Manual Cultivo de Microalgas Uabcs

UNIVERSIDAD
AUT NOMA
DE BAJA
CALIFORNIA SUR
`REA INTERDISCIPLlNARIA
MAR DEPARTAMENTO DE
DE CIENCIAS DEL MARINA
BIOLOG A
MANUAL PARA EL CULTIVO DE MICROALGAS
MEMORIA T CNICA DE UN TRABAJO PROFESIONAL
QUE COMO UNO DE lOS REQUISITOS PARA OBTENER El
T TULO
MARINO
DE
Bi LOGO
PRESENTA ABRIL KARIM ROMO
PI ERA
la Paz B C S
diciembre de 2002
f
y
0
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054616v
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AUT NOMA
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lAR EMELIO BAIUAlJ GONZAL
Z 1 lARINA
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE
BIOLOG A
PRESF NTE
Los
abajo
firmantes comunicamos el la pas

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que habiendo
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Trabajo
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p Il1kr
DEDICATORIA
A Dios A Osmar por existir por A Daniel por

su amor su amor
y por
ser lo
mejor
de mi vida
comprensi n
compa a
y apoyo
siempre y
en
todos
aspectos
A mis vida A mis hermanos Paco Laura y Yazm n cario
padres Laura y Francisco por
su
cario
confianza y apoyo
en
toda mi
por
su
AGRADECIMIENTOS
Muy especialmente a Erika por su amistad ayuda y enseanza tanto profesional como personalmente por las revisiones ideas correcciones y
dems inicio Al
cosas
hechas
este documento
adems de
ser
la persona que
me
en
sta rea Gracias
amigocha
sus
ahora si
quedo
listo por toda la
Doc
Rangis por
me
su
amistad Jefe
enseanzas
ayuda que
ha brindado del
iPor fin
aqu
las comidas y esta la tesis
A los dems
integrantes
proyecto Cultivo de Pteridos Hector Hugo Champ
y Alex a quien agradezco adems del acomodo de grficas A mis
tambin la
ayuda en la revisi n ndices fotograf as etc
de este documento
compaeros de generaci n X el Ofelia y Carlitos con quienes logre adems de un trabajo en equipo una gran amistad En especial a Marichu por su cario y bastantes platicas y parrandas junto a Ella al Negrito por su amistad y a ambos gracias por adoptar a mi hijo como su sobrino y en la impresi n de este trabajo
A mis
compaeros de trabajo en la Unidad Don Cuiti por sus dulces y platicas A Micke por la ayuda elctrica e hidrulica en el laboratorio a Edgar por su ayuda para los cultivos masivos a Esther por sus platicas adems de su ayuda con los anlisis bacteriol gicos a Efra n por su amistad por darme una mano cuando necesitaba ayuda y por ser nano de mi hijo cuando lo he
necesitado Gracias tambin
a
Marco Cadena por
ser
que a Roberto Carmona por la
ayuda
en
parte de mi comit revisor al igual la parte estad stica de este trabajo
Romo Piera Abril UABCS
Karim
2001
Manual para el cultivo de
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
NDICE
PRO LOGO
1
G LO SARIO
mTRO D Ue el o N
2 o BJETIV o
3 CONTROL DE LOS
REQUERIMIENTOS FSICOS
QUMICOS
EN EL 9
LADO RA TO RIO
3 1 PARAM ETROS FISICOS 3 2 PARAM ETROS QUI M ICOS
9 11
EQUIPO
DE TRABAJO
12
4 1 AREA DE GAS I N ETE 4 2 AREA H U M ED A 4 2 1 TRATAMIENTO DEL AGUA UTILlZADA 2 4 2 CULTIVOS MASIVOS
12 18
18 20
5 ASPECTOS IMPORTANTES DEL CULTIVO DE MICROALGAS
22
5 1 CONT AMINA e 10 N 5 1 11NDICADORES DE 5 1 2 INDICADORES DE
22
CONTAMINACi N QU MICA CONTAMINACi N BIOL GICA

MARINA
23 23
23 24 25
5 2 CONTROL DE LA CALIDAD DEL AGUA 5 3 I N oe u LO 5 4 NIVEL CEP ARIO 4 5 1 SIEMBRA EN LIQUiDO 4 5 2 SIEMBRA EN 5 5
28 30
33
AN`LI S IS
S LIDO BACTERI OL G ICOS
6 EVALUA CIO N DE LA BIOMASA
35
6 1 HEMA TOCIT
METRO O C`MARA
DE NEUBAUER
35 37
6 2 E SPECTo FOTO METR O 2 6 1 CURVAS DE
38
CALIBRACi N
Romo Piera
Abril Karim
2001
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
UABCS
50pp
IES ESPEC
EXISTENTES EN EL LEAP
r
44
Bm LIOG RAFIA
45
ANEXO I
FORMULACI N PARA
LA PREPARACI
N DEL MEDIO DE CULTIVO

47
F 2 DE GuaLARD y RYTHER 1973
ANEXO n BIT` CORAS DE APARA TOS
49
BITAeoRA AUTOCLAVE
50
BITAeo RA MICROSCO PIo
51
BITAeo RA BALANZA
52
BITAeo RA DESTILADOR
53
BIT`CORA SISTEMA
DE
FILTRACI N
IRRADIACI N
DE AGUA
54 MARINA 55
ANEX O ID CRIS TALERIA
INVENTARIO
ANEXO IV PROTOCOLO DE USO DEL SISTEMA DE FILTRACION E

RAD IR lACIO N D E AGUA MARINA 56
NDICE
Figura Figura Figura Figura Figura
1
DE FIGURAS Y TABLAS
Curva
representativa de crecimiento de
un
cultivo esttico de
Material utilizado para cultivos estticos 3 Autoclave para esterilizaci n de material 4 Campana de flujo laminar Utilizada para siembras y elaboraci n de vitaminas esterilizadas 5 Destilador de agua 6 Sistema de filtraci n 7 Sistema hidrulico marino
en
2 Cristaler a
microalgas 13
15 16 18 19 20 21
Figura
Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura
irradiaci n de agua marina
8 Cultivos masivos 9 Bolsa de 10 Estante 11
plstico montada
con
el sistema de
columpio
21 25 27 28 31 32
11
cultivos
nivel
cepario
y cultivos estticos
Horno de
precisi n
cepario
12 Siembra del 13 Tubos

14
con
en la campana de flujo laminar colocados sobre una pipeta de 5 mL agar Sembrado en zig zag sobre agar
Romo Piera UABCS
Abril Karim
2001
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
Figura 15 Diiluci n del cultivo para la
toma de muestra en un anlisis
bacteriol gico
34
Figura
un
16 Cmara de conteo Neubauer Utilizada para cultivo
conocer
la concentraci n de 35 39 39 40 41 42 42 43 44 1O 14 26
a
Figura 18 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de Isochrysis galbana en cultivos de 1 OOL Figura 19 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de
Monochrysis
luther
en
cultivos de 1 OOL
entre la absorbancia y la densidad de
Figura 20 Tendencia de la regresi n

Dunalliela tertiolecta
en
cultivos de 1 OOL
Figura
21
Tendencia de la
Chaetoceros
gracilis
regresi n entre la absorbancia y la densidad de en cultivos de 1 OOL

entre la absorbancia y la densidad de
Figura 22 Tendencia de la regresi n Isochrysis galbana en cultivos de 400L Figura 23 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de Monochrysis luther en cultivos de 400L Figura 24 Tendencia de la regresi n entre la absorbancia y la densidad de
en
cultivos de 400L
Figura
25 Tendencia de la
Chaetoceros gracilis
Tabla 1 Relaci n de Tabla 11
regresi n entre la absorbancia y la densidad de en cultivos de 400L lmparas

matraces
interruptores y
Tiempos de irradiaci n para los
Tabla 111 Relaci n del volumen de agua marina yagua destilada Tabla IV
Proporci n de vitaminas y silicatos de acuerdo al valumen
29 utilizar
ili
Romo Piliera UABCS
Abril Karim
2001
microalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
PR LOGO
La Unidad ubica
en
Pichilingue de la Universidad Aut noma de Baja California Sur
se
el km 16 de la carretera La Paz
mar
Pichilingue
a
en un
rea concesionada
junto al
se
La
Unidad
depende acadmica
Coordinaci n de Ciencias del Mar debido

desarrollan
como son
y administrativamente de la la naturaleza de las actividades que
la acuacultura y la pesca Para el ao de 1993 el Laboratorio Experimental de Acuacultura de la Unidad
Pichilingue
actividades
LEAP
de la Universidad Aut noma de
para respaldar la docencia a teniendo como l neas prioritarias el cultivo de moluscos y el cultivo de peces marinos Siendo tambin sede de la Maestr a en Ciencias en Acuacultura del
Baja California Sur inicia sus nivel superior y la investigaci n
Programa Regional de Posgrado

El LEAP consta de
seco
en
Acualcultura divididas reas de

en
reas
se
especializadas
localizan las
dos
secciones
laboratorio
donde
Histolog a
El Qu mica
Microbiolog a y Microalgas El laboratorio hmedo donde se encuentran las reas de Cultivo de Microalgas Cultivo de Moluscos Cultivo de Peces Planta de Alimentos Balanceados y rea de Temperatura Controlada Todas las reas tienen como principio dar respaldo a las labores docentes y de investigaci n en particular para la realizaci n de prcticas capacitaci n y
para el asesoramiento continuo de los trabajos de tesis para los estudiantes de licenciatura maestr a y doctorado tanto de nuestra Instituci n como de las Instituciones de educaci n superior o entrenamientos
espec ficos
as
como
investigaci n
con
las que
se
tengan convenios vigentes
Romo Piiera Abril Karim UABCS
2001
microalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
GLOSARIO
AGAR
Polisacarido extra do
como
agente
solidificante
de Gelidium y otras algas marinas utilizado en medios de cultivo de muestra de
AISLAMIENTO
Obtenci n de cultivos agua
monoalgales
partir
una
ASEPSIA BACTERIA CEPA COSECHA
Estado libre de
microorganismos pat genos
Procariota unicelular
Cultivo puro de
Extracci n de alcanzado
una
especie
del
determinada de
microorganismos
una vez
microalgas
recipiente
de cultivo
que han
una
densidad deseada de todos los
ESTERILIZACi N
Destrucci n
total
organismos
que
viven
en
un
volumen de agua
FOTOAUT TROFOS
Organismo
capaz de sintetizar su sustancias inorgnicas usando la luz Proceso de s ntesis
propio
como
alimento fuente de
partir
de
energ a
de la
FOTos NTESIS
de carbohidratos
partir
de bi xido
carbono yagua utilizando energ a clorofila en las clulas vegetales
radiante de la luz
captada por
HETER TROFOS
que necesita fuente de carbono
Organismo
compuestos orgnicos complejos
como
INOCULAR
Procedimiento de transferencia de niveles del cultivo
microalgas
en
los diferentes
MEDIO DE CULTIVO
Soluci n
otro substrato utilizado para cultivar capaz de
microorganismos
de luz
u
MIXOTR FICOS
Organismo
oscuridad
reproducirse
en
presencia
NUTRIENTE
Trmino
genrico
para
cualquier sustancia
un ser
que
pueda utilizarse
en
los procesos metab licos de
vivo del ion

o
pH
Logaritmo negativo
virtud de la cual
se
de la concentraci n
expresa el grado de acidez
hidr geno por alcalinidad de un
l quido SOLUCi N STOCK

