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LABORATOIRE DE CHIMIE BIOANALYTIQUE, DE TOXICOLOGIE ET

DE CHIMIE PHYSIQUE APPLIQUEE


Directeur : Professeur Jacques Dubois PROMOTEUR

LABORATOIRE DE BIOCHIMIE MEDICALE
Directeur : Professeur Yves Mardens CO-PROMOTEUR





DETECTION ET QUANTIFICATION DE
DEGATS OXYDATIFS A L'ADN CELLULAIRE.
ROLE PHOTOSENSIBILISANT DES
PORPHYRINES ENDOGENES

par

Pierre DUEZ
Pharmacien


Thse prsente en vue de l'obtention du grade de Docteur en
Sciences Pharmaceutiques


Bruxelles, Septembre 2001

Remerciements


Toute ma gratitude va au Professeur Michel HANOCQ qui ma propos, il y a bien
longtemps dj, de partager avec lui une exprience de coopration au dveloppement. Celle-
ci a profondment marqu mon approche du mtier de pharmacien, du mtier de chercheur,
du mtier d'enseignant. Depuis nos essais dlectrodialyse jusqu sa relecture attentive de ce
document, je le remercie d'avoir port aux nombreux travaux mens sous sa direction des
moyens matriels apprciables mais aussi toute son attention, ses conseils, sa comptence
scientifique, son enthousiasme et ses coups de sang lgendaires.

Je tiens exprimer ma reconnaissance au Professeur Jacques DUBOIS dont l'amiti m'a
permis de revenir dans le service et de raliser ce travail; son acharnement a contribu
mettre en place une infrastructure et des moyens matriels dont nous profitons tous. Je
n'oublie pas qu' travers de grandes et de petites expriences, vingt ans de longues discussions
scientifiques nous ont amens dvelopper de nombreux travaux, thories et projets.

Je remercie tout particulirement le Professeur Yves MARDENS qui m'a accueilli dans
son Laboratoire une priode extrmement difficile pour moi. Alors mme que j'envisageais
de changer compltement d'activit, il m'a permis de reprendre confiance. C'est inestimable...
Il a apport toute son nergie la lecture et la correction de ce manuscrit. J'ose esprer que
sa rigueur se reflte dans la version finale.

Mes remerciements vont galement au Professeur Lopold MOLLE pour son
enseignement et surtout pour son dynamisme et son enthousiasme; les projets de coopration
qu'il a initis attestent d'un profond sens humain. Il n'a pas mnag sa peine essayer de nous
le communiquer.

Une partie de ce travail n'aurait pas t possible sans l'aide de ceux et celles qui ont
aimablement mis ma disposition du matriel et/ou des logiciels; je remercie M. le Professeur
J.-P. DEHAYE du service de Biochimie Gnrale, M. le Professeur A. MOS du Service de
Galnique, M. le Professeur M. VAN DAMME du Service de Toxicologie, M. le Professeur
VANDER DONCKT du service de Chimie Organique Physique et Mme le Dr L. DE
CLERCQ des Laboratoires Este Lauder. Les cellules de mlanome HBL nous ont t
i
gnreusement fournies par M. le Professeur G. GHANEM, Directeur du Laboratoire
d'Oncologie et de Chirurgie Exprimentale de l'Institut Bordet, dont les conseils sont
apprcis.

Je remercie vivement Mme le Professeur M. Kirsch-Volders et Mlle M. De Boek pour
leur introduction aux arcanes de l'essai comte, Mme I. SENTE pour son assistance avec le
dtecteur barrettes d'lectrodes, M. le Professeur J.P. DEHAYE et le Mme le Dr N. CHAB
pour leur aide dans les mesures de fluorescence, M. le Professeur J.-M. KAUFMANN pour
nous avoir permis d'obtenir un dtecteur ampromtrique et M. R. VANDELOISE pour le
relev des spectres de lampes .

Un travail de thse apparat comme une activit essentiellement solitaire. Cette exprience
permet cependant des interactions fascinantes avec dautres personnalits dont on apprend
dautant plus que lon partage. J'ai essay de partager mais jai surtout beaucoup appris de
tous ceux que j'ai croiss au cours de cette "carrire" dj longue et que je me permettrai de
citer.

Le Dr Alain KUMPS n'a pas mnag sa peine me faire acqurir des notions de chimie
clinique, de chromatographie gazeuse, de spectromtrie de masse, de statistique et de marche
pied. Je lui dois d'avoir t accueilli dans le Laboratoire de Biochimie Mdicale, une tape
dterminante. Merci.

Que les doctorants du service Lassina BADOLO, Muriel BALTES, Sylvianne
BIDOUIL, Gilles DEHON, Eric KINNAERT et Issa SOME soient remercis pour avoir
recr une ambiance chaleureuse et amicale dans le laboratoire. Leur compagnie sympathique
a rendu supportables les interminables analyses chromatographiques. Un merci particulier
Issa et Lassina qui m'ont rellement remis le pied l'trier pour initier ce travail. Ma
sympathie Muriel qui supporte le dsordre que je fais rgner partout o je passe.

J'exprime tous mes remerciements l'quipe technique du Laboratoire de Chimie
Bioanalytique, de Toxicologie et de Chimie Physique Applique. Sans Didier COLSON,
Marianne HELSON, Touria LAMKAMI, Dominique MERTENS, Dora OOMEN et Liliane
RICHIL, ce travail n'aurait pas t possible. Merci pour l'ambiance sympathique qu'ils font
rgner. Salut galement Sergio PAREDES et Marianne TRIBOUT.
ii
Merci aussi l'quipe technique du Laboratoire de Biochimie Mdicale. Sans les
encouragements incessants de Janine GENIN et de Kanzengelele (Chrtienne) KALWELE, je
n'aurais pu mener bien cette thse.

Une pense amicale pour tous les chercheurs de l'Institut de Pharmacie qui m'ont
tmoign leur amiti, plus particulirement pour Bertrand BLANKAERT, Lucette
BOUILLARD, Katrina GROSFILS, Elie KABRE, Nama et Mourad METIOUI, Stphanie
POCHET et Olivier VOSTERS.

Je suis assez ancien dans l'Institut pour me souvenir d'une autre gnration de chercheurs,
Sylvie CHAMART, Christine DE SMET, Danielle LUCAS, Eric SCHENKEL, Bernard
VINCKE mais aussi du personnel technique de jadis, Pierre THIELEMANS, Christine
ALVOET and, last but not least, Aristotlis LIVADITIS. Si par hasard ils tombent sur ces
lignes, qu'ils sachent que les bons souvenirs sont toujours l. Salut galement Valrie
BERLAIMONT et Jean-Pierre TASSIN.

Au cours de mon travail chez Schering-Plough, j'ai eu l'occasion d'avoir des suprieurs qui
m'ont accord une extrme souplesse d'horaire; je remercie le Dr J.-P. OSSELAERE,
M. P. DE POURCQ et Mme B. SCHOCKAERT, grce qui j'ai pu mener de front un travail
dans l'industrie et une activit scientifique. Merci galement ma collgue Chantal HUBER
qui m'a permis de comprendre que je n'tais peut-tre pas vraiment fait pour les Affaires
Rglementaires

Merci mon papa, ma maman, ma p'tite sur.

Merci, enfin et surtout, Nicole et Quentin.

Je ddie ce travail M. Jean MAINIL et au Dr Nestor CHAMOLES.




"Est-ce que le monde est srieux ?"
Francis Cabrel
iii
Liste des abrviations

8-nitrodG 8-nitro-2'-dsoxyguanosine
8-oxodG 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine
8-oxoG 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine
A adnine ou adnosine (en fonction du contexte)
ACTH corticotropine
ADN acide dsoxyribonuclique
ADP adnosine-5'-diphosphate
AP abasique (apurique et apyrimidique)
AP-1 complexe de protines activatrices 1
ara-C 1--D-arabinofuranosyl cytosine
ARN acide ribonuclique
ATP adnosine-5'-triphosphate
BCC carcinome basocellulaire
BER rparation par excision de base (base excision repair)
C cytosine ou cytidine (en fonction du contexte)
CAT catalase
CLHP chromatographie liquide haute performance
CMM mlanome malin cutan
CpC dinuclotide cytosine-cytosine (dans l'ADN)
CpG dinuclotide cytosine-guanine (dans l'ADN)
CpT dinuclotide cytosine-thymine (dans l'ADN)
CV% coefficient de variation
dA 2'-dsoxyadnosine
-ala acide -aminolvulinique
dC 2'-dsoxycytidine
dG 2'-dsoxyguanosine
DOVA acide 4,5-dioxovalrique
dT 2'-dsoxythymidine ou thymidine
EC dtection lectrochimique
EDTA thylnediaminettraactate
EMS thylmthanesulfonate
ESCODD European Committee for Oxidative DNA Damage
FAD flavine-adnine-dinuclotide
FaPy formamidopyrimidine
G guanine ou guanosine (en fonction du contexte)
GC chromatographie gazeuse
GC-MS chromatographie gazeuse couple une dtection de masse
GSH glutathion rduit
iv
GSSG glutathion oxyd
GSH-Px glutathion peroxydase
HH protine sonic hedgehog
HIV virus d'immunodficience humaine
HMB hydroxymthylbilane
HNE 4-hydroxy-2-nonnal
HpD driv d'hmatoporphyrine
HPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransfrase
IL interleukine
LC-MS-MS chromatographie liquide couple 2 dtecteurs de masse placs en tandem
m moyenne
MDA malondialdhyde
MED dose rythmale minimale (minimal erythemal dose)
MSH mlanotropine
m-THPC meta-(ttrahydroxyphnyl)-chlorine
Microculture Tetrazolium Test
n.d. non dtermin
NADH nicotinamide adnine dinuclotide (forme rduite)
NADPH nicotinamide adnine dinuclotide phosphate (forme rduite)
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
NER rparation par excision de nuclotides (nucleotide excision repair)
NF-B facteur nuclaire B
PG prostaglandine
PPIX protoporphyrine IX
PTC protine patched
ROS espce ractive de l'oxygne (reactive oxygen species)
s cart talon
s% coefficient de variation
SCC carcinome spinocellulaire
SEM erreur standard de la moyenne
SMO protine smooth
SOD superoxyde dismutase
SPF facteur de protection solaire
T thymine
TNF facteur de ncrose tumorale (tumoral necrosis factor)
TpT dinuclotide thymine-thymine (dans l'ADN)
UDP uridine-5'-diphosphate
UV - UVA
- UVB
- UVC
ultraviolet - 315 400 nm
- 290 315 nm
- 100 290 nm
v
TABLE DES MATIERES

1. Introduction ............................................................................................................................ 1
1.1 Intrt et buts du travail .................................................................................................... 2
1.2 Les dommages l'ADN.................................................................................................... 3
1.2.1 Introduction ............................................................................................................... 3
1.2.2 Les altrations spontanes de l'ADN......................................................................... 5
1.2.3 Les altrations environnementales de l'ADN : les agents physiques ........................ 9
1.2.4 Les altrations environnementales de l'ADN : les agents chimiques ...................... 14
1.2.5 La rparation des dgts l'ADN............................................................................ 17
1.2.6 La structure de la chromatine et les dgts l'ADN ............................................... 22
1.3 Les espces ractives de l'oxygne et les dommages oxydatifs l'ADN....................... 26
1.3.1 Introduction ............................................................................................................. 26
1.3.2 Proprits fondamentales de l'oxygne ................................................................... 26
1.3.3 Les principales sources physiologiques d'espces ractives de l'oxygne .............. 31
1.3.4 Protections cellulaires antioxydantes....................................................................... 34
1.3.5 Le stress oxydatif..................................................................................................... 35
1.3.6 Dgts oxydatifs aux lipides et aux protines ......................................................... 36
1.3.7 Dgts oxydatifs aux acides nucliques: Gnralits.............................................. 38
1.3.8 Dgts oxydatifs aux acides nucliques: les bases oxydes.................................... 41
1.3.9 Dgts oxydatifs aux acides nucliques: les autres types de lsions....................... 47
1.3.10 Stress oxydatif et pathologies................................................................................ 49
1.3.11 Les biomarqueurs du stress oxydatif ..................................................................... 49
1.4 La lumire et la peau ...................................................................................................... 54
1.4.1 La lumire................................................................................................................ 54
1.4.2 La peau humaine...................................................................................................... 56
1.4.3 Le rayonnement solaire ........................................................................................... 58
1.4.4 Le soleil et la peau................................................................................................... 60
1.5 La mutagense et la carcinogense en rapport avec les dommages l'ADN................. 71
1.5.1 La carcinogense, un processus multi-tapes.......................................................... 71
1.5.2 Lsions l'ADN et mutations.................................................................................. 73
1.5.3 Le gne et la protine p53 ....................................................................................... 75
1.5.4 La mutagnicit des bases oxydes ......................................................................... 79
1.5.5 La photocarcinogense ............................................................................................ 80
2. Matriel et mthodes ............................................................................................................ 90
2.1 Mthodes et Modles biologiques utiliss in vitro......................................................... 91
2.1.1 Ractifs et matriel .................................................................................................. 91
2.1.2 Lignes cellulaires et conditions de culture............................................................. 91
2.1.3 Mesures de phototoxicit au moyen du test MTT (Microculture Tetrazolium
Test) .................................................................................................................................. 94
2.2 Dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine par chromatographie liquide haute
performance couple une dtection lectrochimique......................................................... 98
2.2.1 Dtecteur ampromtrique et coulomtrique .......................................................... 98
2.2.2 Ractifs et matriel .................................................................................................. 99
2.2.3 Dosage de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire........................................................ 103
vi
2.3 Induction et photoactivation des porphyrines endognes............................................. 105
2.3.1 Ractifs et matriel ................................................................................................ 105
2.3.2 Mthode d'induction des porphyrines.................................................................... 113
2.3.3 Dosage fluorimtrique des porphyrines intra- et extra-cellulaires ........................ 113
2.3.4 Dosage des protines ............................................................................................. 114
2.3.5 Examen en microscopie de fluorescence............................................................... 115
2.3.6 Irradiation UVA et visible..................................................................................... 115
2.4 L'Essai "Comte" (single cell gel electrophoresis) ...................................................... 116
2.4.1 Ractifs et matriel ................................................................................................ 116
2.4.2 Mode opratoire..................................................................................................... 118
2.4.3 Mesure des comtes............................................................................................... 119
2.5 Mthodes statistiques.................................................................................................... 122
3. Rsultats et Discussion : Dveloppement et validation du dosage de la 8-oxo-7,8-
dihydro-2'-dsoxyguanosine dans l'ADN cellulaire ............................................................... 123
3.1 Introduction : les mthodes de dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine
(8-oxodG) ........................................................................................................................... 124
3.2 Dveloppement du dosage de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire par CLHP
couple une dtection lectrochimique............................................................................ 125
3.2.1 Choix des conditions chromatographiques............................................................ 125
3.2.2 Digestion enzymatique .......................................................................................... 130
3.2.3 Extraction de l'ADN cellulaire .............................................................................. 134
3.3 Validation de la mthode analytique ............................................................................ 136
3.3.1 Spcificit.............................................................................................................. 136
3.3.2 Linarit................................................................................................................. 143
3.3.3 Exactitude .............................................................................................................. 174
3.3.4 Prcision ................................................................................................................ 184
3.3.5 Sensibilit .............................................................................................................. 191
3.3.6 Seuils de dtection et de quantification................................................................. 196
3.3.7 Robustesse ............................................................................................................. 198
3.3.8 Stabilit des analytes ............................................................................................. 200
3.3.9 Validation inter-laboratoires.................................................................................. 204
3.4 Discussion et conclusion .............................................................................................. 205
3.4.1 Intrt du dosage de la 8-oxodG............................................................................ 205
3.4.2 Intrt de la mthode valide................................................................................. 210
3.4.3 Conclusions ........................................................................................................... 211
4. Rsultats et Discussion : Photoactivation des porphyrines endognes et induction
de 8-oxodG............................................................................................................................. 212
4.1 Induction des porphyrines endognes........................................................................... 213
4.1.1 Gnralits sur les porphyrines ............................................................................. 213
4.1.2 Rsultats : Spectroscopie de fluorescence............................................................. 219
4.1.3 Rsultats : Cintique d'induction........................................................................... 226
4.1.4 Rsultats : Microscopie de fluorescence ............................................................... 227
4.1.5 Discussion et conclusion ....................................................................................... 228
4.2 Rsultats : Porphyrines et Dgts Photodynamiques aux acides nucliques................ 229
4.2.1 Induction de bases oxydes ................................................................................... 229
4.2.2 Paramtres impliqus dans la photooxydation de l'ADN...................................... 231
vii
4.3 Rsultats : Tests de cytotoxicit MTT.......................................................................... 235
4.4 Discussion..................................................................................................................... 237
4.4.1 La problmatique de la carcinogense solaire, des UVA et de la 8-oxodG.......... 237
4.4.2 Porphyrines et dommages l'ADN....................................................................... 241
4.4.3 Implications possibles de l'effet photodynamique mis en vidence...................... 245
4.5 Conclusion.................................................................................................................... 247
5. Rsultats et Discussion : Essai "comte"et photoactivation des porphyrines endognes.. 248
5.1 L'essai comte............................................................................................................... 249
5.1.1 Principe.................................................................................................................. 249
5.1.2 Mcanisme............................................................................................................. 250
5.1.3 Applications de l'essai comte............................................................................... 250
5.2 La place de l'essai comte dans les tests de gnotoxicit ............................................. 251
5.2.1 Gnotoxiques et tests de gnotoxicit ................................................................... 251
5.2.2 Les diffrents tests de gnotoxicit ....................................................................... 252
5.3 Validation de l'essai comte ......................................................................................... 256
5.3.1 Reproductibilit ..................................................................................................... 257
5.3.2 Mise en vidence de quelques effets gnotoxiques dcrits ................................... 264
5.3.3 Diffrence de sensibilit entre les mesures comte et CLHP................................ 270
5.3.4 Conclusion............................................................................................................. 271
5.4 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Reproductibilit inter-
lectrophorses et mise en vidence d'un effet ................................................................... 272
5.4.1 Protocoles mis en oeuvre....................................................................................... 272
5.4.2 Etude de reproductibilit ....................................................................................... 273
5.4.3 Analyse de tendance .............................................................................................. 301
5.5 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Utilisation
d'endonuclases spcifiques. .............................................................................................. 310
5.5.1 Les endonuclases utilises ................................................................................... 310
5.5.2 Protocole................................................................................................................ 311
5.5.3 Purines et pyrimidines oxydes ............................................................................. 312
5.5.4 Photoproduits dimres ........................................................................................... 317
5.6 Discussion : la lumire et l'essai comte ...................................................................... 320
5.6.1 Formation de cassures de chanes par une irradiation lumineuse.......................... 320
5.6.2 Dgts oxydatifs, dimres de pyrimidine et irradiation lumineuse ....................... 322
5.6.3 Essai comte et bronzage artificiel ........................................................................ 323
5.6.4 Essai comte et effet photodynamique des porphyrines........................................ 324
5.7 Conclusions .................................................................................................................. 325
5.7.1 L'essai comte........................................................................................................ 325
5.7.2 Effet photodynamique des porphyrines endognes............................................... 327
6. Rsultats et Discussion : Essai "comte"et photoactivation des porphyrines
endognes - Application une ligne de mlanome humain ................................................. 328
6.1 Induction des porphyrines endognes........................................................................... 329
6.1.1 Spectroscopie de fluorescence............................................................................... 329
6.1.2 Cintique d'induction de la fluorescence intracellulaire........................................ 331
6.1.3 Microscopie de fluorescence ................................................................................. 331
6.1.4 Conclusion............................................................................................................. 333
viii
6.2 Cytotoxicit du traitement photodynamique ................................................................ 333
6.3 Rsultats de l'essai comte............................................................................................ 335
6.3.1 Mise en vidence d'un effet gnotoxique de rfrence.......................................... 335
6.3.2 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Analyse de tendance.... 335
6.4 Discussion et conclusions............................................................................................. 340
6.4.1 Mlanocytes et cassures de chanes UV-induites.................................................. 340
6.4.2 Effet pro-oxydant des mlanines ? ........................................................................ 341
6.4.3 Mlanome et porphyrines ...................................................................................... 342
6.4.4 Conclusions ........................................................................................................... 343
7. Conclusions gnrales ........................................................................................................ 344
7.1 Propos du travail........................................................................................................... 345
7.2 Validation des mthodes analytiques ........................................................................... 345
7.2.1 La mthode de dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine .................. 345
7.2.2 L'essai comte........................................................................................................ 345
7.3 Effet photodynamique des porphyrines endognes...................................................... 346
7.4 Conclusions .................................................................................................................. 347
8. Bibliographie ...................................................................................................................... 348

ix
1. Introduction

1
1.1 INTERET ET BUTS DU TRAVAIL
Les donnes acquises au cours des 15 dernires annes montrent que l'ADN est une cible
primordiale de nombreux agents chimiques et physiques. Les mcanismes de dfense
cellulaire sont en fait suppls par les mcanismes de rparation de l'ADN et ce, dans une
proportion auparavant insouponne. Il est prsent certain que, dans le processus de
carcinogense, l'induction de nuclotides modifis, au potentiel mutagne tabli, soit une des
causes majeures de la phase d'initiation.
L'tiologie des cancers cutans non-mlanomes apparat lie l'exposition solaire et les
UVB (290-315 nm) en semblent la cause principale; leur nergie est directement absorbe par
les chromophores nuclotidiques pour induire des dimres cyclobutanes et des photoproduits
(6-4), hautement mutagnes. La contribution des UVA (315-400 nm) au processus
cancrigne n'est cependant pas ngligeable, la fluence solaire augmentant considrablement
avec la longueur d'onde. Comme l'ADN n'absorbe quasi pas dans les UVA, les proprits
mutagnes de cette bande de longueurs d'onde seraient en fait mdies par des espces
ractives de l'oxygne, induites par la photoactivation de molcules endognes non encore
identifies. Bien que moins efficaces d'un facteur 1000 par rapport aux UVB, les UVA sont
galement un carcinogne complet, la fois initiateur et promoteur; ce seraient mme les
principaux responsables des mlanomes.
Nous proposons d'examiner dans 2 modles cellulaires in vitro si les porphyrines
endognes sont des photosensibilisants capables de mdier un stress oxydatif au niveau de
l'ADN. Aprs induction de leur synthse et photoactivation par une source UV identique
celles employes dans les salons de beaut, deux paramtres de l'oxydation de l'ADN ont t
dtects et quantifis, (i) une base oxyde, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine, par
chromatographie liquide haute performance avec dtection ampromtrique; et (ii) la
proportion de cassures de chanes et de sites abasiques, par essai comte.
Ce travail tente de mettre en vidence un mcanisme possible d'initiation de la
cancrogense cutane par le soleil, afin que les informations obtenues puissent contribuer
une prvention plus efficace de ce problme de sant publique, devenu majeur dans nos
socits obsdes par le soleil et le bronzage.

2
1.2 LES DOMMAGES A L'ADN
1.2.1 Introduction
L'ADN est habituellement peru comme une biomolcule stable, support inaltrable de
l'information gntique, qui se transmet fidlement de gnration en gnration. La ralit est
cependant beaucoup plus complexe. L'ADN est en fait une molcule trs ractive, la
structure primaire dynamique et sujette des modifications constantes. Sa rplication elle-
mme est loin d'tre exempte d'erreurs et la fidlit de l'information gntique transmise est
due bien plus d'extraordinaires mcanismes de rparation et de correction d'erreurs qu'
l'intangibilit de la molcule elle-mme.
A ct de transformations de grande chelle, comme la transposition de gnes, l'ADN
subit des altrations au niveau des nuclotides, la fois dans leur squence et dans leur
structure chimique. Certaines erreurs peuvent tre dues l'instabilit inhrente aux liens
chimiques spcifiques des nuclotides, d'autres peuvent tre introduites par les mcanismes de
rplication, de recombinaison et de rparation. L'ADN est galement sensible certains
agents physiques, certains mtabolites normaux de l'organisme ou de formes vivant en
symbiose avec celui-ci, ainsi qu' de multiples composs chimiques, pour la plupart d'origine
environnementale.
Toutes les modifications
1
de la structure molculaire du matriel gntique sont
considres sous le terme collectif de "dommages l'ADN" et sont habituellement rparties
en deux classes majeures, "dommages spontans" et "dommages environnementaux". La
frontire entre ces deux classes est cependant floue et certaines modifications chimiques
"spontanes" ne peuvent tre distingues de celles induites par interaction avec des agents de
l'environnement. Le terme "spontan" signifie parfois simplement qu'un coupable
environnemental n'a pu tre mis en vidence.
Bien que tous les composants primaires de la molcule ADN (bases, sucres et liens
phosphodiesters) soient susceptibles d'tre endommags, cette introduction sera focalise sur
les bases qui constituent le support signifiant de l'information (Figure 1.2-1).
Les ractions qui seront voques sont gnralement plus efficientes pour l'ADN simple-
brin que pour l'ADN duplex. Le Tableau 1.2-1 prsente un exemple de ce phnomne pour

1
Note : le plan de cette Section 1.1 est bas en partie sur celui adopt dans l'ouvrage "DNA repair and
mutagenesis" (Friedberg et al., 1995)
3
Figure 1.2-1 : Les quatre bases principales de l'ADN


N
N
N
N
NH
2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Adnine
H
2
N
HN
N
N
N
Guanine
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
HN
N
O
CH
3
O
Thymine
1
2
3
4
5
6
N
N
NH
2
O
Cytosine
1
2
3
4
5
6
Purines Pyrimidines


des ractions spontanes que peuvent subir les bases. Dans une cellule vivante, la plupart du
gnome est probablement en permanence dans une configuration double-brin, si ce n'est lors
de dnaturations transitoires localises, par exemple lors des processus de rplication, de
recombinaison ou de transcription. Cet ADN temporairement dnatur pourrait donc tre un
site privilgi pour une raction chimique ou physique (Halliwell, 1998a; Halliwell et
Gutteridge, 1999; Marnett, 2000).

Tableau 1.2-1 : Temps requis pour une seule raction spontane (pH 7.4 et 37C)

Temps pour une raction (h)
(a)

Raction ADN simple-brin
(2 x 10
6
bases
(b)
)
ADN double-brin
(1 x 10
6
paires de bases)
Dpurination 2.5 10
Dpyrimidination 50.8 200
Dsamination de la cytosine 2.8 700
Dsamination de l'adnine 140 n.d.

