Coleccin de Microhongos Laboratorio de Micologa y Fitopatologa Uniandes (LAMFU) Misin La coleccin de Microhongos del Museo de Historia Natural de la Universidad

de los Andes, est dirigida a la conservacin y preservacin de aislamientos de importancia mdica y agrcola, especialmente aquellos descritos en publicaciones cientficas indexadas. Esta coleccin constituye el material de referencia para la ejecucin de nuevos estudios que promuevan el intercambio cientfico entre instituciones y centros de investigacin orientados al conocimiento y desarrollo de la Fitopatologa y Micologa Mdica. Manejo del Material Biolgico

1. Recepcin de Muestras: Las muestras que van a ingresar a la coleccin de Microhongos del Museo de Historia Natural de la Universidad de los Andes, deben ser cultivos puros, crecidos en caja o tubo, con el medio especfico, segn los requerimientos de cada hongo filamentoso. PDA. Medio Papa-Dextrosa- Agar YM. Medio extracto de Malta Extracto de Levadura Caractersticas especficas: El cultivo debe estar puro y viable El cultivo debe estar esporulado. Los cultivos deben ser jvenes aproximadamente 10 das

Una vez se recibe la muestra, se procede a llenar una ficha de seguimiento del material recibido en el cual se consignan datos como: Fecha de recepcin Enviada por (Nombre de la persona o entidad correspondiente) Tipo de Muestra (suelo, vegetal, aislamiento) Aislamiento Identificacin* Conservacin*

Informacin* Observaciones* * Estos datos dependern del tipo de anlisis requerido y del destino de la muestra, una vez analizada Los Registros de Recepcin de Muestras y la documentacin entregada por la persona que trae la muestra deben archivarse en la carpeta seguimiento. Codificacin. Cada muestra entregada se codificar, siguiendo el nmero consecutivo presente en la ficha de seguimiento establecida para tal fin. Almacenamiento. La persona encargada de la recepcin, clasificacin y codificacin de muestras es responsable de su almacenamiento. de ficha de

2. Conservacin de Microhongos Objetivo: Establecer la metodologa adecuada para la conservacin de las accesiones de la Coleccin de Hongos Filamentosos de tal forma que sus caractersticas biolgicas se mantengan estables a travs del tiempo y que no se contaminen con ningn otro tipo de microorganismos (Corpoica). Es responsabilidad del Curador de la coleccin de hongos aplicar el protocolo adecuado segn las caractersticas de crecimiento y desarrollo propias de cada especie. Protocolo 1 Conservacin de Cultivos Activos Bajo Aceite Mineral Estril. Corpoica Mediante este mtodo se disminuyen las tasas metablicas de los hongos aerbicos, al disminuir la cantidad de oxgeno disponible. Sin embargo, no se induce latencia verdadera, ya que una pequea cantidad de oxgeno se difunde a travs del aceite mineral. Este mtodo es apropiado para la mayora de los hongos filamentosos y ha sido usado por diferentes colecciones internacionales durante los ltimos 100 aos. Preparacin de Materiales. Se debe preparar el mismo nmero de viales con PSA y aceite mineral.

Se sirve PSA hervido durante 1 minuto en viales de 10 ml de capacidad, a razn de 2 a 3 ml por vial. Este PSA NO debe incluir ningn antibitico. Los viales son sellados con tapones de algodn y autoclavados a 15 psi durante 20 minutos. Estos viales NO se inclinan durante el enfriamiento Se dispensa aceite mineral en viales de 10 ml de capacidad, a razn de 5 a 6 ml por vial y se sellan con tapones de algodn Los viales con aceite mineral son esterilizados mediante calor seco, a 120C ( 250F) durante 1,5 horas (se debe tener en cuenta que el horno se demora cerca de 15 minutos en alcanzar la temperatura deseada)

Se toma el nmero de tapones de caucho necesarios, se envuelven en papel peridico y se autoclavan a 15 psi durante 20 minutos Se prepara el nmero de agrafes metlicos necesarios. No es necesario esterilizarlos