Soluci n que contiene el medio de cultivo concentrado para
su
fcil
manejo
2
Romo Piflera UABCS
Abril Karim
2001
Manua para el cultivo de mieroagas Memoria tcnica
profesional
50pp
INTRODUCCi N
El cultivo de considerando
en
microalgas
conocido
como
cultivos de apoyo
cultivos
anexos en
esta definici n tambin al cultivo de
zooplancton
es
primordial
su
el
desarrollo de los cultivos
principales
en su
esto
es
para los moluscos durante todo Las
ciclo del
de vida crustceos y peces suministro de
etapa
larvaria
microalgas son
las
encargadas
energ a por
a
medio de biomolculas travs
sintetizadas de elementos
Estas
en
menos
complejos
transformados
a
de la fotos ntesis de biomasa
microalgas
son
las que
mayormente contribuyen
reservorios La
la
producci n
los ocanos
estuarios
lagos
posici n
de estos
organismos
aporte
como
dentro de las redes tr ficas forman los
pilares
bases de stas debido al Es as
de
energ a
de las biomolculas sintetizadas
por estos Hoff y Snell 2001

se
hasta el momento estos
microorganismos
en
no
han
podido
sustituir
como
fuente nutricional para
cualquier organismo
cultivo
Caizares et al 1994
El trmino otros
microalga
se
refiere
aquellos microorganismos
que contienen clorofila y Este trmino

con no
pigmentos
fotosintticos
capaces de realizar fotos ntesis

se
tiene
sentido taxon mico
alguno
y dentro del mismo
incluyen organismos
dos
tipos
celulares distintos cianobacterias que tienen estructura celular procariota y las restantes
microalgas
con
estructura celular eucariota Pese ambos
las
grandes diferencias procariota

son
estructurales
con un es
fisiol gicamente
tipos
de
microalgas
eucariota y
similares
metabolismo fotosinttico
similar al de las
con
plantas superiores
de
La
reproducci n
o menos
generalmente
los
por divisi n binaria cianobacterias
tiempos
a
duplicaci n
o
de
una
hora
para
procariotas
y de 8
24 horas
ms para las eucariotas
Carpenter
1979 Dawes 1991
stos organismos primarios

a
fotosintetizadores
a
son
considerados
como
los
productores
luminosa de la
de biomolculas sintetizadas
partir
de la transformaci n de los y de cuales
energ a
energ a
qu mica
de
su
Son
organismos
celular el
unicelulares de clorofila
dependiendo
composici n
pared
tipo
pigmentos accesorios
entre
se
otras caracter sticas
utilizadas para clasificarlas
permiten que
de tal diversidad 1979
puedan
2001
seleccionar
aquellas que puedan
cultivarse
Carpenter
Hoff y Snell
Romo Pinera Abril Karim UABCS
2001
microalgas
Memoria tcnica
profesional
SOpp
No todas las
especies
incluidas
en
este grupo
son
son
fotoaut trofas
como se
explic
a
al
no
principio
de esta secci n
algunas
otras de
verdaderas heter trofas debido tales

como
que
requieren
cidos
de luz y toman la de
energ a
compuestos orgnicos especies

son
los azcares y
es
orgnicos
igual
en
forma muchas otras de luz

o en
mixotr ficas esto
que
pueden reproducirse
Las
presencia
la oscuridad
se
Hoff y Snell 2001

en
microalgas
heter trofas y mixotr ficas El
encuentran virtualmente
cada clase
taxon mica del grupo
alga
fotoaut trofa tiene la de

sus a
capacidad
de obtener la
en
energ a
heterotr ficamente
dependiendo
su
necesidades alternando la
la utilizaci n de la
energ a
como
luminosa y
transformaci n
qu mica
utilizando bi xido de carbono as
sustancias
orgnicas Oroop
que
1974 de este grupo base

a en
Cabe mencionar
algunos integrantes obligados

con
anlisis
con en
han sido niveles de
etiquetados
como
Ufotoaut trofos
experimentaci n
transformarse
nutrientes An cuando
algunas
de estas
se
especies pueden
heter trofas
cuando los niveles de nutrientes
encuentran sustancialmente arriba
por
debajo
de
las condiciones naturales Gladue 1991 El crecimiento crecimiento

es
mieroalgal
se
rige
por la
ley
del m nimo
es
decir el factor Iimitante del
aquel
que est presente Es
en
cantidades ms
pr ximas
al m nimo
critico
necesario para la de tolerancia de bien
microalga
una
importante
conocer o
las condiciones
ptimas
y los l mites Ahora

un
microalga
o
para todos para

un
el mayor nmero de
parmetros
estas condiciones
l mites
parmetro generalmente
cambian cuando
segundo parmetro
flucta
Caizares
1994
En el cultivo masivo el rendimiento alcanzado las clulas

en
depende
tanto de la concentraci n de
el cultivo
como
del
grado
en
que las clulas

un
pueden
de
desarrollar
su en
potencial
de crecimiento
es
Por tanto
un
para in culo
conseguir
cultivo
mieroalgas
crecimiento activo
I ecesario
viable de tamao
m nimo y f sicas
suministro de luz aireaci n
nutrientes y microelementos adecuadas condiciones
qu micas
temperatura
Al
salinidad y
como
energ a
Caizares
otro
1994 vivo las condiciones f sicas Cada tienen gran

un
igual
que
en
cualquier
organismo microalga
influencia
el crecimiento de la
especie presenta
particular
intervalo de
temperatura ox geno
intensidad de luz
preferencias espectrales
un
salinidad bi xido
se
de carbono y
para la
producci n
de
mximo crecimiento Tambin
debe
mencionar que ms que la influencia de
un
solo
parmetro
es
el
conjunto
de
parmetros
Romo Pilera
Abril
Karim
2001
Manual para al cultivo de
gas microa
Memoria tcnica
profesional
UABCS
50pp
lo que 1994
crea
determinadas
respuestas
en
el crecimiento de las
microalgas Caizares
Como
parmetros
f sicos
se
consideran luminosa sta
La luz
en
las
microalgas
son
fotoaut trofas y
encargadas
sus
de convertir la de
energ a
a
metab lica por medio de la fotos ntesis

ser
periodos
exposici n
pueden
continuos
mediante luz artificial de oscuridad tambin
discontinuos
con
periodos
o
de iluminaci n alternados
con
periodos
1986
luz artificial La aireaci n
el ciclo natural d a y noche Richmond
asegura
la distribuci n
homognea
para
su
de las clulas y los nutrientes la
dentro del cultivo
dejndolos disponibles
a se
mejor aprovechamiento mejora
distribuci n de la luz
activas evitando que 1986 En el
caso
las clulas sedimenten
asegurando
y
que permanezcan fotosintticamente

una
previene
estratificaci n trmica
Richmond
de la
su no
temperatura
cultivo
son
las
microalgas
en
las que
se
est
interesado debido
a
generalmente
que
su
para
las consideradas
en un
como
especies tropicales
a
crecimiento de 240C sin
sufre alteraciones
en
intervalo de 16
con
270C presentando
no
un
ptimo
Bajas temperaturas
referencia
una
el intervalo anterior
matan
la
microalga
embargo puede
provocar
disminuci n de crecimiento
temperaturas
Hoof y Snell
arriba de 350C 2001
provocar an
que la
mayor a
de las
microalgas colapsaran
El intervalo de salinidad Generalmente salin dad el

en
ptimo
para
una
microalga depender
no es
de la
se
especie maneja
la
en
el cultivo
en
interiores este
mar
parmetro
cultivo
a
controlado y
presente
el agua de
En
un
exterior la salinidad A balde et al

un
se
convierte
parmetro
control
en
microalga
1995
Dentro de los
requerimientos qu micos
se
necesarios para entre otras
buen crecimiento de las el balance

en
microalgas
en
cultivo
encuentran
cosas
entre
los
macronutrientes
espec ficos
y los micronutrientes invariablemente
Un desbalance
se
la
proporci n
un
suministrada de estos descenso Otro

en
nutrientes
o
manifiesta ya
sea como
el crecimiento
a
hasta la detenci n del mismo Hoof y Snell 2001

es
aspecto
considerqr
en
la disminuci n de la fuente de nutrientes y

como
como
factor los
importante
limitativo
el
cultivo
control 1957
de calidad
nutricional
en
denominados cultivos masivos Provasoli et al Por macronutrientes

se
consideran la fuente de nitratos fosfatos y
en
el
caso
de las
se
diatomeas la adici n de silicatos Con
respecto
los micronutrientes
son
aquellos
que
Romo Pil era Abril Karim 2001 UABCS 50pp
microalgas
Memoria tcnica
profesional
suministran pero
no
en
poca cantidad trazas

menos
en
comparaci n
con
los anteriores mencionados
por ello
se
importantes
Se sabe que tales
en
soluciones alcalinas
algunos
metales
precipitan agentes quelantes

se
como en
el EDT A
Acido Etilen diamino
tetractico para las
utilizan para mantener los metales et al 1986
soluci n hacindolos
disponibles
microalgas Kaplan
Adems de los mcr por las
y micronutrientes existen otras sustancias que
son
requeridas
son
microalgas
para obtener
mejor
crecimiento La
mayor a
de las
microalgas
auxotr ficas
esto es que no son capaces de sintetizar todas las vitaminas necesarias y
tienen que asimilarlas del medio La tiamina 81 86

son
la cianocobalamina 812 y la biotina de las
consideradas esenciales para la

cerca
mayor a
microalgas Spotte
1979
De
hecho se ha estimado que de cianocobalamina 812 Para

a
del 70
de todas las
microalgas planct nicas requieren
Hoffy
Snell 2001
proporcionar
estos nutrientes se debe seleccionar el medio de cultivo que se va

es un
utilizar
El agua marina marinas sin
medio de cultivo ideal para el crecimiento de las

es
microalgas
embargo
necesario
enriquecerfa
en una
con
nutrientes Los medios
de cultivo son muy diversos
pero todos coinciden

con
fuente
principal
de
nitr geno
f sforo y al
una
mezcla de metales traza 1973
soluci n de quelante y vitaminas Provasoli et
1957 Stein Existen
diversas formulaciones de medios de cultivo
algunos
de estos han sido De
seleccionados de diferentes laboratorios y utilizados durante muchos aos forma

se
igual
han formulado medios 1957 adems

es
espec ficos prctica
para
algunas especies
a
de
microalgas
provasoli et al
se realicen
comn que
se
partir de
un
medio formulado de
modificaciones
emp ricamente
hasta que
satisfagan
1962
los
requerimientos
diversas
microalgas
utilizadas para
investigaci n Myers
La tasa de
en un
ox geno
y bi xido de carbono suministrado al cultivo

en
puede
convertirse
factor limitativo de carbono

o
el cultivo
Mejorando
la circulaci n
la adici n adecuada de
bi xido
bicarbonato de sodio de la
puede
provocarse la
prolongaci n
a
del
crecimiento
exponencial
poblaci n
Sin
embargo puede
el bombear aire
un
los cultivos
conteniendo ms del 5 Snell 2001
de bi xido de carbono
tener
efecto inhibitorio Hoff y
El bi xido de carbono y el bicarbonato de sodio que ste debe Como

se
ser
pueden
afectar el
en
pH
del cultivo as
revisado
peri dicamente microalgas
para mantenerlo
condiciones
ptimas
ha mencionado las
utilizan bi xido de carbono para la fotos ntesis
Romo Pinera Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
y liberan
ox geno
escala comercial el bi xido de carbono de luz Sin
es
inyectado
en
los cultivos
una
durante los
periodos
embargo
en
cultivos utilizados para acuacultura
aireaci n moderada Un alta

o
es
suficiente Hoff y Snell 2001

en
baja
excesiva
el
pH disminuye
microalga
por el
rompimiento
como
de muchos procesos celulares Si el
nitr geno
no es
suministrado al cultivo
tomaran el ion amonio
sal de amonio la
una
mayor a
el
de las
microalgas selectiva mente

son
provocando
tiende
a
baja
en
pH
Si los iones nitratos
eliminados por el
alga
el
pH
de
incrementarse
pero usualmente controlado por suministro de bi xido si el bi xido de carbono

es es
carbono del cultivo Sin
embargo
Iimitante el mantenido
pH
del cultivo
puede
elevarse hasta 11 matando

o
microalgas
Si el cultivo
se
en
condiciones
de ambiente los
controlando los ciclos de luz oscuridad
observa elevado
a
pH
durante
periodos
de luz y
bajo
durante el
periodo
de oscuridad tendiendo
balancear el
pH
Hoff y Snell 2001 Adems de los factores fisico qu
micos
mencionados anteriormente
es
otro
aspecto
con
importante
bacterias
considerar
en
el cultivo de
a ser
microalgas
la asociaci n de estas Se ha
las
la cual comienza
se
mejor
entendida
sugerido
que el
mejor
crecimiento
da
en
cultivos libres de bacterias axnicos Sin
condiciones que s n dif ciles
y costosas de
crecen
conseguir
embargo
parece
ser
que muchas
casos en
especies
de
microalgas
ha
mejor
se
en
asociaci n
se
con
las bacterias En los

a
los que esto
se
podido
a
observar
sabe que
debe
la
producci n
a
de cianocobalamina Snell 2001
812 que lleva
cabo la bacteria y que la En el cultivo de crecimiento de cada
proporciona
se
la
microalga Hoffy
microalgas especie
en
hace necesario el conocimiento de la cintica de
cada determinado volumen