(a) Calcul partir des constantes de vitesse des ractions
(b) Rappelons que le gnome d'une cellule mammifre contient environ 3 x 10
9
paires
de bases (Sambrook et al., 1989)

(Friedberg et al., 1995)
4
Il faut cependant remarquer que les phnomnes de compactage de l'ADN dans les
nuclosomes ainsi que le reploiement de la chromatine influencent l'ensemble de ces ractions
(cf 1.2.6.2 ).
1.2.2 Les altrations spontanes de l'ADN
1.2.2.1 Le msappariement de base ("mismatch")
Le msappariement de bases lors de la synthse semiconservatrice reprsente la principale
source d'altration de l'ADN lors du mtabolisme normal. La diffrence d'nergie libre entre
l'appariement avec la base complmentaire et le msappariement est quivalente l'nergie
d'un lien hydrogne, soit seulement 20kJ/mole. En l'absence d'autres facteurs cellulaires, ces
facteurs nergtiques correspondraient une frquence d'erreur potentielle de 1 10% par
nuclotide; la frquence de mutation spontane lors de la rplication est en ralit moindre de
6 9 ordres de grandeur logarithmique. En fait, comme dmontr chez Escherichia coli, le
rplisome, un complexe entre ADN polymrases et protines accessoires, apporte une
contribution significative la fidlit de rplication en combinant une slection stricte des
bases une relecture-excision des nuclotides nouvellement insrs; les bases voisines
semblent galement jouer un rle dans ces mcanismes de relecture (Nelson et Cox, 2000).
Les cellules eucaryotes contiennent au moins 5 ADN polymrases
2
qui ont galement une
fonction performante de relecture-excision des bases nouvellement insres. De plus,
l'utilisation d'amorces ARN pour l'initiation de la synthse permettrait d'assurer l'intgrit du
message gntique, de par l'excision ultrieure des squences d'initiation, susceptibles de
contenir un nombre lev d'erreurs (Nelson et Cox, 2000).
1.2.2.2 Le rarrangement tautomre des bases
Chacune des quatre bases peut subir un rarrangement transitoire spontan de ses liaisons
pour former un isomre de structure ou tautomre, ce qui altre sa facult former des liens
hydrognes (les fonctions amines, peuvent se rarranger sous leur forme tautomre rare imine
NH et les fonctions ctones peuvent passer en configuration nol; cf Figure 1.2-2). D'autres
causes possibles de msappariement ont t proposes, comme une rotation de 180 des bases
autour du lien glycosidique (passage en configuration syn) ou l'inclusion d'une molcule d'eau
pour jouer un rle de pont.

2
Les polymrases dmarreraient la rplication de l'ADN alors que les polymrases , et peut-tre , en
continueraient la synthse. La polymrase est largement implique dans les phnomnes de rparation et la ,
prsente dans les mitochondries, assure la rplication de l'ADN mitochondrial (Halliwell et Gutteridge, 1999).
5
Figure 1.2-2 : Msappariements induits par les formes tautomres des bases


(Friedberg et al., 1995)

Lors de la rplication, il est possible qu'une base, qui se trouverait sous une forme
tautomre rare dans la chane d'ADN rplique, induise un msappariement et donc une
mutation ponctuelle dans la chane fille. La relle contribution de ces scnarios aux altrations
spontanes de l'ADN reste cependant inconnue (Venkateswarlu et Leszczynski, 1998).
1.2.2.3 La dsamination de bases
Quatre des bases normales de l'ADN (cytosine, adnine, guanine, mais aussi la 5-
mthylcytosine) portent des groupes amines exocycliques. Une dsamination spontane, pH-
et temperature-dpendante, peut se produire, rsultant en la conversion de la base affecte en,
respectivement, uracile, hypoxanthine, xanthine et thymine (Friedberg et al., 1995; Nelson et
Cox, 2000). Certaines de ces lsions sont mal-codantes, elles peuvent rsulter en
l'incorporation d'une base non correcte lors de la rplication semiconservatrice. Pour la
cytosine, il a t dmontr que la dsamination peut tre augmente par des facteurs striques
ou chimiques tels que les dimres cyclobutanes UV-induits, les agents intercalants ou la
6
prsence d'une base msapparie ou alkyle en face de la cytosine (Viswanathan et al., 1999).
De tels facteurs affectent vraisemblablement les autres bases d'une faon similaire.
Les dsaminations spontanes peuvent galement tre catalyses par certains agents
chimiques, notamment le NO (Wink et al., 1991).

Figure 1.2-3 : Principaux produits forms partir de la dsamination des bases de l'ADN
N
N
N
N
NH
2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Adnine
H
2
N
HN
N
N
N
Guanine
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
HN
N
O
CH
3
O
Thymine
N
N
NH
2
O
Cytosine
1
2
3
4
5
6
HN
N
NH
2
O
5-mthyl-Cytosine
1
2
3
4
5
6
N
N
N
N
O
Hypoxanthine
O
HN
N
H
N
N
Xanthine
O
HN
N
O
O
Uracile
CH
3


D'aprs (Friedberg et al., 1995)

1.2.2.4 Perte de bases - Dpurination et dpyrimidination
Ces ractions sont bien connues en milieu acide mais mal caractrises en milieu neutre.
Elles se produiraient par protonation de la base, suivie d'un clivage du lien glycosidique, ce
qui rsulte en un site abasique. Le lien phosphodiester se rompt alors lentement en donnant
naissance une cassure de chane. De tels sites abasiques sont sensibles un traitement par un
alcali fort qui gnre des lsions simple-brins pouvant tre mises en vidence; ces sites sont
7
dits alcali-labiles. Chez les mammifres, les pertes ont t extrapoles 10000 purines et
plusieurs centaines de pyrimidines par cellule par cycle cellulaire (cf Tableau 1.2-1).
1.2.2.5 Dommages oxydatifs
L'attaque par les espces ractives de l'oxygne (reactive oxygen species ou ROS) est une
source majeure de dgts spontans l'ADN mais aussi aux autres biomolcules que sont les
lipides, les protines et les glucides.
Les radicaux oxygns ont des sources intra- et extracellulaires varies. Les "fuites"
d'lectrons associes la rduction de l'oxygne en eau au long de la chane respiratoire
mitochondriale en constituent certainement la source intracellulaire principale. Les ractions
peroxysomales et microsomales, la synthse enzymatique du NO

, le mtabolisme associ la
phagocytose, certaines enzymes oxydantes et certaines ractions d'auto-oxydation sont
d'autres sources endognes d'espces ractives de l'oxygne (Sahnoun et al., 1997; Halliwell
et Gutteridge, 1999). Le Tableau 1.2-2 dtaille la structure des diffrents ROS ainsi que leur
temps de demi-vie; celui-ci se corrle bien entendu la ractivit de la molcule.

Tableau 1.2-2 : Structure des principales espces ractives de l'oxygne

Espces ractives de l'oxygne Temps de demi-vie 37C (sec)
Radicalaires

O
2
-
anion superoxyde 10
-6
(destruction enzymatique)
HO
2

radical hydroperoxyle faible (destruction enzymatique)

OH radical hydroxyle 10
-9
ROO

radical peroxyle de 10
-2
quelques secondes
RO

radical alkoxyle 10
-6

Non-radicalaires

H
2
O
2
peroxyde d'hydrogne faible (destruction enzymatique)
HOCl acide hypochloreux faible (destruction enzymatique)
1
O
2
oxygne singulet 10
-5
- 10
-6

ONOO
-
peroxynitrite 0.05 1
O
3

ozone n.d.
O
2
oxygne molculaire > 10
2
ROOH peroxyde de lipide > 10
2


(Sies, 1993; Yu, 1993; Halliwell et Gutteridge, 1999)

8
L'attaque radicalaire de l'ADN produit un ensemble complexe de lsions. L'attaque du
squelette osidique mne des cassures de chanes et des pertes de bases; l'attaque des bases
puriques et pyrimidiques rsulte en bases oxydes qui peuvent soit bloquer la rplication, soit
mener des msappariements, donc des mutations ponctuelles. Les radicaux oxygns
peuvent aussi agir en facteurs clastogniques, c'est--dire causer des fragmentations de
chromosomes. Il semble en outre que les ROS puissent induire dans les cellules mammifres
un facteur clastognique diffusible et transmissible, un mlange complexe de substances
capable de dclencher ce phnomne dans d'autres cellules que celles touches par les espces
ractives (Friedberg et al., 1995; Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999; Marnett,
2000).
Les sources extracellulaires de ROS incluent les radiations ionisantes et lumineuses
(principalement les UVA), la chaleur ainsi que de nombreux composs chimiques.
En raison de son importance pour notre travail, ce sujet sera dvelopp de manire
approfondie dans la section 1.2.
1.2.3 Les altrations environnementales de l'ADN : les agents physiques
Depuis le dbut de la vie sur notre plante, les radiations ionisantes et ultraviolettes ont t
une source de dgts l'ADN des organismes vivants et probablement un des moteurs mmes
de leur volution. L'utilisation relativement rcente des radiations ionisantes des fins
mdicales, nergtiques et militaires en augmente cependant considrablement le risque
d'exposition environnementale. De mme, la modification des styles de vie et le recours au
bronzage artificiel accroissent l'exposition aux UV d'une grande partie de la population.
1.2.3.1 Les radiations ionisantes
1.2.3.1.1 Source des dgts l'ADN
Ces radiations causent des dommages alatoires tous les composants cellulaires et
induisent des dgts considrables l'ADN, qui peuvent tre de type direct ou indirect. Alors
que les effets directs rsultent de l'interaction directe entre la radiation et l'ADN, les effets
indirects sont dus l'interaction entre l'ADN et diverses molcules excites ou ionises
induites par le transfert d'nergie. En effet, dans les cellules vivantes, l'ADN se trouve dans un
environnement compos d'eau, d'ions et de nombreuses molcules qui sont autant de sources
possibles d'espces excites. Cette multiplicit de ractifs et de mcanismes de ractions
potentiels explique la grande diversit de lsions qui peuvent tre induites (Halliwell, 1998b).
9
De par la prdominance de l'eau dans les systmes biologiques, les espces ractives
principales
3
sont formes par sa radiolyse (80 % de l'nergie ionisante) :

2 H
2
O H
2
O
+
+ e
-
+ H
2
O*

H
2
O
+
+ H
2
O

OH + H
3
O
+

H
2
O
*

OH + H

OH +

OH H
2
O
2

e
-
aq
+ O
2
O
2

-

2 O
2

-
+ 2H
+

O
2
+ H
2O2


Rappelons que le peroxyde d'hydrogne gnre des radicaux hydroxyles par la raction de
Fenton, catalyse par les mtaux :

H
2
O
2

M
n+
M
(n +1) +

OH + OH
-


Et, en fait, la majorit des dgts indirects l'ADN apparat mdie par les radicaux
hydroxyles. Ceux-ci seraient responsables d'environ 65 % des dgts contre 35 % dus
l'ionisation directe de la molcule (Halliwell, 1998b; Halliwell et Gutteridge, 1999). De
nombreux aspects qui seront voqus dans le chapitre consacr aux radicaux libres
s'appliquent donc aux dommages radio-induits.
1.2.3.1.2 Dgts aux bases et au squelette osidique
En ce qui concerne les bases, il y a apparition de bases oxydes, de dimres et de drivs
cycliss (Frenkel et al., 1981; Dizdaroglu, 1985; Halliwell, 1998b). La formation de
dommages groups est caractristique des lsions radio-induites; il semble qu'un seul impact
nergtique puisse gnrer plusieurs ractions radicalaires dans le voisinage proche. La
densit locale de dgts dpend du rayonnement, mais galement des dimensions spatiales des
molcules d'ADN compactes. Une base altre peut galement rsulter en une labilisation,
puis une rupture de la liaison base-sucre, gnrant un site abasique alcali-labile.
Les dommages la chane osidique de l'ADN rsultent en cassures simple-brins et double-
brins, ces dernires contribuant majoritairement l'effet ltal des radiations (Sahnoun et al.,
1997; Halliwell, 1998b; Halliwell et Gutteridge, 1999).
10

3
Note : H
2
O* est un tat excit de l'eau
Bien que les tudes manquent sur le sujet, il est possible que les dimrisations de bases
permettent la formation de liens croiss entre brins d'ADN complmentaires; de mme, la
gnration de dimres thymidine-tyrosine pourrait entraner des liaisons ADN-protines.
1.2.3.2 Les radiations UV
L'influence de la lumire UV, ressentie par tous les organismes la surface de la terre, a
de formidables consquences biologiques, la fois favorables et nfastes.
Le spectre UV est conventionnellement divis en 3 zones, appeles UVC (100 290 nm),
UVB (290 315 nm) et UVA (315 400 nm); en raison de l'absorption drastique des UVC
par les couches suprieures de l'atmosphre, ceux-ci sont pratiquement absents du
rayonnement solaire la surface de la terre. Bien que certains auteurs fixent la limite entre
UVB et UVA 320 nm (cf 1.3.4.2.7), le prsent travail adopte la limite recommande par la
Commission Internationale de l'Eclairage, soit 315 nm (Commission Internationale de
l'Eclairage, 1970).
Les lsions les plus importantes produites par une irradiation UVC ou UVB sont
certainement les dimres pyrimidines et les photoproduits 6-4 (Figure 1.2-4) (Strickland et al.,
1988). Ces modifications de bases contribueraient significativement. la carcinogense
solaire dont la problmatique sera aborde en dtails dans les sections 1.3 et 1.4.

Figure 1.2-4 : Principaux photoproduits forms partir de pyrimidines adjacentes


NH
N
O
O
S
NH
O
O
NH
N
O
O
NH
N
O
O
UVC
UVB
Thymines adjacentes
Dimre cyclobutane
thymine-thymine
NH
N
O
O
NH
N
NH
2
O
NH
N
O
O
N
N
O
UVC
UVB
Thymine et cytosine
adjacentes
Photoproduit (6-4)
thymine-cytosine
HO
S
P
N
P
S S
P P
S S
P P
S S
P P
NH
N
O
N
313 nm
Dewar
pyrimidone
HO
S S
P P
N
O
O


Adapt de (Bootsma et al., 2001)
11
1.2.3.2.1 Les dimres pyrimidines cyclobutanes
Quand l'ADN est expos des radiations proches de son maximum d'absorption,
~ 260 nm (UVC), une pyrimidine absorbe un photon, passe un tat excit et ragit ensuite
avec une pyrimidine adjacente en formant une structure cyclique 4 atomes; celle-ci rsulte
de la saturation de leurs doubles liaisons respectives en 5,6 (Beissert et Granstein, 1995). La
structure forme par cette cycloaddition photochimique est appele un dimre dipyrimidique
ou encore un dimre pyrimidine cyclobutane. Bien qu'il y ait 12 formes isomres thoriques
possibles, il ne s'en forme que 4 en quantits significatives, dans les configurations cis-syn,
cis-anti, trans-syn et trans-anti (Khattak et Wang, 1972). Les possibilits de reploiement de
l'ADN simple-brin permettent la formation de dimres entre pyrimidines non-adjacentes.

Figure 1.2-5 : Deux des principaux isomres de dimres dipyrimidiques et leur orientation
tridimensionnelle dans l'ADN de forme B

(Friedberg et al., 1995)

Le processus de cyclisation est influenc par la composition et la squence en bases de
l'ADN et n'est donc pas un phnomne entirement alatoire; les cytosines mthyles sont un
site prfrentiel de cette raction (Mitchell, 2000). La cyclisation est rversible mais dplace,
proportionnellement l'intensit du rayonnement UV, vers la formation du dimre et ce
jusqu' un tat d'quilibre .
Ces dimres sont traditionnellement considrs encombrants et strictement non-codants,
12
ce qui conduirait une dformation importante de la double hlice et l'arrt obligatoire de la
rplication. Des tudes thermodynamiques et spectroscopiques fines ont cependant montr
qu'un dimre dithymine cys-syn n'introduit que peu de distorsions dans l'hlice de l'ADN-B et
peut mme s'apparier de manire correcte avec 2 adnines; le mme dimre en configuration
trans-syn introduit quant lui d'importantes perturbations dans la chane de l'ADN (Taylor et
al., 1990).
1.2.3.2.2 Les lsions pyrimidine(6-4)pyrimidone
Une irradiation UV de l'ADN peut galement induire une lsion alcali-labile en une
cytosine, et beaucoup plus rarement en une thymine, localise en 3' d'une pyrimidine; il s'agit
d'un photoproduit (6-4), appel dimre pyrimidine(6-4)pyrimidone, une dipyrimidine non-
cyclobutane. Dans l'ADN irradi par les UV se retrouvent des produits (6-4) de TC, CC, plus
rarement TT, mais jamais CT. Comme pour les dimres cyclobutanes, les cytosines mthyles
sont un site prfrentiel de cette raction (Mitchell, 2000). Ces photoproduits (6-4) sont
gnrs de manire moins efficace que les dimres de pyrimidine (~15 %) (Peak et Peak,
1989) mais les frquences relatives varient considrablement suivant les squences d'ADN
(de 5.4 % 276 %) (Mitchell et Nairn, 1989). Ils induisent une bien plus importante distorsion
de la double hlice. Une irradiation 313 nm de ces produits gnre un isomre Dewar
pyrimidinone (Figure 1.2-4) (Mitchell et Nairn, 1989).
1.2.3.2.3 Les hydrates de pyrimidines
Sous UV, l'addition d'une molcule d'eau sur la double liaison 5-6 de la cytosine gnre un
driv 5,6-dihydro-6-hydroxy, l'hydrate de cytosine. La stabilit de cet hydrate est nettement
accrue lorsque la base est incorpore dans l'ADN et cette lsion pourrait tre le photoproduit
monomre majeur de la dsoxycytosine. Ce driv peut subir une dsamination hydrolytique
en uracile. Le photoproduit 5-methylcytosine hydrate peut galement subir une dsamination
en thymidine hydrate instable qui se transformerait en thymine, gnrant une mutation
ponctuelle (Vairapandi et Duker, 1994).
1.2.3.2.4 Les thymine glycols
Une saturation photochimique de la double liaison 5-6 de la thymine rsulte en thymine
glycols, un ensemble de bases oxydes majeures formes notamment par les radiations
ionisantes (cf Section 1.2).
1.2.3.2.5 Les lsions de purines
Des lsions complexes, dont certaines ne sont pas encore caractrises, peuvent tre
induites dans des purines, particulirement si elles sont en position 3' de deux ou plusieurs
13
pyrimidines. Ces bases modifies sont reconnues par des enzymes de rparation, ce qui
suggrerait leur importance biologique (Friedberg et al., 1995).
1.2.3.2.6 Les liens croiss et les cassures de chanes
Une irradiation UVC peut gnrer quelques cassures de chanes, qui semblent avoir peu
de consquences biologiques, ainsi que des liens croiss ADN protines; si la molcule
d'ADN est l'tat sec, trs fortement compacte ou dans des conformations trs particulires,
les UVC peuvent galement induire des liens croiss ADN ADN.
Dans les cellules eucaryotes, l'ADN nuclaire est en contact troit avec des protines
chromosomales, au sein de la chromatine; une telle proximit des protines favorise
l'tablissement de liens croiss ADN protines. La nature chimique de ces liens est encore
mal connue mais certains photosensibilisants peuvent catalyser ce type de raction.
La frquence des cassures de chanes et des liens croiss ADN protines augmente de
manire drastique avec la longueur d'onde.
1.2.3.2.7 Les ractions photosensibilises
A ct de toutes les photolsions de l'ADN qui rsultent de l'absorption directe des
photons par les bases, des ractions de photosensibilisation peuvent se produire. Dans ce cas,
les photons sont absorbs par d'autres espces molculaires, les photosensibilisants. Ceux-ci
transfrent ensuite leur nergie, soit directement aux bases nucliques (Photosensibilisation
de Type I) (Lamola et Yamane, 1967), soit l'oxygne, rsultant notamment en oxygne
singulet, une raction appele effet photodynamique (Photosensibilisation de Type II)
(Halliwell et Gutteridge, 1999). Le spectre possible de dommages oxydatifs l'ADN induits
par ces ractions de type II sera prsent dans la section 1.2; les mcanismes de
photosensibilisation seront dtaills dans la section 1.3.
1.2.4 Les altrations environnementales de l'ADN : les agents chimiques
Aprs de premires tudes vises militaires et chimiothrapeutiques, le domaine des
altrations chimiques l'ADN a connu une forte extension, probablement motive par les
exigences du public devenu mfiant l'encontre des risques carcinognes et mutagnes
environnementaux.
La formation de liens covalents entre les bases de l'ADN et diffrents types de composs
conduit un type de lsions appeles les adduits l'ADN. Ces adduits peuvent impliquer des
constituants cellulaires comme les protines ou des intermdiaires mtaboliques, mais aussi
de nombreux xnobiotiques parmi lesquels des mdicaments, des cosmtiques, des polluants
14
ou encore des composs issus de l'alimentation. Quelques exemples seront abords, soit pour
leur reprsentativit, soit pour leur importance dans ce travail.
1.2.4.1 Les agents alkylants
Les alkylants sont des composs lectrophiles de structures varies qui ont une affinit
pour les centres nuclophiles des macromolcules organiques. La plupart de ces composs
sont des carcinognes reconnus. Cependant, certains intermdiaires mtaboliques, comme la
S-adnosyl-mthionine, sont galement capables d'alkyler l'ADN; dans ce cas, il s'agit d'une
fonction cellulaire normale qui prsente une importance physiologique.
Les sites d'alkylation potentiels des bases nucliques sont varis, mais ne prsentent pas
tous la mme ractivit. De plus, leur localisation n'est pas alatoire; elle dpend de l'agent
alkylant, de la squence en bases et de l'encombrement strique, qui est fonction de la
conformation de l'hlice d'ADN (Pieper, 1998).
L'alkylation de la base labilise son lien N-glycosidique, ce qui peut entraner la formation
de sites abasiques alcali-labiles; le lien phosphodiester peut galement tre alkyl en un
phosphotriester (Pieper, 1998).
Les alkylants peuvent tre classs en agents monofonctionnels et bifonctionnels (Lawley,
1995). Ces derniers portent 2 groupes ractifs, sont donc potentiellement capables de ragir
avec 2 sites dans l'ADN et de gnrer des liens croiss, soit au sein du mme brin d'ADN
(liens croiss intra-catnaires), soit entre les 2 brins complmentaires (liens croiss inter-
catnaires). Ces derniers empchent la sparation des 2 brins, bloquant de fait la rplication et
la transcription, et sont employs en chimiothrapie anti-cancreuse (moutardes azotes, cis-
platine,). Ce type de composs peut galement induire des liens croiss ADN protines.
1.2.4.2 Les agents intercalants de type psoralne
Ces furocoumarines possdent une configuration tricyclique plane qui peut s'intercaler
dans l'ADN; par irradiation UVA, elles forment un adduit covalent avec les pyrimidines,
principalement par addition sur la double liaison 5-6 de la thymine. Les molcules totalement
planes (par exemple, le 8-methoxypsoralne) prsentent une gomtrie idale qui leur permet
de ragir avec une pyrimidine chaque bout de la molcule, et ce par 2 absorptions
indpendantes de photons UV. Elles peuvent donc gnrer des liens croiss inter-catnaires
qui induisent une forte distorsion et un droulement partiel de l'hlice d'ADN (Gruenert et al.,
1985).
15
1.2.4.3 Les composs activs par mtabolisation
Un ensemble de composs relativement non polaires peut subir une activation
mtabolique en formes lectrophiles capables de ragir avec les centres nuclophiles de
l'ADN, devenant par l-mme des mutagnes et des carcinognes puissants. Les enzymes
impliques dans une telle activation de carcinognes sont notamment les cytochromes P450,
les glutathion S-transfrases, les sulfotransfrases, les actyltransfrases, les UDP-
glucuronosyltransfrases, les enzymes catalysant les ractions d'adnosylation et de
mthylation (Halliwell et Gutteridge, 1999).
Le benzo[a]pyrne (Leadon et al., 1995), le paraquat (Peter et al., 1992; Gupta et al.,
1997), les aflatoxines (Friedberg et al., 1995) et les nitrosamines (Bartsch et al., 1989) sont
des exemples classiques de ce type d'activation mtabolique.
A titre d'illustration, nous prsenterons le schma d'activation postul pour la N-nitroso-
dimthylamine (Figure 1.2-6). L'hydroxylation d'un des carbones de la molcule et sa
dsalkylation en diazonium sont catalyses par diffrentes isoformes du cytochrome P450. Le
compos rsultant, l'ion mthylcarbonium, est un puissant agent alkylant (Rowland, 1988).
Pour ces nitrosamines, une activation indpendante des cytochromes P450 a galement t
dcrite, qui requiert soit l'intervention de radicaux hydroxyles, soit une photolyse par les
radiations UV (Bartsch et al., 1989).

Figure 1.2-6 : Activation mtabolique de la N-nitroso-dimthylamine


N N
O H
3
C
H
3
C
N N
O H
3
C
HOH
2
C
N N
O H
3
C
H
+ HCHO
N NOH H
3
C
CH
3
+
+
N
2
Hydroxylation
enzymatique


D'aprs (Rowland, 1988)
16
1.2.4.4 L'incorporation d'analogues de bases nucliques
Il a t dmontr in vitro que certains dsoxynuclotides endommags pouvaient tre
incorpors dans l'ADN au cours de la rplication d'une chane intacte. D'autre part, une
enzyme spcifique, qui dgrade la dsoxyguanosine triphosphate hydroxyle en position 8
(8-oxodGTP), a t rcemment mise en vidence, ce qui semble indiquer l'existence d'un
mcanisme visant dtruire ce nuclotide oxyd avant son incorporation dans l'ADN (Wani
et al., 1998). La pertinence et l'importance biologique ventuelle de ces phnomnes restent
cependant tudier.
1.2.4.5 Adduits divers
Des adduits volumineux ont t dtects dans le foie de patients souffrant de la maladie de
Wilson (accumulation de cuivre) et d'hmochromatose (accumulation de fer), mais n'ont pu
tre identifis (Carmichael et al., 1995). De grandes quantits d'adduits lipophiles l'ADN ont
t rcemment mises en vidence par
32
P CLHP (Yang et al., 1998).
1.2.5 La rparation des dgts l'ADN
La tche assurer par les mcanismes de rparation est immense; il s'agit en effet de
surveiller en continu, dans chaque noyau de l'organisme, les 2 mtres de la double hlice de
l'ADN, soit 3 x 10
9
paires de bases, la recherche de lsions chimiquement trs varies et
prsentes l'tat de traces (Bootsma et al., 2001). Plusieurs mcanismes extrmement
efficaces ont t mis en vidence, la fois chez les procaryotes, les eucaryotes et les
mammifres (Tchou et al., 1991; Bjoras et al., 1997; Boiteux et Radicella, 1998; Jaiswal et al.,
1998; Moller et Wallin, 1998; Bootsma et al., 2001) (Tableau 1.2-3).

Tableau 1.2-3 : Les principaux mcanismes de rparation des dommages l'ADN

Type de lsion Mcanisme de rparation
Modification de bases (alkylation,
oxydation, formation d'un adduit,)
rversion directe
excision de bases
excision de nuclotides
rparation post-rplication
Liens croiss intracatnaires rversion directe
excision de nuclotides
Liens croiss intercatnaires excision de nuclotides
recombinaison
Cassures mono-brins ligation
Cassures double-brins ligation
recombinaison
17
1.2.5.1 La rparation par rversion directe
Il s'agit du mcanisme le plus simple; la liaison entre la base et l'adduit est brise par une
enzyme de manire directe. Les enzymes impliques dans ces mcanismes sont :
les photolyases qui rparent les dimres cyclobutanes et les drivs (6-4) UV-induits.
De manire originale, l'nergie ncessaire la rupture du lien covalent est fournie
l'enzyme par une r-irradiation une longueur d'onde suprieure (300 600 nm); il
s'agit donc d'une photoractivation enzymatique via un cofacteur catalytique FAD et
un chromophore capteur de lumire. L'existence de ce mcanisme chez les humains
reste controverse (Thoma, 1999).
la O-6-mthylguanine-DNA-mthyltransfrase et la N-mthylpurine-DNA-
glycosylase qui rparent les bases mthyles (Pieper, 1998).
1.2.5.2 La rparation par excision de bases (base excision repair, BER)
Ce mcanisme est un des plus importants (Wilson et Thompson, 1997); il permet en effet
de rparer une srie de lsions, incluant les sites abasiques, les cytosine et 5-mthyl-cytosine
dsamines, les bases oxydes (Boiteux et Radicella, 1999) et, dans une moindre mesure, les
lsions d'alkylation, condition que le groupement alkyle ne soit pas trop volumineux
(Wilson et Singhal, 1998). Il remplace de 1 5 bases dans le brin ls.
Quatre types d'enzymes interviennent successivement :
les ADN-glycosylases qui identifient la lsion et rompent le lien N-glycosidique,
gnrant un site apurinique ou apyrimidique (AP); plusieurs enzymes ont t
identifies et prsentent des spcificits diffrentes (Tableau 1.2-4);
l'AP-endonuclase qui catalyse la rupture du lien phosphodiester du ct 5', gnrant
un 5'-dsoxyribose-phosphate et un rsidu 3'-OH; chez les mammifres, il n'existe
qu'une seule AP-endonuclase;
les ADN-polymrases; la longueur du fragment synthtis varie en fonction des
polymrases impliques et 2 mcanismes peuvent tre distingus, short patch repair
et long patch repair;
les ADN-ligases qui scellent le fragment nouvellement incorpor.

