Crnica: A leucemia linfoctica crnica (LLC) das clulas B a leucemia mais comum nos pases ocidentais, com uma incidncia anual de 3 a 5 novos diagnsticos por cada 100,000, na sua maioria em idosos. (17) O prognstico da LLC bastante varivel: alguns doentes vivem uma vida normal durante anos com a doena estvel e sem qualquer interveno, outros sofrem um curso de doena agressivo e desgastante com uma

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rpida progresso, tratamentos rduos e morte precoce. Assim, as taxas de sobrevida global podem ir de menos de 2 a mais de 15 anos (mediana de 9 anos) aps o diagnstico. No existe nenhuma cura para esta doena com excepo do transplante alogeneico de clulas estaminais aplicvel a uma pequena poro dos doentes. (27) A descoberta de aberraes cromossmicas recorrentes e relevantes para o prognsticos nas clulas de LLC, via citogentica convencional e hibridizao in situ fluorescente (FISH), introduziu a estratificao dos casos de LLC de acordo com a presena ou ausncia de anomalias genticas chave. Delees/mutaes no cromossoma 17p13, o stio do supressor de tumor TP53 (gene p53), esto associadas com a resistncia ou falha logo aps a quimioterapia. Uma vez refratria ao tratamento base de anlogos de purina, tais como a fludarabina, os doentes pertencem categoria de pior prognstico com uma sobrevida global mdia de menos de 12 meses. Da mesma forma, as delees/mutaes no cromossoma 11q22-23 (inclui o locus do gene ATM) correlacionam-se com doena avanada precoce, especialmente nos ndulos linfticos, menor tempo para o primeiro tratamento e diminuio da sobrevivncia a longo prazo aps quimioterapia. (27) A LLC caracterizada pela acumulao progressiva de linfocitos maduros fenotipicamente malignos, provavelmente uma combinao de resistncia apoptose e uma componente de proliferao continua. As clulas de LLC normalmente coexpressam CD5, CD23, CD19, CD79b e CD20, mas o nvel de expresso de CD20, CD79b, e de imunoglobulina de superfcie baixo quando comparado com os linfocitos B normais. (28)

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Os frmacos de primeira linha, aprovados pelas agencias reguladoras incluem agentes alquilantes, como o clorambucil, a ciclofosfamida e a bendamustina, o anlogo de purina, a fludarabina, e o AcM anti-CD52, o alemtuzumab (ALM). A aprovao explcita do RTX, para imunoquimioterapia combinada para tratamento da LLC no tratada, foi dada pela EMEA em Fevereiro de 2009. Nunca foi demonstrado o benefcio do tratamento para a sobrevida dos doentes com LLC em fase inicial da doena. (27) De acordo com ensaios clnicos de fase II e III, a imunoquimioterapia combinada com fludarabina, ciclofosfamida, e RTX (FCR) atualmente o regime de primeira linha mais ativo, com uma TRG de 95%, 44% de TRC e SSE de 51,8 meses. O regime FCR demonstrou ser significativamente melhor do que o tratamento s com FC (TRG 88,4%, 21,7% TRC, SSE 32,8 meses), embora induza mais mielossupresso, particularmente neutropenias. (27; 29) Os grupos de estudo continuam a investigar modificaes ao regime FCR, a fim de otimizar a sua eficcia e diminuir a sua toxicidade (isto , pela reduo da dose de FC, o aumento da dose de RTX, adio de mitoxantrona ou ALM, por exemplo). (27)

O Ofatumumab (Arzzera TM, GlaxoSmithKline, Philadephia, PA, HuMax-CD20TM, Genmab, Copenhagen, Denmark) (OFA) um Ac IgG do tipo 1 humanizado, de 2 gerao, que se liga a um segmento do CD20 que contm uma pequena laada (loop) extracelular junto da regio N-terminal da segunda grande laada extracelular. (28) Tem maior afinidade para o CD20 que o RTX e liga-se a um eptopo diferente mais perto da superfcie da clula (Figura 7), teoricamente melhorando a ativao do complemento e o acesso das clulas efetoras para destrurem o alvo por CCAD. (2)
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Fig. 7- Sitios de ligao do Rituximab e Ofatumumab no CD20.