se reconoce un
Independientemente
de la
especie
y el volumen al que
es
cultivada
patr n
1
estndar de crecimiento
indicado por las
siguientes adaptaci n llegar a
fases
Fogg y
Thake
1987 figura
incremento
Lag
fase de
En donde
en
no ocurre
en
el nmero de clulas
pudiendo
incluso Ya
disminuir
nmero
con
respecto
al inoculo inicial las
Exponencial
una vez
adaptadas
al medio de cultivo
microalgas
que
comienzan
multiplicarse puesto
dividirse el aumento
que la divisi n da
en
lugar
a nuevas se
clulas
son
capaces de
en
nmero
de
microalgas
acelera continuamente
forma
exponen cial De declinaci n relativa de crecimiento En este

se
caso
conforme el cultivo va creciendo

como
da
una
disminuci n de nutrientes cambios de
pH
y alteraci n de otros factores
Romo UABCS
lera Pil
Abnl Karim 2001
gas microa
Memoria tcnica profesional
50pp
consecuencia del incremento de la

tasa de
poblaci n
de ah
que las
microalgas disminuyan
su
divisi n celular
Cuando ya
se no se
Estacionaria
aprecia
una
divisi n celular neta esto
es
que el nmero debido al
de clulas alcanzado
mantiene constante por cierto
periodo
de
tiempo
cultivo
balance entre la natalidad y la mortalidad que De muerte Las clulas aunque lo ms normal fase
es
presenta
la
poblaci n
en
pueden
durar
en
fa fase anterior morir
semanas e
incluso
meses
que comiencen
es entonces
cuando
se
presenta
esta
Densidad celular
Tiempo
Figura 1 Curva representativa de crecimiento de un cultivo esttico de microalgas Modificado Fogg y Thake 1987 1 Fase de adaptaci n 2 Fase de crecimiento exponencial 3
declinaci n relativa de crecimiento 4 Fase estacionaria 5 Fase de muerte
de
Fase de
La medici n de la biomasa
recuento directo de la
como son
es
importante
se
en
el cultivo de hacer
a
microalgas
para tener
un
poblaci n
a
celular y
puede
travs de diferentes mtodos

este es uno de los
con
el conteo celular
comunes
travs de
una
cmara de conteo
mtodos ms
un
La medici n de la densid d
ptica
absorbancia
ayuda de
espectrofot metro
y
es
un
que tiene la de alta

a
ventaja precisi n
un
de
poder
leer varias muestras de fluorometr a la
en un corto
tiempo
mtodo
El mtodo fluor metro

a no
que mide la
concentraci n radica
en
de c1orofilas
travs de
desventaja
de este mtodo
que la concentraci n de clorofila
permanece constante durante toda la

no
curva de
crecimiento del alga por lo que los valores
son
constantes Otro mtodo
es
Romo Pitlera Abnl Karim 2001 UABCS
m croalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
el de la cuantificaci n de la biomasa muy utilizado
travs del peso
seco
este mtodo tambin
es
L pez
et al
1993
2 OBJETIVO
Este manual contiene
informaci n
con
respecto
base
a
las tcnicas
ms ya
comunes
utilizadas para
el cultivo de
microalgas
con
mtodolog as
propuestas
en
probadas presenta
respaldadas
por investigadores versados
en
el tema El formato
el cual
se
este documento consiste en
proporcionar el
en
marco
te rico de dichas tcnicas y de la infraestructura que
metodolog as
su
aplicaci n
con
base
las caracter sticas
presenta el Laboratorio Experimental de Acuacultura de la Unidad Pichilingue LEAP de

la Universidad Aut noma de
Baja
California Sur
Este laboratorio de cultivo de
microalgas
un
es
utilizado tanto para docencia
como
para
investigaci n cualquiera
la existencia de
manual de
procedimientos
elaboraci n
se
es
fundamental para
no
de las dos actividades de informaci n
Sin
embargo
a
su
realiz
solo para la
compilaci n
bibliogrfica
considerar durante el cultivo de estas
especies
sino tambin para
proporcionar objetivo
de
al lector los elementos bsicos necesarios para realizar
esta actividad con el
aportar ms
all que
una receta a
seguir
CONTROL DE LOS
REQUERIMIENTOS F SICOS
QU MICOS
EN EL
LABORATORIO
3 1
PAR`METROS F SICOS
LUZ Se utiliza luz artificial constante
per odos
de 24 horas por medio de desde el

a
lmparas
del
tipo
cool white de 400 L stas
fux 250O Estas
en
todos los niveles de cultivo estn
cepario
sus
hasta las
tolvas
lmparas
conectadas por pares
respectivas
que
se
balastras
a su vez se conectan a un en
interruptor Tabla
de
seguridad
encuentra localizado
la
pared
exterior al cuarto de cultivo
Para efecto de mantenimiento de las semanal de la sal que

momento de
se
lmparas
se
hace necesaria
mar que
una a
limpieza
adhiere a stas debido al agua de los cultivos de

manera
llegase
salpicar al
trabajar
con
igual
forma el verificar las condiciones de uso
de cada
lmpara
detectando de
preventiva
la
presencia
de coloraci n
oscura
la
Romo Pif era Abnl Karim
2001
gas microa
UABCS 50pp
cual
es
indicativo de que la
lmpara
esta
pr xima
fundirse y tomar las medidas
necesarias
Tabla 1 Relaci n de interruptores y lmparas
No de
Interruptor
1 2 3 4 5
Serie de
lmparas
Tolvas 100 L 400 L 1 2 3 y 4 Tolvas 400 L 5 6
y7
Tolvas 400 L 8 9 y 10 Bolsas 20 L Cultivo esttico y estante central
AIREACi N
agitan
Al
cepario
cultivos estticos
no se
le Se
proporciona sugiere
aireaci n y s lo
se se
manualmente para
con
homogenizar objeto
su
el cultivo
se
que esta
agitaci n
realice diariamente
el
de evitar que
sedimenten y
permitir
que todas las
clulas reciban la luz durante
crecimiento El
se
tiempo
de duraci n de estos cultivos ya

sea
depender
de los fines para los cuales

o
prepararon
recambio de cepas el
mantenimiento cultivo de el
cambios de volumen de cultivo

manera
procurando que
tiempo
mximo de
ninguna
supere los 5 d as
para cambios
en volumen
y de 7 d as para
cepario
En el
caso
de los cultivos masivos

un
partir
de 20 L
se
utiliza aireaci n constante
con
ayuda
de
compresor
a
blower
de
baja presi n
de 1 2
hp
el cual
se
encuentra
conectado al rea de cultivo
travs de
se
una
tuber a flotante de PVC

un tubo
Para las tolvas de 100 Y 400 L PVC dentro del cual

va
utilizan air Iift que constan de

se
delgado
de
la manguera que
encuentra conectada
la salida de aire
TEMPERATURA
Esta
se
mantiene constante por medio de

verano
un
aire acondicionado
mantener el rea a
integral
una
de 3 toneladas
En
de mayo
octubre
se
sugiere
temperatura
de 24 i 1 oC para tratar de evitar que al momento de utilizar la
microalga
celulares
como
alimento sta
disminuya
de calidad
es
decir
en
que la
sus
paredes
comiencen
a reventarse
debido al brusco incremento
temperatura
que presenta el
10
Romo Pit era Abnl Karim 2001 UABCS
Manual para el cultivo de microalgas Memoria tcnica
profesional
50pp
cultivo cultivo
principal
a
Para el
periodo
de invierno
noviembre abril
se
sugiere
mantener el
21 t 10C
Se tiene
un tenn se
metro de mximos y m nimos

una
para ir verificando la
temperatura
del laboratorio
recomienda hacer
bitcora para efectos de detectar
cualquier cambio en el
medidas de
funcionamiento del aire acondicionado
integral y
llevar acabo las
seguridad correspondientes
SALlNIDAD Para los cultivos masivos filtrada

e
partir
de 20 L el agua marina utilizada salinidad En el

caso
es
irradiada sin necesidad de disminuir
su
de los cultivos
a
estticos
incluyendo
el 15
el
cepario
se
disminuir
la salinidad
de 35 ups
a
30 ups
agregando
debido
a
de agua destilada del volumen del agua marina
preparar Esto existe

una
que al aumentar la de agua
temperatura
al momento de la esterilizaci n
evaporaci n
ups
por lo que aumenta la salinidad y esta debe mantenerse
en
35
3 2
PAR`METROS QU MICOS
El medio de cultivo utilizado
en
NUTRlENTES la formulaci n
ste laboratorio cuya
se
elabora
con
base
en
sugerida
por Guillard y
Ryther
1973
preparaci n
y especificaciones
se enumeran en
el ANEXO 1
BI XIDO
DE CARBONO
a
En el laboratorio
no se
suministra bi xido de carbono
los
cultivos debido
que el suministro de aire ha sido suficiente para estos hasta la fecha
BACTERIAS Y SU del nivel
ASOCIACi N
CON LAS MICROALGAS
En los cultivos estticos

se
cepario
hasta el volumen de 1 500 mL matraz Fernbach

tener todas las condiciones
mantienen cultivos
en
lo ms axnico
su cu
posible procurando
aspticas requeridas
mantenimiento do
En los cultivos masivos
bolsa 20 L
tolvas de 100 y 400 L

no se
aun
se encuentran
bajo riguroso
sistema de
asepsia
consideran axnicos
11
Romo Pif era Abril Karim 2001 UABCS
gas microa
50pp
EQUIPO DE TRABAJO
El
equipo
de
de
trabajo
utilizar
se
basa
principalmente
en
cumplir
con
los m nimos el cultivo
requisitos
de
limpieza
se
facilidad y maniobrabilidad adecuados para

a
lograr que
microalgas
lleve
cabo donde
se
Dependiendo mayor a
del rea
trabaje
el material ser
as
de diverso
con
En la
de los laboratorios donde rea de
se
cultivan
microalgas
se
cuenta
2 reas
espec ficas
La
gabinete y
rea hmeda de
primera
cubre los
requerimientos principales
preparaci n
de nutrientes
es
esterilizaci n
se
cristaler a y rea de mantenimiento del material La segunda rea
donde
lleva
cabo el cultivo de estos
microorganismos
e
y consta de
una toma
de agua para aireaci n
cultivo canal de
desag e
sistema de filtraci n
irradiaci n de agua de
mar
luz y contenedores para cultivo
4 1
`REA
sta
DE GABINETE
con una
rea
superficie
de 6x6 y
es
la que
proporciona
con
todo el material cristaler a para
necesario para el cultivo En este

matraces
caso
generalmente
vasos
cuenta de
lo
siguiente
probetas pipetas
tubos de ensaye
precipitado
refrigerador flujo
mantenimiento de reactivos
autoclave horno de microondas campana de

as
laminar
se
microscopio compuesto y
balanza
bitcoras para
registrar el
uso
de cada
aparato
encuentran en el ANEXO 11
Adems de estanter a tubos de vidrio alcohol agua de
para el material del almacn y material accesorio bolsas de
como son
pipetas probetas
mar
polietileno
selladora de bolsas
guantes
yagua destilada
CRISTALERA
principalmente cepario
La cristaler a por los
utilizada
en
el
rea
de 2
gabinete
est
determinada utiliza es
en
requerimientos
en
del usuario
figura
a
El nivel al que
se
y cultivos estticos que

se
volmenes de 10 mL
2500 mL Los diferentes

en
tipos
de
cristaler a
tienen
en
ste laboratorio se encuentran enlistados
el ANEXO 11I
12
Romo Piera UABCS 57pp
Abril
Karim
2001
Manual para el cultivo de mieroalgas
Figura
2 Cristaler a
Material utilizado para cultivos estticos
Debido
es
que el
uso
de la cristaler a
se
en
el cultivo
exige
da
medidas de de
limpieza
estrictas de
necesario que antes de utilizarla

es
lave
con un
anticipaci n
El mtodo
limpieza sugerido
1 2
el
siguiente
con
El matraz deber Con

una
enjuagarse
agua de la llave al 10 contenido

en una
soluci n de cido
clorh drico
piseta limpiar orgnica
las
paredes
3
del matraz para asegurarse que

con
no
queden
residuos de materia
Enjuagar
abundante agua de la llave libre de fosfatos