Le BER est extrmement efficace et rapide; les cintiques d'excision de quelques bases
oxydes ont notamment t mesures dans des lymphoblastes humains pralablement traits
par du peroxyde d'hydrogne (Tableau 1.2-5) (Jaruga et Dizdaroglu, 1996).

18
Tableau 1.2-4 : Spcificit de quelques ADN-glycosylases

Enzyme Substrats
uracile-ADN-glycosylase uracile
3-mthyladnine-ADN-glycosylase 3-mthylpurines, 7-mthylpurines, bases thyles,
hypoxanthine, thnoadnine
pyrimidine hydrate-ADN-glycosylase pyrimidines oxydes
formamidopyrimidine-glycosylase formamidopyrimidines, 8-oxodG
thymine mismatch-ADN-glycosylase thymine et uracile dans T:G et U:G

D'aprs (Wood, 1996)

Tableau 1.2-5 : Demi-vie de bases oxydes dans l'ADN cellulaire humain

Bases trs
rapidement excises
Demi-vie
(min)

Bases excision
plus lente
Demi-vie
(min)
8-oxodA 12 FaPy-guanine 34
5-hydroxy-cytosine 12 8-oxodG 55
5-hydroxy-uracile 8.5 xanthine 38
5-hydroxymthyl-uracile 11 FaPy-adnine 62

D'aprs (Jaruga et Dizdaroglu, 1996)

1.2.5.3 La rparation par excision de nuclotides (nucleotide excision repair, NER)
Ce mcanisme permet la rparation d'un nombre remarquable de lsions qui n'ont entre
elles aucun rapport de structure; pour agir, il ncessite la fois une distorsion structurale et
une modification chimique dans les bases. Le NER intervient pour de nombreuses adduits qui
dforment la double hlice, par exemple les adduits forms avec des carcinognes comme le
benzo[a]pyrne. Il peut galement rparer des adduits avec de petits composs chimiques, les
photolsions du type dimre de pyrimidine et photoproduits 6-4 ainsi que les liens croiss
inter-catnaires. In vitro, il ncessite une trentaine de polypeptides (Moggs et Almouzni,
1999) qui interviennent dans un mcanisme fort semblable au prcdent, si ce n'est qu'il y a
remplacement, non plus de 1 5 bases, mais bien de 25 30.
Les mcanismes exacts du NER ne sont pas encore lucids; suivant diffrentes
conceptions, les protines pourraient agir au sein d'un norme complexe "rparosome" ou
interviendraient les unes aprs les autres (Batty et Wood, 2000).
19
Le processus, qui est rgul par des phosphorylations rversibles (Moggs et Almouzni,
1999), se droule en 5 tapes
4
:
la reconnaissance de la lsion et de la dformation structurale;
le changement de conformation; le brin d'ADN exciser se relche et se
dcomplmentarise par l'intermdiaire de 2 hlicases;
la double incision; une incision se produit de part et d'autre de la lsion, une
distance de 2 8 nuclotides du ct 3' et 15 24 nuclotides du ct 5';
l'excision du fragment ls; les protines intervenues ne se dissocient pas du
fragment excis.
la synthse et le scellage en place du nouveau fragment.
Au moins 2 voies de rparation, en partie communes, ont t mises en vidences. Pour
l'ensemble du gnome, la rparation gnomique globale, telle que dcrite ci-dessus, assure le
processus. Son efficacit varie fortement en fonction de la lsion, de sa localisation dans le
gnome, de la conformation de la chromatine et de la phase du cycle cellulaire. Pour les gnes
structurellement actifs, la rparation couple la transcription limine les lsions dans le
brin transcrit, directement pendant la transcription. Une rparation rapide et efficace est donc
possible pour rsoudre le problme urgent que peut poser la cellule le besoin de transcrire
un ADN endommag. L'ARN-polymrase II assurerait la dtection initiale de la lsion
lorsque son processus de transcription est bloqu par un site ls; le dplacement de la
polymrase est alors requis pour que la rparation soit assure (Bootsma et al., 2001). Pour
beaucoup de lsions, ce processus est plus rapide que le mcanisme global.
1.2.5.4 La rparation post-rplication des msappariements de bases (mismatch repair)
Une srie d'ADN-polymrases " fidlit faible" a t rcemment mise en vidence
(polymrases , , , , , , , Eso1p, hRev1); ces enzymes sont capables de rpliquer l'ADN
malgr la prsence d'une lsion. Elles agissent seules ou en concert pour rpliquer un ADN
endommag et diffrent dans leur spcificit vis--vis d'un substrat. Par rapport aux
polymrases de rplication classiques, qui ont une fidlit d'environ 10
-5
10
-7
, celles-ci se

4
Note : l'importance du NER dans les mcanismes de dfense anti-cancreux a t mise en vidence chez des
patients atteints de xeroderma pigmentosum, une affection gntique rare autosomique rcessive caractrise par
des dficiences dans cette voie de rparation. Ces patients prsentent un taux extrmement lev de cancers
cutans induits par le soleil (1000 fois suprieur la normale). Sept groupes complmentaires (de A G) qui
sont dficients dans diffrents gnes peuvent tre distingus. Ces gnes codent, notamment, pour les protines
XPA XPG requises pour la rparation par excision de nuclotides; les groupes A et B sont galement dficients
dans la rparation des gnes haut degr de transcription. Un autre groupe de patients (variant XP) est dficient
en une protine qui permet la rplication semi-conservatrice partir de sites endommags (rparation post-
rplication), la polymrase (Bootsma et al., 2001; Cleaver et al., 2001).
20
caractrisent par une fidlit de l'ordre de 10
-2
seulement. Ce qui pose pas mal de questions
quant leur contribution aux mcanismes de rplication de l'ADN (Cleaver et al., 2001).
Quand l'ADN a pu tre rpliqu malgr une lsion, le mcanisme de rparation des
msappariements peut intervenir. Il limine ainsi les appariements incorrects qui peuvent
survenir suite des dltions, des transversions, des bases lses ou des erreurs des ADN-
polymrases. Cette rparation fait intervenir un grand nombre de protines interagissant entre
elles; les tapes principales sont en fait trs mal connues chez les mammifres.
1.2.5.5 La ligation des fragments mono-brins
Les ADN-ligases I et III sont mises en jeu pour recoller les fragments mono-brins qui sont
forms par hydrolyse du lien phosphodiester au niveau des sites abasiques, mais aussi par les
diffrents mcanismes de rparation que nous venons de voir.
1.2.5.6 La rparation des fragments double-brins
Les fragments double-brins sont parmi les lsions les plus problmatiques; elles peuvent
mener des cassures et des rarrangements de chromosomes, un processus prolifratif ou
la mort cellulaire (Rathmell et Chu, 1998). Leur rparation est particulirement dlicate car
les ADN-polymrases ne peuvent tirer que peu d'information du brin complmentaire pour
reconstituer le puzzle (Haaf et al., 1999; Raderschall et al., 1999).
Deux mcanismes de rparation ont cependant t mis en vidence, la recombinaison
homologue (le double-brin est reconstruit partir de l'information du chromosome
homologue) et la recombinaison non homologue (des complexes enzymatiques alignent et
recollent les fragments assembler) (Rathmell et Chu, 1998; Haber, 2000).
1.2.5.7 La rparation des liens croiss inter-catnaires
Cette rparation combine 2 des mcanismes que nous venons de dcrire, la rparation par
excision de nuclotides et la recombinaison. Elles procde en 3 tapes :
Une incision dans la mme chane, de chaque ct du lien crois, gnre deux
"trous", donc un fragment de nuclotides qui reste accroch au brin complmentaire
par le lien crois et les liens hydrognes.
La recombinaison du brin ls avec une chane homologue forme un intermdiaire
triple-brin; il y a ensuite excision du fragment comportant le lien crois.
Le brin complmentaire sert alors de modle pour la synthse du fragment manquant.
21
1.2.6 La structure de la chromatine et les dgts l'ADN
1.2.6.1 Structure de la chromatine
Dans les cellules eucaryotes, les molcules d'ADN sont organises d'une manire bien
spcifique avec des protines histones et non-histones pour former la chromatine, ce qui
permet un compactage d'un facteur ~10.000 de la double hlice de l'ADN dans les
chromosomes. L'ADN est associ aux histones pour s'organiser en nuclosomes, des units
rptitives d'environ 200 paires de bases (160 260 suivant les organismes et les tissus),
enroules raison de 150 paires de bases autour d'octamres histones (association de 2
copies de chacun des histones H2A, H2B, H3 et H4), et ancres par 50 bases sur l'histone
H1 (linker region ou rgion d'ancrage). Grce l'histone H1, les nuclosomes s'empileraient
en une fibre dite fibre de 300 . (Figure 1.2-7)

Figure 1.2-7 : Schma des liaisons ADN/histone et fibre de 300





(Calladine et Drew, 1997)

L'ensemble de ces oprations ne permet cependant qu'un compactage total d'un facteur
~ 40 et les niveaux d'organisation suprieure sont encore fort mal connus. Ils font intervenir
notamment de petites protines dites High-Mobility Group (Calladine et Drew, 1997; Nelson
et Cox, 2000).
22
Dans l'ADN chromosomique, il y a une htrognit structurelle prononce de la
composition et de la squence des nuclotides, mais aussi de l'activit fonctionnelle. La
majorit des gnes est inactive par un ensemble de protines qui laborent avec les
nuclosomes un complexe rpresseur. Une fraction mineure des gnes est cependant
continuellement transcrite ou toujours prte pour la transcription; leur structure peut inclure
des protines histones actyles ou ADP-ribosyles, des nuclosomes altrs dans la rgion
promotrice, un dploiement de la chromatine, une perte ou un rarrangement de nuclosomes
dans la rgion transcrite ou mme une densit rgionale particulire en ARN polymrase
(Moggs et Almouzni, 1999; Thoma, 1999). Certaines rgions peuvent galement s'associer
avec des protines spcifiques, ce qui permet la rgulation de l'expression de gnes. La
position du nuclsome sur la squence d'ADN pourrait jouer un rle fondamental dans
l'expression ou la rpression d'un gne. A cette htrognit structurelle et fonctionnelle se
superpose galement une variabilit temporelle qui reflte les proprits dynamiques de la
chromatine au cours du cycle cellulaire (Thoma, 1999).
Les dformations structurelles de l'ADN nuclosomal, sa mobilit et sa flexibilit
suggrent une tendance accommoder des lsions varies ainsi qu'une tolrance envers les
interactions avec certains agents chimiques et protiques. L'impact des contraintes
structurelles des nuclosomes sur la formation des dgts et leur rparation ainsi que l'impact
des lsions de l'ADN sur la structure et la position des nuclsomes restent des questions
fondamentales (Thoma, 1999).
1.2.6.2 Chromatine et dgts l'ADN
L'ADN des rgions d'ancrage est sensible la digestion par certaines nuclases; en
mesurant les dommages l'ADN avant et aprs digestion enzymatique, les dgts peuvent
donc tre grossirement localiss. Il apparat que certaines formes de dommages ne sont pas
alatoires quant leur localisation dans le nuclosome. Ceci pourrait reflter des problmes
d'accessibilit aux groupements ractifs des bases ou des problmes d'encombrement strique
pour la formation de certains adduits volumineux (Tableau 1.2-6) (MacLeod, 1995).
1.2.6.2.1 L'exemple des dgts oxydatifs
L'tude in vitro des dgts provoqus par des ractifs de type Fenton (Enright et al., 1992)
a montr que les dommages oxydatifs, cassures double-brins et 8-oxodG, dpendent la fois
du ractif et de la rgion nuclosomale. Sur des fondements striques, il est donc possible que
les changements structuraux de la chromatine qui accompagnent la transcription favorisent
l'accs aux gnes actifs d'attaques potentiellement mutagnes (Enright et al., 1996).
23
Tableau 1.2-6 : Distribution des lsions l'ADN dans les nuclosomes


Type de dgts

Examples
Taille de l'adduit
et/ou distorsion de la
double hlice
Distribution
dans les
nuclosomes
Radiations UVC
et UVB
dimres cyclobutanes
photoproduits (6-4)
++
+++
Alatoire
Rgion d'ancrage
Chimiques
encombrants
N-acetoxy-2-actylaminofluorne
aflatoxine b1
benzo[a]pyrne
+++ Rgion d'ancrage
Petits agents
alkylants
dimthylsulfate, mthylmthane sulfonate
mthylnitrosoure, dimthylnitrosamine
+
+
Alatoire
Rgion d'ancrage
Radiations
ionisantes
rayons X, rayons + Rgion d'ancrage
(?)
Chimiques radio-
mimtiques
blomycine + Rgion d'ancrage
Agents formant
des liens croiss
cis-dichloroplatine (II), psoralne +++ Rgion d'ancrage

D'aprs (Smerdon et Thoma, 1998)

1.2.6.2.2 L'exemple des photolsions dimres
En ce qui concerne les dgts UV-induits, la flexibilit de l'ADN conditionnerait en fait la
possibilit de dommage (Thoma, 1999) et les squences favorisant les courbures et les
droulements constitueraient des sites prfrentiels. Les dimres de pyrimidine sont rpartis
uniformment dans le nuclosome, alors que les photoproduits (6-4) se concentrent
principalement dans les rgions d'ancrage; cette diffrence de distribution pourrait tre due
la forte distorsion de chane que provoquent ces derniers, distorsion qui pourrait tre rendue
localement difficile par l'enroulement autour des histones (Smerdon et Thoma, 1998; Thoma,
1999). Il est galement possible que ce soient les nuclosomes qui changent de position suite
l'induction d'un dommage; les octamres histone pourraient soit glisser le long de la
squence d'ADN, soit se dissocier pour se rassembler une autre position. Ce mouvement
permettrait de dplacer les adduits volumineux, qui provoquent de fortes distorsions de
chane, vers la zone d'ancrage (Schieferstein et Thoma, 1998; Thoma, 1999), un moyen trs
simple de librer les chanes (Moggs et Almouzni, 1999)
Les dimres de pyrimidine prsentent une distribution non alatoire, avec une priodicit
de 10.3 paires de bases qui reflte la priodicit de l'enroulement de l'hlice d'ADN dans les
nuclosomes. Les zones loignes du squelette histone semblent les plus exposes aux
24
dgts UV. Par contre, et de manire inattendue, la distribution des lsions (6-4) est cette fois
parfaitement alatoire (Friedberg et al., 1995; Smerdon et Thoma, 1998); il apparat donc que
les nuclosomes peuvent tolrer la perte d'nergie entrane par des lsions volumineuses qui
causent des distorsions svres de l'ADN.
Une distribution htrogne des lsions l'ADN dpend aussi des protines qui lui sont
lies; il n'y a pas de rgle et la situation dpend des rgions d'ADN et des protines
constituant les complexes.
1.2.6.3 Chromatine et rparation
La structure de la chromatine influence galement la rponse cellulaire aux dgts subis;
elle conditionne en fait l'accessibilit des dommages aux mcanismes de dtection de lsion et
de rparation, notamment les photolyases et les protines du complexe NER (rparation par
excision de nuclotides) (Thoma, 1999). De sorte qu'un dommage donn pourrait tre
particulirement ais et rapide rparer si les mmes mcanismes d'encombrement ou
d'hydrophobicit conditionnaient la position du dgt et l'accessibilit aux enzymes de
rparation (Pendrys, 1983; Schieferstein et Thoma, 1998; Thoma, 1999; O'Connor et al.,
2000).
1.2.6.3.1 La rparation par excision de nuclotides (NER)
Il semble que la phase de reconnaissance soit rapide dans les rgions d'ancrage et procde
par glissement ou dploiement/reploiement de la fibre d'ADN pour le reste de la chromatine.
La reconnaissance serait plutt tridimensionnelle (les enzymes en solution "plongent" sur une
lsion) que linaire (les enzymes scannent toute la chane d'ADN la recherche d'une lsion),
mais les 2 processus sont probablement concomitants. Les tapes suivantes ont besoin de
beaucoup plus de place, au moins 100 paires de bases (Moggs et Almouzni, 1999); celle-ci
pourrait provenir de la dynamique naturelle de la chromatine et d'un remodelage enzymatique.
Aprs rparation, les fragments d'ADN nouvellement insrs se trouvent
prfrentiellement dans les rgions d'ancrage (1/2 vie, 20 min) (Moggs et Almouzni, 1999) et
"migrent" au cours du temps pour finir distribus de manire homogne dans les
nuclosomes. Ce qui suppose une maturation de la chromatine, vraisemblablement en
plusieurs tapes, pour terminer la rparation (Smerdon et Thoma, 1998; Moggs et Almouzni,
1999; Thoma, 1999).
Rappelons que le NER est intimement li la transcription, elle-mme fortement
dpendante de la structure de la chromatine. C'est notamment le cas pour la rparation des
25
photoproduits UV qui dpend du statut transcriptionnel des squences rparer (Pfeifer,
1997) et prsente un caractre non alatoire (Nakagawa et al., 1998).
1.2.6.3.2 La rparation par excision de bases (BER)
A notre connaissance, aucune corrlation n' a encore t dmontre entre le BER et la
structure de la chromatine. Pour certaines lsions (thymine glycols), mais pas pour d'autres, le
BER est li la transcription.

1.3 LES ESPECES REACTIVES DE L'OXYGENE ET LES DOMMAGES
OXYDATIFS A L'ADN
1.3.1 Introduction
L'histoire gologique nous montre que la vie serait survenue sur notre plante, il y a quatre
milliards d'annes, dans des conditions d'absence quasi totale d'oxygne. Un milliard d'annes
plus tard, l'volution du processus de la photosynthse dans les algues bleues commenait
gnrer de l'oxygne, transformant en un laps de temps relativement court la composition de
l'atmosphre. La filtration des UV, par l'oxygne mais aussi par la couche d'ozone gnre
dans la stratosphre, a probablement permis aux organismes vivants de quitter la mer pour
lentement coloniser les terres (Figure 1.3-1).
Cette monte d'oxygne dans l'atmosphre a aussi probablement reprsent une source de
dgts considrables aux formes de vie anarobies primitives. Certaines ont d s'adapter,
inventer des moyens de dfense appropris et in fine voluer pour tirer parti de cette molcule
omniprsente, en l'utilisant comme siphon d'lectrons. Au cours de la respiration arobie,
l'nergie provenant de la rduction de l'oxygne en eau est ainsi rcupre dans la molcule
hautement nergtique qu'est l'ATP.
Bien qu'indispensable la vie arobie, l'oxygne reste cependant un toxique ubiquiste
auquel tous les tres vivants sont exposs de manire massive; certains auteurs vont mme
jusqu' le qualifier de polluant atmosphrique gnotoxique majeur.(Halliwell et Gutteridge,
1999).
1.3.2 Proprits fondamentales de l'oxygne
1.3.2.1 Oxygne molculaire et oxygne singulet
Suivant la dfinition trs large propose par Halliwell et Gutteridge (Halliwell et Gutteridge,
1999), un radical libre est toute espce chimique capable d'existence indpendante et qui
26
Figure 1.3-1 : Evolution de la teneur en oxygne dans l'air





(Wayne et Wayne, 1996)

comprend un ou plusieurs lectrons non apparis. Le Tableau 1.3-1 nous montre que la forme
la plus stable de l'oxygne, la molcule diatomique, rpond cette dfinition. Elle possde en
effet 2 lectrons non apparis, localiss dans 2 orbitales anti-liantes * 2p diffrentes et
portant des spins identiques; il s'agit de l'tat basal appel aussi tat triplet
5
(Halliwell et
Gutteridge, 1999).
Si cet oxygne tente d'arracher une paire d'lectrons (oxydation) une autre molcule ou
atome, ces 2 lectrons doivent galement tre de spins anti-parallles pour entrer dans les 2
orbitales * 2p. Cependant une paire d'lectrons d'une orbitale atomique ou molculaire ne
peut, de par le principe d'exclusion de Pauli, remplir ce critre. Cette importante restriction de
spin sur le transfert d'lectrons amne l'oxygne plutt accepter les lectrons un par un, ce

5
Les termes singulet et triplet proviennent du comportement magntique des lignes du spectre d'mission de
l'oxygne. L'oxygne triplet est paramagntique car les champs magntiques de ses 2 lectrons clibataires sont
orients dans la mme direction; les 2 lectrons interagissent avec le champ magntique externe et chaque raie
du spectre d'mission se divise en trois raies contigus. L'oxygne singulet est diamagntique, les champs
magntiques des 2 lectrons apparis s'annulant; les raies d'mission restent donc inchanges en prsence d'un
champ magntique externe ((Sahnoun et al., 1997).
27
qui interdit ou ralentit sa ractivit vis--vis des non-radicaux. Par contre, un apport d'nergie
(22.4 kcal), via une molcule photo-excite, peut amener les 2 lectrons * 2p en anti-
parallle dans la mme orbitale; l'oxygne est alors l'tat singulet
1
g O
2
, une espce non-
radicalaire mais extrmement ractive (Figure 1.3-2). Ce phnomne est connu sous le terme
raction de photosensibilisation de Type II. Un autre tat singulet, l'tat
1
g
+
O
2
, qui permet
galement de lever la restriction de spin, peut aussi tre form (37.5 kcal); mais cet tat est
fortement instable et se dgrade en
1
g O
2
qui est habituellement la seule espce oxygne
singulet considre en biologie, sous le symbole
1
O
2
(Floyd, 1993; Sahnoun et al., 1997;
Halliwell et Gutteridge, 1999).

Tableau 1.3-1 : Occupation des orbitales molculaires de l'oxygne, de l'anion superoxyde, de
l'anion peroxyde et de l'oxygne singulet

Oxygne triplet
(
3
g
-
O
2
)
Anion
superoxyde
(O
2
-
)
Anion peroxyde
(O
2
2-
)
Oxygne singulet
(
1
g O
2
)
Oxygne singulet
(
1
g
+
O
2
)
* 2p
* p
2p
* 2S
2S
* 1S
1S

D'aprs (Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999)


Figure 1.3-2 : Ractivit de l'oxygne avec les molcules biologiques


Oxygne molculaire
(Etat triplet)

+

Molcules biologiques
(Etat singulet)

Pas de raction
(Eq.1)

Oxygne molculaire
(Etat triplet)

+

Energie (23 kcal)


Oxygne singulet
(Eq. 2)

Oxygne singulet

+

Molcules biologiques
(Etat singulet)

Oxydation
(Eq. 3)

D'aprs (Floyd, 1993)
28












1.3.2.2 Espces semi-rduites de l'oxygne
Les espces ractives intermdiaires entre les 2 tats redox extrmes que sont l'oxygne et
l'eau (Figure 1.3-3) sont formes en trs faibles quantits dans les systmes biologiques.