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O OFA exibe mltiplas atividades via CMC, ADCC, e tem mostrado acentuar a morte celular de linhas celulares resistentes ao RTX. Existe a hiptese que o aumento da CMC demonstrado pelo OFA est relacionado com a sua ligao ocorrer mais prxima membrana celular. (28) Coiffier et al relataram num estudo de fase I / II em LLC recidivante / refratria com uma TRG de 50%, mas a durao de resposta mdia foi de apenas 3,7 meses. (30) No entanto, a durao mdia do tratamento seguinte foi de 12 meses. Posteriormente, foi realizado um estudo internacional de fase II com 138 doentes com LLC refratria dupla (refratria fludarabina e alemtuzumab; n = 59) e LLC refratria fludarabina com linfadenopatia volumosa (>5 cm) (aqui o alemtuzumab foi considerado uma opo menos vivel). A TRG foi de 47% -58% com uma SSE mediana de 5,7- 5,9 meses e uma sobrevida mediana 13,7-15,4 meses. O OFA foi bem tolerado, mas foi reportada uma
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incidncia de 25% de complicaes infecciosas.

Estes resultados clnicos

impressionantes em LLC de risco muito elevado levou aprovao do OFA pela FDA, em 2009, para o tratamento de doentes com LLC refratrio a outras formas de quimioterapia. (2) O OFA tem sido bem tolerado, e os efeitos adversos mais reportados so os relacionados com a perfuso. A maioria dos efeitos secundrios ocorrem no dia da infuso e so de graus 1 ou 2. Estes so geralmente febre, calafrios, falta de ar, erupes cutneas e urticria. Apenas 12% dos doentes apresentam complicaes infecciosas de grau 3 ou pior, embora sem queda significativa dos nveis de imunoglobulina srica. Observa-se toxicidade hematolgica de grau 3 ou 4 em 15% dos doentes doa quais 6% apresentaram grau 3 ou 4 de neutropenia. (28) O Alemtuzumab (Campath-1H, Campath / MabCampath ; Bayer Schering Pharma, Berlin) (ALM) um AcM totalmente humanizado do tipo IgG1 contra o recetor CD52, uma glicoprotena ancorada na superfcie celular expressa em clulas B e T humanas, clulas NK, eosinfilos e macrofagos. (27)

Fig. 8 - Imagem do ALM.

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As clulas estaminais hematopoiticas, eritrcitos e plaquetas no expressam CD52 na sua superfcie pelo que se encontram protegidas da citotoxicidade induzida. Em contraste, os neutrfilos expressam CD52 em baixos nveis, pelo que sofrem lise mediada pelo complemento e explica as neutropnias observadas com o uso clnico do ALM. (27) O ALM foi inicialmente aprovado para doentes com LLC refratria fludarabina. No estudo piloto com ALM em 93 doentes com LLC refractria fludarabina, a TRG foi 33%, e apenas 2% de TRC. O TMP para doentes que responderam terapia foi de 9,5 meses, mas houve uma melhora na sobrevida em 32 meses, em comparao com 16 meses para todos os doentes. de notar, que o ALM parece ter atividade em doentes que no respondem quimioterapia devido presena de mutaes no gene p53. Isto foi confirmado num estudo com 36 doentes de LLC refratrio fludarabina tratados com ALM, 15 dos quais com mutaes ou delees no p53. (33) O ALM demonstra uma eficcia impressionante no tratamento da doena do sangue perifrico e nos compartimentos de medula ssea, no entanto tem menor atividade em linfadenopatias volumosas (>5cm). Infelizmente, muitos doentes refractrios fludarabina tm linfadenopatias significativas, pelo que o benefcio do tratamento com ALM , portanto, limitado. (33; 34) Num esforo para superar esta limitao, foram investigadas terapias de combinao, acrescentando RTX, fludarabina, FC, ou FCR ao ALM. Embora as TRG relatadas sejam encorajadoras, no est claro que qualquer destas combinaes permitam superar significativamente as limitaes do ALM no tratamento de doentes com

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linfadenopatias. Alm disso, a quimioimunoterapia combinado com ALM potencialmente muito txica. (34) O ALM, foi mais recentemente aprovado para a utilizao em LLC no tratada previamente. Foi realizado um estudo de fase III com 297 doentes com LLC progressiva sem tratamentos prvios em que comparou o ALM com o clorambucil. Este estudo demonstrou uma TRG significativamente superior, bem como uma maior SSE para o ALM relativamente ao clorambucil (TRG, 83% vs 56%; P < 0,001% e TRC,24% vs 2%; P< 0,001). O ALM em monoterapia ou em combinao uma boa opo para doentes com mutaes no 17p ou no p53, uma vez que tem sido demonstrada a sua eficcia nestes casos. (33) No existe nenhum protocolo estabelecido para a terapia de manuteno da LLC. O ALM foi avaliado neste cenrio com alguns resultados interessantes, mas o entusiasmo foi temperado pela alta toxicidade observada. (33) Clinicamente, este AcM reduz os linfcitos normais das linhagens B e T, resultando numa profunda e ocasional linfopnia de longa durao com imunossupresso concomitante. Isto tem sido associado a um risco aumentado de infees oportunistas, especialmente em doentes pr-tratados intensivamente. A infeo com