Inoculacin y Sellado. Este procedimiento debe ser llevado a cabo bajo condiciones de esterilidad. Todos los viales con cultivos deben ser claramente marcados usando stickers en los cuales se escribe con tinta resistente al agua y al alcohol: El nombre de la accesin, Fecha de inoculacin con el siguiente formato: da/tres primeras letras del mes/cuatro cifras del ao, Fecha de conservacin con el mismo formato. A partir de un cultivo puro y con identidad taxonmica confirmada se realiza un repique al nmero de viales con PSA necesario para la accesin en cuestin. Se inocula un vial adicional para el control de calidad. El inculo debe tomarse con un asa micolgica y ser tan pequeo como sea posible. Se debe tener en cuenta que siempre se debe flamear la boca de los viales recin destapados, antes de introducir cualquier cosa en ellos y justo antes de sellarlos. Adicionalmente, siempre se debe flamear toda la extensin del asa, hasta alcanzar el rojo vivo, empezando en la zona ms cercana al mango y en direccin a la punta, para evitar que cualquier residuo lquido se introduzca en el mango. Los viales son sellados usando el mismo tapn de algodn, el cual es envuelto firmemente con vinilpel, de tal forma que no se caiga accidentalmente. Se incuban los viales a 24 C, en oscuridad o bajo luz blanca tipo da, dependiendo del gnero y sus requerimientos para produccin de estructuras reproductivas, durante 10 das o hasta que se observe esporulacin (generalmente el perodo no excede 14 das) Una vez se observa esporulacin adecuada, los cultivos son cubiertos con el aceite mineral previamente esterilizado en viales, utilizando el aceite contenido

en un vial para cubrir tan solo un cultivo. Nunca se debe usar el aceite sobrante de un vial para cubrir un segundo cultivo, ya que se podran producir contaminaciones cruzadas a travs del aceite. Se flamea la boca del vial con PSA y ahora con un cultivo cubierto con aceite mineral y se sella con un tapn de caucho estril. Se asegura el tapn de caucho con el agrafe metlico. Control de Calidad. Este procedimiento se debe realizar para cada una de las accesiones conservadas. Dentro de los 14 das siguientes a la conservacin, se toma al azar uno de los cultivos cubiertos con aceite y sellados, se destapa cuidadosamente. Se flamea la boca del vial. Usando un asa micolgica se toma un pequeo cuadrado (2 mm) de la colonia Se inocula una caja de Petri con medio PSA, arrastrando un poco el inculo sobre la superficie del medio para eliminar el exceso de aceite Se incuba en oscuridad a 25C hasta que se observe esporulacin Se lleva a cabo la comprobacin de identidad y verificacin de pureza Si el control de viabilidad son positivos, se procede a ingresar las rplicas conservadas de cada accesin a la coleccin ya registrar este movimiento en el inventario. Si los resultados son negativos, se repite todo el proceso nuevamente. Procolo 2 Conservacin en papel filtro (Monospricos) Laboratorio Fitopatologa Universidad Militar Nueva Granada Pedro Jimnez 1. Crecimiento de hongo filamentoso en PDA (Potato dextrose agar)

2. Siembra por agotamiento del hongo en Agar agua, para diseminar y separar las esporas, durante 24h a temperatura ambiente

3. Extraccin de una espora, siembra en caja con PDA y papel filtro estril.

4. Incubar 25 C (hasta colonizacin total del papel filtro por parte del hongo)

5. Extraccin del papel filtro y secado en caja de petri vaca, estril, aproximadamente 10 a 15 das

6. Corte del papel filtro, en tiras delgadas, y almacenamiento en viales a -4C, (3 replicas por muestra) Protocolo3 Conservacin de Cultivos Activos en Agua destilada Estril. Corpoica Smith and A.H.S. Onions Preparacin de Materiales. Se sirve agua destilada esteril (ADE) 2 a 3 ml por vial. Los viales son sellados con tapones de algodn y autoclavados a 15 psi durante 20 minutos. Se toman 4 plugs del hongo crecido y se ponen en los viales estriles con ADE Se toma el nmero de tapones de caucho necesarios, se envuelven en papel peridico y se autoclavan a 15 psi durante 20 minutos Se prepara el nmero de agrafes metlicos necesarios. No es necesario esterilizarlos El proceso de inoculacin y sellado, as como el de control de calidad de describen en el protocolo 1.

Asesoria: Lynne Sigler Professor, Dept. of Medical Microbiology & Immunology Curator of the University of Alberta Microfungus Collection and Herbarium (UAMH)

University of Alberta Microfungus Collection and Herbarium Devonian Botanic Garden Canada. Referencias 1. Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria (CORPOICA) 2. Grgoire Laurent Hennebert, Guidelines in studying fungi 3. The preservation and Maintenance of Living Fungi 1994 de D. Smith and A.H.S. Onions .second edition, International Mycological Institute CAB International U.K