Figure 1.3-3 : Chimie de l'oxygne; transferts d'lectrons et de protons
(les potentiels redox sont rapports l'lectrode normale d'hydrogne)


O
2
O
2
-
O
2
--
O
-
+ O
--

pKa H
+
pKa H
+

4.8 > 16
HO
2

HO
2
-
pKa H
+
pKa H
+

11.9 > 16
pKa H
+

11.8

H
2
O
2
HO

+ HO
-


pKa H
+

14
H
2
O
HO

HO
-



D'aprs (Pierre, 1995)

Ces espces semi-rduites de l'oxygne sont :
l'anion superoxyde, O
2
-
, espce charge ngativement au pH physiologique qui peut
traverser les membranes via les canaux ioniques
le peroxyde d'hydrogne, H
2
O
2
, qui passe aisment les membranes
et le radical hydroxyle,

OH, qui ragit trs rapidement et sans distinction avec toute


molcule proche de son site de formation

Le superoxyde
e e e

160 mV


+ 816 mV
-

-

-

-

O
2
+ 2e
-
+ 2H
+

e
-


- + 940 mV
e
+ 460 mV
+ 1770 mV
peut se transformer par dismutation en peroxyde d'hydrogne; cette
raction, trs efficace pH acide, est pratiquement inexistante pH neutre et requiert une
activation enzymatique par la superoxyde dismutase.
O
2
-
+ O
2
-
+ 2H
+



H
2
O
2
+ O
2


(Eq. 4)
29
Le superoxyde est un excellent rducteur; il est notamment capable de rduire certains
mtaux, tels le fer
(III)
ou le cuivre
(II)
:

O
2
-
+ M
(n+1)+
O
2
+ M
n+
(Eq. 5)

Le peroxyde d'hydrogne, quant lui, ragit facilement avec un mtal, par exemple le
fer
(II)
, pour former le radical hydroxyle (Raction dite de Fenton) :

H
2
O
2
+ M
n+
OH
-
+

OH + M
(n+1)+
(Eq. 6)

Le bilan de ces 2 ractions s'tablit comme suit (Raction dite de Haber-Weiss) :
O
2
-
+ H
2
O
2
Mtal


OH
-
+

OH + O
2


(Eq. 7)

Le mcanisme de ces ractions est mal connu et passe vraisemblablement par la formation
de complexes intermdiaires; des espces de type ferryl (fer
(IV)
) telles que (Fe=O)
2+
sont
souvent proposes, mais n'ont pas t mises en vidence de manire concluante (Halliwell et
Gutteridge, 1999). Le mtal agit comme catalyseur et est donc requis en quantits trs faibles;
dans les cellules, le fer actif du point de vue redox est probablement en traces sous la forme
d'un complexe de poids molculaire faible. Ces mtaux sont galement capables de catalyser
la dcomposition des peroxydes organiques en radicaux alkoxyles et peroxyles :

ROOH + M
n+
RO

+ M
(n+1)+
+ OH
-
(Eq. 8)
ROOH + M
(n+1)+


ROO

+ M
n+
+ H
+
(Eq. 9)

Le radical hydroxyle, par des ractions qui sont pratiquement diffusion-contrles, ajoute
ou soustrait un atome d'hydrogne aux biomolcules cibles pour former un autre radical; par
exemple :

RH +

OH HR

OH (Eq. 10)
RH +

OH

R

+ H
2
O (Eq. 11)
R'H + R



R'

+ RH

(Eq. 12)

Si l'oxygne est prsent, il peut ragir avec certains radicaux libres pour former des
radicaux, par exemple peroxyles :

30
R

+ O
2
ROO

(Eq. 13)
ROO

+ R'H

ROOH + R'

(Eq. 14)
Dans tous les cas (Eq. 10 14), une raction en chane peut tre initie, menant d'autres
radicaux; chaque hydroperoxyde form peut galement ragir en prsence d'un mtal comme
le fer ou le cuivre pour produire d'autres radicaux, propageant galement la raction. Ces
dgts sont particulirement importants quand ils se produisent dans les lipides insaturs des
membranes biologiques; une telle raction mne une vritable amplification d'une attaque
radicalaire, la peroxydation lipidique.
La localisation des dgts oxydatifs aux biomolcules, lipides, protines, ADN et ARN,
dpendrait largement de la proximit d'un mtal ou de sa liaison un site spcifique de la
molcule.
1.3.2.3 Le peroxynitrite
Le peroxynitrite ONO
2
-
, form par le couplage entre l'oxyde nitrique NO

et le superoxyde
O
2
-
a pour forme protone l'acide peroxynitreux, ONO
2
H (pKa, 6.8). La vitesse de cette
raction est 3.5 fois suprieure la dcomposition de O
2
-
catalyse par la superoxyde
dismutase (Burney et al., 1999). Le NO

et le superoxyde tant produits par les macrophages


et les neutrophiles, ONO
2
-
est susceptible d'tre produit en grandes quantits dans les sites
inflammatoires. Il y a diffrentes sources exognes de peroxynitrite, incluant la fume de
cigarette et l'exposition des nitrates aux UVC ou aux radiations ionisantes.
ONO
2
-
est un oxydant trs puissant, il peut capter 1 ou 2 lectrons et est capable d'oxyder
les lipides, les protines et l'ADN; il est diffusible et peut tre pris en charge par certains
systmes de transport. Il est capable de ragir par lui-mme, mais aussi de gnrer par
dcomposition (temps de vie 37C de ONO
2
H, 1 s) des radicaux trs ractifs, parmi
lesquels le radical hydroxyle (Douki et Cadet, 1996). Sa dcomposition est fortement
acclre en prsence de CO
2
.
1.3.3 Les principales sources physiologiques d'espces ractives de
l'oxygne
Les sources exognes d'espces ractives de l'oxygne ont t envisages dans la Section
1.1; rappelons que celles-ci peuvent tre d'origine physique, mais aussi chimique.
1.3.3.1 La phosphorylation oxydative mitochondriale
De 85 90 % de l'oxygne consomm par les animaux est utilis par les chanes
respiratoires mitochondriales, un ensemble de transporteurs d'lectrons qui sont soit mobiles,
soit lis aux membranes internes. Chacun de ces lments a son propre potentiel redox, ce qui
permet une rduction contrle de l'oxygne en eau partir des lectrons gnrs par le
mtabolisme nergtique cellulaire, notamment le cycle de de Krebs. Une partie des lectrons
31
est cependant perdue en cours de route, aboutissant la formation de O2
-
(Nivire et
Fontecave, 1995). Le devenir de ce superoxyde reste un point de controverse; il aurait
apparemment peu de chances d'chapper aux superoxydes dismutases de l'organite de sorte
que le peroxyde d'hydrogne mitochondrial driverait entirement de ce superoxyde. Les
mitochondries peuvent galement gnrer des radicaux hydroxyles.
L'ADN mitochondrial, qui reprsente chez l'homme 16569 paires de bases pour 37 gnes,
serait ainsi une cible privilgie des attaques oxydatives. Cette hypothse a conduit une
tentative d'explication des modifications subies par l'organisme au cours du vieillissement
(Ames, 1989; Halliwell et Gutteridge, 1999). De par l'exposition continue de cet ADN des
conditions pro-oxydantes, il pourrait en effet y avoir une accumulation de mutations qui
rsulterait en des mitochondries incapables d'assurer suffisamment d'ATP pour un
mtabolisme cellulaire correct.
En cas d'hypoxie suivie d'une roxygnation brutale, par exemple lors d'une ischmie-
reperfusion, la chane de transport d'lectrons ne peut absorber l'afflux d'oxygne trop brutal
et rduit celui-ci directement en superoxyde qui sera transform par dismutation, directe ou
enzymatique, en peroxyde d'hydrogne. Si cet afflux massif de ROS dpasse les dfenses
antioxydantes de la cellule, des dgts d'autres constituants cellulaires deviennent
invitables (Nivire et Fontecave, 1995; Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.2 Les complexes enzymatiques du rticulum endoplasmique
Le rticulum endoplasmique, une structure cytoplasmique constitue d'une membrane en
un feuillet continu, extrmement repli et soud la membrane nuclaire externe, comprend
un systme de chane de transport d'lectrons, les complexes enzymatiques cytochromes P450
et b5. Des fuites d'lectrons, la fois au niveau des cytochromes et de la rductase, peuvent
gnrer le superoxyde et le peroxyde d'hydrogne (Nivire et Fontecave, 1995; Sahnoun et
al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.3 La phagocytose et l'explosion respiratoire
Les membranes plasmiques de cellules spcialises, principalement les leucocytes,
comportent un systme complexe de transport d'lectrons. Celui-ci permet de gnrer de
grandes quantits de superoxyde pendant le processus phagocytaire, un mcanisme de dfense
essentiel contre les microorganismes. Aprs l'ingestion de particules opsonises dans des
vsicules formes partir de la membrane plasmatique, la NADPH oxydase est rapidement
active, suivie d'une rapide explosion respiratoire qui gnre du superoxyde, du peroxyde
32
d'hydrogne et, via la raction de Haber-Weiss (Eq. 7) catalyse par un mtal, le radical
hydroxyle. Par l'action de la myloperoxydase, de l'hypochlorite est galement produit:
H
2
O
2
+ Cl
-

Mylo-Px



HOCl + OH
-

(Eq. 15)

Une partie de ces ROS est libre dans le milieu extra-cellulaire, ce qui permettrait
d'expliquer les dgts tissulaires observs durant les processus inflammatoires ainsi que les
effets anti-inflammatoires de la superoxyde dismutase (Nivire et Fontecave, 1995; Sahnoun
et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.4 Les ractions oxydasiques des peroxysomes
Bien que le peroxyde d'hydrogne cellulaire soit form en majeure partie par la
dismutation des radicaux superoxydes, il peut galement rsulter de la rduction 2 lectrons
de l'oxygne par diverses oxydases
6
. La plupart de ces enzymes sont localises dans les
peroxysomes o de grandes concentrations de catalase ont t galement mises en vidence.
Ces petits organites catalysent des ractions d'oxydation qui permettent une dtoxification au
niveau du foie et des reins; elles participent galement la -oxydation des acides gras.
La compartimentation de ces ractions protge en grande partie la cellule des ROS
gnrs; des quantits significatives de peroxyde d'hydrogne peuvent cependant passer dans
le compartiment cytoplasmique (Floyd, 1993; Nivire et Fontecave, 1995; Sahnoun et al.,
1997; Halliwell et Gutteridge, 1999).
1.3.3.5 Les ractions cytoplasmiques
Certaines des enzymes oxydatives sont galement prsentes dans le cytoplasme;
l'importance physiologique d'ventuelles fuites de ROS au niveau de ces enzymes reste fort
controverse (Halliwell et Gutteridge, 1999).
Des molcules endognes et exognes varies, ascorbate, glutathion, pyrogallol,
catcholamines et flavines rduites subissent une autooxydation, rsultant en une production
de superoxyde. En prsence de thiols ou d'ascorbate, le fer(III) peut tre rduit en fer(II) qui
peut s'autooxyder en produisant du superoxyde. L'importance relle de ces phnomnes in
vivo est cependant obscure (Halliwell et Gutteridge, 1999).
33

6
Entre autres la xanthine oxydase, la glutathion oxydase et la monoamine oxydase
1.3.4 Protections cellulaires antioxydantes
La compartimentation en organites spcialiss et la squestration des mtaux reprsentent
certainement les premires dfenses cellulaires. Celles-ci sont compltes par toute une
panoplie d'antioxydants enzymatiques et non-enzymatiques dont la fonction essentielle vise
liminer les espces ractives de l'oxygne ainsi que leurs prcurseurs.
1.3.4.1.1 Les antioxydants enzymatiques
Les superoxydes dismutases, SOD, acclrent considrablement la dismutation de l'anion
superoxyde :
O
2
-
+ O
2
-
SOD

2 H
+


H
2
O
2
+ O
2


(Eq. 16)

La catalase dgrade le peroxyde d'hydrogne :
2 H
2
O
2

CAT



2 H
2
O + O
2


(Eq. 17)

La glutathion peroxydase (GSH-Px) rduit le peroxyde d'hydrogne en eau en utilisant le
glutathion rduit, GSH, comme donneur d'lectrons :
H
2
O
2
+ 2 GSH
GSH-Px



2 H
2
O + GS-SG

(Eq. 18)

1.3.4.1.2 Les antioxydants non-enzymatiques
Une littrature abondante dtaille de nombreuses molcules aux proprits antioxydantes
(Nivire et Fontecave, 1995; Sahnoun et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999); la plupart
de ces substances montrent galement une activit antimutagne et anticarcinogne dans
nombre de modles (Hartman et Shankel, 1990). Les antioxydants non-enzymatiques les plus
importants sont le glutathion, les tocophrols (vitamine E), l'ascorbate et l'acide urique.
1.3.4.1.3 La troisime ligne de dfense antioxydante
En raison de leur importance pour la rgnration des fonctions cellulaires aprs une
attaque oxydative, les mcanismes d'limination et de rparation des biomolcules oxydes
sont considrs comme une vritable troisime ligne de dfense antioxydante (Yu, 1993).
Cette classe comprend les enzymes lipolytiques et protolytiques, mais aussi les systmes de
rparation de l'ADN. Les lipides et protines oxyds constituent d'excellents substrats
enzymatiques qui sont dgrads prfrentiellement.
34
1.3.5 Le stress oxydatif
L'exposition l'oxygne ainsi que sa mtabolisation rsultent donc dans la formation de
sous-produits, des espces toxiques semi-rduites, qui sont l'origine d'un stress oxydatif.
Celui-ci est frquemment dfini comme un dsquilibre entre les attaques par les espces
ractives de l'oxygne et les dfenses antioxydantes (Nivire et Fontecave, 1995; Sahnoun et
al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999). Un stress oxydatif est gnralement la consquence
d'un excs de production d'espces ractives de l'oxygne; il peut galement survenir lors
d'une dpltion en antioxydants, par exemple en cas de malnutrition (Sahnoun et al., 1998).
Le stress impos peut tre considr comme un potentiel de dgts oxydatifs, P. Des
dfenses antioxydatives, capables d'empcher ou de rduire l'accumulation de ces sous-
produits toxiques, sont cependant apparues au cours de l'volution de sorte que le potentiel de
dgts oxydatifs soit oppos par la capacit de dfense oxydative du systme, A
c
.
Ces 2 procds opposs sont en quilibre dynamique suivant l'quation (Floyd, 1993) :
P

A
c


(Eq. 19)

En fait, il semble que le potentiel de dgts oxydatifs soit toujours suprieur la capacit
de dfense de sorte qu'une faible quantit de ROS chappe en permanence aux dfenses
cellulaires; soit P' cette fraction de ROS :


P' = P - A
c



(Eq. 20)

L'existence de cette fraction est actuellement quasi certaine. Toutes les mthodes
analytiques montrent en effet, sauf artefacts multiples, qu'il existerait, dans toutes les cellules
tout moment, une quantit basale de protines et de bases nucliques oxydes. D'autre part,
il est bien connu que les cellules ges accumulent un pigment form de lipides et de
protines oxydes, la lipofuscine. Il semble donc y avoir une certaine tolrance de la nature
l'gard des oxydations; il est en fait probable que la dpense d'nergie requise pour bloquer
tout vnement oxydatif serait tout simplement trop leve. De plus, un faible flux d'espces
oxydes semble indispensable pour initier ou relayer une srie d'vnements comme le
dveloppement ou la diffrenciation cellulaire (Floyd, 1993; Mossman, 2000).
Toutes ces observations refltent en fait l'existence continue d'oxydations mais indiquent
aussi que la rparation par les diffrents mcanismes n'est jamais complte. De sorte que la
quantit de dgts prsente un moment donn reflte un niveau d'quilibre qui serait la
rsultante du taux de formation moins le taux de rparation et de dgradation responsables de
35
l'limination du dommage. Ainsi, pour une macromolcule oxyde B
ox
dont le produit de
dgradation est A (Floyd, 1993) :


B
P'

R
B
ox

D
ox

A

(Eq. 21)


le taux de formation de B
ox
est gouvern (i) par la quantit de ROS toxiques qui ont chapp
aux systmes de dfense, P'; (ii) par le taux de rparation de la macromolcule oxyde, R; et
(iii) par le taux de dgradation de cette macromolcule oxyde en ses lments de base, D
ox
.
En ce qui concerne les protines, la dgradation protolytique de la molcule oxyde est
probablement le facteur le plus important; cette fonction serait assure par les protasomes,
des complexes protasiques multicatalytiques. Une certaine fonction de rgnration serait
assure par les protines dites de stress (heat shock proteins). Pour l'ADN en revanche, ce
sont les facteurs de rparation qui jouent un rle primordial (Floyd, 1993).
1.3.6 Dgts oxydatifs aux lipides et aux protines
Le mcanisme chimique des dgradations provoques par les radicaux oxygns est
complexe et pas toujours compltement lucid.
1.3.6.1 Les lipides
Les acides gras polyinsaturs sont particulirement sensibles la peroxydation en raison
de leurs hydrognes bis-allyliques facilement oxydables (Figure 1.3-4).

Figure 1.3-4 : Une partie de la structure d'un acide gras polyinsatur



C H HC
C
H H
CH H C

Hydrognes bis-allyliques

En fonction du nombre d'insaturations de la structure lipidique, la peroxydation conduit
la formation de diffrents hydroperoxydes (ROOH) suivant des ractions analogues aux
quations 10 14. Ces derniers, du fait de leur instabilit se fragmentent, notamment en
prsence d'ions de mtaux de transition, en composs de masses molculaires plus faibles,
comprenant des aldhydes, des acides et des traces d'hydrocarbures, thane, pentane, Parmi
les aldhydes, une trs large place a t initialement donne un dialdhyde tricarbon, le
malondialdhyde (MDA), un mutagne reconnu. En fait cet aldhyde serait produit en
36
beaucoup moins grande quantit que les hydroalknals, comme le 4-hydroxy-2-nonnal
(HNE), le compos le plus toxique produit partir des lipides (Sahnoun et al., 1997;
Halliwell et Gutteridge, 1999; Marnett, 2000).
La peroxydation lipidique semble tre la fois un mcanisme d'amplification et de
dplacement d'une attaque radicalaire locale, permettant une "action distance" de ROS
extrmement ractifs, notamment les radicaux

OH. Les hydroperoxydes lipidiques et leurs


produits de dgradation sont toxiques pour les cellules. Il semble toutefois qu'une
peroxydation massive soit le plus souvent un vnement tardif qui accompagne la mort
cellulaire plutt qu'une cause de cette mort. Les dgts aux protines et l'ADN semblent en
effet prsenter plus d'importance que la peroxydation lipidique dans le processus de mort
cellulaire (Halliwell et Chirico, 1993; Marnett, 2000).
Les isoprostanes, une famille de composs apparents aux prostaglandines, sont forms au
cours de la peroxydation lipidique d'acides gras insaturs comme l'acide arachidonique (Bachi
et al., 1996; de Zwart et al., 1999).
Le cholestrol des membranes cellulaires et des lipoprotines peut galement tre oxyd
pendant la peroxydation lipidique, gnrant un ensemble complexe de produits dont la toxicit
reste l'objet de controverses (Geiger et al., 1997; de Zwart et al., 1999).
1.3.6.2 Les protines
De nombreuses protines peuvent subir des dommages considrables sans que leur
fonction en soit altre; par exemple, l'activit d'une enzyme ne sera rellement rduite que
lorsque le dgt sera port sur un acide amin proche de son site actif (Floyd, 1993; Nivire et
Fontecave, 1995; Halliwell et Gutteridge, 1999). D'autre part, il a t montr in vitro qu'une
oxydation svre peut induire des modifications physico-chimiques importantes, rsultant en
une fragmentation, une agrgation et une susceptibilit plus leve la protolyse (Yu, 1993).
A ct d'une oxydation gnrale des protines et des acides amins, qui mne l'accumulation
de carbonyles et de peroxydes, une attaque radicalaire peut mener :
l'oxydation rversible des groupes thiols,
l'oxydation de la mthionine en sulfoxyde et en sulfone,
l'oxydation des acides amins cycliques, tryptophane, phnylalanine, tyrosine,
histidine et proline
La susceptibilit d'une protine une attaque oxydative dpend donc de sa composition en
acides amins, de la quantit et de la position des acides amins fragiles mais aussi de sa
structure tertiaire, qui conditionne l'accs un site donn et, ventuellement, la facilit de
37
rparation des dgts. Outre une attaque radicalaire directe sur les protines, une attaque
indirecte peut tre cause par les produits terminaux de la peroxydation lipidique (MDA et
HNE) (Mahmoodi et al., 1995).
Avec l'ge, il semble que se produise une accumulation de protines oxydes qui
entraneraient des dysfonctionnements biochimiques, cellulaires et physiologiques (Ames,
1989). Des protines oxydes sont en outre susceptibles d'tre reconnues comme trangres
par le systme immunitaire, menant la formation d'anticorps qui peuvent entraner des
phnomnes d'auto-immunit.
1.3.7 Dgts oxydatifs aux acides nucliques: Gnralits
Les radicaux oxygns peuvent interagir avec l'ADN, la fois au niveau des bases
nucliques et du squelette dsoxyribose-phosphate, pour produire des bases altres, des sites
abasiques, des cassures de chanes et des liens croiss ADN-ADN et ADN-protines (Cadet et
al., 1995). D'autre part, l'oxydation des lipides et des protines peut galement gnrer des
intermdiaires qui forment des adduits l'ADN (Agarwal et Draper, 1992; Marnett, 2000).

Tableau 1.3-2 : Ractivit avec l'ADN des espces impliques dans le stress oxydatif

Espce ractive Raction avec l'ADN
1
O
2
Oxyde la guanine

OH Oxyde les bases et les sucres


H
2
O
2
Oxyde l'adnine
O
2
-
et HO
2

Pas de ractivit dtectable


RO

et ROO

Oxyde les sucres


O
3
Oxyde les bases
ONOO
-
Oxyde les bases et les sucres
Radicaux cationiques purines et pyrimidines Hydratation et dprotonation
Ions de type ferryl (fer
(IV)
) Oxyde les bases et les sucres

D'aprs (Cadet et al., 1995)

1.3.7.1 L'oxydation des bases
Jusqu'au milieu des annes 1980, l'attention des chercheurs s'est porte sur les dgts
l'ADN induits par des xnobiotiques tels que les hydrocarbures polycycliques, les amines
aromatiques ou les nitrosamines. Des mthodes sensibles, telles que le post-marquage au
32
P
en chromatographie couche mince, ont t dveloppes pour dtecter et quantifier les adduits
l'ADN de ces composs. Ces mthodes ont notamment permis de tester la relation entre
38
niveau d'adduit et pouvoir cancrigne. En l'absence de traitement, aucun de ces adduits
fortement apolaires n'tait dtect et l'opinion gnrale estimait que l'ADN gnomique
d'animaux ou d'humains normaux n'tait pas endommag (Marnett, 2000). La radiobiologie
avait bien caractris une panoplie de produits de dgradation obtenus par irradiation X ou
de l'ADN, mais ces produits taient considrs comme une source forcment mineure de
dgts, gure plus qu'un simple bruit de fond induit par les rayonnements cosmiques
(Ward, 1988). Les seuls dgts spontans admis taient les dsaminations, dpurinations et
dpyrimidations voques dans la Section 1.1 de ce travail.
Des essai de caractrisation d'adduits polaires ont cependant entran une modification
des luants employs pour sparer les adduits marqus au
32
P; ces nouvelles conditions
chromatographiques ont rvl des composs polaires inconnus dans l'ADN des rongeurs et
des humains non traits (Randerath et al., 1986), composs qui variaient en fonction du tissu,
de l'espce, du genre, de l'alimentation, A la mme poque, (i) l'excrtion urinaire de bases
oxydes (les glycols de thymine et thymidine ainsi que le 5-hydroxymthyl-uracile) a t mise
en vidence chez diffrentes espces (Cathcart et al., 1984; Adelman et al., 1988; Ames,
1989); (ii) une mthode trs sensible a t propose (Floyd et al., 1986) pour le dosage d'une
base oxyde, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine, la 8-oxodG, qui s'est rvle un
biomarqueur de choix; et, (iii) une mthode de chromatographie gazeuse couple la
spectromtrie de masse a permis la dtection simultane non ambigu de toute une srie de
bases oxydes (Dizdaroglu, 1986). Bien que les premiers rsultats, surtout ceux obtenus par
GC-MS, aient, depuis lors, fait l'objet de beaucoup de critiques, ils ont permis une prise de
conscience de l'existence de dgts oxydatifs endognes aux bases de l'ADN (Marnett, 2000).
1.3.7.2 L'importance des altrations oxydatives spontanes
A partir de l'excrtion urinaire de certaines bases oxydes, Ames a tent une estimation
grossire de l'ampleur des dgts oxydatifs l'ADN (Ames, 1989). Un homme normal excrte
dans les urines environ 100 nmoles par jour des 3 bases thymine glycol, thymidine glycol et
5-hydroxymthyl-uracile. Cette excrtion traduirait une moyenne d'environ 10
3
thymines
oxydes par jour pour chacune des 6 x 10
13
cellules de l'organisme. Comme ces produits ne
reprsentent que 3 bases oxydes sur environ 20 connues, le nombre de chocs oxydatifs
l'ADN par cellule et par jour pourrait tre suprieur 10
4
.
39
Les dgts oxydatifs l'quilibre pour une cellule humaine moyenne
7
ont galement t
estims (Floyd, 1995) (Tableau 1.3-3).

Tableau 1.3-3 : Mtabolisme de l'oxygne et dgts oxydatifs. Estimation pour une cellule
humaine moyenne
7


Mtabolisme de l'oxygne Dgts oxydatifs l'quilibre pour une cellule
(steady state)
Une cellule moyenne cubode
Volume, 10
3
m
Masse, 1 ng
Protines
0.9 % de l'O
2
consomm
4 x 10
8
protines oxydes

Flux d'oxygne
~ 10
12
O
2
par cellule par jour
ARN
0.03 % de l'O
2
consomm
1.4 x 10
7
lsions pour l'ARN total par jour

Production de H
2
O
2

3 x 10
9
H
2
O
2
par cellule par
heure
ADN
0.008 % de l'O
2
consomm
2 x 10
4
lsions par gnome par jour
2 x 10
5
nuclotides remplacs par gnome par jour

(Floyd, 1995; Newcomb et Loeb, 1998)

La proportion entre bases altres et autres types de dgts (cassures de chanes et liens
croiss) a t value in vitro par oxydation avec le peroxyde d'hydrogne. Une extrapolation
in vivo, partir des donnes d'excrtion de thymines modifies, a permis d'valuer chez
l'homme une incidence spontane de 7 14 cassures simple-brins, 3 cassures double-brins et
3 liens croiss inter-brins par cellule et par jour (Bernstein et Gensler, 1993).
L'ensemble de ces calculs suppose videmment que la plus grande partie des bases
excrtes provienne des mcanismes de rparation de l'ADN oxyd, et non de sources
exognes comme l'alimentation ou la flore intestinale (Halliwell et Aruoma, 1991); la
supposition d'une origine endogne semble cependant raisonnable (Ames, 1989). Remarquons
que la contribution de l'ADN libr par les cellules mortes n'est pas prise en compte
(Halliwell et Aruoma, 1991).

