Patologia Molecular em Medicina Curso I

Imunohistoqumica
Ana Alarco 28 de Maio de 2009

Imunohistoqumica (IHQ)
Cincias: imunologia, histologia e qumica Fundamento: demonstrao de antignios (Ag) nos cortes histolgicos atravs de anticorpos (Ag) especficos. Aps ligao Ag-Ac a sua demonstrao possvel atravs de uma reaco histoqumica com colorao visvel em microscopia ptica Material: tecido parafinado, fresco, suspenses celulares, imprints e cell block Permite: 1 ou mltiplos Ag simultaneamente Analisar a presena de 1 Ag particular em vrios tecidos na mesma lmina (microarray)
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Imunohistoqumica (IHQ)
Aplicao: Diagnstico quando a morfologia e dados clinopatolgicos no o permitem Distino entre tumores histologicamente semelhantes Identificao do sub-tipo histolgico Caracterizao de tumores malignos no diferenciados ou pouco diferenciados para determinar se so primrios ou metastticos Identificao de micrometstases Permite diagnstico, prognstico e orientao teraputica
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Imunoglobulina G (IgG)
Imunoglobulinas (Ig): G, A, M, D , E
Ligao do antignio (Ag): VL e VH Regies hiperactivas (HV): domnios VL e VH Reaco antignio-anticorpo: HV fica em proximidade com o determinante antignico (eptopo) Cada Ag pode conter 1 ou mais eptopos. Cada eptopo pode ser composto por aminocidos (5 ou +) ou unidades de monossacardeos
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Estrutura da IgG: A cadeia pesada (H) e a leve (L) so compostas por domnios varivel (V) e constante (C). As cadeias esto ligadas por pontes dissulfito.

Anticorpos
Tipo de Anticorpos: Monoclonais Produzido atravs de hibridomas Produto de um clone individual clulas do plasma Reagem com um eptopo especfico Animal usado para a sua produo: ratinho

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Anticorpos
Tipo de Anticorpos: Policlonais Produzidos em diferentes clulas Produzidos por animais imunizados Reagem com vrios eptopos Animal usado para a sua produo: coelho, cabra, porco, ovelha, cavalo, porquinho-da-ndia Podem ser obtidos na forma de anti-soro ou fraces de Ig
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Anticorpos
Anticorpos monoclonais versus anticorpos policlonais
Anticorpos Caractersticas Origem Afinidade Sensibilidade Especificidade Contedo Ig irrelevante Efeito da fixao Tolerncia da fixao Homogeneidade Custo
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Monoclonais Maioria ratinho Sem variao Baixo a moderado Alto Nenhum no sobrenadante de clulas, na ascite 0.51.0 mg/ml nico Baixo Sem variao por lote Alto

Policlonais Mltiplas espcies Varivel Alta Baixa a alta Alta (10 mg/ml) Mltipla Alta Variao por lote Moderado

Anticorpos
Algumas dificuldades na utilizao de Ac monoclonais: O eptopo alvo tem de ser preservado pela fixao A reactividade de um eptopo aps uma fixao ptima no assegura necessariamente que seja preservado em condies de fixao sub-ptima O eptopo alvo tem de ser nico para um dado antignio Os Ac monoclonais dependem mais de outros factores, tais como, pH e outros reagentes

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IHQ - Principais Factores que a Afectam

Manipulao de tecidos
- Fixao - Recuperao antignica

Exposio dos eptopos

Eptopos Mascarados ou destrudos

Anticorpos - Monoclonais - Policlonais

Eptopos alvo Alta especificidade

Outros Eptopos Fraca especificidade

Reaco cruzada Anticorpos contaminados

Sensibilidade do sistema de deteco

Colorao IHQ Interpretao

Sem colorao IHQ

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IHQ - Metodologia
Escolha da Metodologia: Tipo de amostra Disponibilidade do Ac primrio Grau de sensibilidade Tempo de processamento necessrio Custo dos reagentes

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IHQ - Metodologia
Mtodo Directo Mtodo Indirecto 2 passos

Ramos-Vara JA., Vet Pathol 2005, 42:405-426

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IHQ - Metodologia
Mtodo Indirecto 3 passos