con
4 Lavar 5 Dar
con
jab n
enjuagar con
abundante agua de la llave
un
ltimo
enjuague
agua destilada y
dejar secar escurriendo
NOTA El cido utilizado para
limpieza
es
reutililizable de tal forma que
se
sugiere
un
enjuague
y
previo
de los matraces
con
agua de la llave para desechar
cualquier
residuo de
microalga
poder
reutilizar el cido
Para el al 10
caso
de los tubos de ensaye ser necesario por 24 h Cuando

se
sumergirlos
en esa
soluci n debe
HCI
ser
m nimo
utilice
cristaler a Y
nueva
esta
desengrasada primeramente
rutinaria y
con en
hidr xido de sodio al 10
despus
lavada de
manera
luego
esterilizada
autoclave
REFRIGERADOR
El
refrigerador
con
el que
se
cuenta
en
el laboratorio
es un
SAMSUN los
13
modelo SR 458DV Se recomienda que toda soluci n que
sea
guardada
ah
contenga
Romo Piflera Abril Karim 2001 UABCS
Manual para el cultivo de microalgas Memoria tcnica profesional
50pp
siguientes
da
mes
datos nombre de la sustancia y y ao usuario y elaborador

se
tiempo
de caducidad fecha de elaboraci n
Es recomendable que cada usuario de tal

manera
responsabilice
de las sustancias
preparadas
que al trmino de
en
su uso se o
les d el destino sustancias aqu
correspondiente
almacenadas
para efectos
de verificar caducidad
las soluciones
HORNO DE MICROONDAS de 1 4 Kw de
El laboratorio cuenta
con un SAMSUNG
modeloMW8610T de
potencia
Este
aparato
se
usa
principalmente
para esterilizaci n
matraces aunque su utilizaci n se encuentra cuestionada por el hecho de la existencia
del autoclave
Sin
en
embargo
su uso es
recomendable pues ya
se
realiz
un
anlisis
bacteriol gico
el laboratorio que avala los resultados de esterilizaci n
Para cada
volumen y nmero de
recipientes
existe
un
tiempo
determinado de irradiaci n
Tabla
11
Tabla 11
Tiempos
de irradiaci n para los matraces
Tipo
de recipiente
No 12 12
4
Volumen 75mL 100 150 mL
Tiempo en la mxima potencia

6min 8min 10 min 13 min
Erlenmeyer Erlenmeyer Erlenmeyer

Fembach
500 mL 1500 mL
AUTOCLAVE STMEL Este de cultivo as

a
El que
se encuentra en
el laboratorio
es una con
MARKET FORGE modelo
aparato figura
como
nos
pennite
en
esterilizar
mayor
seguridad
los medios
el material utilizado
se
los cultivos estticos

a
Se utiliza calor hmedo
1210C
por lo cual
necesita vapor
presi n
de 15 Ib
pulg2
para
lograr
esta
temperatura
Este
aparato
un
consta de un
reloj
para el control de la temperatura
un
man metro
un
tenn metro y 1 Fast
indicador de nivel de agua Presenta dos instruments Slow y 2
opciones
para esterilizar la fonna

en
Iiquids
cuya diferencia radica
en
que el
aparato
Se
libera la
presi n
utilizada para
lograr la temperatura requerida

de
recomienda
utilizar
capuchones algod n
papel
encerado
para
evitar que
se
humedezcan los tapones de
de los matraces Dadas las caracter sticas
de la
14
Romo Piera UABCS
Abril Karim
2001
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
puerta
evitar
del autoclave
es
importante
la distribuci n
cerrar
del material dentro de la misma para

no se
algn
accidente al momento de
con
el
aparato
deber por
uso
ningn
motivo
a
sobrellenarlo de matraces considerar

es
objeto
de ahorrar
con
tiempo
no
en su
Otro
aspecto
el verificar el llenado correcto
agua
sobrepasando puesto
a
el nivel indicado
para el cilindro y de
se
ningn
modo descuidar el mismo

o se
una vez
trabajar
Cuando de
esterilicen medios de cultivo
prepare agar para cultivo de
se
utilizar el
dispositivo
Slow
para efectos de que la liberaci n
presi n
no
afecte las
propiedades
en
de las
no es
sustancias esterilizadas necesario

ese
de tal forma que para el
caso
de instrumentos Fast
donde
control de
presi n
en
se
utilizara el
se
dispositivo
Al utilizar el autoclave
en un
para la eliminaci n
de agar
placas
recomienda meterlas
no se
recipiente
de
plstico
para efectos de que el agar disuelto el drenado del agua
derrame
en
el aparato y
obstruya
posteriormente
h
iG
o
Figura
3 Autoclave para esterilizaci n de material
Se
sugiere
utilizar agua destilada

es
agua de
garraf n
para el llenado del
aparato
La
operaci n
1 L1enarlo
del aparato
con
la
siguiente
de agua de
4 L
aproximadamente
garraf n
destilada por
debajo
del
nivel indicado
en
el cilindro
a
2 Introducir el material 3 Seleccionar el 4 Activar el
esterilizar y
cerrar
la
puerta
select exhaust
dispositivo
de liberaci n de
presi n
reloj
15 minutos
15
Romo Piera UABCS
Abril Karim
2001
Manual para el cultivo de microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
El
dispositivo
de temperatura
presenta
las
siguientes opciones
230oF 110oC 240oF 1180C y 250oF 121 oC utilizar esta ltima para esterilizaci n
CAMPANA DE FLUJO LAMINAR
Es
aqu
donde
se
realiza la siembra de matraces y de

un
tubos de ensaye de los cultivos estticos travs de

un
Est
provista
ser
ventilador que
arroja
aire
filtro de fibra de vidrio

con
el cual debe
verificado cada 3
meses
para
su
mantenimiento y que laboratorio
ayuda
de los mecheros
crea un
ambiente aislado del resto del
figura
Para
su
utilizaci n
se
recomienda lo
siguiente
alcohol
Limpiar
el rea
en su
totalidad
con
Prender los mecheros
Encender la campana y esperar cinco minutos antes de iniciar
Despus
de
su uso
limpiar
el rea de
trabajo
nuevamente
Unidad de
Figura
Campana
de flujo laminar Utilizada para siembras y elaboraci n de vitaminas esterilizadas
16
Romo Pif era Abril Karim 2001 UABCS
gas microa
Memoria tcnica
profesional
50pp
MICROSCOPIO OPTICAL
El
microscopio
de 4
utilizado
es
de
tipo compuesto
40X y 100X
marca
AMERICAN
el cual consta
objetivos
4X 10X
utilizando para las
observaciones del ltimo
objetivo
se
aceite de inmersi n
BALANZA 2842 de
La balanza que de
tiene
en este
laboratorio
es
de
tipo anal tica
Sartorius
a
160g
capacidad
Se recomienda utilizarta para pesar sustancias de 1

se
150
g Para pesar vitaminas metales traza EDTA y cloruro frrico balanza anal tica que
se encuentra en el
recomienda utilizar la
rea de A 1
histolog a
a
del laboratorio
a
Los botones utilizados para bot n de
pesado
son
9 g
B 10
150 g Y E denominado
bloqueo pesado
es
El proceso de 1 Pesado
a
el
siguiente
El bot n E
se mueve
previo
del contenedor de la sustancia

se anota
hacia
abajo
se
regresa
bot n de inicio
el peso observado
Se
suma
la cantidad del peso observado del contenedor
mas
el de la sustancia
pesar EJEMPLO Contenedor Cantidad Total

a
2 9 75 9
se
pesar
77 9
Con los botones A y B

se va
coloca la cantidad
a
pesar hasta que la
3 Se enciende la balanza y
agregando
cantidad
correspondiente
balanza marque las dcimas de gramo observadas al
pesado previo
la balanza
con
4 Una
vez
alcanzado el peso deseado se regresa
a ceros
los botones A
yB
DESTILADOR DE AGUA El laboratorio consta de
un
destilador de agua Autostill 5 El
Jen ons
instalado
conectado al agua corriente del laboratorio

en un
figura
aparato
se encuentra en
el cuarto
anexo
al laboratorio de cultivo de
microalgas
y consiste
lo
un
siguiente serpent n
dispositivo
suavizador de agua por medio de iones
water softenerj
de vidrio y calentador de agua
17
Abril Karim
2001
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
i
h
l
r
f
i
Figura
5 Destilador de agua
Este
aparato
funciona de
manera
automtica
s lo
es
necesario que
se
conecte y
se
enciendan los calentadores controla la entrada del

entonces
2 botones de encendido
Estos tienen
un sensor con
el cual
agua y la que
evaporaci n
de sta
a
por lo que ser

con
necesario
no se
estar verificando
el contenedor
llenar
agua destilada
desborde el resto lo realiza el
aparato
automticamente
4 2 AREA
H MEDA presenta
una
sta
rea
superficie
de 6x9
comprende aquella
canal de
donde luz
se
llevan
acabo los cultivos
Esta
provista
a
de agua marina la
desag e
es
aireaci n
y
en
temperatura
controlada Debido
importancia
de sta rea
se
recomendable tomar
cuenta normas y medidas de
limpieza
de las cuales
hablar
posteriormente
4 2 1 TRATAMIENTO DEL AGUA UTILIZADA El tratamiento del agua de desarrollo de los cultivos Toda
ser mar
utilizada
es
de vital
importancia
para
un
ptimo
debe
aquella
agua utilizada para el cultivo de otras
microalgas
de
tratada para y
remover
materia
particulada protozoarios
El tratamiento
especies
ser
microalgas
o
bacterias
ciertos
metales
disueltos
puede
simple
complejo
dependiendo
de la fuente de agua utilizada
18
Romo Piera
Abril Karim
2001
mieroalgas
UABCS
57pp
SISTEMA DE
en
FILTRACi N
IRRADIACi N lmparas
DE AGUA MARINA UV de 30 W cada
El sistema utilizado dando adems

un
este laboratorio consta de cuatro

una
una
total de
120 W lo que da
capacidad
van
de esterilizaci n de 258 5 Lmin de 15 Ilm

en
presenta
6 El
cuatro filtros de cartucho que
10 Ilm
5 IJm y hasta 1 IJm
Figura
protocolo
para
su uso se
encuentra
el ANEXO 111
ti il
1
i
llt
tl
l
Figura
6 Sistema de filtraci n
irradiaci n de agua marina
SISTEMA
HIDR`ULICO
MARINO
El
agua
proviene
una
de
la
bah a
m
travs
del
una
denominado
canal de llamada
el cual
presenta
longitud
a
de 200
de
largo
serie de decantadores
arena arena se
despus
del canal el agua pasa

es
travs de
a un
un
primer
filtro de filtro de
vierte 7
en
dos contenedores de donde finalmente al rea El
bombeada
segundo
figura
e
llegando
hmeda donde pasa por el sistema de para

su uso se
filtraci n
irradiaci n
de agua marina
protocolo
encuentra
en
el
ANEXO 111
19
Abril Karim
2001
mieroalgas
iIJ6I
l
c
T
Figura
Sistema hidrulico marino
4 2 2 CULTIVOS MASIVOS Definiremos as

a
los cultivos de
microalgas
en
los cuales
se
suministra aire
con
el
objetwo
de
permitir
son
que los
microorganismos
reciban la misma intensidad

como
de luz y de
espec ficamente organismo

El
en
utilizados de forma
directa
alimento
de la
especie
cultivo
en
tipo
de cultivo utilizado de los
este nivel de
es
el denominado Semicontinuo Un cultivo semicontinuo

a
se
Continuo
dependiendo
requerimientos
de
un
producci n
caracteriza
por la remoci n el
regular
volumen estndar de cultivo

nuevo
ciertos intervalos de
tiempo
reemplazo
de ste
con
medio
para obtener el volumen

es
original
lo que
se conoce
como
raz n de diluci n
es
Un cultivo continuo
aquel
en
donde la cosecha y renovaci n
de nutrientes
constante
dependiendo
de la tasa de divisi n de la
microalga
Lo anterior
permitiendo
A
te ricamente el crecimiento
exponencial
continuo del cultivo consideraremos

mar a
partir
de las bolsas de 20 L hasta las tolvas de 400 L masivos
estos
con
cultivos
como
figura
A stos
se
les
proporciona
agua de
tratada
el
sistema anteriormente mencionado luz constante y aireaci n
20
Abril Karim
2001
microalgas
Memoria tcnica
profesional
111 1 8 t 1 44
Vi
tr
Figura
8 Cultivos masivos Bolsas de 20 L Y tolvas de 400 L
Prcticamente
con
el inicio de los cultivos masivos

a su vez
se
realiza
a a
con
la bolsa de
un
polietileno
capacidad
para 20 L esta de 3
a
siendo sembrada de la
partir
de
matraz Fernbach
cultivo esttico
5 d as
dependiendo
especie
cultivar
El proceso de elaboraci n de las bolsas 1 Del rollo de
se
realiza de la
se corta
siguiente
manera
cm
plstico
de 50
cm
de ancho
la bolsa de 120
de
largo
se
2 Con la selladora forma de

un
previamente
calentada esperar 5 minutos

se
despus
de encenderla
en
ojal
en uno
de los extremos de la bolsa para que
pueda colgar figura