Cytomegalovrus (CMV) a mais comum e requer a monitorizao cuidadosa dos doentes, de acordo com as guidelines publicadas. A profilaxia anti-infecciosa com cotrimoxazol e aciclovir, ou equivalente, obrigatria durante o tratamento e deve continuar por pelo menos 6 meses aps a cessao do ALM. (27)

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3.5 VANTAGENS E INCONVENIENTES O trunfo dos AcsM sobre a utilizao de outros frmacos a sua especificidade. Os Acs podem selectivamente reconhecer pequenas modificaes em protenas, pptidos e molculas orgnicas, bem como mudanas conformacionais que podem estar associadas a alteraes na atividade de enzimas, recetores ou outros componentes biologicamente ativos de uma clula. (35) Os Acs circulantes tm semi-vidas de 7-14 dias, quando no so destinados a linfcitos circulantes. Quando comparados com pequenos frmacos, com semi-vidas de minutos a horas, os Acs tm grande vantagem no perodo de tempo em que esto no corpo para manter o bloqueio. (35) Os ensaios clnicos iniciais com AcsM produziram alguns efeitos antitumorais impressionantes, mas a maioria dessas experincias ilustraram os obstculos a uma terapia bem sucedida. A maioria dos AcsM empregues nos primeiros ensaios clnicos foram obtidos a partir ratos, e os doentes expostos desenvolveram resposta imunitria contra esses AcsM, o que limitava o nmero de tratamentos que esses doentes poderiam receber de forma segura. Mas as tcnicas de engenharia molecular tm superado este obstculo, e agora possvel criar imunoglobulinas completamente humanas. No entanto, estas abordagens no inibem a produo de Acs anti-idiotipo.
(35; 36)

Alm disso, devido sua grande dimenso molecular (~150kDa), os AcsM no

so eficientes a penetrarem clulas vivas para alvos intracelulares e a sua biodisponibilidade baixa quando administrados oralmente. (6; 35) Alguns Ags tumorais so eliminados ou secretado. Os Acs que tm como alvo estes Ags vo-se ligar na circulao, limitando a quantidade de Acs no ligados disponveis
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para se ligarem ao tumor. As barreiras que impedem a distribuio dos Acs dentro dos tumores incluem (a) vascularizao tumoral desordenado, (b) aumento da presso hidrosttica nos tumores e (c) heterogenenicidade na distribuio dos Ags nos tumores. Estima-se que, devido a estas barreiras, uma molcula de IgG levar dois dias para percorrer 1 mm e 7-8 meses para viajar um centmetro dentro de um tumor. As estimativas para uma molcula de Ac menor, como um fragmento Fab, so um dia para percorrer 1 mm e dois meses para percorrer 1 cm. Se os Acs alcanarem os seus alvos, h pouca evidncia de que vo mediar CCAD eficazmente in vivo. Para que isso ocorra, devem de estar presentes no tumor um nmero suficiente de clulas efetoras, tais como macrfagos, clulas NK, ou clulas T citotxicas. Finalmente, sabe-se que muitos tumores secretam compostos que desregulam a resposta imune, ou que tm diminuio de clulas efetoras como consequncia de hipoxia. Apesar destes impedimentos, os dados pr-clnicos e clnicos continuam a demonstrar que a terapia com AcsM tem um papel importante no arsenal oncolgico. (36) Outra questo, so os custos extremamente elevados das atuais teraputicas com AcsM, principalmente devido ao uso de sistemas de expresso em clulas de mamferos e os processos de purificao em grande escala que so necessrios. A administrao continua de dose elevadas, que muitas vezes necessria para manter uma concentrao srica de AcM eficaz para induzir uma resposta clnica, no s limita os atuais regimes / aplicaes clnica devido aos efeitos colaterais relacionados com a dose, mas tambm reduz os seus potenciais campos de indicao. (6)