Renshaw S., Immunohistochemistry: Methods Express 2007, captulo 4

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IHQ - Metodologia
Complexo fosfatase alcalina-fofatase anti-alcalina (complexo APAAP)

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Renshaw S., Immunohistochemistry: Methods Express 2007, captulo 4

IHQ - Metodologia
Complexo peroxidase-anti-peroxidase (complexo PAP)

Ramos-Vara JA., Vet Pathol 2005, 42:405-426

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IHQ - Metodologia
Labelled streptavidin-biotin (LSAB) method

Ramos-Vara JA., Vet Pathol 2005, 42:405-426

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IHQ - Metodologia
Mtodo do Polmero: EnVision Systems

Ramos-Vara JA., Vet Pathol 2005, 42:405-426

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IHQ - Metodologia
Mtodo do Polmero: ImmPRESS polymerized reporter ezyme staining system

Renshaw S., Immunohistochemistry: Methods Express 2007, captulo 4

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IHQ - Metodologia
Tyramide Signal Enhancing (TSE) ou CSA

Renshaw S., Immunohistochemistry: Methods Express 2007, captulo 4

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IHQ Etapas do mtodo LSAB - HRP

1 Desparafinizao e hidratao 2 Recuperao antignica 3 Bloqueio da peroxidase endgena 4 Bloqueio das reaces inespecficas 5 Anticorpo primrio 6 Anticorpo secundrio biotinilado 7 Estreptavidina-HRP 8 Substracto/cromogneo: 3,3-diaminobenzidina (DAB) 9 Contraste nuclear 10 Montagem

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IHQ Efeito da Fixao com Formol

Fixao com formol a 10% tamponado: Formao de ligaes cruzadas: umas reversveis (bases de Schiff) outras no (pontes de metileno) Modificao da estrutura tridimensional (terciria e quaternria) das protenas reconhecimento dos Ag impossvel ou difcil Excesso de fixao falsos negativos Fixao insuficiente resultados no esperados No h um tempo ptimo standard de fixao para cada Ag (estrutura qumica do Ag e sua relao com outras protenas)
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IHQ Efeito da Fixao com Formol

Durao da fixao pode alterar as reaces IHQ: Falha na deteco de um antignio Reaco fraca Aumento de rudo de fundo Deteco de um Ag num compartimento celular no esperado Reaco cruzada

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IHQ Recuperao Antignica

Recuperao antignica

Ramos-Vara JA., Vet Pathol 2005, 42:405-426

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IHQ Recuperao Antignica

Recuperao antignica: Digesto proteoltica (pronase, tripsina, quimotripsina, pepsina e proteinase K) Recuperao pelo calor: Mdulo PT, microondas, panela de presso e banho-maria Citrato de sdio pH 6.0, EDTA pH 8.0 e Tris/EDTA pH 9.0 Forma combinada: digesto enzimtica e pelo calor
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IHQ Rudo de Fundo

Interaces hidrofbicas: Entre protenas Armazenamento de Ig (agregao e polimerizao levando a diminuio ou perda de reactividade imune) Entre Ig G monoclonal e as protenas do tecido (composio do diluente de Ac)

Interaces inicas e electrostticas: Entre Ag e correspondente Ac

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IHQ - Bloqueio de Reaces Inespecficas

Bloqueio das reaces inespecficas Blocking protein:
Tem de ser do tipo que compete efectivamente com IgG pelos locais de ligao hidrofbica no tecido Aplicada antes do Ac primrio A soluo deve conter protenas idnticas s do anticorpo marcado (mas no do Ac primrio) para prevenir a ligao inespecfica do Ac secundrio

Adio de detergente (ex: Tween 20) Adio ao diluente do Ac primrio de albumina srica bovina a 1% Adio de leite magro em p ou casena Reduo das interaces inicas Diluentes de Ac com fora inica superior
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IHQ Rudo de Fundo

Actividade enzimtica endgena: Actividade da peroxidase endgena Resulta na decomposio de H2O2 e uma propriedade comum da hemoglobina (eritrcitos), mioglobina (clulas musculares), citocromo (granulcitos, moncitos) e catalases (fgado e rim) Pode encontrar-se no tecido intersticial devido difuso de sangue antes da fixao Actividade fofatase alcalina endgena Tracto gastrointestinal
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IHQ - Bloqueio da Peroxidase Endgena