9
el sistema
columpios
y el extremo
opuesto
ser sellado
en su
totalidad
Columpio Ojal
Sello
Sello
50 cm
Figura
9 Bolsa de
plstico
montada
en
el sistema de columpio
21
054616
Romo Pilera Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
50pp
La
permanencia
de la
de este volumen de cultivo bolsas de 20 L ser de entre 3 y 5 d as pero

no
dependiendo
La
especie
deber exceder de este tiempo

es
siguiente etapa
de cultivo
la tolva
ya
sea
de 100
se
400 L Son tolvas

con
cilindroc nicas
de fibra de vidrio translcido
las cuales
siembran
la bolsa
aadiendo
El
80 L de agua marina y los nutrientes de duraci n de estos cultivos
correspondientes
de los
no
tiempo
depender
requerimientos
mas
para
su en
utilizaci n Se recomienda que los cultivos semicontinuos

este sistema lo anterior para asegurar la calidad de la servir
como
pasen de
a
de 15 d as
microalga
utilizar adems de y
medida de seguridad para el control de las condiciones
higinicas
aspticas
del rea Se hace necesario que

una vez
terminadas de utilizar las tolvas cada usuario las las

en
enjuague
caso
con
agua dulce y doro restos de
cepillando microalgas
paredes
cono
y el
cono con
Se
sugiere
que
en no se a
de que
quedasen
el
se vez
deje
doro yagua por
ms 24 horas
para evitar daar el contenedor

se
Una
transcurrido este
tiempo
enjuaga
con
agua dulce por y

con
dejan
reposar por lo
se
menos
24 horas antes de volver

con
usarla Antes de lIenarla filtrada

e
el agua de cultivo
sugiere enjuagarla
agua de
mar
irradiada
5 ASPECTOS IMPORTANTES DEL CULTIVO DE MICROALGAS
Si bien menci n
manera
es un
hecho que lo anteriormente escrito

en
presenta
una
importancia
en
en su a
los de
aspectos contemplados
ya que
se
esta secci n del texto

como
se
tomaron
cuenta
puntualizarlos
consideran
parte
medular dentro del cultivo de
microalgas
5 1
CONTAMINACi N
La contaminaci n de los cultivos de
microalgas puede ser biol gica qu mica particular

o ser una
f sica
sin
embargo Fluede
afectar de
manera
combinaci n de estos tres
tipos
22
Romo Pirera Abnl Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
5 1 1INDICAOORES DE Existen diversos ha ca do
CONTAMINACi N QU MICA
indicativos de este
en
patrones
tipo
de contaminaci n recin
si el cultivo
se
alta disminuci n
su
el nmero
celular
sembrada la
microalga
del agua
conservando sta
color natural el
problema podr a
de
deberse a la En este
caso
composici n
poca circulaci n
cambio
repentino
temperatura
las clulas estn vivas
y deben reponerse incrementando la Cuando el cultivo

se
agitaci n
probablemente
se
toma blanco dentro de las 24 h de sembrado
debe al cloro residual y otros Si el cultivo crecimiento nutrientes Cultivos

se
qu micos
disueltos
en
el agua de 3 poca
o
conserva un
color claro
despus
es
4 d as existe
observando poco los
puede
deber a que la fuente de luz
un desbalance en
viejos
de 15
ms d as de cultivo que inician
una
deficiencia
en
nutrientes
generalmente
se toman
turbios y
algunos
otros levemente claros Esfuerzos por recobrar
estos cultivos ya carentes de nutrientes son intiles
5 1 2INDICADORES DE los
CONTAMINACi N BIOL GICA

de contaminaci n
o
tipos
ms
comunes
biol gica
Si
son un
excesivos niveles de
bacterias otras d as
microalgas protozoarios
se
macroalgas
causa
cultivo
despus
de 3
cambia de color y eventualmente
aclara la
ms comn
se
se
debe considerar
como
provocada
turbia
por protozoarios Excesivo crecimiento de bacterias crecimiento y
manifiesta
agua
bajo
colapso del
cultivo
5 2 CONTROL DE LA CALIDAD DEL AGUA MARINA Como ya filtraci n

e se
mencion
a
en
la secci n 4 2 1
en este
laboratorio el agua teniendo la
es
tratada con que

es
irradiaci n
travs de rayos ultravioleta
seguridad
suficiente para asegurar agua marina de buena calidad Otra

manera
para tratar el agua

con
puede
ser
mediante la c10ra El
n de la misma
n caso
neutralizndola desee realizar
despus
se
tiosulfato de sodio
procedimiento
de que
se
hace
partir de la
bolsa de 20 la las tolvas de 400 lagregando 1 ml

se
de cloro por cada 5 litros de agua marina y
deja
con
aireaci n hasta el d a
siguiente
para neutralizar agrega el tiosulfato de sodio ml de cloro utilizado Sin
en una
concentraci n de 1 5 g por cada 4

con
embargo
el tratar el agua
luz UV y filtraci n ha sido
23
Romo Pit era Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
suficiente y eficiente para efectos del cultivo Se recomienda de cloro para preparar el agua de cultivo Un
ser
posible
no
utilizar
aspecto importante
considerar para evitar
cualquier contaminaci n
es
pedir
los usuarios que mientras estn

manera
trabajando pies
en
el laboratorio utilicen botas de hule de
tal que
se
pueda
introducir los
a
en un
recipiente
de
plstico
conteniendo cloro rea hmdel Es
diluido que
encuentra
las entradas al laboratorio de cultivo
necesario entonces que al regreso del cuarto de bombas y
enjuaguen
su
calzado con agua
despus pisen el recipiente

No
es
con
cloro
a
posible permitir
es
que los cultivos

una vez
cualquier
nivel pasen del
tiempo
sean
estricto de propensos
cultivo esto
a
para evitar que
que estos cultivos estn
viejos y
la bacterizaci n
puedan ser foco
de infecci n para otras tolvas
Se hace necesario que el usuario marque las mangueras utilizadas para cosecha de tal forma que
se
hagan responsables de su mantenimiento y limpieza y

Se debern
que estas no
sean
fuente de contaminaci n
enjuagar
con
agua dulce y
secar antes
de
guardarlas
Se recomienda rea que esta
sea
despus
de las cosechas de las tolvas

con
de haber
trabajado
en
en
el
enjuagada
agua dulce y secada

con
con un
trapeador limpio
algn
caso se
har necesaria la
limpieza
cloro
5 3
IN CULO
Una
vez
que
se
tiene evaluada la cintica de crecimiento de la
microalga
se
debe
ser
tomar en cuenta que la
mayor a
de las clulas inoculadas
sembradas
pueden
viables pero
no en una
condici n de dividirse inmediatamente el in culo cultivo
espec ficamente pueden
si el
estar
cultivo de donde
proviene
madrej
es
viejo
las enzimas
a
inactivas y las concentraciones de metabolitos para la divisi n celular Caizares et al 1994 Se sabe que existe esto
es una
pueden
decrecer
niveles insuficientes
relaci n entre la
longitud
de la fase
lag
y la edad del inoculo

i
la duraci n de la fase
lag
en
el cultivo iniciado ser
menor mientras que el
inoculo
sea
tomado durante la fase
exponencial del
cultivo madre
Fogg y
Thake 1987
24
Romo P era UABCS
Abril Karim
2001
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
5 4 NIVEL CEPARIO En esta y

en
etapa
de cultivo
se
hace necesaria la mayor
precauci n
en
medidas
aspticas
control y verificaci n de las condiciones de la

a
microalga
Se deber observar cada
15 d as
las
microalgas
para verificar las condiciones de cultivo
figura
10
Los volmenes recomendados Tubos

con
utilizar
nivel
cepario son
10 mL de medio de cultivo de 75 mL de medio de cultivo
Matraces
Erlenmeyer
con
Cajas Agar
de Petri
agar
inclinado
Figura
10
Estante
con
cultivos
nivel
cepario
tubos
con
estticos
matraces
con
1500
10 mL y matraces mL
con
75 mL
y cultivos
ESTERILIZACi N previamente
con
Se
utiliza
estrictamente
se
el
autoclave
el
material
debe estar
HCI al 10
o
tal cual
se
describi
anteriormente
Los matraces 100 mL
tubos
llenan
con
el volumen de medio
requerido
filtrada
10 mL 75 mL
e
150 mL Se recomienda tener ya
preparada
agua de
mar
irradiada
con
medio de cultivo macronutrientes y micronutrientes El agua utilizada salinidad Esto

es en
este nivel antes de
ser
preparada
con
con
nutrientes
se
baja
en
de 35 ups que
presenta
30 ups
agua destilada
dependiendo
del
volumen que
se va a
preparar Tabla 111

25
Romo Pif era Abnl Karim UABCS
2001
profesional
50pp
El agua de cultivo mayor

a
preparada para
este nivel
puede
ser
refrigerada por un tiempo

su
no
15 d as
se
recomienda entonces al momento de
elaboraci n fechar el
contenedor Una
vez
que los matraces ya contienen el agua de

con
mar
preparada
con
nutrientes
se
introducen
para el los
al autoclave
el medio de cultivo
en
excepci n
dispositivo
de las vitaminas y silicatos slow
caso
de diatomeas por 15 minutos matraces para el

caso
el la
liquids
esto
se
es
para
tubos
de
preparaci n
de agar
descbir
pqsteriormente
Tabla 111 Relaci n del volumen de agua marina yagua destilada Volumen
a
Preparar
Agua
marina
Agua
destilada
2000 mL 1000 mL 500 mL
1700 mL 850 mL 425 mL
300 mL 150 mL 75mL
NOTA
se
puede
tener agua de mar filtrada

en
irradiada
sin nutr entes

en
en
un
contenedor de 20 1
se
recomienda mantenerlo lejos del sol
este caso se
guarda
es
el estante del laboratoo
el tiempo de
en verano
duraci n de esta agua viable depender de la temporada esto

no mas de 10 d as
en
inviemo puede durar 20 dlas
Se recomienda durante cada Denado del contenedor lavar y enjuagar
previamente
el
recipiente
VilAMINAS Las vitaminas evitar que

se
se
colocan hasta el momento el calor y la

una
en
que
se va a
sembrar para
desnaturalicen
a
con
presi n
del autoclave por lo que stas
deben estar esterilizadas
travs de
unidad de filtraci n
Figura 4
26
Abril Karim
2001
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
Modo de
preparaci n
en
1 Todo el proceso deber realizarse 2 Se coloca

un
la campana de
mm
flujo
laminar
en
filtro whatman GFC de 25

a un
de dimetro
la unidad de filtraci n conecta

a
la
cual estar conectada de

una
matraz kitasato de 250 mL que
a su vez se
travs
manguera
a
a una
bomba de vac o
se
3 Se
procede
encender la bomba de vac o y
comienza
filtrar la soluci n
primaria
de vitaminas 4 Una
vez
terminada de filtrar la
soluci n
primaria
se
vierte el agua destilada necesaria
para hacer la soluci n de 5 Ya lista la soluci n de esterilizado y
trabajo trabajo
el esta deber colocarse
en un
tubo
frasco
previamente
guardarse
en
refrigerador
IMPORTANTE horno
a una
Todo el material utilizado deber de 800C durante 6 horas

en
estar
previamente
11
esterilizado
en
el
temperatura
Figura
el agua destilada tambin

usarse
deber estar esterilizada
el autoclave y estar fr a al momnto de
Figura
11
Horno de
precisi n
SILlCATOS Los silicatos tambin
se
esterilizan
a
en
el autoclave
en un
tubo de ensaye por