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3.6 PRESPECTIVAS FUTURAS Em esquemas de terapia combinada, a terapia com AcsM melhora claramente os resultados do tratamento das neoplasias hematolgicas. O momento ideal e os regimes de combinao so reas de investigao em curso. O melhor entendimento dos mecanismos de ao dos AcsM e das combinaes deve levar melhoria da sua atividade e reduo dos efeitos colaterais. No que respeita aos AcsM desses regimes de tratamento, fazem-se esforos para encontrar melhores Ags-alvos de superfcie, melhorar a afinidade das ligao, melhorar a interao com as clulas efetoras, e reduzir a imunogenicidade. A imunogenecidade reduzida com o uso de Acs totalmente humanizados e a melhoria da afinidade pode ocorrer com a engenharia de protenas ou a seleo de epitopos alternativos no Ag-alvo. A melhoria da interao do AcM com as clulas efetoras tem potencial para aproveitar mais plenamente o poder do sistema imunolgico para combater a neoplasia. (2; 5) A interao entre o AcM e as clulas efetoras depende principalmente da ligao ao Fc, pelo que as investigaes em curso tm como foco a melhoria da qualidade dessa ligao Fc atravs da engenharia de protenas. Outra abordagem para a melhoria da interao entre clula efetora/AcM a melhoria da qualidade das clulas efetoras atravs da expanso e/ou ativao. Uma abordagem intrigante para a melhoria dessa interao a criao de Acs bivalentes (diabodies), que consiste na construo de uma protena que se liga tanto s clulas alvo como s clulas efetoras. J h relatos da criao de Acs trivalentes e at de maior valncia, mas quanto maiores os Acs menor a penetrao no tumor apesar de terem semi-vidas maiores e maior actividade ligante.
(2)

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Para os tumores slidos, como o linfoma, a penetrao do tumor pelo Ac uma questo importante. Esta questo pode ser um problema menor para o caso da leucemia, mas mesmo nesta h formao de ndulos ou acumulaes de massas na medula e outros tecidos. Para investigar o significado do tamanho dos Acs na penetrao do tumor e na eficcia da terapia, os investigadores testaram fragmentos de Acs gerados por protelise ou por engenharia gentica. Estes fragmentos tm menores pesos moleculares, variando entre 25 e 100 kDa, do que os Acs intactos (150 kDa). Infelizmente, os fragmentos de Ac tm desvantagens, incluindo a perda das funes efetoras e curta semivida. (2) A tabela 3 lista os AcsM atualmente em ensaios clnicos, para a teraputica de neoplasias hematopoieticas, que incorporam algumas dessas melhorias.
Tabela 3: Anticorpos monoclonais em estudos clinicos
(2; 5)

NOME GENERICO Lintuzumab Brentuximab vedotin MDX-60 Epartuzumab Mapatuzumab Apolizumab

NOME COMERCIAL SGN-33 SGN-30

Ag ALVO CD33 CD30 CD30

TIPO Humanizado Quimrico Humano Humanizado Humano Humanizado

INDICAO TERAPEUTICA LMA Linfoma Hogkins Linfoma Hogkins LNH LNH, Mieloma LLC, LNH

hLL2, LymphoCide TRM-1 HUlD10, Remitogen

CD22 TRAIL-R1 HLA-DRB

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4 CONCLUSES Os AcsM revolucionaram o arsenal teraputico contra o cancro, sendo hoje elementos chave no tratamento de muitas formas de cancro, particularmente nas neoplasias hematopoieticas. A sua incluso nos tratamentos oncolgicos levou melhoria dos resultados teraputicos e diminuio da toxicidade relativamente aos regimes convencionais de quimioterapia, mas ainda ocorrem muitas falhas no tratamento. Atualmente os AcsM aprovados pela FDA tm como alvos os Ags CD33 das clulas mielides, o CD20 das clulas linfoides B, e CD52 expresso nas clulas linfoides. No entanto, o seu uso ainda emergente e a compreenso do seu potencial requer a otimizao do uso dos AcsM atualmente disponveis e um esforo concertado para assegurar que os programas de desenvolvimento de novos AcsM so baseados em princpios cientficos robustos.

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6 AGRADECIMENTOS Agradeo minha orientadora, a Professora Doutora Maria Leonor Correia pelo empenho, dedicao e disponibilidade para contribuir valiosamente na concretizao do presente reviso. E, tambm, aos meus amigos e famlia por serem uma extraordinria fonte de apoio.

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