7
Pour autant qu'une telle cellule existe; l'apport et la consommation en oxygne dpendent videmment du type
cellulaire et des conditions physiologiques
40
1.3.8 Dgts oxydatifs aux acides nucliques: les bases oxydes
En raison de l'importance de la guanine pour notre travail, ses schmas d'oxydation seront
considrs en dtails. Pour les autres bases, nous nous contenterons de prsenter les produits
d'oxydation et de rfrer aux publications originales pour l'explication des schmas.
1.3.8.1 Les ractions de la guanine
Parmi les composants de l'ADN, la guanine est la cible prfrentielle des ractions de
photosensibilisation de Type I (soustraction d'un seul lectron ou d'un hydrogne) et la seule
cible significative des ractions de Type II (mdies par l'oxygne singulet
1
O
2
). La guanine,
une base nuclique trs sensible aux dgts oxydatifs, se dcompose suivant des schmas
complexes (Figure 1.3-5).
1.3.8.1.1 Oxydation par le radical

OH et oxydations mono-lectroniques
L'attaque par le radical

OH de la 2'-dsoxyguanosine ainsi que l'oxydation mono-


lectronique (par exemple lors d'une photo-oxydation directe de Type I) aboutissent aux
mmes produits principaux, un driv imidazole-4-one (driv 5), instable, et son produit
d'hydrolyse-rarrangement, une oxazolone (driv 6). Ces ractions procdent via un radical
oxydant neutre (driv 3) qui existe sous plusieurs formes tautomres; celui-ci subit une
dgradation impliquant l'ouverture du noyau pyrimidine au niveau de la liaison C5-C6,
l'addition d'un oxygne molculaire, l'addition d'une molcule d'eau sur la double liaison
N7-C8 et un rarrangement complexe. Lorsque le nucloside est expos aux radicaux

OH en
solution aqueuse are, la 8-oxodG (driv 8, form partir de l'addition du radical hydroxyle
en C8 au lieu de C4) n'est qu'un compos mineur (< 3 %); dans ces conditions, le driv
formamidopyrimidine (driv 9) n'est absolument pas form.
Par contre, dans l'ADN bicatnaire, le rendement en 8-oxodG augmente (~ 50 %) aux
dpens de l'oxazolone et de son prcurseur (drivs 6 et 5; ~ 30 %); la formamidopyrimidine
(driv 9), est alors gnre par l'ouverture du cycle imidazole en C8-N9, raison d'environ
20 %. De mme, dans les oxydations mono-e
-
, l'inclusion de la guanine dans un ADN
bicatnaire favorise la formation de 8-oxodG partir du radical cationique (driv 2).
1.3.8.1.2 Oxydation par les ractfs de type Fenton
Lors de l'oxydation par les ractifs de type Fenton (H
2
O
2
+ ascorbate + fer
(II)
), la
rpartition des produits d'oxydation change entirement. La rduction du compos 3 est alors
favorise; la formation de 8-oxodG (driv 8) est ainsi considrablement augmente par
rapport aux drivs 5 et 6 qui ne se forment quasi plus.
41
Figure 1.3-5 : Voies d'oxydations principales de la guanine dans les nuclosides et l'ADN


H
2
N
HN
N
N
N
H
2
N
N
N
N
N
O
H
2
N
HN
N
N
N
O
H
2
N
H N
N
N
N
O
H
2
N
HN
N
N
H
N
H
2
N
HN
N
NH
CHO
H
N
H
2
N
HN
N
N
N
H
2
N
HN
N
N
N
N
N
O
H
2
N
NH
5
N
O
O
H
2
N
H
2
N
NH
6
3
2 4
1
10
7
8 9
+
OH
O
O
O O
O
OH
O
O

OH
H
OH

OH
1
O
2
- H antioxydant
- H
+
- H
2
O
H
2
O, O
2
H
2
O
Ractions
mono-e
-
Rduction Oxydation
1
2
3
4
5
6
7
8
9

D'aprs (Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1997)
1. 2'-dsoxyguanosine
2. radical cationique
3. radical oxydant guanilyl
4. radical hydroxyl en C4
5. 2-amino-5-[(2-deoxy--D-erythro-pentofuranosyl)amino]-4H-imidazole-4-one
6. 2,2-diamino-4-[(2-deoxy--D-erythro-pentofuranosyl)amino]-5(2H)-oxazolone
7. radical 8-hydroxy-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosyl
8. 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine ( = 8-oxodG)
9. driv formamidopyrimidine
10. 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine
42
1.3.8.1.3 Oxydation par
1
O
2

Le traitement de la 2'-dsoxyguanosine par l'oxygne singulet induit 2 produits principaux
d'oxydation, les diastroisomres 4R* et 4S* de la 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-
dsoxyguanosine (drivs 10); le mcanisme passerait vraisemblablement par l'addition de
1
O
2
sur la guanine pour former un 4,8-endoperoxyde instable. La 8-oxodG (driv 8) est
galement forme, mais seulement dans un rapport de 1 7 par rapport aux diastroisomres
(Cadet et al., 1997).
Dans l'ADN bicatnaire cependant, la formation des diastroisomres est empche et la
8-oxodG devient, une fois de plus, le produit d'oxydation majeur. Notons que cette 8-oxodG
est prs de 100 fois plus ractive envers
1
O
2
que la guanine elle-mme; ses produits
d'oxydation principaux sont, dans l'ordre dcroissant d'importance (Cadet et al., 1997) : acide
cyanurique et/ou son prcurseur > oxazolone (driv 6) > diastroisomres (drivs 10).
1.3.8.1.4 Oxydation par

ONO
2
-

Au niveau du nucloside, l'attaque par le peroxynitrite induit la formation de l'oxazolone
(driv 6), des isomres de la 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine (drivs 10)
(Douki et Cadet, 1996), de la 8-oxodG (driv 8) et de la 8-nitrodG (Burney et al., 1999). Au
niveau de l'ADN, certains auteurs (Douki et Cadet, 1996) n'ont pu mettre en vidence comme
guanines oxydes que l'oxazolone et pas la 8-oxodG. Des tudes plus rcentes ont cependant
montr l'induction de 8-oxodG; celle-ci tant beaucoup plus ractive envers le peroxynitrite
que la dG, des doses trop leves de ONOO
-
auraient empch sa dtection dans les premires
sries d'expriences (Burney et al., 1999).
1.3.8.1.5 Conclusion
Des modifications marques dans les rendements de dgradation de la guanine sont
observes suivant que celle-ci est sous forme nuclosidique libre ou incorpore dans un ADN
double-brins; ces modifications sont probablement dues l'empilement des bases dans l'ADN
mais aussi, peut-tre, la prsence de cations lis (Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1999).
La 8-oxodG peut tre considre comme un marqueur ubiquitaire du stress oxydatif au
niveau de l'ADN; il s'agit en effet du produit de dgradation principal de la guanine, form
la fois par le radical

OH, par les oxydations mono-lectroniques, par l'oxygne singulet et par


le peroxynitrite. Sa mise en vidence ne peut cependant permettre la caractrisation du
mcanisme d'une attaque radicalaire.
43
1.3.8.2 Les ractions de l'adnine


N
N
N
N
NH
2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
N
N
N
H
N
NH
2
N
N
N
N
NH
2
N
N
N
N
OH
1
2 4
3
O
O
H
2
O
2

OH
Oxydation
mono-e
-


D'aprs (Cadet et al., 1995; Douki et Cadet, 1996)

1. 2'-dsoxyadnosine
2. 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyadnosine ( = 8-oxodA)
3. inosine
4. 2'-dsoxyadnosine N
1
-oxyde

44
1.3.8.3 Les ractions de la thymine

HN
N
O
CH
3
O
1
HN
N
O
CH
3
O
2
HN
N
O
CH
2
O
4
H
OH

HN
N
O
CH
3
O
5
HN
N
O
CH
2
OOH
O
7
OH
H
OOH
HN
N
O
CH
3
O
8
OH
HN
N
O
CH
3
O
9
OH
H
OH
O
HN
N
O
CH
2
OH
O
12
HN
N
O
CHO
O
13
HN
N
CH
3
OH
O
O
10
HN
C
H
O
11
OH
O
2
O
2
-
, H
+
O
2
O
2
-
, H
+
35 %
60 % 5 %
1
2
3
4
5
6
HN
N
O
CH
3
O
3
H
OH

HN
N
O
CH
3
O
6
H
OH
OOH
O
2
O
2
-
, H
+
HN
N
O
CH
3
O
14
Oxydation
mono-e
-
+


D'aprs (Wagner et al., 1990; Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1997)
1. thymidine
2. radical rducteur C-6
3. radical oxydant C-5
4. radical aromatique
5. 6-hydroperoxy-5-hydroxy-5,6-dihydrothymidine
6. 5-hydroperoxy-6-hydroxy-5,6-dihydrothymidine
7. 5-hydroperoxymethyl-2'-dsoxyuridine
8. acide 1-(2-dsoxy--D-erythro-pentofuranosyl)-5-hydroxy-5-methylbarbiturique
9. 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrothymidine
10. 1-(2-dsoxy--D-erythro-pentofuranosyl)-5-hydroxy-5-methylhydantone
11. N-(2-dsoxy--D-erythro-pentofuranosyl) formamide
12. 5-hydroxymethyl-2'-dsoxyuridine
13. 5-formyl-2'-dsoxyuridine
14. radical cationique
45
1.3.8.4 Les ractions de la cytosine



N
N
NH
2
O
1
OH
1
2
3
4
5
6
N
N
NH
2
O
10
Oxydation
mono-e
-
+

HN
N
O
O
5
OH
OH
HN
N
H
OH
O
O
7
HN
C
H
O
8
N
N
NH
2
O
4
OH
N
N
NH
2
O
2
H

N
N
NH
2
O
3
H
OH

N
N
OH
OH
O
6
NH
2
C
NH
C
NH
O
O
9
HN
N
O
O
11
NH
2
C O
H
2
O, e
-
H
2
O
O
2
H
OH
H

D'aprs (Wagner et al., 1990; Cadet et al., 1995; Cadet et al., 1997)
1. 2'-dsoxycytidine
2. Radical C-6
3. Radical C-5
4. 5-hydroxy-2'-dsoxycytidine
5. 5,6-dihydroxy-2'-dsoxyuridine
6. N-(2-dsoxy--D-erythro-pentofuranosyl)- 1-carbamoyl-4,5-dihydroxy-
imidazolidine-2-one
7. N-(2-dsoxy--D-erythro-pentofuranosyl)-5-hydroxy-hydantone
8. N-(2-dsoxy--D-erythro-pentofuranosyl) formamide
9. N-(2-dsoxy-D-erythro-pentosyl)-biuret
10. Radical cationique
11. 2'-dsoxyuridine
46
1.3.9 Dgts oxydatifs aux acides nucliques: les autres types de lsions
1.3.9.1 Les lsions doubles
Des lsions doubles, appeles dgts en tandem, formes suite un seul vnement
radicalaire, peuvent apparatre. Ainsi, les composs formylamine/8-oxoG et 5-
(uracilyl)methyl/guanine oxyde ont t mis en vidence aprs attaque par, respectivement,

OH et photo-oxydation de Type I. D'autres dgts en tandem mdis par

OH incluent les
nuclosides cyclopurines qui comportent une lsion, la fois au niveau du sucre et de la base
(Cadet et al., 1999).
1.3.9.2 Les cassures de chanes
1.3.9.2.1 Les cassures de chanes provenant d'une attaque directe
Les attaques radicalaires, notamment

OH et ONOO
-
, peuvent former un radical au niveau
du dsoxyribose. Celui-ci se fragmente de diffrentes faons, menant une cassure de chane,
un sucre ls alcali-labile ou un relargage de la base nuclique pour former un site
abasique, lui aussi alcali-labile (Halliwell et Aruoma, 1991; Burney et al., 1999).
1.3.9.2.2 Les cassures de chanes provenant d'un mcanisme indirect
Il est galement possible qu'un stress oxydatif enclenche au niveau de la cellule une
squence d'vnements qui mne une augmentation du calcium libre intra-cellulaire et une
activation d'endonuclases calcium-dpendantes (Ueda et Shah, 1992). Celles-ci
fragmenteraient alors l'ADN dans un mcanisme semblable celui de l'apoptose (Halliwell et
Aruoma, 1991).
1.3.9.3 Les liens croiss ADN-protines
Rappelons que le traitement de la chromatine par des radiations ionisantes et par des
ractifs de type Fenton provoque des liens croiss ADN-protines (cf Section 1.1)
1.3.9.4 Les adduits avec des produits de la peroxydation lipidique
Si les aldhydes gnrs par une peroxydation lipidique se trouvent proximit de l'ADN,
ils peuvent se combiner avec certaines bases. Des adduits entre le malondialdhyde (MDA) et
l'adnine, la guanine et la cytosine ont t mis en vidence (Agarwal et Draper, 1992;
Marnett, 1999) (Figure 1.3-6). L'adduit MDA-guanine subit une ouverture de cycle rapide et
quantitative dans l'ADN bicatnaire, mais pas dans l'ADN simple-brin. Quand l'ADN portant
l'adduit cycle ouvert, N
2
-propnyl-dG, est dnatur, le cycle se referme, reformant l'adduit
MDA-guanine, et ainsi de suite chaque cycle de dnaturation-renaturation. Cet adduit est
47
galement un ractif lectrophile envers les amines, pouvant mener des liens croiss ADN-
ADN ou ADN-protines.
Le 4-hydroxy-2-nonnal peut former un poxyde en 2,3 qui forme des thno-adduits avec
l'adnine, la guanine et la cytosine (Chung et al., 1999; Marnett, 1999) (Figure 1.3-7).
L'acrolne et le crotonaldhyde peuvent ragir avec la guanine pour former des hydroxy-
propano-dsoxyguanosines (Marnett, 2000) (Figure 1.3-7).

Figure 1.3-6 : Adduits forms entre le malondialdhyde (MDA) et les nuclosides de l'ADN

H
H
O
O
H
H
O
HO
ADN
N
N
N
N
Adduit MDA-dG
O
N
HN
N
N
N
N
H
H
O
H
H
N
N
N
H
H
O
H
H
O
HN
N
N
N
O
N
H
O
Adduit MDA-dA Adduit MDA-dC
-hydroxyacrolne
MDA
N
2
-oxopropnyl-dG

D'aprs (Marnett, 2000)

48

Figure 1.3-7 : Autres adduits forms entre les produits de la peroxydation lipidique et les
nuclosides de l'ADN

N
N
N
N
Ethno-dG
O
N
N
N
N
N
N
O
Ethno-dA Ethno-dC
N
N
N
N
N
N
O
N
H
OH
H
3
C
HN
N
N
N
N
O
N
H
OH
N
N
N
N
O
N
H
HO
Hydroxy-propano-dsoxyguanosines

D'aprs (Marnett, 2000)
1.3.10 Stress oxydatif et pathologies
De nombreuses tudes exprimentales et pidmiologiques impliquent le stress oxydatif
dans le vieillissement, la carcinogense mais aussi dans une srie de processus pathologiques,
notamment inflammatoires, qui sont repris en partie dans le Tableau 1.3-4. Nous n'avons pas
la place dans ce travail de dvelopper ces multiples aspects et nous n'aborderons que la
problmatique stress oxydatif lsion l'ADN mutagense carcinogense (Section 1.4).
1.3.11 Les biomarqueurs du stress oxydatif
A ct de mthodes instrumentales (Punchard et Kelly, 1996) principalement utilises in
vitro (rsonance de spin d'lectron
8
, rsonance magntique nuclaire, radiolyse pulse), de
nombreuses mthodes biochimiques permettent la mise en vidence d'une attaque radicalaire;
un travail considrable a rsult dans le dveloppement de biomarqueurs fiables de
l'exposition des conditions pro-oxydantes. Ces marqueurs permettent nombre d'tudes, la
fois in vitro et in vivo, et ce, dans des domaines trs varis. Ceux-ci concernent par exemple
les conditions et mcanismes du stress oxydatif, les dfenses cellulaires, les mcanismes de
rparation, la nutrition, la gnotoxicologie, le biomonitoring environnemental et humain.

8
Couple des techniques de spin trapping pour les tudes in vivo
49
Tableau 1.3-4 : Quelques maladies dans lesquelles le stress oxydatif est ou serait
impliqu.

Neurologie
maladies
neurodgnratives
(Parkinson; Alzheimer)
lipofuscinose crode
neuronale
traumatisme
ischmie crbrale
trisomie 21
Systme pulmonaire
hyperoxie
bronchite chronique
emphysme
mucoviscidose
pneumoconiose
sarcodose
tabagisme
Systme cardio-vasculaire
athrosclrose
ischmie-reperfusion
Rhumatologie
syndrome de Raynaud
arthrite rhumatode
synovite inflammatoire
Tractus gastro-intestinal
pathologies
inflammatoires (Crohn)
pancratite
thylisme
ischmie hpatique
Intoxications
thylisme
Maladies rnales
nphropathies
hmodialyse
Muscles
dystrophie musculaire
exercice
Maladies endocriniennes
diabte
Pathologies infectieuses
fivre hmorragique
parasitologie
infection HIV
septicmie
otite moyenne
mningites
Dermatologie
radiations solaires et
ionisantes
photosensibilisation
maladies gntiques
(xroderma
pigmentosum;
porphyries)
Ophtalmologie
rtinopathies
vitropathies
cataracte
Surcharges en mtaux
cuivre (maladie de
Wilson)
fer (hmochromatose)
Carences alimentaires
slnium
vitamine E
Exposition aux radiations
ionisantes
accidentelle ou militaire
traitement mdical

D'aprs (Gutteridge et Halliwell, 1994; Sahnoun et al., 1998)

Les biomarqueurs classiques sont les antioxydants cellulaires enzymatiques et non-
enzymatiques, tels que les tocophrols, le glutathion rduit, les superoxyde dismutases, les
glutathion peroxydases ou les catalases. Ces marqueurs mesurent la capacit ragir des
conditions oxydantes mais ne donnent quasi pas d'information sur les dgts subis par la
cellule, le tissu ou l'organisme. Les dommages rels sont en fait reflts par les biomolcules
et une srie de lsions oxydatives ont t proposes en tant que biomarqueurs invasifs ou non-
invasifs (Kinter, 1995; de Zwart et al., 1999). Un schma gnral pour la validation
biologique des biomarqueurs d'exposition (Taioli et al., 1994) et un modle dcisionnel pour
leur slection et leur valuation ont galement t proposs (Stevens et al., 1991).
50
Bien que les techniques chromatographiques soient communment appliques la
dtermination des biomarqueurs de dgts oxydatifs aux biomolcules, il n'y a que quelques
mthodes pour lesquelles des donnes trs partielles de validation analytique aient t
publies. Notamment pour des marqueurs de la peroxydation lipidique (Tomita et al., 1990;
Morrow et Roberts, 1991; Wieland et al., 1992; Luo et al., 1995; de Zwart et al., 1997;
Stashenko et al., 1997; Basu, 1998; Cighetti et al., 1999), pour des adduits l'ADN (Takeuchi
et al., 1994; Povey et Cooper, 1995; Farooq et al., 1997; Doerge et al., 1998; Przybyszewski
et al., 1998) et pour l'essai comte (single-cell gel electrophoresis) (Collins et al., 1997b;
Belpaeme et al., 1998; Gedik et al., 1998).
De nombreuses questions sur les performances analytiques de ces mthodes restent donc
sans rponse et la fiabilit de certaines donnes publies peut certainement tre mise en doute
(Cadet et al., 1998).
1.3.11.1 Les biomarqueurs de la peroxydation lipidique
Comme nous l'avons vu, les lipides insaturs des membranes sont habituellement
considrs comme la premire cible des oxydants; leur peroxydation gnre des alcanes
volatiles ainsi que des aldhydes relativement stables de poids molculaires faibles.
La disparition des dines conjugus peut tre suivie par la mesure de l'absorbance UV
234 nm (Esterbauer et al., 1989). Un index total de peroxydation est couramment mesur par
une colorimtrie des chromophores forms par raction des aldhydes et autres produits de
dgradation avec l'acide thiobarbiturique (Halliwell et Chirico, 1993). Les aldhydes
individuels peuvent tre galement mesurs, principalement par GC (Frankel et al., 1989) et
GC-MS (de Zwart et al., 1999), mais aussi par HPLC aprs drivation, par exemple avec
l'acide thiobarbiturique (Kinter, 1995) ou la 2,4-dinitrophnylhydrazine (Werner et al., 1990;
Halliwell et Chirico, 1993). L'excrtion pulmonaire des alcanes est utilise pour estimer le
stress oxydatif au niveau d'un organisme entier (de Zwart et al., 1999).
La plupart de ces mthodes analysent les produits terminaux de la peroxydation lipidique.
Des produits intermdiaires, tels que les hydroperoxydes de lipides insaturs et d'esters de
cholestrol, sont fort spcifiques d'une attaque oxydative, mais ils sont plus rarement mesurs,
soit par iodomtrie, HPLC (Wieland et al., 1992) ou GC-MS (Thomas et al., 1991; Turnipseed
et al., 1993). Une dconvolution des spectres UV entre 210 et 300 nm permet le suivi
simultan des hydroperoxydes, du 7-ctocholestrol ainsi que des aldhydes conjugus et non
conjugus (Pinchuk et Lichtenberg, 1996).
51
Les biomarqueurs probablement les plus spcifiques sont les prostaglandines du type F2
isoprostane; celles-ci sont en effet quasi-exclusivement drives de l'acide arachidonique par
une voie oxydative indpendante des cyclooxygnases (Morrow et al., 1990). Elles peuvent
tre analyses par GC-MS aprs silylation (Kinter, 1995) et par immunodosages (de Zwart et
al., 1999).
Lorsque des cellules sont incubes in vitro en prsence d'acide cis-parinarique, un acide
gras exogne, polyinsatur et fluorescent (Drummen et al., 1999; van den Berg, 1999), ou
d'undcylamine-fluorescine (Makrigiorgos et al., 1997), ces marqueurs s'incorporent dans les
lipides cellulaires. Comme leur fluorescence diminue en cas d'oxydation, ce sont des
indicateurs sensibles de la peroxydation lipidique.
De grandes quantits d'adduits lipophiles l'ADN ont t rcemment mises en vidence
par
32
P HPLC (Yang et al., 1998) et pourraient tre des marqueurs prometteurs.
1.3.11.2 Les biomarqueurs de l'oxydation des protines
Le contenu total en carbonyles des protines est un indicateur prsum de dgts
oxydatifs; ces carbonyles sont forms par oxydation des chanes latrales des acides amins
ou par raction avec des produits d'oxydation des sucres ou des lipides. Ces carbonyles
peuvent tre estims par une simple mesure en spectrophotomtrie UV (de Zwart et al., 1999),
par immunologie (Buss et al., 1997) ou par HPLC aprs raction avec la 2,4-
dinitriphnylhydrazine (Shacter et al., 1996). Un couplage de ce ractif avec un anticorps
permet mme un marquage in situ des protines oxydes (Smith et al., 1998). Une rduction
des carbonyles avec un ractif boro[
3
H]hydrure permet une mesure sensible de la radioactivit
incorpore dans les acides amins (Winter et Liehr, 1991). La mesure des thiols protiques,
par exemple en spectromtrie visible aprs condensation avec l'acide 5,5'-dithio-bis-(2-
nitrobenzoque) (Soszynski et Bartosz, 1997), permet galement une estimation du dommage
oxydatif.
Plusieurs protines et acides amins oxyds, hydroxyls ou nitrs ont t utiliss comme
biomarqueurs, par exemple, les hydroperoxydes et hydroxydes de protines (Dean et al.,
1996), les adduits protine-3,4-dihydroxyphnylalanine (Dean et al., 1996), l'ortho-tyrosine et
la dityrosine (Huggins et al., 1993; Daneshvar et al., 1997), ou encore l'acide 5-hydroxy-2-
amino-valrique, un marqueur de l'oxydation de l'arginine et de la proline (Ayala et Cutler,
1996); ils sont mesurs par diverses techniques chromatographiques et immunologiques.
52
D'autres marqueurs sont moins activement tudis car ils ncessitent encore des mthodes
de quantification adquates. C'est le cas des adduits ADN-protines, par exemple ceux induits
par des produits de la peroxydation lipidique (Younes, 1995); il en va de mme pour
l'expression de divers peptides ou protines, comme les molcules d'adhsion (Treina et al.,
1996).
1.3.11.3 Les biomarqueurs de l'oxydation de l'ADN
Les acides nucliques sont une cible majeure des modifications oxydatives, certainement
pas du point de vue quantitatif, mais bien du point de vue biologique. L'impact des oxydations
au niveau de l'ARN doit encore tre valu, mais il est prsent bien tabli que certaines
modifications de l'ADN peuvent tre hautement mutagnes, rsultant en transitions, en
transversions, cassures de chanes, dltions, Quelques-unes des lsions que nous venons
de passer en revue sont certainement d'excellents biomarqueurs, non seulement de l'exposition
des conditions pro-oxydantes, mais surtout du risque carcinogne (Halliwell, 1998a).
Les dgts oxydatifs l'ADN (Frenkel et Klein, 1993) ont t quantifis par des mthodes
immunologiques (Snopov et al., 1995; Mistry et al., 1999) et par chromatographie des bases
modifies aprs digestion acide ou enzymatique, notamment par GC-MS (Dizdaroglu, 1994),
HPLC (Maidt et Floyd, 1996), lectrophorse capillaire (Le et al., 1998), post-marquage
32
P et
fluorescence (Randerath et al., 1992). La 8-oxodG, un des marqueurs les plus utiliss (Kasai,
1997), sera prsente en dtails dans la section 3 de ce travail.
Les cassures simple-brins et doubles-brins sont mesures par diffrentes mthodes qui
seront dcrites dans la Section 5.2.2.3. Les liens croiss ADN-protines peuvent tre
quantifis par des mthodes de prcipitation slective (Voitkun et Zhitkovich, 1999).
1.3.11.4 Autres biomarqueurs refltant un dgt oxydatif
Les diffrents organes, foie, poumon, peau, le sang, le plasma mettent une faible
quantit de lumire, appele la chemiluminescence; celle-ci est due aux ROS et aux radicaux
lipidiques. Certains phnomnes biologiques, comme la phagocytose, sont galement
accompagns d'une mission de lumire, concomitante la production de ROS. Cette lumire,
aprs une ventuelle amplification par des agents chimiques comme le luminol et la
lucignine, peut tre mesure par un systme photomultiplicateur (Vladimorov, 1996; Parij,
1999).
Bien qu'il ne puisse tre considr comme un marqueur stable de dgts oxydatifs, le
peroxyde d'hydrogne a t mesur, lors d'tudes cliniques, dans l'air exhal, les urines et la
salive (de Zwart et al., 1999).
53
Sous l'attaque du radical

OH, le dsoxyribose forme du malondialdhyde qui est alors


condens avec l'acide thiobarbiturique pour former un chromogne, mesurable en
spectrophotomtrie visible. Cette mthode est utilise pour doser le radical

OH, bien que sa


spcificit ne soit probablement pas absolue et que d'autres ROS puissent entrer en jeu
(Halliwell et Gutteridge, 1999; Parij, 1999).
Des xnobiotiques sont employs comme marqueurs sensibles de la gnration des ROS
(Kaur et Halliwell, 1996). Ainsi, sous l'action des

OH, le salicylate se transforme en acides


2,3-dihydroxybenzoque et 2,5-dihydroxybenzoque. Le driv 2,5-dihydroxy pouvant tre
form par les cytochromes P450, seul le driv 2,3-dihydroxy est considr en tant que
biomarqueur; celui-ci peut tre mesur de manire sensible par HPLC avec dtection
lectrochimique . De mme, la phnylalanine s'hydroxyle en ortho- et mta-tyrosine, l'aniline
en ortho- et para-aminophnol, le phnol en hydroquinone et catchol (Radzik et al., 1983), le
terephtalate en 2-hydroxyterephtalate fluorescent (Qu et al., 2000). Des indicateurs dont la
fluorescence change en fonction de l'tat d'oxydation ont t galement proposs (Rosenkranz
et al., 1992; Wang et Joseph, 1999; Chen et Gee, 2000).

1.4 LA LUMIERE ET LA PEAU
1.4.1 La lumire
Pour l'ensemble du spectre lectromagntique (Figure 1.4-1), l'nergie d'une onde est une
fonction inverse de sa longueur d'onde :
E = h. = h.c

Dans cette quation, E est l'nergie, h la constante de Planck (6.63 x 10
-34
joules.sec
-1
), la
frquence de l'onde, c la vitesse de la lumire dans le vide (3 x 10
8
m/sec) et la longueur
d'onde.
Aux longueurs d'onde les plus courtes (rayons X et ), la radiation lectromagntique a
tendance se comporter comme une particule, alors qu'aux longueurs d'onde leves, elle a
plutt le comportement d'une onde. Les portions visibles et UV occupent une position
intermdiaire et prsentent la fois des proprits d'onde et de particule (photon). Comme
toutes les ondes lectromagntiques, les ondes de lumire peuvent interfrer entre elles, se
polariser et se courber lgrement pour passer un angle. Ces proprits permettent de filtrer la
54
Figure 1.4-1 : Spectre lectromagntique et pntration de la lumire travers la peau

UV
Vis
Rayons Rayons Infrarouge Micro- Ondes
X ondes radio
U
V
B
10
-9
10
-7
7 x 10
-7
10
-3
1 m
UVC UVA Visible IR
290 315 400 700 nm
Stratum
corneum

Epiderme

Derme




















D'aprs (James, 1991; Kornhauser et al., 1991; Nelson et Cox, 2000)

lumire par longueur d'onde ou de l'amplifier de manire cohrente, comme dans un laser. La
propagation de la lumire est modlise comme un rayon suivant une ligne droite et les
lentilles et miroirs redirigent ces rayons suivant des trajectoires prvisibles. Dans un systme
optique macroscopique et non cohrent, tel que nous l'avons employ dans ce travail, les
ondes lumineuses sont distribues alatoirement et il y a un nombre suffisant de photons pour
que les effets ondulatoires puissent tre considrs insignifiants (Ryer, 1997).
La plupart des effets photobiologiques montrent une rciprocit entre les temps
d'exposition et l'intensit du rayonnement. La rponse dpend du nombre total de photons et
non de la vitesse laquelle ils sont reus. Cependant, pour les phnomnes dans lesquels des
processus de rparation entrent en jeu et pour les doses massives, cette rciprocit peut ne
plus tre vrifie (Kochevar, 1992).
55
1.4.2 La peau humaine
La peau est un organe htrogne constitu de 2 couches principales, le derme et
l'piderme, sous-tendues par une paisseur variable de graisses sous-cutanes, l'hypoderme.
Sa structure anatomique (Figure 1.4-2) varie fortement selon la zone du corps, l'ge, l'tat
de sant, notamment en ce qui concerne l'paisseur des diffrentes couches et leurs proprits
physiologiques. Le collagne est le principal constituant de la matrice extracellulaire.
1.4.2.1 L'piderme
Il s'agit d'un pithlium stratifi non vascularis dans lequel plusieurs couches sont
distingues du point de vue histologique; savoir, depuis la base, le stratum basale (couche
basale), le stratum spinosum (couche de Malpighi), le stratum granulosum (couche
granuleuse) et le stratum corneum (couche corne). Son paisseur varie de 40 m (paupires)
1.6 mm (plante des pieds).