a
separado
del resto de los nutrientes debido
la tendencia que
presentan
precipitarse
27
Romo Piera UABCS
Abril Karim
2001
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
SIEMBRA cultivo 1
se
La siembra
a
inoculaci n de los matraces tubos el
cajas
agar inclinado para
lleva
con
cabo
con
siguiente
proceso
figura
12
Limpiar
alcohol el rea de
trabajo
2 Prender ambos mecheros de la campana de 4 Encender el
flujo
laminar
interruptor
de la campana y esperar 5 minutos
Figura
12 Siembra del
cepario
en
la campana de flujo laminar
5 4 1 SIEMBRA EN LIQUIDO Los volmenes que

se
siembran
en
la campana
van
desde tubos de 10 mL hasta
matraces Fernbach de 1500 mL
Previo al sembrado de los tubos y matraces transferir la
hay
que
asegurarse que el agua donde

que las
se
microalga
Para
est
la misma
se
temperatura
recomienda Al
a
microalgas
de las que
o
se
tomara el in culo
en
lograr
lo anterior
dejar
los matraces
tubos ya esterilizados
en
el rea de cultivo laminar

se
rea hmeda
momento de la siembra
la campana de
flujo
agregan
primero
los
matraces las vitaminas y los silicatos y Las tomando
despus
el cultivo sern
proporciones
en
de vitaminas y silicatos
segn
el volumen
tabla IV
cuenta la formulaci n del medio f 2 de Guillard y
Ryther
1973 de Q 5mUL
de vitaminas y 1 mUL de silicatos
28
Romo Pil era Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
Tabla IV
Proporci n
de vitaminas y silicatos de acuerdo al volumen
utilizar
VITAMINAS VOLUMEN mL 10 75 100 150 1500
SILICATOS VOLUMEN mL 10 75 100 150 1500
PROPORCi N 5lJL
0 0375 0 050 0 075 0 75
PROPORCi N 10lJL
0 075 0 100 0 150 1 5
Para agregar estas cantidades
se
utiliza
una
pipeta
automtica
Eppendorff
se
con un
puntas previamente
esterilizadas Para la esterilizaci n de las

con
puntas
colocan en
o en
frasco de vidrio para autoclave
tapadera
para
un
algod n
de 100
con
en
el fondo
cajas
de
plstico
de las solo
se
resistentes al calor el de 1
primero
en
puntas
I Y el
segundo
para el
caso
puntas
mL
se
meten
el autoclave
junto
los matraces
esterilizar y
abrirn para
su uso en
la campana de
flujo
laminar
El in culo mismos Si 10
se
utilizado
en
este
tipo
de volmenes
depender
en
del
prop sito
se
de los
est transfiriendo el cultivo para aumentarlo

a
volumen
utilizar el 5
del volumen
se
sembrar Si s lo
se
requiere
como
respaldos
para los
en
trabajos
los tubos
de
investigaci n
sembrara 1 mL de
se
microalgas
agitar la
en los
matraces y 0 5 mL
a
Al realizar la siembra
deber
en
muestra y esperar de 2
vez
3 minutos para
con
que las microalgas
se
distribuyan
la columna de agua Una la muestra de la de
hecho esto
la
ayuda
tomar misma
menor
de la
pipeta
automtica
se toma
superficie
sin
para asegurarse de funciona de la

es
microalgas
manera a a
activas Para las diferencia que la
especies
microalgas
de estas
flagelo
permanencia
en
la columna de agua
pero
la
vez
suficiente para realizar las inoculaciones

un
Cada
vez
que se abra
tubo
matraz antes y
uno
despus
de tomar
depositar
la
muestra se
pasar
la boca de cada
por la flama del mechero
como
medida de
seguridad
El
tiempo
de cultivo de estos volmenes
es
de mximo 7 d as para los matraces de
75 100 y 150 mL y de 15 d as para los tubos de 10 mL
29
Romo Pinera Abril Karin 2001 UABCS
profesional
50pp
5 4 2 SIEMBRA EN Este del
S LIDO
se
tipo de
Se
rutina
realiza para tener
en o
medio s lido las
especies
de
microalgas
de las
cepario
pueden
tener
cajas
de Petri
tubos de ensaye todo
depender
disponibilidades
del laboratorio
Se utiliza agar
bacteriol gico
utilizando 14 5 g por cada litro de agua marina
preparar 2 Al agua marina filtrada

se e
irradiada y
previamente
calentada
3 minutos
en
el
en
microondas
le agrega el agar
y los nutrientes
se
macros
micros y silicatos
proporci n
3
la cantidad de medio que

se
desee preparar
se
La mezcla
agita
un
poco hasta observar que toda la soluci n pegue

en
encuentre
en
suspensi n
para que
no se se
el matraz inmediatamente
se
4 Cuando la mezcla 15 Ib pulg2
observe
transparente
mete
el autoclave
1210C por 15 minutos

es
5 Antes de sacario del autoclave

un
necesario abrir
a
parcialmente
la
puerta
para evitar
un
cambio brusco de
temperatura
que afecte
la mezcla sta
presentar
color
amarillo cristalino 6
Esperar aproximadamente
adecuada para
de 15
20 minutos para y llenar las
que la
mezcla
o
baje
de
temperatura
ensaye
poder manejaria
cajas
de Petri
los tubos de
7 Antes de iniciar el llenado se deben de agregar las vitaminas 8 Es
en
el agar
importante etiquetar
tanto las
cajas
como
los tubos
con
el nombre de la
especie
la fecha de siembra
LLENADO DE LAS CAJAS DE PETRI 1 Se realiza

en
la campana de flujo laminar
2 Se vierte la mezcla dentro de la

es
caja en un volumen
caja
en un
de 30 mL
aproximadamente
c
esto
sin pasar del
primer
borde de la
se
3 La enfr e
caja
un
semicerrada
coloca
lugar
dentro de la campana
esperando
que
poco para evitar condensaci n terminado de llenar las estas
4 Una que
vez
cajas
se van no
poniendo
una
sobre otra para mayores de 5
dejarias cajas
se
solidifiquen
columnas
debern
ser
30
Romo Piftera Abril Karim UABCS
2001 Manual para 81 cultivo de
microalges
Memoria tcnica
profesional
50pp
aproximadamente
los mecheros 5 Al d a
se
1 h durante este
tiempo
nicamente la campana
se
se
dejar
encendida
apagan ya solidificadas
se
guardan
en
el
refrigerador
se
siguiente
a
revisan las
cajas
y si
alguna presenta condensaci n
mete
la
incubadora 6 No
es
300C por 4 horas
recomendable utilizar
aquellas cajas
donde la condensaci n
no se
elimine por
completo
LLENADO TUBOS DE ENSAYE AGAR INCLINADO 1 La mezcla

se
vierte
en
los tubos
con
ayuda de una pipeta
de 10 mL
en una
proporci n
de entre 9 y 10 mL 2 3
aproximadamente
en
Despus
Una
vez
se
meten
el autoclave para la esterilizaci n

se
esterilizados
colocan
una
en
el
ngulo
de inclinaci n
figura
13
que
se
obtiene colocando los tubos sobre 4 Se dejan solidificar hasta el d a 5 En

caso
pipeta de 5
mL
siguiente
a
de condensaci n
se
meten
la incubadora
300C por 4 horas
Figura
13 Tubos
con
agar colocados sobre
una
pipeta de 5 ml
31
Romo Piera UABCS
Abril Karim
2001
Manual para el cultivo de mieroa gas Memoria tcnica
profesional
57pp
SEMBRADO EN AGAR 1 Se realiza 2 Se utiliza

en
la campana de
flujo
laminar
un asa
bacteriol gica rojo

vivo
se
3 El
asa se
pasa por el mechero hasta el
4 Se abre la 5 El
asa se
caja
enfr a
tubo 1
respectivo
en
de donde
sembrara
segundo
las
paredes
de la
caja
tubo y
se
toma la muestra de
microalga
6 El 7
rayado
es en
zig
zag
en
la
caja
o en se
el tubo
figura
14
Despus
de
descargar
el
asa
esta
pasa por el mechero hasta
rojo
vivo antes de
iniciar otra siembra 8 Las
cajas
de Petri
se
sellan
con
papel parafilm
en
se
colocaran para cultivo invertidas
el lado del agar hacia la fuente de luz 9 Los tubos

se
el rea del
manera
cepario
con
colocaran
en
la
gradilla
de
invertida
el
tap n
hacia
abajo
Figura
14
Sembrado
en
zig
zag sobre agar
Los resultados de crecimiento
en
placa
se
observaran entre los 7 y 10 d as

una en
de tal
un
sembrado Se deber observar el crecimiento de cada que

se
de las colonias de
o
manera
pueda
detectar si
presentan alguna
La coloraci n
alteraci n
el color
forma
esto ser a
en
indicativo de contaminaci n
depender
del color de la
microalga
medio
l quido
generalmente
su
aspecto
es
brilloso y
homogneo
32
Romo Piftera Abril Kam UABCS
2001
gas mcros
Memoria tcnica
profesional
50pp
Se
sugiere para
el
sembrado de transferencia de la
escoger las colonias que

pues estas
se
encuentren al final del

menor
rayado
placa
el tubo
presentan
una
carga
de bacterias
El
va
tiempo
a
de cultivo de las
en
microalgas
en
s lido tubo
depnder
de la
especie pero este

la carga bacteriana
de 15
20 d as
placa
y hasta 1
mes en
dependiendo de
del cultivo Una meten

a vez
pasado
ste
tiempo
en
el
caso
de las
cajas
de Petri si de
se
son
de
plstico
se
la autoclave
Fast Instrumenf 10 min

se escurra
en un
recipiente
cajas
plstico
para evitar
que el material diluido En el

caso
dentro del
aparato
y estas
desechan colocados Estas

se en una
de
cajas
de Petri de vidrio y los tubos de ensaye

es
gradilla
con
el
tap n
se
hacia arriba
el mismo
procedimiento
de
pueden
recuperar solo
lavan
siguiendo
el
procedimiento
limpieza ya
mencionado
5 5
AN`LISIS BACTERlOL GICOS

Se recomienda que
se
realicen monitoreos
peri dicos
de la
poblaci n
bacteriana cada
presente
3 4
en
los cultivos de
microalgas
En el laboratorio se realizan estos
una vez
meses se
Estos anlisis
realizan
travs del mtodo de extensi n
en
superficie
utilizando
en
dos diferentes medios
bacteriol gicos agar
marino para la observaci n de bacterias 01 2
general
y TCSS
Tiosulfato
Citrato Sales Siliares Sacarosa DIFCO 065
para
observar si existe la
presencia
Vibrio
MEDIO DE AGAR MARINO 1 El agar marino

se
prepara utilizando 55 1 g de este por cada litro de agua destilada

a
previamente
calentada
preparar
luego
se
sigue
el
procedimiento
del sembrado
en
s lido para la esterilizaci n y llenado de las 2 Para el sembrado diluciones de 10 nmero 1

se
1
cajas
en
secci n 5 4 2 la campana de
en
placa
10
qu
se
realiza
flujo
laminar
se
hacen
hasta 10
es decir
cada tubo tendr 9 ml de agua destilada al tubo de este tubo

se toma
le coloca 1 ml de la
microalga
1 ml que
se
coloca
en
el tubo nmero 2 y as 3 Del tubo nmero

con
sucesivamente hasta 10
se va a
llegar
al tubo nmero 10
figura
15 la
tomar 0 1
ml que ser
colocado
en
placa
cuidadosamente
ayuda
de
una
pipeta
automtica
33
gas microa
Memoa tcnica
profesional
50pp
Este 0 1 mL ser distribuido

en un se
en
la
placa
en
con
ayuda
de
una
varilla de vidrio estril por el mechero y
doblada
ngulo
enfr e
de 900
mojada
se
alcohol y
luego pasada
la
mano
dejando
que
se
que
mientras
gira
la
placa
con
simultneamente hasta
se
absorba
completamente
el agar este
el in culo
Es decir
una vez
que
con
ha colocado el 0 1
se
mL de cultivo observe que
en
se
extender por toda la
placa
la varilla hasta que
no
queda l quido placas
sobre el agar sembradas