Bloqueio da peroxidase endgena: Incubao dos cortes em H2O2 a 3% No necessrio se usar uma enzima marcada com fosfatase alcalina em vez da peroxidase

Bloqueio da fofatase alcalina endgena: Incluir levamisole 5 mM na soluo de substracto Lavagem com cido fraco
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IHQ Controlos dos Anticorpos

Ac Primrio: Testar a diluio ptima num tecido positivo Testar em tecidos que contenham e no contenham o Ag Testar a especificidade do Ac monoclonal: usar outro Ac primrio irrelevante, embora estejam disponveis Ac de ratinho no imune da mesma subclasse

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IHQ Controlos dos Anticorpos

Testar a especificidade do Ac policlonal: Controlo (-): soro no imune ou fraco de Ig da mesma espcie do Ac primrio ou Ac primrio irrelevante para a especificidade Exemplo de preparao de controlo (-) para fraco de IgG de anti-soro policlonal:
[Proteica da fraco IgG]: 4.2 g/l, diluio recomendada 1:200, concentrao final da protena 4.2/200 = 0.021 g/l Fraco de IG de coelho no imune: 18 g/l, a diluio necessria determina-se como se segue: 18/0.021 857 Diluio do controlo (-): 1:857 (1 parte fraco de IG de coelho no imune em 856 partes de tampo)

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IHQ Controlos dos Tecidos

Controlo negativo: Tecido sem a protena alvo (processado de forma idntica s amostras) Controlo positivo: Tecido com a protena alvo (processado de forma idntica s amostras):
Nalguns casos vantajoso ter um controlo (+) com pouca intensidade de marcao para monitorizar no s a presena do Ag, mas tambm a possvel perda de sensibilidade Controlo de perda de sensibilidade pode ser muito importante quando se coram tumores, uma vez que nestes a intensidade de marcao varia com o grau de diferenciao do tumor
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IHQ Controlos dos Tecidos

Controlo interno do tecido: Contm o Ag alvo no s nos elementos do tecido em anlise (ex: tumor) mas tambm na zona normal adjacente Ideal porque a varivel fixao dos tecidos entre as amostras e os controlos eliminada Vantagem de no ser necessrio um controlo (+) em separado Controlo da fixao: Vimentina para assegurar a qualidade da fixao com formaldedo e facilitar a seleco de campos para a interpretao diagnstica

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IHQ Optimizao do Anticorpo Primrio

Anticorpos Diluio ptima do anticorpo: Tempo de incubao Temperatura de incubao (4C, temperatura ambiente, 37C) Srie experimental de diluies Intensidade de colorao e presena mnima de rudo de fundo
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Colorao Imunohistoqumica

PTEN

APC

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VIM

Colorao Imunohistoqumica

EGFR

CK7

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Marcadores Imunohistoqumicos
Anti-queratinas = + Anti-queratinas = + Anti-EMA =+ Anti-EMA =+ Anti-queratinas = Anti-queratinas = =+ Anti-LCA Anti-LCA =+ Anti-queratinas Anti-queratinas Anti-EMA Anti-EMA Anti-LCA Anti-LCA = = = = = =

CARCINOMA CARCINOMA

LINFOMA LINFOMA

OUTROS TUMORES OUTROS TUMORES

Linfoma de clulas T Linfoma de clulas B Linfoma histiocitrio

CD45 CD45 F1 F1 Anti CD3 Anti CD3 CD20 CD20 CD45 CD45 MAC 387 MAC 387 CD 68 CD 68 CD 163 CD 163 CD15 CD15
CD30 CD30

=+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+ =+

Melanoma
Rabdomiosarcoma Leiomiosarcoma

Protena S100 = + Protena S100 = + HMB 45 =+ HMB 45 =+ Melan-A =+ Melan-A =+ Desmina Desmina =+ =+

Neuroblastoma

Neurofilamentos = + Neurofilamentos = +

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Linfoma de Hodgkins

Leu MI Leu MI

Outros sarcomas

Vimentina Vimentina

=+ =+