Figure 1.4-2 : Vue d'ensemble de la peau

(Shier et al., 1996)
56
Les kratinocytes, cellules nucles mtaboliquement actives, se diffrencient et se
kratinisent au cours d'une volution de 28 jours environ. Les cellules sont continuellement
formes (pidermopose) dans la couche basale, la jonction dermo-pidermique. En
migrant d'une couche l'autre, la kratinisation, processus li au mtabolisme lipidique,
progresse. Les cellules perdent finalement leur noyau et leurs lipides, s'aplatissent et
durcissent pour former les cornocytes, cellules polyhdriques riches en kratine, de 30 50
m de long sur 0.2 2 m d'paisseur, la membrane extrmement rsistante. Au niveau du
stratum disjunctum, les cellules cornes finissent par desquamer. L'ensemble de la couche
cornee contribue contrler l'hydratation de la peau et le transport percutan. Les substances
hydrosolubles et les lipides de l'piderme et des glandes cutanes se retrouvent la surface de
la peau, sous une forme plus ou moins mulsifie (Langguth et al., 1991).
Intercals entre les kratinocytes de la couche basale, les mlanocytes tendent leurs
dendrites. Ils relarguent dans les kratinocytes voisins des mlanosomes, vsicules contenant
des pigments, les mlanines. Ces pigments protecteurs sont la fois un filtre de densit
neutre, capable d'attnuer les radiations solaires depuis les UV jusqu'aux confins du visible
(Bickers, 1998), et un changeur d'lectrons qui permet de piger les espces ractives de
l'oxygne (Pathak, 1986).
Les cellules de Langerhans sont les principales cellules dendritiques de la peau. Elles
drivent de la moelle osseuse et contiennent des granules cytoplasmiques distincts, les
granules de Birbeck (Muller et al., 1992). Etalant de longs dendrites, elles sont rparties dans
les cellules pidermiques (stratum spinosum) raison d'environ 2 %. Elles sont spcialises
dans la prsentation des antignes dans le cadre de la rponse immunitaire mdie par les
lymphocytes T (Bayerl et al., 1999). D'autres types de cellules dendritiques, rcemment mises
en vidence, joueraient galement un rle important dans les rponses immunitaires (Meunier,
1999).
Les cellules de Merkel (stratum granulosum) sont des rcepteurs la douleur, au prurit et
la temprature.
Un trafic permanent des lymphocytes T entre la peau et la circulation systmique, et donc
l'quilibre entre activation et tolrance immunitaire, dpend de nombreux facteurs, notamment
de mdiateurs solubles (intgrines, slectines et cytokines) qui seraient en partie rguls via
les cellules dendritiques (Stevens et Bergstresser, 1999).
57
1.4.2.2 Le derme et l'hypoderme
Le derme forme la masse principale de la peau et lui assure rsistance et lasticit. Il
supporte et lie la couche pidermique; son paisseur varie de 3 5 mm. Ses papilles
augmentent la surface de contact entre les 2 tissus, assurant la cohsion de l'ensemble et
l'alimentation de l'piderme. Le derme est un tissu essentiellement non cellulaire, constitu
d'une matrice dense de tissu conjonctif, fibreux et lastique, le collagne, imbriqu dans des
glycosaminoglycanes et des protoglycanes. Il comprend des fibroblastes, des histiocytes, les
corpuscules de Meissner (sensation du toucher), les corpuscules de Pacini (capteurs de
pression et de vibration) et des mastocytes. Ces derniers jouent un rle dans le dclenchement
de ractions allergiques. La matrice enrobe galement des fibres nerveuses, des capillaires
sanguins, des vaisseaux lymphatiques, les glandes sudoripares, de mme qu'une partie de
l'appareil pilosbac.
L'hypoderme n'a qu'une frontire floue avec le derme. Il est form de tissu conjonctif
lche dont les mailles enserrent des amas d'adipocytes; il est l'origine du tonus cutan et
forme un manteau d'isolation thermique et de protection mcanique. Dans l'hypoderme se
trouvent des vaisseaux sanguins et lymphatiques, des muscles et les follicules pileux
(Langguth et al., 1991; Magee, 1991; Bickers, 1998).
1.4.3 Le rayonnement solaire
Bien que l'nergie mise par le soleil corresponde pratiquement tout le spectre
lectromagntique, seule une troite portion du rayonnement arrive la surface de la terre.
Cette fraction correspond une partie des ultraviolets (depuis environ 290 nm), au visible et
aux infra-rouges proches. L'ozone stratosphrique, qui se forme par interaction de l'oxygne
avec les rayonnements infrieurs 100 nm, absorbe l'nergie incidente entre 120 et 310 nm,
ce qui permet de filtrer efficacement les radiations les plus nergtiques (Figure 1.4-3).
Les mesures du flux solaire montrent cependant que les doses d'UVB qui arrivent la surface
du sol peuvent varier jusqu' un facteur 20. Cette variabilit est en partie lie des effets
saisonniers, au trajet optique de la lumire dans les couches d'ozone et d'air, l'altitude, la
latitude, la quantit de nuages, de brouillard et de pollution (Bickers, 1998). Une rduction
drastique de l'ozone atmosphrique, telle qu'actuellement observe
9
, devrait avoir des
consquences biologiques importantes qui semblent enfin proccuper les dcideurs politiques.
Bien que la distribution des longueurs d'onde solaires dpende fortement de la latitude, les

9
Aux latitudes moyennes de l'hmisphre nord, la diminution d'ozone par dcennie est actuellement estime 6
7 % en hiver et 2 3 % en t (Diffey, 1999).
58
Figure 1.4-3 : Spectre de l'nergie solaire reue la surface de la terre avec les
principales bandes d'absorption atmosphriques (O
2
, O
3
et H
2
O).


(Kornhauser et al., 1991)

fluences
10
en UVA sont gnralement 10 50 fois suprieures celles des UVB (El-Ghorr et
Norval, 1999) et beaucoup plus constantes au cours de la journe et des saisons (Gasparro et
al., 1998). Les nuages attnuent les UVB et UVA de 25 35 % mais ils absorbent beaucoup
plus les infrarouges, diminuant la sensation d'avertissement par la chaleur au niveau cutan.
Ils augmentent de la sorte les risques de surexposition aux UV (Diffey, 1999).
La composante du spectre solaire photobiologiquement active la surface de la terre
inclut les longueurs d'onde de 290 700 nm. Bien que la portion infrarouge induise
principalement un effet thermique, elle est susceptible d'interfrer avec la rponse
physiologique aux longueurs d'onde plus basses (Menezes et al., 1998).

10
cf Section 2.3.1.4
59
1.4.4 Le soleil et la peau
" A la fois bienfaisant et cruel, l'astre du jour a toujours t l'objet de vnration, par
exemple dans l'ancienne Egypte. Le dernier culte en date est celui, n il y a peu, du
bronzage, c'est--dire du hle rig en signe de bonne sant, de bien-tre matriel et
de dynamisme de bon aloi." (Bertrand, 1992)
De fait, les modes de vie se sont nettement modifis au cours des dernires dcennies. Un
surplus de loisirs passs en "vacances ensoleilles", le recours au bronzage artificiel, la
mauvaise utilisation des produits solaires et le port de vtements rduits leur plus simple
expression entranent des expositions au soleil plus frquentes et plus longues (Diffey, 1999).
1.4.4.1 Pntration de la lumire travers la peau
La rponse de la peau vis--vis d'une radiation lectromagntique est variable suivant la
longueur d'onde et la dose reue. La transmission des rayons lumineux (Figure 1.4-1) dpend
de nombreux paramtres, parmi lesquels la couleur de la peau, l'paisseur et l'tat de
l'piderme ainsi que le spectre d'absorption, la concentration et la distribution des
chromophores dans les diffrentes couches cutanes. D'ventuelles expositions solaires
antrieures peuvent galement jouer un rle, ainsi que certains tats pathologiques altrant
l'intgrit du revtement pidermique tels que brlures ou psoriasis (Kornhauser et al., 1991).
La peau est un milieu non homogne constitu de plusieurs couches qui prsentent des
proprits optiques propres et une distribution particulire de chromophores. Le stratum
corneum transmet les longueurs d'onde de 250 3000 nm. Une partie de l'nergie (4 7 %)
est perdue par rflexion; l'acide urocanique
11
, dpos la surface de la peau par la
perspiration, ainsi que les lipides excrts dans le sbum peuvent rduire fortement cette
transmission. Une autre partie du rayonnement, principalement pour les longueurs d'onde les
plus basses, est disperse et absorbe par les chromophores endognes, savoir, les mlanines,
l'acide urocanique, les protines, les lipides et les drivs de cholestrol. Dans l'piderme, les
40 % des UVB qui ont pu traverser la couche corne sont absorbs quasi totalement par les
mmes chromophores auxquels s'ajoutent les acides nucliques des cellules vivantes. Des
mesures d'induction de dimres cyclobutanes dans l'ADN ont cependant montr qu'un
rayonnement de 300 nm tait attnu de seulement 2.5 % par couche cellulaire traverse sans
qu'un gradient de dgts s'tablisse dans l'paisseur de l'piderme (Chadwick et al., 1995);

11
form par dsamination enzymatique de l'histidine
60
celui-ci n'offre en dfinitive que peu de protection contre les UVB la couche basale
germinative (Therrien et al., 1999).
Les UVA sont galement attnus par de nombreux chromophores, incluant le NADPH, le
NADH, les ttrahydroptrines et les flavines (Kornhauser et al., 1991; Kochevar, 1992). Pour
les radiations visibles, les chromophores majeurs sont la mlanine et l'hmoglobine mais la
protoporphyrine IX, la bilirubine et les carotnes absorbent galement. Il y a une vritable
fentre optique pour les radiations de 600 1300 nm, ce qui pourrait avoir des consquences
biologiques importantes. La peau est un organe principal de thermorgulation; elle est donc en
contact troit avec le sang et tous les mtabolites exognes et endognes sont susceptibles
d'tre activs par la lumire. La totalit du sang passe au niveau de la peau en 20 min
(Kornhauser et al., 1991; Beissert et Granstein, 1995), ce qui correspond au temps requis pour
recevoir de 1 2 MED
12
, le midi en t au Royaume-Uni (Duthie et al., 1999).
1.4.4.2 Effets des rayons solaires sur la peau
Une exposition solaire provoque diffrentes ractions de la peau qui peuvent tre classes
par rapport leur ordre chronologique d'apparition (Heenen, 2000) :
des lsions l'ADN; une biopsie 15 minutes aprs l'exposition montre que des
phnomnes de rparation sont dj effectifs; en fait, 24 h aprs exposition
1 MED d'UVB, 50 % de l'ensemble des cellules de la peau et 75 % des cellules de
Langerhans prsentent encore des dimres cyclobutanes dans leur ADN (Vink et al.,
1994);
une rgulation positive des facteurs de transcription AP-1, p53 et NF-B, dans les 15
30 minutes suivant l'irradiation (Young, 1999);
un rythme, d majoritairement aux UVB et dpendant en partie des lsions l'ADN
(Young, 1999);
une pigmentation, lie de manire encore incomprise l'rythme mais aussi aux
lsions l'ADN (Young, 1999);
une hyperplasie, un paississement de la couche corne qui serait en fait une
cicatrisation rparatrice aprs la mort apoptotique des cellules lses; ce phnomne
commence quelques heures aprs l'irradiation et persiste plusieurs semaines (Young,
1999).


12
MED = minimal erythemal dose, la dose minimale de radiation UV qui induit un rougissement de la peau
perceptible 24 h aprs l'exposition. Une MED correspond 21 mJ/cm pour le spectre d'un simulateur solaire.
61
Les effets de l'irradiation solaire et des UV sur la peau sont trs nombreux (Tableau 1.4-1)
et, malgr un nombre considrable d'tudes, encore relativement peu connus. Ils sont
extrmement complexes et dpendent des doses reues pour les diffrentes composantes du
spectre UV. Les effets de ces composantes peuvent en effet tre mdis par diffrents
mcanismes qui agiraient en synergie et/ou en antagonisme (El-Ghorr et Norval, 1999). Les
tudes menes avec des lampes de spectre bien dfini permettent d'lucider certains points et
d'attribuer certains effets des bandes prcises de longueurs d'onde mais la comprhension du
problme global reste encore fragmentaire.

Tableau 1.4-1 : Effets des rayons UV sur la peau

nm
UVB
290 315
UVA
2
315 340
UVA
1
340 400
Bnfices

Bronzage
++ + +
Synthse de vitamine D
3 ++ - -
Risques

Erythme
++ + -
Photolsion de l'ADN
++ + -
Cancers cutans
++ + ?
Vieillissement
++ + -
Immunosuppression
++ + -
Ractions photodynamiques Type II
- + ++
Lucites
+ + ++

D'aprs (Bertrand, 1992)

Les spectres des lampes employes, les filtres et monochromateurs, les niveaux d'nergie,
les temps d'exposition, les conditions d'irradiation et mme les radiomtres diffrent fortement
d'une tude l'autre. Il n'est donc gure tonnant que les donnes publies apparaissent
parfois contradictoires. A notre connaissance, il n'y a dbut de standardisation des mthodes
que dans les 2 domaines qui comportent un intrt notable pour l'industrie cosmtique,
savoir la mesure in vivo du facteur de protection solaire (SPF, sun protection factor)
(Chardon, 1997) et l'tude in vitro de la phototoxicit (Spielmann et al., 1994).

1.4.4.2.1 Effets aigus des rayons solaires : le"coup de soleil"
Le coup de soleil rsulte habituellement d'une exposition de la peau aux rayons UV. La
symptomatologie apparat dans un dlai de 4 24 h et, sauf en cas de raction svre, se
rsorbe entre 48 et 72 heures (Tableau 1.4-2). Les altrations cutanes vont de l'rythme
62
modr, suivi d'une desquamation rapide, la douleur, l'dme, la sensibilit douloureuse
au toucher et aux phlyctnes, qui rsultent d'expositions plus prolonges. Des symptmes
gnraux (fivre, frissons, faiblesse, choc) semblables ceux d'une brlure thermique peuvent
apparatre si la surface corporelle est atteinte sur une grande partie, ou encore tre lis un
coup de chaleur ou un puisement par la chaleur (Berkow et al., 1992).

Tableau 1.4-2 : Rponses cutanes une irradiation UV (rythme et bronzage)


Radiation solaire UVA UVB UVC PUVA
(a)

(psoralne+UVA)
Erythme

Dose relative 1 1000 1 0.5 1 5 100

MED 15 - 30 min 30 - 60 J/cm 30 - 60 mJ/cm 15 - 30 mJ/cm 0.1 - 10 J/cm
Temps (heures)
- dbut
- pic
- fin

4 6
24
72

< 1
6 12
24

6
24
72

4
6
12 - 36

12 24
48 72
> 96
Pigmentation

Dose relative 1 500 1 Pas de pigmentation 5 - 100
Temps (heures)
- dbut
- persistance

Immdiate et 72 h
+++

Immdiate
++

72
+++

-
-

Variable
+++

(a)
Effets variables avec la dose et la voie d'administration
(De Leo, 1992)

Le mcanisme du coup de soleil n'est pas encore connu avec prcision. La cible cellulaire
principale est probablement le kratinocyte, mais le chromophore n'est pas dtermin (De
Leo, 1992). D'aprs les spectres d'action, il s'agirait principalement de l'ADN avec induction
de dimres cyclobutanes et de photoproduits (6-4); la rponse rythmale serait en fait initie
par la rparation des photoproduits (6-4) (Young, 1999). Ceci suggre que l'rythme pourrait
tre un indicateur clinique des photodgts l'ADN; il faut cependant rappeler que des doses
sub-rythmales sont effectives dans l'induction de ces dommages (Young, 1999).
Le spectre d'action pour l'rythme implique la fois les UVB et les UVA; les UVB
seraient 1000 fois plus efficaces, mais, dans certaines conditions d'exposition,notamment le
midi, les UVA sont reus en doses trs importantes qui agissent en synergie avec les UVB.
Dans les coupes histologiques d'un piderme irradi par les UVB, des "sunburn cells",
kratinocytes fortement endommags et entrs en apoptose, sont visibles dans les 30 minutes
qui suivent l'exposition et atteignent un maximum dans les 24 h (Bayerl et al., 1999). Les
corps apoptotiques forms par les sunburn cells peuvent soit migrer "passivement" travers
63
l'piderme et desquamer, soit tre phagocyts par les kratinocytes intacts adjacents, les
cellules de Langerhans et les macrophages (Bayerl et al., 1999).
Les UVA produisent moins de kratinocytes endommags que les UVB, mais leur action
sur l'endothlium vasculaire est plus intense. Sous irradiation UVB et UVA, les kratinocytes,
mais aussi les mastocytes, librent des mdiateurs de l'inflammation, histamine,
prostaglandines (PG), interleukines (IL) et bradykinine (Bickers, 1998). Tous ces mdiateurs
contribuent dilater les vaisseaux et en augmenter la permabilit. L'IL-6 apparat comme
un mdiateur principal de la raction coup de soleil avec un pic 12 h et une persistance pass
72 h (Murphy, 1999).
1.4.4.2.2 Le bronzage
Le bronzage, coloration accrue de la peau aprs exposition au soleil, est biphasique. Il
commence par une pigmentation immdiate qui s'affaiblit rapidement jusqu'au dveloppement
d'une pigmentation retarde persistante (Tableau 1.4-2). La rponse primaire est due aux
photons UVA et procde probablement par oxydation de la mlanine dj prsente dans
l'piderme; la rponse retarde est due principalement aux UVB qui induisent une
augmentation du nombre de mlanocytes ainsi qu'une redistribution et une mlanisation
accrue des mlanosomes. Le degr de rponse pigmentaire dpend principalement du
phototype et de la dose de radiation (De Leo, 1992).
La mlanogense serait en fait initie par l'excision des photodgts l'ADN (Eller et al.,
1996; Gilchrest et Eller, 1999; Young, 1999).
La rgulation biochimique du mlanocyte apparat extrmement complexe; elle est
module par un grand nombre de mdiateurs produits par les cellules de l'piderme et du
derme (cytokines, lymphokines, prostaglandines, vitamines et facteurs de croissance).
Certains de ces signaux rgulent le type et la quantit de mlanine produite, d'autres affectent
la croissance, la dendricit, la migration ou la survie des mlanocytes (Hearing, 1999).

Chez
l'homme, l'influence des hormones mlanotropes sur la rponse pigmentaire reste conteste.
Les radiations UV induisent cependant (i) la synthse par les mlanocytes et les kratinocytes
de la mlanotropine (MSH) et de la corticotropine (ACTH) partir de pro-opiomlano-
corticotropine; et (ii) la rgulation positive de leur rcepteur mlanocytaire, le MC1R (Suzuki
et al., 1999).
1.4.4.2.3 Effets chroniques des rayons solaires
Une exposition chronique au soleil provoque un vieillissement de la peau. Epaississement,
rides, lastose, tlangiectasie et altrations de la pigmentation sont les consquences nfastes
64
les plus habituelles. Le derme est le site principal des dgts chroniques associs au soleil qui
seraient principalement le fait des UVA. Sa teneur en collagne diminue alors qu'augmentent
les fibres lastiques (lastine, fibrilline et desmosine), les glycosaminoglycanes, le nombre de
fibroblastes et de mastocytes; le taux en liens croiss du collagne s'lve. Un paississement
de l'piderme et une augmentation des kystes dermiques sont galement observs. Des lsions
kratosiques prcancreuses (kratose actinique ou solaire) constituent une consquence
frquente de plusieurs annes d'exposition excessive (Berkow et al., 1992).
Le photovieillissement prmatur de la peau serait d en grande partie des ROS, induits
par les UVA via un chromophore photo-excit. Les chromophores endognes possibles
incluent le NADH/NADPH, le tryptophane, la riboflavine et les porphyrines mais aussi une
transition photochimique mineure de l'acide trans-urocanique qui produirait du
1
O
2
(Hanson
et Simon, 1998).
1.4.4.2.4 Action sur le systme immunitaire
Une immunosuppression intense peut tre induite par une seule exposition des doses
leves d'UVB (Dandie et al., 1998), et ce aussi bien pour l'hypersensibilit immdiate
13
et
retarde
14
(El-Ghorr et Norval, 1999) que pour l'immunosurveillance vis--vis des cancers
UV-induits (Cruz, 1992). La suppression de l'hypersensibilit de contact est la fois locale
15
,
via une action sur les cellules dendritiques, mais aussi systmique
16
, via la libration de
mdiateurs solubles (Meunier, 1999). Les UVA induisent une inhibition locale, mais pas
d'inhibition systmique; cet effet tant aboli par les tocophrols, il a t attribu la
gnration d'espces ractives de l'oxygne (Halliday et al., 1998).
Ces phnomnes d'immunosuppression, extrmement complexes, font intervenir des
aspects cellulaires et molculaires que nous ne pouvons dtailler dans ce travail (Figure
1.4-4). Ils joueraient un rle considrable dans la possibilit de croissance des cancers UV-
induits (Finlay-Jones et Hart, 1998; Duthie et al., 1999; Murphy, 1999).
A ct de tous ces aspects cellulaires et molculaires, les photodgts directs l'ADN
seraient, d'aprs les tudes sur rongeurs, un vnement critique dans l'immunosuppression
(Meunier et al., 1998; Vink et al., 1998). De fait, l'limination des dgts cyclobutanes
restaure la rponse immunitaire (Vink et al., 1998) et un traitement topique avec des enzymes

13
Mise en vidence par l'application d'un haptne sur la peau
14
Mise en vidence par injection sous-cutane d'un antigne
15
Application d'un haptne sur la peau irradie
16
Application d'un haptne sur la peau un site distant du site d'irradiation
65
de rparation immdiatement aprs irradiation semble empcher la migration des cellules de
Langerhans (Dandie et al., 2000). Les tudes sur l'homme manquent cependant pour
confirmer cette hypothse (Duthie et al., 1999).

Figure 1.4-4 : Mcanismes potentiels d'immunosuppression






















UV
Mastocyte Cellule de
Langerhans
Mlanocyte
Kratinocyte
TNF
TNF
IL-1
IL-1ra > IL-1
IL-15
IL-10
IL-10 mRNA
IL-12, IL-18
Monocyte
Macrophage
Monocyte
Macrophage
Cellule T
Natural
killer
cell
cis-UCA
Trans-UCA
LAK
Th1 cytokines
Direct ou via PGE
2

(kratinocytes, mastocytes)
CD4
+
T
Th2 cytokines
CD4
+
> CD8
+

EPIDERME
?
Migration vers les
ganglions lymphatiques
Facult de prsentation
dantigne altre

D'aprs (Duthie et al., 1999)

1.4.4.2.5 Action sur la transduction des signaux intra-cellulaires
L'exposition aux UV est bien connue pour modifier la transcription de gnes et nombre
des effets cliniques observs rsultent probablement de modifications ce niveau. Les effets
sur plus de 100 gnes mammifres sont documents, la fois in vitro et in vivo (Applegate et
al., 1998; Young, 1999; Katiyar et al., 2000). Les mcanismes, cascades d'vnements
molculaires fort complexes inities par l'absorption des UV et la gnration de ROS,
commencent tre partiellement lucids, principalement in vitro (Figure 1.4-5).
Les principaux facteurs de transcription induits par les UV sont AP-1 (Wisdom, 1999), p53
(Meek, 1998; Young, 1999) et NF-B (Piette et al., 1997).

66
Figure 1.4-5 : Schma simplifi des vnements cellulaires reliant un stress UV
la transcription de gnes


(Young, 1999)

1.4.4.2.6 Ractions de photosensibilisation
Une molcule de photosensibilisant passe un tat excit singulet en absorbant un photon
d'nergie gale celle sparant son tat de base de l'tat excit (Figure 1.4-6). La molcule
excite, d'une dure de vie trs courte (< 10 nsec), peut dissiper l'nergie acquise sous forme
de chaleur et/ou de lumire (fluorescence) et retourner son tat de base. Elle peut aussi se
transformer par inversion de spin d'lectron en un autre tat excit, d'nergie intermdiaire,
donc plus stable (quelques sec), l'tat triplet. Cet tat triplet, caractris par la prsence
de 2 lectrons de mme spin, peut galement retourner son tat de base en mettant un
photon (phosphorescence). Les 2 tats excits peuvent aussi donner naissance des
photoproduits issus d'une isomrisation, d'une fragmentation, d'un rarrangement ou de
ractions intermolculaires (Kornhauser et al., 1991; Ito et Kawanishi, 1997b). L'tat singulet
n'a gure le temps de rencontrer d'autres molcules et initiera plutt des rarrangements de
structure du chromophore. La dure de vie plus longue de l'tat triplet lui permet de diffuser et
de ragir avec des constituants cellulaires (photosensibilisation de Type I) et avec de
67
l'oxygne (photosensibilisation de Type II). Cette raction formera principalement de
l'oxygne singulet
1
O
2
mais aussi de faibles quantits d'anion superoxyde O
2
-
.
De fait, bien que les sensibilisants endognes de la peau ne soient pas encore dtermins
avec prcision, les radiations solaires et UVA grvent svrement les dfenses antioxydantes
cutanes, la fois enzymatiques et non-enzymatiques (Fuchs et al., 1989; Fuchs et Packer,
1990; Dubertret, 1996) induisant une peroxydation lipidique (Tirache et Morliere, 1995) et
des dgts oxydatifs l'ADN (Douki et al., 1999).

Figure 1.4-6 : Interconversions entre les tats lectroniques d'une molcule sous l'action de la
lumire


(Kochevar, 1992)

1.4.4.2.7 Dgts au niveau de l'ADN
La dconvolution des spectres d'action pour les dgts l'ADN montre que les radiations
infrieures 327 nm ont une action essentiellement de "type UVC" (dommages directs), alors
que les radiations de longueurs d'onde suprieures 347 nm ont des "effets UVA" (dommages
oxydatifs) purs. Entre ces limites, les dgts l'ADN sont de type mixte UVC/UVA, le
rapport dpendant de la longueur d'onde (Peak et Peak, 1989). Une irradiation solaire induira
donc une grande varit de dgts, module par des synergies et des antagonismes entre les
composantes chromatiques. La diffrence classique pour le public entre "UVB dangereux" et
"UVA sans risques" est donc un leurre, que la limite arbitraire entre ces bandes soit fixe
315 ou 320 nm
68
1.4.4.2.7.1 Les dommages directs
Rappelons que ces dgts induits au niveau des sites dipyrimidiques, dimres
cyclobutanes et de photoproduits (6-4), ainsi que la possibilit de former des liens croiss
ADN - protines ont t largement dtaills dans la Section 1.1 de ce travail (Figure 1.4-7).
Ces photodgts ont un rle central dans l'irradiation solaire et sont probablement la cause
principale de l'rythme, de l'immunodpression, de la mlanogense et de la carcinogense
(Malorni et al., 1996).