se
5 A continuaci n las 20C 1 28 por 48 h
invierten y
son
colocadas
en
la incubadora
6 Transcurrido el
tiempo
se
prosigue al
conteo de colonias colocando las
placas
en un
contador de colonias Quebec
1m
n
Se toma 0 1 mL
11
para el anlisis
l
a
CD
tJ Q
C aa
lo
Figura
15 Diluci n del cultivo para la toma de muestra
en un
anlisis
bacteriol gico
MEDIO DE Teas 1 Se utilizan 89 9 por cada litro de agua

a
estilada
previamente
calentada hasta la
ebullici n 2 Se
preparar NO
se
utiliza el autoclave 15 minutos para el llenado de las
deja
enfriar un poco
se
aproximadamente
la misma
placas
a
3 A continuaci n
sigue
metodolog a
que para el medio de agar marino
partir del punto
nmero 2
34
Romo Pitlera Abril Karim 2001 UABCS
gas mictoa
Memoria tcnica
profesional
50pp
EVALUACi N
DE LA BIOMASA
a
Para alimentar
los
cultivos
principales
es
necesario
conocer
cual
es
la
concentraci n de biomasa que presentan los cultivo de

es
microalgas
para as
saber cual
en
la
proporci n
de alimento que
se
se va a
suministrar Los mtodos utilizados

a
este
laboratorio para medir biomasa
describen
continuaci n
6 1 HEMA TOCIT
METRO
C`MARA DE NEUBAUER
cara
Presenta dos cmaras canales existen
En la
superior
del
portaobjetos
a
se
encuentran cuatro
longitudinales grabados
un
canal transversal central
cuyos lados subdivididos
superior
inferior
dos cuadros de 9
mm2
de
superficie
a su vez en una
cuadr cula ms fina
Figura
16
Canallat8nll
Canal
nInII
D
FIgura
16 Cmara de conteo Neubauer Utilizada para
conocer la
concentraci n de
un
cultivo
Al colocar el cuadr cula de 0 1

mm
cubreobjetos
encima de la
superficie
donde
una
se
encuentra
grabada
la
existe entre ellos cuadr cula y misma que viene indicada

en uno en
cubreobjetos
el
distancia
fija profundidad
portaobjetos
de 1
Por lo tanto el volumen de la
muestra
problema
X 0 1
de los cuadros
grandes
mm2
de
superficie
ser
igual
1 0
mm2
mm
0 1
mm3
Las tcnicas de conteo consideran el nmero

se
de
individuos presentes en la muestra de volumen determinado y comnmente

como
expresan y
como
nmero de individuos por cada mililitro Ya que 1 mL
cm3
1000
mm3
1000 que
mm3
10 000 X 0 1 ya
se
mm3
entonces 1 mL de 0 1
10 000
veces
el volumen de la muestra
como
vio
es
siempre
mm3
35
gas microa
50pp
Vamos cuadr cula mililitro 1mL El

se
suponer que
se
hizo
un
conteo de clulas
en
el cuadro central de la
obtenindose la cifra de 320 clulas Para expresar el nmero de clulas por
multiplica
320 X 10 000 ya que 1000
son
320 las clulas existentes
en
0 1
mm3 y
10 000 X 0 1
mm3
El resultado el
es
de 3 200 000 clulas I mL
procedimiento
para el conteo
es
siguiente
una en un tubo
1 Se toman dos muestras de 1 mL cada 2 Una de las muestras vivo esto tiene
como se
de ensaye efecto de observarta in
observa el
microscopio
sin
fijar para
objetivo verificar las
condiciones de la
microalga
NOTA ESTO SE DEBE HACER CADA SEMANA CON EL CEPARIO SOLO PARA EFECTOS
DE
REVISi N
DEL CULTIVO
se
3 La otra muestra forma soluci n soluci n 4
fija
con
lugol
gota ellugol puede
ser
preparado
de la
siguiente
tipo tipo
Tinci n Gram
1 5
Iugol
agua destilada
utilizada
en
el laboratorio
2 1 1 1
Qugol
formol agua destilada

se
Dependiendo
de la densidad del cultivo
puede
hacer diluci n de la muestra para

a usar se
efecto de conteo Para la determinaci n de la diluci n la cmara de conteo y si el nmero de la cmara

es
observara la muestra los cuadros de 4 si

se x
en
microalgas
a
localizadas
en
4 de
mayor
100
se e
procede
diluir la muestra Por
ejemplo
es
agregan 5
mL de agua marina filtrada diluci n 5 6 mL y as
irradiada
1mL de muestra la diluci n
de f d factorde
sucesivamente
se
El llenado de la cmara que
utiliza
en
el laboratorio
es
por
cualquiera
de los
se
canales laterales iniciando cubran ambas 6 La f rmula
en uno
de ellos hasta que la muestra pase al otro lado y
rejillas
de la cmara nmero de clulas 15 esto

es
para obtener el
en
por mililitro
depender
de las
cuadr culas 1 No
utilizadas
la cmara
Figura
de clulas contadas I No
de cuadros contados 10 000
10 000
No
de clulas
contadas f
d I No de cuadrantes contados los cuadros 4L

se
Cuando
se cuentan
dividir entre 4 esto por cada
una
de las
rejillas
de la cmara 2 No de clulas contadas

se
10 000
un
No de clulas contadas f d
10 000
esto cuando 3
cuenta solo
cuadro L 5 No de clulas contadas fd

10 000
No de clulas contadas
10 000
36
Romo Piera UABCS
Abril Karim
2001
Manual para el eultivo de
mieroalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
cuando conteo
se se
cuenta el cuadro del centro de la realiza sp para las
rejilla
las 4E
a
E central
este
tipo
de
microalgas pusilla
menores
Jlm
Nannochloris
sp
Nannochloropsis
Micromonas
6 2 ESPECTRO FOT Este
METRO
de densidad
tipo
de
metodolog a
ptica
absorbancia la
es
muy utilizado para

de
la determinaci n de biomasa de las
microalgas presentando
en
ventaja
poder
leer de
rpidamente
Para
poder
basarse que
se
este
mtodo
es
necesario realizar
curvas
calibraci n para cada
especie
desee medir
es
Para la lectura de la muestra el 1 Se
procedimiento
se
el
siguiente
aproximadamente
20 mL
en un
homogeniza
la muestra y
toma
un
volumen de
recipiente
2 Se
nm
procede
no
leer
en
el
espectrofot metro
figura
17
a una
longitud
de onda de 750
donde
exista interferencia por
pigmentos
mar
3 Se calibra
con un
blanco de agua de
se
filtrada
irradiada
O de absorbancia
4 Se lee la muestra y
registra
la absorbancia
4 1
11 ft
I lIECIlM4I
Figura
17
Espectrofot metro Utilizado para medir biomasa
a travs
de
longitudes de onda
37
Romo Pit era Abril Karim 2001 UABCS
mictoalgas
Memoria tcnica
profesional
50pp
6 2 1 CURVAS DE Las
mas curvas
CALIBRACi N
se dan a
de calibraci n que
en
continuaci n fueron hechas para las
especies
utilizadas
el este laboratorio
Isochrysis galbana Monochrysis

cultivos semicontinuos Es ya que
lutheri Dunallie a
es
tertiolecta y Chaetoceros masivo que estas

se
gracilis
en
en
el
tipo
cultivo
mantiene
este laboratorio
importante
cultivo
recalcar que para utilizar ya mencionadas

en
curvas se
deben mantener las condiciones de
el
presente
manual
curvas
Para obtener las volmenes
de calibraci n L los cuales
se se
realizaron cultivos semicont nuos mantuvieron durante 15 y
en
de 100 y 400
13 d as
respectivamente
conteos
Diariamente fueron tomadas muestras de los cultivos para hacer

con
celulares
el
hematocit metro
los conteos
se
lecturas las
un
de
absorbancia
se
con
el
espectrofot metro
cuadruplicado
Tanto
como
mediciones anlisis de
hicieron
por
A los datos obtenidos
les realiz
regresi n
lineal para Estas
obtener la ecuaci n
de la recta para cada

se
especie
y volumen de cultivo
en
ecuaciones son las que
utilizarn para
conocer
la concentraci n
ceVmL del cultivo
utilizando la lectura de absorbancia como nuestra variable
independiente
ECUACi N
bx
Donde y variable
a
dependiente
clulas mL
ordenada al origen
b
x
pendiente
variable independiente absorbancia
CULTIVOS DE 100 L
Isochrysis galbana
Donde
a
580680 943 7069008 38
b
x
absorbancia
38
Romo Piftera Abril Karim 2001 UABCS
Manual para el cultivo de microalgas Memoa tcnica
profesional
57pp
Isochrysis galbana
2500000 200000O
O
1500000
E
c
i 3
1000ooo 500000 o o 0 02 0 04 0 06 0 08 01 0 12
om
0 14
0 16
0 18
Absorbaocia
I
Figura
18 Tendencia de la
datos obsenedos
modelo
I
galbana
en
regresi n
entre la absorbancia y la densidad de Isochrysis cultivos de 100L
Monochrysis luthen
Donde
a
534024 34
b 7355434 98
x
absorbancia
Af onochrysis lutheri
2500000 200000O
0 lIS
2E
1500000
i31000000
500000 o O 0 02 0 04 0 06 0 08 01 0 12
om
0 14
0 16
0 18
Absorbaocia
I
Figura
19 Tendencia de la
datos obsenados
modelo
I
iadde densi
regresi n
entre la absorbancia y la
Monochtysis
39
lutheri en cultivos de 100L
xabsorbancia40
Romo Piflera Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
Dunallie a tertiolecta Donde

a
161737 936 2738972 75 absorbancia
b
x
500000 450000 400000 35
oo
al
300000 E
250000 200000 CD
e a 150000 10 oo 50000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 01 0 12 0 14 0 16
0 18
Absoranci
nro
datos Iobsen
edos
Figura 20 Tendencia de la regresi n modelo I
entre la absorbancia y la densidad
deDunaTtela tertiolecta en cuftivos
de 100L Chaetoceros
gracilis
Donde a 199 b 89
354705
6228837
Romo Pif era Abril Karim UABCS
2001
Manual para el cultivo de microaJgas Memoria tcnica
profesional
57pp
Chaetoceros gracilis
1600000 1400000 1200000
i
2 E
lA
1000ooo 800000 600000 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08 01 0 12

nro
c 4D
4D
0 14
0 16
0 18
Absorbancia
I
Figura
21 Tendencia de la
datos observados
modelo
regresi n
entre la absorbancia y la densidad de Chaetoceros gracilis en cultivos de 100L
CULTIVOS DE 400 L
Isochrysis galbana
Donde
a
100504 156 10189981 4 absorbancia
b
x
41
Romo Pil era Abril Karim 2001 UABCS
gas microa
Memoria tcnica
profesional
57pp
lsochrysis galbana
1600000 1400000 1200000
g
c el
J 1000ooo
el o
800000 600000 400000
200000
O O 0 02 0 04 0 06 Absorbancia 0 08
nm
01
0 12
0 14
I
Figura 22 Tendencia
de la
datos obsenedos
modelo
regresi n entre la absorbancia y galbana en cultivos de 400L
la densidad de Isochrysis
Monochrysis
Donde
a
lutheri
172093 1
b 10066436 1
x
absorbancia
Monochrysis lutheri
1600000 1400000 1200000
g
e CD
J 1000ooo
800000 600000 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08
nm CD
si E
2 0
01
0 12
0 14
Absorbancia
I
Figura
23 Tendencia de la lutheri
datos obsenedos
modelo
regresi n
en
entre la absorbancia y la densidad de Monochrysis cultivos de 400L
42
Romo Pitlera Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
Dunalliela tertiolecta Donde

a
56111 3817 1807414 9 absorbancia
b
x
160000 140000 120000
i g
c
100000 80000 60000 40000 20000 O o 0 02 0 04 0 06 0 08

nm
01
0 12
0 14
Absorbancia
I
Figura 24
Tendencia de la
datos obsenados
modelo
regresi n
entre la absorbancia y la densidad de Dunaliela
terlioJecta en cultivos de 400L
Chaetoceros Donde
a
gracil s
74429 724
b
x
11035287 6
absorbancia
43
Romo Pinera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de UABCS 57pp
microalgas
Memoria tnica
profesional
Chaetoceros
1600000 1400000 1200000
grad
is
i
g E
I
1000ooo 800000 600000 400000 200000 O O 0 02 0 04 0 06 0 08

nm
c Q
i
u
01
0 12
0 14
Absorbancia
I
Fgura
25 Tendencia de la
datos observados
modelo
I
gracilis
regresi n
entre la absorbancia y la densidad de Chaetoceros en cultivos de 400L
7 ESPECIES EXISTENTES EN EL LEAP