Figure 1.4-7 : Les photoractions au niveau de l'ADN

450
250
300
350
400

(nm)
Chromophore
primaire
Mcanisme
Dgts
l'ADN
DNA
Dimres cyclobutanes
Photoproduits (6-4)+ isomres Dewar
Dimres thymidine-adnine
Compos
carbonyle
Type I
(transfert d'e
-
)
Photo-
sensibilisant
1
sens
3
sens
Type
II
O
2
1 Modification de guanine
(5'-G-3')
O
2
-
H
2
O
2

OH
Cassures de chane
Bases oxydes
(A~T~C~G)
Cassures de chane
Bases oxydes
(T>G>C>>A)
Type I
(transfert d'e
-
)
Modification de guanine
(5'-GG-3')
O
2
majeur
mineur
fer
cuivre
Photoaddition - dimrisation
Modification de guanine
hydrates de cytosine
Transfert d'e
-
Photohydratation
majeur


D'aprs (Cadet et al., 1997; Ito et Kawanishi, 1997b)

1.4.4.2.7.2 Les ractions photosensibilises
Certains photosensibilisants peuvent faciliter la formation de dimres cyclobutanes et de
photoproduits (6-4) par un mcanisme de Type I (Figure 1.4-7). C'est le cas par exemple lors
de l'irradiation de l'ADN des longueurs d'onde proches de 300 nm en prsence
d'actophnone ou de dihydroxyactone (Lamola et Yamane, 1967). Un mcanisme similaire
peut galement induire un attachement covalent base pyrimidique acide amin, donc
69
probablement des liens croiss ADN protines. Les guanines situes en 5' d'une guanine ou,
dans une bien moindre mesure, en 5' d'une adnine, sont galement sensibles une oxydation
par ce mcanisme (Ito et Kawanishi, 1997b); l'oxydation de cette guanine semble favorise
par un effet d'empilement qui modifierait sensiblement son potentiel d'ionisation.
Les photosensibilisations de Type II (
1
O
2
) ont t prsentes en dtails dans la Section
1.2; il y attaque slective des guanines. Une voie mineure procde par la formation de O
2
-
et
sa dismutation en H
2
O
2
. En prsence de fer
(II)
, il y a formation de

OH qui provoque des


cassures de chanes et attaque sans distinction les 4 bases; en prsence de cuivre
(II)
, il y a
galement des cassures de chanes mais, par contre, les dgts au niveau des thymines et des
guanines sont nettement plus frquents (Ito et Kawanishi, 1997b).
1.4.4.2.8 Gnralits sur les cancers cutans
La frquence des carcinomes basocellulaires (BCC) et spinocellulaires (SCC) cutans
chez les sujets de race blanche au teint clair est directement lie l'ensoleillement annuel de la
rgion. Ces lsions sont habituelles chez les adeptes du soleil et les personnes travaillant en
extrieur (agriculteurs, marins). Les carcinomes basocellulaires sont le plus souvent
accessibles un traitement chirurgical radical et ne mtastasent gnralement pas (< 0.5 %),
augurant d'un pronostic favorable (Lacour, 1999). Les carcinomes spinocellulaires se
dveloppent gnralement sur des lsions cutanes prcurseurs (dysplasies, kratoses
actiniques, lsion inflammatoire chronique) et sont observs en zones photo-exposes (visage,
mains). Leur traitement chirurgical pose peu de problmes un stade initial mais, de par leur
propension l'extension locorgionale et mtastatique, le pronostic est dfavorable un stade
plus avanc (Descamps, 1999).
L'incidence du mlanome malin cutan (CMM) augmente galement avec la dure
d'exposition au soleil, mais la relation est moins vidente que pour les autres cancers
(Berkow et al., 1992; Bickers, 1998). Le risque de mlanome n'est en gnral pas corrl avec
une accumulation d'expositions au soleil mais bien avec les squelles d'une exposition solaire
brutale dans l'enfance ou l'adolescence (Buzzell, 1993; Bickers, 1998). Deux types de CMM
peuvent tre opposs, d'une part le mlanome se dveloppant sur un nvus d'autre part le
mlanome "primitif" sans lsion pigmentaire prexistante (Drno, 1999). Ce sont des tumeurs
variables dans leur taille, leur forme, leur couleur (habituellement pigmente) et dans leur
tendance l'invasion et aux mtastases. Seuls le dpistage prcoce par inspection et la
pratique d'une biopsie afin d'apprcier histologiquement l'paisseur des mlanomes apportent
la garantie d'un traitement efficace et d'un pronostic optimal (Berkow et al., 1992). En effet, le
type de mlanome compte moins pour le taux de survie que l'paisseur de la tumeur au
70
moment du diagnostic. Le mode de dissmination du mlanome malin est la fois
lymphatique et sanguin; les mtastases cutanes et viscrales sont difficiles traiter et
rsultent en un taux de mortalit considrable (Drno, 1999).

1.5 LA MUTAGENESE ET LA CARCINOGENESE EN RAPPORT
AVEC LES DOMMAGES A L'ADN
La mise en vidence de toute une srie d'adduits et lsions l'ADN (Sections 1.1 et 1.2)
pose un certain nombre de questions qui restent pour la plupart sans rponse :
Quelles sont les lsions qui prsentent un risque pour la cellule ?
Une lsion donne est-elle en relation avec un risque de mutagnicit et/ou de
ltalit ?
Y a-t-il un seuil de risque ou une relation "dose quantit de lsion risque" ?
Quelle est l'importance de la localisation de la lsion ?
Quel est le rle des mcanismes de dtection et de rparation de la lsion ?
Un stress ou une lsion peut-il induire des facteurs de transcription ? Leur
induction est-elle priphrique ou, au contraire, centrale la rponse cellulaire ?
Y a-t-il des lsions marqueurs d'un risque ?

Bien qu'il y ait sans doute beaucoup de mcanismes communs, la situation dpend
largement du problme envisag. Il est vident qu'une lsion rare, mal dtecte, mal rpare,
mutagne et situe sur un gne essentiel prsentera un risque beaucoup plus grand qu'un
adduit abondant travers tout le gnome mais efficacement rpar. Il est en fait parfaitement
possible qu'une lsion "exotique", rare mais dvastatrice, n'ait pas encore t mise en
vidence; les mthodes actuelles les plus sensibles permettent, dans le meilleur des cas, de
dtecter une base modifie pour 10
7
10
8
bases normales, ce qui n'est peut-tre pas encore
suffisant
1.5.1 La carcinogense, un processus multi-tapes
La croissance et la diffrenciation cellulaire dpendent de l'action coordonne de gnes
promouvant (proto-oncognes), inhibant (gnes suppresseurs de tumeur) ou rgulant (gnes
des cyclines et protines apparentes) le cycle cellulaire. La progression tumorale serait la
consquence d'une cascade d'vnements successifs, en fait une accumulation de lsions

71
Figure 1.5-1 : Modlisation des diffrentes tapes de la carcinogense










Carcinogne
Initiation
(gntique, irrversible)
Promotion
(pigntique, rversible)
Progression maligne
(gntique, irrversible)
Pas de modification phnotypique Phnotype tumoral
Promoteur
D'aprs (Soufir et Basset-Seguin, 1999)

gntiques, lie l'volution clonale et la slection. Diffrents types d'altrations peuvent
s'observer, comme par exemple l'inhibition des gnes suppresseurs
17
ou l'activation des proto-
oncognes
18
(Weinstein et al., 1995; Soufir et Basset-Seguin, 1999).
La carcinogense est donc un processus multi-tapes (Figure 1.5-1) associ
l'accumulation de mutations et/ou l'expression anormale de gnes : (i) au cours de
l'initiation, une seule cellule, qui subit un vnement carcinogne, peut se dvelopper en
formant un clone cancreux; (ii) la promotion est une phase rversible dans laquelle
l'existence stable de la prolifration clonale cancreuse dpend gnralement d'un agent
agissant un niveau pigntique, par altration des voies de transduction de signaux, de
l'expression de gnes ou de la diffrenciation cellulaire; et (iii) la progression correspond la
croissance irrversible des cellules altres et leur volution ultrieure vers des phnotypes
htrognes d'autonomie et de rsistance. Dans ce processus multi-tapes, un agent promoteur
est administr aprs l'exposition l'agent carcinogne; l'inverse, la cocarcinogense
implique l'exposition simultane un agent carcinogne et un agent qui potentialise l'effet
carcinogne. Bien que de tels processus puissent tre exprimentalement bien dfinis, la
situation est certes plus complexe dans le monde rel o l'exposition des mlanges divers
d'initiateurs et de promoteurs est continue et rpte. Il est donc probable que se succdent
plusieurs cycles de dgts l'ADN, d'expansion clonale et de promotion de tumeur (Berkow
et al., 1992; Weinstein et al., 1995; Owens et al., 1999).

17
Les mutations les plus souvent impliques en cancrogense humaine se situent au niveau des gnes
suppresseurs p53 et p16
18
L'activation des proto-oncognes ras est l'anomalie la plus frquente dans les tumeurs solides
72
Il est habituel de classer les composs chimiques suivant la terminologie classique en
"initiateurs", "promoteurs", "carcinognes complets" et "progresseurs"; mais ces distinctions
deviennent floues en regard de la facult de certains composs agir par altration de l'ADN
et/ou augmentation de la prolifration cellulaire. Une classification diffrente a donc t
propose, qui se base la fois sur la proprit des carcinognes interagir ("gnotoxique") ou
pas ("non-gnotoxique") avec l'ADN et sur leurs proprits prolifratives. Un non-gnotoxique
agit par augmentation de la prolifration cellulaire soit par interaction avec un rcepteur
cellulaire spcifique
19
soit par un mcanisme non spcifique qui peut tre (i) un stimulus
mitogne direct; (ii) une toxicit suivie d'une rgnration; ou (iii) l'interruption d'un processus
physiologique. Tous ces mcanismes peuvent galement tre induits par un gnotoxique, ce qui
contribue alors en renforcer les effets (Cohen et Ellwein, 1990).
1.5.2 Lsions l'ADN et mutations
1.5.2.1 Types de mutations
Les mutations les plus frquentes dues l'exposition un agent mutagne chimique ou
physique sont les mutations ponctuelles; elles rsultent de la substitution d'une paire de bases
ou de l'addition / dltion d'un petit nombre de paires de bases (Tableau 1.5-1). D'autres types
de mutations (dltions, insertions, duplications et inversions), de mme que les
rarrangements de chromosomes, impliquent de grandes pices d'ADN. Bien que la relation
entre les dgts l'ADN et ces macro-vnements soit moins claire, ils peuvent contribuer
ce type de mutation de par les cassures de chane, primaires ou secondaires, qu'ils provoquent.
Les mutations complexes, impliquant de multiples changements de squence, pourraient

Tableau 1.5-1 : Nomenclature des mutations ponctuelles

Type Mutation Bases substitues
Transition Purine purine
Pyrimidine pyrimidine
G A, A G
C T, T C
Transversion Purine pyrimidine
Pyrimidine purine
G T, G C, A T, A C
T A, T G, C A, C G
Frameshift (3n 1) o n est un nombre entier Dcalage du cadre de lecture

(Friedberg et al., 1995)


19
par exemple, les esters de phorbol, les hormones
73
rsulter d'un seul vnement mutagne qui provoquerait un glissement de l'ADN pendant sa
rplication (Weinstein et al., 1995).
Une substitution de base
20
dans la rgion codante d'un gne peut influencer la protine
code des degrs varis. Une mutation dans une zone non-codante du gnome peut
galement induire des effets biologiques importants, par exemple au niveau des introns, d'une
origine de rplication de l'ADN ou des squences promotrices ou rgulatrices d'un gne.
1.5.2.2 Etude des spectres mutationnels
Pour un agent mutagne donn, les tudes sur bactries, levures et cellules mammifres
permettent de dterminer les sites de mutation d'un ADN endommag ainsi que leur nature
molculaire. Le couplage de ces donnes la chimie de la lsion et sa distribution dans
l'ADN permet d'apprcier quels agents chimiques ou physiques sont pr-mutagnes ainsi que
le type de mutation entrane. La plupart des carcinognes causent cependant une varit de
lsions chimiques, certaines abondantes, d'autres fort rares; il n'est donc gure ais de
confirmer par ces mthodes si une lsion suspecte pr-carcinogne l'est rellement. Ces
hypothses peuvent tre testes par la construction et la transfection de molcules d'ADN
portant un adduit bien dfini dans une squence prcise (site-specific adducts); les effets
biologiques de la lsion tudie et l'influence du contexte de la squence peuvent alors tre
valus sans ambigut (Friedberg et al., 1995). Le mme type de plan exprimental permet
d'tudier les mcanismes de discrimination des ADN polymrases (Wilson et Singhal, 1998;
Efrati et al., 1999) ainsi que les spcificits des endonuclases de rparation et donc la
"rparabilit" d'une lsion donne (Boiteux et al., 1998; Karahalil et al., 1998). Ces tudes
n'en sont toutefois qu' leurs dbuts car elles reprsentent un travail considrable, exigeant
une matrise en chromatographie, en biologie molculaire et, surtout, en synthse chimique.
1.5.2.3 Les mutations "signatures"
Une littrature abondante dtaille, notamment sur cellules mammifres, les effets
mutagnes des agents qui endommagent l'ADN, incluant les radiations ionisantes et
ultraviolettes, le stress oxydatif et de nombreux chimiques. Ces tudes supposaient
initialement que les processus mutationnels pourraient laisser des empreintes et signatures
facilement reconnaissables, permettant de leur attribuer un effet carcinogne donn. Mais les
niveaux de complexit se sont avrs beaucoup plus subtils qu'envisag (Friedberg et al.,
1995; Weinstein et al., 1995; Halliwell et Gutteridge, 1999), notamment : (i) les effets induits

20
mutation silencieuse, missense ou non-sens
74
par la squence primaire et la structure secondaire de l'ADN, par la chromatine, mais aussi
par le statut trancriptionnel des gnes; (ii) l'efficacit et les cintiques de rparation; (iii) les
facteurs qui dterminent les prfrences d'insertion de base; (iv) l'efficacit de rplication by-
pass d'une lsion; (v) le type d'ADN-polymrase qui rplique le gne tudi; (vi) la
contribution ventuelle des mutations non attribuables la lsion tudie; (vii) les multiples
adduits de certains carcinognes (notamment les alkylants) qui peuvent avoir des spcificits
mutationnelles propres et tre substrats de mcanismes de rparation diffrents; et (viii)
l'induction de mutations similaires par diffrents types d'agents carcinognes.

Tableau 1.5-2 : Quelques exemples de mutations "signatures"
(a)


Agent Base substitue Mutation signature
Hydrocarbure polycyclique aromatique
(type benzo[a]pyrne)
purine T G:C T:A et
A:T T:A
Amine htrocyclique et aromatique
(type 1-nitropyrne)
G T G:C T:A

Agent alkylant
(type thyl mthanesulfonate)
G A G:C A:T

Espces ractives de l'oxygne :
- 8-oxodG
- ractifs type Fenton (H
2
O
2
+ mtal)

G T
C T
( (
C T

G:C T:A
G:C A:T
(aux sites dipyrimidiques)
UVB :
- dimres cyclobutanes et/ou photoproduits (6-4)
C C C T
( ( et ( (
C T C T
G:C A:T
(aux sites dipyrimidiques)

(a)
Cette table ne reprend que les types de mutations les plus frquentes induites par ces agents; d'autres types de
mutations (autres substitutions, frameshifts, dltions,) peuvent apparatre, par exemple en fonction du
contexte de la squence

D'aprs (Weinstein et al., 1995)

En dpit de ces limitations, l'identification de mutations "signatures" (Tableau 1.5-2) et les
nombreux spectres de mutation gnrs ont contribu la connaissance de processus
molculaires de carcinogense. Les mutations rencontres dans certains gnes d'un type donn
de cancer humain peuvent mme parfois donner une piste srieuse quant la classe d'agent
carcinogne implique dans l'induction de ce cancer (Weinstein et al., 1995).
1.5.3 Le gne et la protine p53
La protine p53, un facteur de transcription, est probablement le point central de la rponse
une attaque gnotoxique. Cette protine intgre l'identification d'un gnome non-permissif
75
avec l'excution de rponses cellulaires qui mnent la rparation ou l'limination d'une
cellule endommage (Moll et Schramm, 1998). La p53 prsente de multiples sites de
phosphorylation, substrats de kinases et de phosphatases qui, en fonction de la nature du
signal activateur, cooprent pour moduler la liaison l'ADN, donc le type de rponse. Des
mcanismes d'O-glycosylation et -actylation pourraient galement intervenir (Meek, 1998).
1.5.3.1 Activation de p53 par la lumire
Une irradiation solaire, UVA, UVB ou UVC rsulte en une augmentation du taux de la
protine p53 et de son affinit envers l'ADN. L'accumulation induite par les UVB est
homogne dans tout l'piderme, sans montrer de gradient avec la profondeur; ce qui
correspond en fait la distribution des dimres cyclobutanes voque plus avant
(Section 1.3.4.1). Par contre, sous UVA, l'accumulation de p53 se fait uniquement dans la

Figure 1.5-2 : Activits biologiques de la protine p53 en rponse des dgts l'ADN


















Activation de protines kinases
? DNA activated protein kinase
? ATM
p53 active
p53
MDM2
Apoptose
Reconnaissance de l'ADN
endommag et
rparation
Arrt en G1
+
p53
p p
MDM2
p
Dgts
l'ADN
p21, GADD45,
IGF-BP3
bax, fas,
IGF-BP3,
autres gnes ?
Rpression
transcriptionnelle
de facteurs de
survie
Non -
transcriptionnel

D'aprs (Meek, 1998; Moll et Schramm, 1998)

76
couche basale; ce qui impliquerait dans l'induction de p53 un photosensibilisant prsent dans
les cellules de cette couche (Young, 1999).
1.5.3.2 Activits biologiques de la protine p53
1.5.3.2.1 La protine p53 et les dommage l'ADN : maintien de l'intgrit gnomique
De nombreux gnotoxiques induisent la p53 mais les cassures de chanes, notamment
double-brins, semblent les signaux les plus effectifs pour cette induction. Les conditions de
stress (hypoxie, privation de srum, chaleur) induisent galement une rponse p53.
En cas de dgts l'ADN, 2 rponses principales sont mdies (Figure 1.5-2) :

L'arrt du cycle cellulaire : L'arrt transitoire des progressions G1 vers S et G2
vers M est essentiel pour empcher la rplication d'un ADN endommag (arrt en
G1) et la sgrgation de chromosomes endommags (arrt en G2); il permet la
rparation de l'ADN endommag avant ces dcisions cellulaires critiques, limitant
la propagation d'erreurs gntiques. Le rle de la p53, bien tabli en ce qui
concerne l'arrt en G1, semble une rponse universelle; son rle dans l'arrt en G2,
moins vident, dpendrait du type cellulaire.
L'apoptose : L'apoptose protge les cellules de la conversion maligne et affecte
ngativement la survie de cellules tumorales dj inities, comme par exemple les
cellules dysplasiques des kratoses solaires. Cette voie, et donc la prsence d'une
p53 phnotypiquement intacte (type sauvage), apparat critique pour l'radication
de certaines lignes de cellules tumorales par les thrapies gnotoxiques
(radiations et agents cytotoxiques). L'induction d'apoptose est contre-balance par
le transcript du gne bcl-2 et il semble qu'un quilibre entre l'expression du p53 et
du bcl-2 soit un point central dans la dtermination de la rponse apoptotique un
stress donn (Wang et al., 1998).

Quand la fonction p53 est perdue, les cellules ne sont pas rpares ou limines mais
procdent la rplication de l'ADN endommag, ce qui peut rsulter en une accumulation de
mutations, de r-arrangements chromosomiques et en une aneuplodie (Moll et Schramm,
1998).
77
1.5.3.2.2 Autres rles de la protine p53
La protine p53 est un suppresseur de tumeur (Moll et Schramm, 1998).
Elle rgule galement la duplication des centrosomes, vitale pour la fidlit mitotique; p53
et son rgulateur ngatif MDM2 agiraient de manire concerte dans le dveloppement
embryonnaire (Meek, 1998; Moll et Schramm, 1998).
1.5.3.3 Mutations du gne p53 dans les cancers humains
Une inactivation fonctionnelle de la p53 est l'vnement le plus frquent observ dans les
tumeurs humaines, raison d'au moins 50 % de tous les cancers. La dltion d'un allle
accompagne d'une mutation missense
21
dans le domaine central de liaison l'ADN de l'allle
restant est classique (77 % des mutations) avec des hot-spots dans 4 zones hautement
conserves au cours de l'volution. Ces hot-spots correspondent aux rsidus en contact direct
avec l'ADN ou critiques pour le reploiement correct de la protine. Ces mutations rsultent
dans la plupart des cas en une protine demi-vie plus leve qui s'accumule dans le
cytoplasme, suggrant que les p53 muts pourraient la fois avoir perdu leur fonction de

Tableau 1.5-3 : Spectre mutationnel du gne p53 dans les cancers humains

Type de cancer Substitution de base
prvalente
Inducteur(s) suppos(s)
Colon G A inconnu
Ovaire, cerveau,
colo-rectal
C T
( (
G G
dsamination (spontane ou induite) de la 5-
mthyl-cytosine au niveau des dinuclotides
CpG
(a)
pour former la thymine
Ovaire G A inconnu
Poumon G T fume de tabac (ex. polycycliques
aromatiques), ROS (8-oxodG)
Foie G T alimentaire (ex. aflatoxines)
Sein G T inconnu
Peau C C C T
( ( et ( (
C T C T
UVB
(b)


(a)
La mthylation enzymatique de la cytosine au niveau de ces dinuclotides est influence par l'oxydation
(ROS) et la mthylation (alkylants) de la guanine
(b)
Ces mutations pourraient tre galement dues des ROS, notamment via la 8-oxodG; de plus, une des
cytosines hot-spot est incluse dans un dinuclotide CpG dont la mthylation-dsamination pourrait galement
expliquer la mutation C T



D'aprs (Weinstein et al., 1995; Moll et Schramm, 1998)

21
Une mutation missense modifie un codon de telle faon que l'acide amin spcifi ne soit plus le mme.
78

suppresseur de tumeur et gagn une fonction tumorigne (Weinstein et al., 1995; Moll et
Schramm, 1998).
L'analyse du type de mutation missense rvle des diffrences en fonction du site tumoral;
le profil mutationnel de p53 apparat donc comme un exemple possible d'pidmiologie
molculaire, base sur les mutations "signatures" capables d'indiquer l'origine probable de
certaines tumeurs (Tableau 1.5-3).
Ces donnes suggrent qu'une mutagense la fois environnementale et endogne est
oprationnelle dans la formation des tumeurs humaines; l'importance relative de ces sources
de mutation dpend du site du cancer, donc de son exposition aux agents externes et de ses
facults de rparation.
1.5.4 La mutagnicit des bases oxydes
Le potentiel mutagne et donc carcinogne de toute base modifie est reflt par ses
proprits mal-codantes; elles peuvent mener des mutations, soit directement, soit au cours
de tentatives cellulaires pour les rpliquer ou les rparer (Floyd, 1990; Halliwell et Gutteridge,
1999).
L'tude du spectre mutationnel (cf 1.4.2.2) du stress oxydatif a permis d'identifier une
srie de mutations dont les plus frquentes sont les transitions C T et les transversions
G T et G C. Aucune de ces mutations n'est cependant exclusive du stress oxydatif; elles
peuvent en effet provenir de causes varies, comme des erreurs de polymrases, des
dsaminations spontanes (cytosine vers uracile ou 5-mthyl-cytosine vers thymine) ou d'un
msappariement de certains adduits base - carcinogne (Halliwell et Gutteridge, 1999). Une
mutation tandem observe au niveau des dinuclotides CpC TpT est, par contre, hautement
spcifique de 2 stress gnotoxiques, les UVB et les ROS (cf Tableau 1.5-2).
L'induction de mutations G T est en accord avec la grande sensibilit de la guanine vis-
-vis des ROS et semble indiquer un rle important de la 8-oxodG, son produit d'oxydation
majoritaire dans l'ADN. Ainsi, dans des cellules exposes au
1
O
2
, dont la guanine est la seule
cible significative, G T est la mutation la plus commune.
Rappelons cependant que tous les paramtres dtaills au 1.4.2.3 influencent galement
le spectre mutationnel induit par les espces ractives de l'oxygne (Halliwell et Gutteridge,
1999) en agissant par exemple sur le degr d'exactitude des polymrases qui rpliquent le
gne ls.
79
Seules quelques bases oxydes ont t tudies (Tableau 1.5-4) (Olinski et al., 1998;
Halliwell et Gutteridge, 1999), mais elles montrent effectivement une capacit de
msappariement certaine, entranant donc des mutations missense.

Tableau 1.5-4 : Quelques mutations entranes par les bases oxydes

Base oxyde Base substitue Mutation entrane
thymine glycols
(a) (b)
T A T:A A:T
8-oxo-guanine
(a)
G T G:C T:A
8-oxo-adnine
(a)
A C A:T C:G
formamidopyrimidines
(Fapy-guanine et Fapy-adnine)
bloquent la rplication
2-hydroxy-adnine A C
A T
A:T C:G
A:T T:A
5-hydroxy-cytosine C T
C G
C:G T:A
C:G G:C

(a)
La base modifie s'apparie cependant majoritairement la base normale
(b)
Ces bases peuvent aussi bloquer la rplication

D'aprs (Olinski et al., 1998; Halliwell et Gutteridge, 1999)

1.5.5 La photocarcinogense
1.5.5.1 Carcinomes basocellulaires et spinocellulaires
Depuis les premires vidences d'une relation entre l'exposition au soleil et le
dveloppement de cancers de la peau, publies partir d'observations sur des marins et des
viticulteurs en 1894 et 1896 (Urbach, 1999), de trs nombreux travaux ont permis une
meilleure connaissance des mcanismes de photocarcinognicit.
Un large consensus reconnat que le risque de carcinomes spinocellulaires (SCC) est
proportionnel la dose UV accumule au cours d'une vie. Dans un modle animal (souris
nues albinos), une exposition journalire aux UV des doses suffisamment leves (mais bien
infrieures au seuil rythmal) induit des tumeurs chez 100 % des sujets et une relation de
rciprocit inverse dose-temps est vrifie jusqu' l'tendue de vie des animaux (de Gruijl,
1996).
En ce qui concerne les carcinomes basocellulaires (BCC), il n'y a pas de bon modle
animal mais l'pidmiologie montre qu'ils partagent de nombreux facteurs de risque des SCC.
Une tiologie commune vis--vis des radiations solaires est donc habituellement postule,
bien qu'il y ait des diffrences essentielles dans la relation entre ces 2 carcinomes et les UV.
80
En effet, il n'y a pas pour les BCC de relation directe avec la dose UV cumule au cours de la
vie et les tumeurs apparaissent sur des sites irrgulirement exposs au soleil. Leur tiologie
pourrait donc ressembler plus celle des mlanomes (CMM) qu' celle des SCC (de Gruijl,
1996)
1.5.5.1.1 Spectre d'action
Un spectre d'action montre la dpendance d'un effet photobiologique donn vis--vis de la
longueur d'onde (Young, 1999). Les premiers spectres d'action gnrs attestaient que seuls
les UVB et C taient carcinognes. Il a ensuite t prouv que les UVA pouvaient galement
induire des cancers cutans, mais avec une efficacit 1000 fois moindre que celle des UVB
(Figure 1.5-3).