El laboratorio consta de 8
especies
de
microalgas
las cuales
se
enlistan
continuaci n El origen de estas cepas esta indicado por el sub ndice
Isochrysis galbana
ISOC
Monochrysis
Pavlova lutheri DUT2

3
MONO
Dunaliella tertiolecta Tetrase mis suecica Tetraselmis tetrathe Chaetoceros
TESAt
e
TETE
CHGRA
gracilis
Chaetoceros calcitrans CHCl Chaetoceros sp CHX 1

3
Phaeodactylum
1 Centro de
tricomotum
PHAEOT
Investigaciones Biol gicas
del Noroeste CIBNOR
2 Acuacultores de la Pen nsula 3 Centro

4
S A APSA y de Educaci n
Investigaci n
desconocido
Cient fICa
no
Superior de Ensenada
CICESE
Origen
existe
registro
44
mictoalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
BIBUOGRAF A
Abalde J
Cid A
Fidalgo
P Torres
E y Herrero
1995
Microalgas Cultivo
Aplicaciones
Caizares V R O
Universidad de Corua C Casas C A R
Espaa
210 pp B y O Voltolina L 1994 Las CINVESTAV
Dom nguez
gas microa
IPN
en
la acuacuHura Cuadernos sobre de
Biotecnolog a
Departamento
Biotecnolog a
Bioingenieria Mxico
44 pp
Carpenter
p L 1982 1991
Microbiolog a
Ed Interamericana Mxico
518 pp
Dawes C J
Botnica Marina Ed Umusa Mxico
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of carbono En W O O Stewart
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Biochemistry Botanical
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vol
10Univ OfCalif Press
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E and B
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CuHures and
Phytoplancton Ecology
The
University ofWiscoinsin
Gladue R 1991
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Heterotophic microalgae production potential

feeds En Rotifer and
application
to
aquaculture
Microalgae
CuHure
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The Oceanic
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Ryther
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1973 W
Culture of L y M H
phytoplankton Chanley
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CuHure of Marine
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microalgal
mass
culture
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E Bez de
O y Huerta
A 1993 Manual de tcnicas anal ticas del centro de
aplicadas
al cultivo y
microalgas
Departamento
investigaciones
74 pp
cient ficas
tecnol gicas
Mart nez
CICTUS
Universidad de Sonora Mxico
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microalga
Nannochloris sp
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alimento del rot fero
Brachionus
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Muller 1786
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1962
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45
Manual para el cultivo de mictoalgas Memoa tcnica
profesional
57pp
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o
Phycological
Methods
Culture methods and
growth
Cambridge University
Press USA 446 pp
46
Romo Pilera Abnl Karim UABCS
2001 Manual para el cultivo de
gas microa
Memoria tcnica
profesional
57pp
ANEXO I Formulaci n para la y
preparaci n
del medio de cultivo f 2 de Gulllard
Ryther 1973
MACRONUTRlENTES
l
Reactivo Nitrato de sodio Fosfato de sodio
3 NaN Na2H2P04 H20

i
en 1 litro de agua destilada Soluci n de Usar 1 mL por cada Iftro de aqua marina Jara cultivo
Disolver los reactivos
trabajo
SILlCATOS Reactivo Silicato de sodio Disolver el
3 NaSi 9H20
reactivo en 1 litro de agua destilada en un recipiente por separado Usar 1 mL por cada Iftro de agua marina Jara cultivo Silicatos se les considera parte de los macronutrientes pero solo se utilizan para las diatomeas
MICRONUTRJENTES Reactivo Soluci n Sulfato stock de metales traza 5 Cantidad 0 98 2 2 1 0 18 0 0 63
g1 L
cprico CUS04
H20
Sulfato de zinc Cloruro de
Znso4 7 HzO MnCh 4HzO
Cloruro de cobalto CoCh 6HzO

man aneso
Molibdato de sodio
NazMo04 2HzO
Disolver en 100 mL de agua destilada cada uno de los reactivos por separado para re arar las soluciones stock de metales traza Conservarlas en el refri erador Cloruro frrico
FeCb 6 H2 EDTA dis dica Na2EOTA
3 15
4 36
Para preparar la soluci n de trabajo de micronutrientes primero disolver en su totalidad el EDT A dis dica agregar el cloruro frrico hasta que se disuelv finalmente agregar 1 mL de cada una de las soluciones stock de metales traza aforando Usar 1 mL de esta soluci n JOr cada litro de aqua marina Jala
a
1000 mL de agua destilada cultivo
47
Romo Pillera Abril Karim UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
VITAMINAS Reactivo Soluci n stock de vitaminas 8iotina B6 Cianocobalamina 812 Pesar hacer soluciones
se
Cantidad 0 1 disolver 100 ml de destilada
en en
ua
0 1 g disolver
100 ml de agua destilada Conservarse 0 2

en
aradas de cada
una
refri eraci n
Tiamina 81
Para preparar la soluci n de trabajo de vitaminas se disuelve la tiamina y se adiciona 1 ml de la soluci n stock de B6 y 1ml de 812 y aforar a 1 Utro de agua destilada Usar 0 5 roL f Or litro de aaua marina para cultivo NOTA Para la
preparaci n de vitaminas este laboratorio utiliza vitaminas provenientes de una soluci n comercial inyectable de complejo 8 El procedimiento para elaborar la soluci n con base a las concentraciones requeridas para el medio de cultivo f 2 es el siguiente
Disolver dos ampolletas de 8EOOYECTAMR 80 mg de 812 Aforar a 1 lde agua destilada y se hace la soluci n primaria
tomaran 10 ml
en
19 8 g de 81 De esta soluci n
primaria
se se
1 l de agua destilada para hacer la soluci n de

a
trabajo
de la cual
tomaran 0 5 ml por litro de agua marina OTRA VIA ES Disolver dos
utilizar para cultivo
ampolletas
de
OOXEMINASuR
Genrico Intercambiable
900 mg de 812
1989deB1
Aforar
a
1 ml en
1 l de agua destilada para preparar la soluci n primaria De sta soluci n tomar 1 lde agua destilada para la soluci n de trabajo de la cual se tomaran 0 5 ml por
a
litro de agua marina
utirlzar para cultivo
48
Romo Pilera Abril Karim 2001 UABCS
profesional
57pp
ANEXO 11 BIT ACORAS DE APARATOS
BIT`CORA HORNO DE MICROONDAS

FECHA USUARIO TEIMPO DE USO OBSERVACIONES
49
Romo Pinera Abril Karim 2001
profesional
UABCS 57pp
BIT`CORA AUTOCLAVE
FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES
50
Romo Piftera Abril Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
BIT`CORA MICROSCOPIO
FECHA USUARIO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES
51
Romo Pitiera Abril Karim 2001 Manual para el cultivo de UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
BIT`CORA BALANZA
FECHA USUARIO REACTIVO QUE PESO TIEMPO DE USO OBSERVACIONES
52
Romo Pinera Abril Karim UABCS
gas microa
Memoria tcnica
profesional
57pp
BIT`CORA DESTILADOR
FECHA USUARIO TEIMPO DE USO OBSERVACIONES
53
Romo P f era Abril Karim 2001 UABCS
microa1gas
Memoria tcnica
profesional
57pp
BIT`CORA SISTEMA DE FILTRACi N E IRRADIACi N DE AGUA MARINA

FECHA USUARIO INICIO TERMINO TOTAL DE MINUTOS
54
Romo Piftera Abnl Karim 2001 UABCS
microalgas
Memoria tcnica
profesional
57pp
ANEXO 11I CRlSTALERIA INVENTARIO

MATRAZ Atorado 1000 ml Atorado 500 ml Atorado 100 ml Bola de fondo 2 8 1 1000 ml 11 12 23 56 36 6 1 14 41 CANTIDAD
plano
Bola de fondo plano 250 ml Erlenmeyer 1000 ml
Erlenmeyer 125 Erlenmeyer 225

Erlenmeyer 4 L
ml mL
Erlenmeyer
500 mL
Erlenmeyer Kitasato 1000 mL

Fembach 2800 mL PROBETAS 2000 mL de 1000 mL de 500 mL de 500 mL 100 mL De 100 rol
plstico
1 6 1 1 4 2 9 4 2 2
plstico plstico
plstico
50mL 25mL 10ml VASOS DE PRECIPITADO 1000 mL De De 1000 mL 600 mL
plstico plstico
1 1
1
500 ml 250 mL 100 mL De 100 mL
11 3 1
plstico
OTROS Embudo de vidrio Embudo de plstico 1 2
55
Romo UABCS
Pii Abril Karin 2001 Manual para el cultivo de mictoalgss Memoria tcnica era
profesional
57pp
ANEXO
IV
PROTOCOLO
DE
USO
DEL
SISTEMA
DE
FIL TRACION
IRRADIACION DE AGUA MARINA
1 Colocar los filtros de cartucho la entrada del agua al
en
orden descendiente 15
10
1 J 1rT1
con
referencia
en
aparato
II Conectar las mangueras de entrada y salida de agua
11I
Abrir la llave de
desfogue
ubicada dentro del rea fr a
colocando la manguera de
desag e
Ir al cuarto de bombas
11I
Conectar y
encender las
se
lmparas
de luz Ultravioleta
Revisar que stas

se
estn
es
encendidas
Importante
recuerda que para que este
procedimiento
arena
lleve
cabo
necesario haber encendido la bomba para la filtraci n por
siguiendo
el
protocolo
conespondiente
IV
Anotar hora de inicio

en
en
la bitcora
Al trmino
de
su
uso
apagar las
lmparas
anotarse
la bitcora
Desconectar el
aparato
ir
apagar la bomba
cuarto de bombas
en
Desarmar el
aparato
quitando primero
los filtros de cartucho

mar
orden de 15
11Jm
despus
desconectar la manguera de entrada de agua de
luego quitar la
manguera de salida y
dejar
vac o
se
que
salga
el
aparato
inclinando
un
poco el sistema para que

una vez
quede completamente
la manguera esta
Enjuagar
la manguera y los filtros de cartucho

secar en
enjuagada
debe poner a
la toma de aire del rea hmeda
56
Romo Piftera Abril Karin UABCS 57pp
2001
Manual para el cufivo de
microalgas
PROTOCOLO DE USO DEL SISTEMA DE BOMBEO Y FILTRACION POR ARENA DE AGUA MARINA
1 Verificar que
hay
agua
en
el
dep sito
cisterna
11 Verificar que el filtro por arena tenga conectadas y entrada de agua
aseguradas
las mangueras de salida y
111 Verificar que la bomba est conectada al filtro por filtro ubicados entrando al cuarto de bombas
arena
y enchufada
primer bomba
IV
Iniciar antes que nada el RETROLAVADO hacia donde dice backwash
mover
la llave
favor de las manecillas del
reloj
verificar que la manguera de
desfogue
este conectada
hacia el
desag e
Encender el
interruptor de
la bomba y esperar 2 minutos
Apagar
la bomba Iniciar el FllTRAOO
primeramente
moviendo la llave hacia donde
dice filter
y encender el
interruptor
de la bomba
etiquetado microalgasj
VI
Al trmino de
su uso
apagar el
interruptor
de la bomba acto
seguido
mover
la llave del
hacia donde dice Closed filtro para vaciarto
Desconectar la manguera de salida del filtro y
quitar el tap n
57

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QUE COMO UNO DE lOS REQUISITOS PARA OBTENER El

PRESENTA ABRIL KARIM ROMO

BAJA CALJFORNli SlJR

L I dJ RicA DE I ll TUmiSl CIE S DI CL l I RL L R

lAR EMELIO BAIUAlJ GONZAL

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE

firmantes comunicamos el la pas

A Dios A Osmar por existir por A Daniel por

padres Laura y Francisco por

sta rea Gracias

listo por toda la

las comidas y esta la tesis

proyecto Cultivo de Pteridos Hector Hugo Champ

y Alex a quien agradezco adems del acomodo de grficas A mis

ayuda en la revisi n ndices fotograf as etc

Marco Cadena por

que a Roberto Carmona por la

parte de mi comit revisor al igual la parte estad stica de este trabajo

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CONTAMINACi N QU MICA CONTAMINACi N BIOL GICA

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