Figure 1.5-3 : Comparaison des spectres d'action pour l'rythme et la carcinogense



(
____
) Dose rythmale minimale 24 h aprs irradiation (MED)
(----) Photocarcinogense : donnes obtenues sur souris nues albinos et
corriges pour la transmission de la peau humaine (de Gruijl et al., 1993)

(Urbach, 1999)

Il apparat que les spectres d'action pour l'rythme et la carcinogense diffrent fortement
au-dessus de 320 nm. Les auteurs soulignent toutefois que ce spectre d'action tabli pour la
carcinogense est relativement imprcis au-dessus de 340 nm; une extension dans le visible
81
est probable mais les donnes manquent au-dessus de 390 nm (de Gruijl et al., 1993).
Soulignons que les UVA sont bien des carcinognes complets, jouant un rle la fois
d'initiateur et de promoteur (de Laat et al., 1997). Leur contribution la carcinogense
cutane est estime environ 10 20 %, s'ajoutant de manire arithmtique aux UVB
(photo-addition) (Kelfkens et al., 1990). Aucune donne n'est encore disponible quant la
contribution ventuelle de doses massives additionnelles de lumire visible, telles que reues
par exposition au soleil ou en salon de bronzage (Pflaum et al., 1994; Duez et al., 2001).
1.5.5.1.2 Donnes concernant le gne p53
1.5.5.1.2.1 Spectres mutationnels
Des mutations du gne p53 sont prsentes dans 30 50 % des carcinomes spino- et
basocellulaires (Soufir et Basset-Seguin, 1999). La plupart des publications soulignent une
prdominance de mutations UV-spcifiques mais ne prsentent que des donnes partielles.
Nous avons donc explor la base de donnes des mutations p53 somatiques compile par
l'International Agency for Research on Cancer (IARC) (Hainaut et al., 1998) afin de vrifier
sur des donnes extensives cette prsence de mutations signatures UV. La version DataR4,
mise jour de juillet 2000, a t tlcharge (IARC, 2001) et importe dans Access; nous
avons alors comptabilis et reprsent graphiquement (Figure 1.5-4) les types de mutations
pour les tumeurs (i) de la sous-topographique "skin"; et (ii) de l'ensemble de la base de
donnes, les tumeurs de la catgorie "skin" tant exclues. Pour les tumeurs de la peau, nous
voyons nettement une prdominance de mutations ponctuelles C T, mais surtout une
prdominance des mutations tandem, principalement aux sites dipyrimidiques CpC. Ces
mutations sont effectivement considres comme des marqueurs de mutations UV, bien
qu'elles puissent tre galement induites par le stress oxydatif (cf Tableau 1.5-2).
Ces lsions du p53 surviennent probablement un stade prcoce de la carcinogense; elles
sont en effet prsentes au niveau des lsions dbutantes telles que la maladie de Bowen et les
kratoses actiniques (Soufir et Basset-Seguin, 1999).
82
Figure 1.5-4 : Types de mutation du gne p53 dans les tumeurs somatiques

Tous c












Tous c











Tous c

Cancers de la peau
(n = 615)
Gto A
28.7%
T to G
2.6% T to C
3.7% T to A
3.0%
missense
0.02%
Gto T
14.2%
Gto C
5.3%
C to G
3.9%
C to T
21.0%
Non
caractris
0.1%
C to A
3.2%
A to C
1.6%
A to G
9.4%
A to T
3.2%
T to G
4.3%
T to C
5.4%
T to A
3.0%
Gto T
7%
Gto C
5.0%
C to G
3.7%
C to T
39.3%
C to A
3.5%
A to C
1.7%
A to G
3.5%
A to T
3.0%
G to A
21.0%
Mutations ponctuelles :
ancers sauf cancers de la peau
(n = 11676)
ancers sauf cancers de la peau
(n = 13403)
Mutations ponctuelles :
Cancers de la peau
(n = 463)
Mutations tandem :
ancers sauf cancers de la peau
(n = 97)
Mutations tandem :
Cancers de la peau
(n = 104)
Ponctuelle
87.1%
Insertion
2.6%
Dltion
9.1%
Tandem
0.7%
Complexe
0.5%
Complexe
0.5%
Dltion
5.4%
Insertion
2.0%
Ponctuelle
75.3%
Tandem
16.9%
CC to TT
AA to TT
AC to GT
AT to TA
CA to TG
CC to AG
CC to AT
CC to GT
CC to TA
CC to TG
CG to TA
CG to TC
CT to GG
CT to TC
GA to CC
GA to CT
GC to AA
GC to AT
GG to AA
GG to AT
GG to CT
GT to AC
GT to TG
TA to GG
TG to AA
TG to CA
TG to GT







1%

CC to TT
Non
caractris
63%
Non
caractris
60%
CC to TT
36%
83
1.5.5.1.2.2 Prsence de clones de kratinocytes muts dans la peau humaine normale
Chez des individus normaux, des "lots" (patches) clonaux de 60 3000 kratinocytes
prsentant un p53 mut ont t mis en vidence avec une frquence leve (jusqu' 4 % des
cellules dans les zones exposes au soleil). Ces lots montent gnralement en cne partir
des compartiments prsums de cellules-souches, la jonction dermo-pidermique (Figure
1.5-5) et les follicules pileux. Ils sont plus frquents et plus grands dans la peau expose au
soleil; des mutations frquentes sont observes aux sites dipyrimidiques, C T et CpC
TpT. Ce ne sont jamais des mutations silencieuses, ce qui indique que les cellules mutes au
niveau de sites essentiels du p53 possderaient un avantage comptitif par rapport leurs
voisines p53 de type sauvage. Cet avantage semble stimul par une exposition solaire et une
telle promotion pourrait tre due une slection des cellules mutes par dficit d'apoptose
UV-induite; elle est rversible, la densit d'lots tant indpendante de l'ge du sujet (Jonason
et al., 1996).En accord avec la thorie de cancrogense multi-tapes ( 1.4-1), ces lots
pourraient reprsenter une population stable de cellules mutantes non-cancreuses,
susceptibles d'voluer plus avant sous des impacts gntiques supplmentaires (Jonason et al.,
1996).

Figure 1.5-5 : Clone conique de kratinocytes p53-muts



Vue latrale d'une coupe pidermique. Reconstruction dans l'axe Z d'images acquises en microscopie confocale
aprs immuno-marquage fluorescent. L'apex du cne se trouve au bas de l'image, dans le plan de la surface
basale. De tels cnes marquent souvent un angle par rapport la verticale.

(Jonason et al., 1996)

1.5.5.1.3 La voie de signalisation "sonic hedgehog"
Des donnes rcentes montrent que la voie de signalisation sonic hedgehog pourrait tre
importante dans l'oncogense des carcinomes basocellulaires (Soufir et Basset-Seguin, 1999).
84
Figure 1.5-6 : La voie de signalisation sonic hedgehog


(Aszterbaum et al., 1999)

Patched (PTC) est une protine avec 12 domaines transmembranaires (Figure 1.5-6) qui
inhibe smoothed (SMO), une autre protine 7 domaines transmembranaires. Lorsque la
protine soluble sonic hedgehog (HH) se fixe sur PTC, l'inhibition est leve permettant
l'activation des composants intracellulaires de la voie de signalisation, ce qui rsulte (i) en
activations transcriptionnelles (notamment du gne ptc qui code pour patched), via les
facteurs de transcription Gli; et (ii) en prolifration cellulaire (Soufir et Basset-Seguin, 1999).
Dans les BCC, mais pas dans les SCC, cette voie semble active en permanence, notamment
via des mutations inhibitrices de patched mais aussi des mutations activatrices de smoothened
ou de hedgehog (Tableau 1.5-5) (Aszterbaum et al., 1999; Wikonkal et Brash, 1999).

Tableau 1.5-5 : La voie sonic hedgehog et les carcinomes basocellulaires (BCC)

Particularit % des BCC dans lesquels cette
particularit est observe
% Mutations type UV
( et )
Dysrgulation positive de toutes les
composantes de la voie sonic hedgehog
> 95 % ---------
Gne PTC (patched) 27 %
C T : 38 %
CpC TpT : 10 %
Gne smo (smoothed) 6 - 13 % n.d.
Gne HH (sonic hedgehog) 2 % n.d.

D'aprs (Aszterbaum et al., 1999; Daya-Grosjean et Sarasin, 2000)
85
Des essais d'altration des gnes codant pour les protines de cette voie de signalisation
ont permis de reproduire, sur modles animaux, une pathologie ressemblant au BCC.
1.5.5.1.4 Autres mcanismes molculaires impliqus
1.5.5.1.4.1 Le gne inhibiteur d'apoptose bcl-2
Alors que les UVB induisent p53 sans effet sur bcl-2, les UVA rgulent ngativement
l'expression de bcl-2 sans effet sur p53. Les cintiques sont galement diffrentes, les UVB
agissant en 12 24 h, les UVA en 4 h (Wang et al., 1998). L'quilibre entre p53 et bcl-2, qui
joue un rle important dans l'induction de l'apoptose, apparat donc modul la fois par les
UVB et les UVA, et ce, vraisemblablement par des mcanismes diffrents.
Les BCC sont des tumeurs croissance lente caractrises par une surexpression de la
protine bcl-2 et la perte de la protine pro-apoptotique bax (Tomkova et al., 1998); ils
pourraient rsulter d'une augmentation de la survie cellulaire plutt que d'un processus
prolifratif. Les SCC par contre prsentent frquemment des altrations de la protine p53 et
une surexpression de la cycline D; ces tumeurs se caractrisent par une hyperprolifration
cellulaire (Teraki et Shiohara, 1999).
1.5.5.1.4.2 Les mcanismes de rparation de l'ADN
Les maladies gntiques connues sous le nom de xeroderma pigmentosum se traduisent
par une forte sensibilit au soleil et un risque 1000 fois plus lev de dvelopper un cancer
cutan. Elles sont dues des anomalies dans le mcanisme de rparation par excision de
nuclotides (cf Section 1.1.5.3), ce qui tend dmontrer une forte implication de la rparation
de l'ADN dans la protection contre les cancers induits par le soleil (Bootsma et al., 2001). Il
semble en outre que la rparation de l'ADN puisse tre en dfaut chez des patients prsentant
un BCC prcoce et chez des individus normaux gs (Kraemer, 1997).
1.5.5.1.4.3 Les eicosanodes et les protinases
Les eicosanodes (acide arachidonique, prostaglandines et leucotrines), mdiateurs
majeurs de l'inflammation induits par l'exposition aux UV (Section 1.3.4.2) mais aussi par les
esters de phorbol, semblent essentiels aux mcanismes de promotion. Les protinases
cutanes, induites par les UV via diffrents facteurs de transcription (Section 1.3.4.2.5),
pourraient contribuer la propagation des cellules tumorales (Kraemer, 1997).
1.5.5.1.4.4 L'immunosuppression
Rappelons que la surveillance immunitaire, un mcanisme essentiel pour reprer et
dtruire les cellules tumorales, est svrement dprime lors de l'exposition aux UV
(Section 1.3.4.2.4).
86
1.5.5.1.4.5 Autres gnes impliqus
L'incidence et la localisation des BCC ont t associes avec des polymorphismes au
niveau des gnes de la glutathion synthtase et des cytochrome P450. Les proto-oncognes
ras semblent agir dans les mcanismes de promotion, mais pourraient galement interagir
avec la voie sonic hedgehog ( 1.4.5.1.3) (Aszterbaum et al., 1999; Rees, 2001). L'induction
d'apoptose par la voie Fas/Fas-L pourrait jouer un rle dans certaines rgression spontanes
de BCC (Teraki et Shiohara, 1999).
1.5.5.2 Les mlanomes
En dpit de nombreuses tudes, l'tiologie du mlanome malin cutan (CMM) reste
obscure. L'pidmiologie indique une relation complexe avec le soleil et l'importance des
expositions pisodiques plutt que chroniques (Setlow, 1996; Weinstock, 1996; Urbach,
1999).
1.5.5.2.1 Spectre d'action
Le spectre d'action n'a t relev que sur un seul modle animal, un hybride d'un poisson
du genre Xiphophorus (Setlow et al., 1993). Ces poissons sont en fait htrozygotes pour un
gne suppresseur de tumeur qui, une fois inactiv, permet un mlanome de se dvelopper.
Ce modle trs sensible prsente une rponse linaire avec la dose de lumire; il mesurerait
principalement l'initiation du processus tumoral (Setlow, 1996).
A toutes les longueurs d'onde tudies, une activit significative est observe; la fluence
solaire augmentant avec la longueur d'onde, les UVA apparaissent comme la bande spectrale
la plus efficace pour l'induction de mlanome chez Xiphophorus (Figure 1.5-7). Si le spectre
d'action pour le CMM humain tait exactement similaire celui-ci
22
, 90 % des effets
inducteurs de mlanome seraient dus aux radiations UVA et visibles contre seulement 10 %
aux UVB.
Cette tude, bien que fortement controverse, est appuye par diffrentes donnes
pidmiologiques qui suggrent que les UVA sont mlanomagniques (Moan et al., 1999). En
effet, l'incidence des CMM, au contraire des BCC et SCC, ne montre quasi pas de gradient de
latitude
23
pour des populations comparables; ce qui se corrle en fait un gradient de latitude
beaucoup plus faible pour les radiations UVA et visibles que pour les UVB (Setlow, 1996;
Moan et al., 1999).

22
Ce qui reste dmontrer, tant donn la distance phylogntique le sparant du modle
23
"Gradient de latitude" signifie qu'une relation peut tre tablie entre le paramtre observ et une latitude
gographique dcroissante
87
Figure 1.5-7 : Spectre d'action pour l'induction de mlanome (modle Xiphophorus)

Spectres du graphe (A) multiplis
par le spectre midsummer sunlight
et normaliss 302 nm
Spectres normaliss 302 nm

(Setlow, 1999)

La question reste ouverte ce jour; un auteur a mme propos il y a peu que le mlanome
pourrait ne pas tre caus par la lumire mais plutt par la temprature corporelle qui serait
elle-mme corrle avec le faible gradient de latitude observ ??? (Christophers, 1998).
1.5.5.2.2 Donnes concernant le p53
Le gnotype du p53 dans le mlanome prsente une image complexe et encore
controverse. Les mutations dans la rgion codante du gne sont dtectes de manire
irrgulire aussi bien dans les mlanomes primaires et mtastatiques (2-25 %) que dans les
lignes cellulaires (10-30 %); la dtection du gne type sauvage est beaucoup plus frquente.
Une surexpression de p53 est en fait observe (i) restreinte aux lsions malignes; et
(ii) focalise en lots de cellules p53-positives parmi des amas de cellules p53-ngatives, la
proportion d'lots p53-positifs augmentant avec la progression. Ces constatations surprenantes
indiquent que l'expression d'un p53 type sauvage confrerait aux cellules de mlanome un
avantage slectif qui pourrait contribuer l'instabilit gntique et aux mtastases; ce qui ne
pourrait s'expliquer que par des mutations dans certaines des voies effectrices de p53 (Albino
et Fountain, 1996).
88
1.5.5.2.3 Autres mcanismes molculaires impliqus
1.5.5.2.3.1 La rgulation du cycle cellulaire
De nombreuses altrations chromosomiques, notamment au niveau du chromosome 1
(~ 80 %) ont t mises en vidence dans les mlanomes (Albino et Fountain, 1996; Kamb et
Herlyn, 2001) rsultant en une perte ou une expression anormale de rgulateurs du cycle
cellulaire.
1.5.5.2.3.2 Les cytokines
Les mlanomes augmentent leurs facults d'invasion et de prolifration dans le derme en
altrant leur expression de molcules d'adhsion, de protinases, de cytokines, de rcepteurs
et de ligands; certains de ces facteurs sont secrts de manire autocrine et sont des
stimulateurs puissants de prolifration cellulaire.
Le caractre invasif du mlanome correspond galement l'acquisition gntique d'une
rsistance envers des facteurs inhibiteurs de transit et de croissance scrts par les
fibroblastes et les cellules infiltres (Albino et Fountain, 1996).

89
2. Matriel et mthodes

90
2.1 METHODES ET MODELES BIOLOGIQUES UTILISES IN VITRO
2.1.1 Ractifs et matriel
Tous les milieux, srums et ractifs pour culture cellulaire, le PBS (phosphate buffer
saline sans hydrognocarbonate), la solution de Bleu Trypan et la solution de trypsinisation
(EDTANa
2
H
2
0.1 g/l et trypsine 0.25 g/l dans le PBS) ont t obtenus chez Gibco Life
Technologies (Paisley, Ecosse). Les srums bovins, d'origine sud-amricaine, ont t
dcongels, dcomplments par chauffage 56C pendant 30 min, et recongels -20C en
parties aliquotes de 50 ml.
Les cellules sont maintenues dans un incubateur 37C, en atmosphre humide (assure
par une solution de thiomersal 2 mg/l), sous un mlange gazeux de 5 % de dioxyde de
carbone dans l'air. L'ensemble des manipulations est ralis sous flux laminaire (classe 100)
dans des conditions aseptiques.
Les botes de culture (botes ares de 75 cm et de 25 cm) proviennent de chez Orange,
les botes de culture 96 puits fonds ronds et fonds plats de chez Falcon (Beckton-
Dickinson, USA), le dimthylsulfoxyde (DMSO, 99.5 %) de chez Vel (Belgique), le MTT
(bromure de 3-[4,5-dimthylthiazol-2-yl]-2,5-diphnylttrazolium) de chez Sigma (USA), la
solution antiseptique (mlange thanol:ther, 97.1:2.9, v/v) de chez Stella (Belgique). Les
autres ractifs sont de qualit pour analyse et proviennent soit de chez Merck (Allemagne) ou
de chez Aldrich (USA)
Les mesures spectrophotomtriques sont ralises l'aide d'un lecteur de microplaques
Labsystems iEMS reader/dispenser MF (Labsystems, Finlande).
2.1.2 Lignes cellulaires et conditions de culture
2.1.2.1 La ligne P388D1
2.1.2.1.1 Description
Cette ligne cellulaire a t isole (Dawe et Potter, 1957) partir d'un noplasme
lymphode (P388) induit sur des souris DBA/2 par le mthylcholanthrne. Les cellules P388
du 49
me
passage i.p. sur souris ont t maintenues pendant une longue priode de temps sans
passage; elles se sont morphologiquement altres vers des formes amoebodes contenant
beaucoup de vacuoles cytoplasmiques. La culture, retransfre in vivo sur souris, a induit une
tumeur prsentant ces caractristiques altres. Une culture in vitro stable a t initie partir
de cette tumeur, sous le nom P388D1. Ce sont des cellules qui adhrent sur le verre et le
91
plastique et sont capables de phagocyter des particules de carbone et de polystyrne (Dawe et
Potter, 1957; Koren et al., 1975). Elles prsentent en fait des caractristiques semblables
celles des macrophages et sont capables d'une activit effectrice anticorps-dpendante
(formation de rosette et lyse) (Koren et al., 1975). La ligne P388 a t utilise par le National
Cancer Institute en tant que modle in vivo pour la slection de molcules anticancreuses.
Son utilisation in vitro s'avrant problmatique en raison de la difficult maintenir ses
caractristiques au cours du temps, il a t propos de les remplacer par les P388D1 qui sont
plus stables (Arnould et al., 1990).
La ligne que nous avons employe a t obtenue auprs de l'American Type Culture
Collection (ligne ATCC CCL-46); une banque de ligne a t ralise au Laboratoire par
cryognation dans du milieu de culture complet (cf 2.1.2.1.2 ) additionn de 9 % de srum
et de 10 % de DMSO (Badolo, 1999).
2.1.2.1.2 Conditions de culture
Les cellules P388D1 sont maintenues en conditions de croissance logarithmique, en
suspension dans un milieu constitu de RPMI 1640 supplment de tampon HEPES
24

(10 mM), de pnicilline (100 U/ml), de streptomycine (100 U/ml) et de srum ftal de buf
(9 %). Les passages sont raliss 2 fois par semaine par transvasement direct d'environ
1.5 x 10
6
cellules dans 30 ml de milieu complet (botes de 75 cm). Seuls les passages 3 35
sont utiliss, de manire viter tout effet du DMSO utilis lors de la conglation et
prvenir une drive ventuelle des caractristiques de la ligne. L'absence de mycoplasmes a
t vrifie 2 reprises au cours de ce travail par l'Institut National de Recherches
Vtrinaires (Bruxelles, Belgique).
2.1.2.2 La ligne HBL
2.1.2.2.1 Description
HBL (Ghanem et al., 1988) est une ligne humaine de mlanome tablie et caractrise
par le Laboratoire d'Oncologie et de Chirurgie Exprimentale de l'Institut Bordet (Bruxelles,
Belgique). Les cellules nous ont t fournies sous forme d'une culture quasi-confluence
(identifie en tant que "HBL-96").

24
acide 4-(2-hydroxythyl)-1-piperazinethanesulfonique
92
2.1.2.2.2 Conditions de culture
Les cellules HBL sont maintenues en culture dans le milieu HAM F-10 supplment de
pnicilline (100 U/ml), de streptomycine (100 U/ml), de kanamycine (100 g/ml) et de srum
ftal de buf (4.5 %) et de srum de veau nouveau-n (4.5%). Les botes de culture sont
examines 2 fois par semaine. En fonction de la densit cellulaire, le milieu est simplement
renouvel ou la culture est subdivise (soit environ une fois par semaine mais, en tous cas,
avant confluence) : les cellules sont rinces 2 reprises par 3 ml de la solution de
trypsinisation, additionnes de 1 ml de la mme solution, laisses en contact temprature
ambiante jusqu' dcrochage (2 6 min), additionnes de 30 ml de milieu complet et
subdivises, en fonction de la densit cellulaire, en 2 4 botes. Le travail a t relativement
court (moins de 30 semaines) avec cette ligne et aucune banque n'a t cre dans notre
Laboratoire. L'absence de mycoplasmes est rgulirement contrle par le Laboratoire
donneur (Mycoplasma T.C., Gen-Probe, USA); elle a t vrifie une fois au cours de ce
travail par l'Institut National de Recherches Vtrinaires (Bruxelles, Belgique).
2.1.2.3 Choix des modles cellulaires
Le choix des modles cellulaires devait prendre en compte les facteurs suivants :
la possibilit de maintenir le modle in vitro de manire continue;
la stabilit des caractres de la ligne pendant la dure du travail;
les grandes quantits de cellules requises pour l'analyse de la 8-oxodG par HPLC
(~ 10
7
cellules par test);
le fait que, in vivo, les cellules puissent se retrouver au niveau de la peau et/ou
subir une irradiation UVA;
une limitation pratique car le travail est ralis par un seul exprimentateur.
Les P388D1 rpondent l'ensemble de ces critres; il s'agit d'une ligne mammifre, en
suspension, continue, stable et de croissance rapide. C'est un lymphocyte de type macrophage,
donc susceptible in vivo d'tre irradi, au niveau de la circulation priphrique ( 1.3.4.1), et
mme de migrer vers la peau.
Le mlanome humain HBL est une ligne continue et stable. Il nous a permis de tester
notre hypothse sur une cellule de la peau humaine particulirement concerne par les UVA.
Ce modle n'a cependant pu tre utilis pour les dosages de 8-oxodG car il s'agit de cellules
adhrentes, ne se prtant donc gure une culture de masse aise.
93
2.1.3 Mesures de phototoxicit au moyen du test MTT (Microculture
Tetrazolium Test)
2.1.3.1 Principe du test
Le test de cytotoxicit MTT considre que le point final de la vie cellulaire correspond
l'arrt de la respiration arobie, mesure par un simple test colorimtrique de l'activit
mitochondriale (Mosman, 1983). Les cellules mtaboliquement actives rduisent un driv de
ttrazolium, dans notre cas le 3-[4,5-dimthylthiazol-2-yl]-2,5-diphnylttrazolium, en bleu
de formazan insoluble dans l'eau (Figure 2.1-1). La dissolution des cristaux de formazan dans
le DMSO donne alors une solution dont la coloration bleu-violet est directement
proportionnelle au nombre de cellules vivantes (Arnould et al., 1990). Cette relation suppose
que la quantit et l'activit de l'enzyme soient constantes ou distribues de manire gaussienne
au sein de la population et que les substances testes ne modifient pas ces paramtres. Elle est
en outre influence par la densit des cellules dans le milieu de culture, probablement via une
modulation de l'activit enzymatique de la chane respiratoire en fonction de la phase de
croissance (Gerlier et Thomasset, 1986). Les conditions optimales, telles que dtermines
pour nos 2 lignes (Arnould et al., 1990; Badolo, 1999; Kinnaert, 2001), ont t appliques
dans ce travail.

Figure 2.1-1 : Structure du MTT et mcanisme de rduction

N+ N
N
N
S
N
CH
3
CH
3
N N
N
H
N
S
N
CH
3
CH
3
+ H
+
+ 2 e
-
MTT Formazan


2.1.3.2 Mode opratoire
2.1.3.2.1 Protocole
Les tests se font en quadriplicat sur une mme plaque de culture 96 puits, ce qui permet,
par plaque, de tester 9 concentrations d'un toxique sur 2 lignes ou de 2 toxiques sur une seule
ligne (Figure 2.1-2). Les cellules sont (i) dispenses dans les puits la dilution optimale et
laisses au repos dans l'incubateur pendant 24 h; (ii) mises en prsence des dilutions du
produit tester et replaces dans l'incubateur pour le temps test; et (iii) irradies 4C sous
94
lumire visible ou UVA et replaces dans l'incubateur pendant 45 h. La proportion de cellules
mortes est alors dtermine l'aide du test MTT.
Une plaque est prpare dans les mmes conditions en remplaant la phase d'irradiation
par un sjour de mme dure 4C, dans l'obscurit ("sham irradiation").
2.1.3.2.2 Prparation des cellules (Jour 0)
2.1.3.2.2.1 Ligne P388D1
A partir d'une culture de 3 4 jours, 250 l de suspension homogne sont prlevs,
additionns de 250 l de solution de Bleu Trypan; aprs homognisation, 30 l de mlange
sont transfrs dans une chambre de comptage de Neubauer. Le comptage des cellules
vivantes, c'est--dire des cellules excluant le colorant, est ralis sur les 4 zones de 16 carrs
et la moyenne M des 4 valeurs exprime le nombre de cellules pour 0.1 l de mlange. Le
nombre de cellules par ml de la suspension initiale est donc gal :

2 x M 10
4
cellules /ml soit 2 x M 10
6
cellules /ml
100
Les cellules ncessaires l'exprimentation envisage sont prleves et centrifuges
(900 g, 2 min); le culot est remis en suspension dans un volume de milieu frais de manire
obtenir une densit de 10
5
cellules/ml. Cette suspension sera distribue de manire homogne
dans une plaque de 96 puits fonds ronds, raison de 200 l par puits, soit 2 x 10
4
cellules,
en excluant la colonne 1 qui servira de "blanc". La plaque multipuits ainsi prpare est alors
place dans l'incubateur pendant 22 26 h.
2.1.3.2.2.2 Ligne HBL
A partir d'une culture de 3 4 jours, les cellules sont dcroches par trypsinisation,
comme dcrit au 2.1.2.1.2 , et la suspension obtenue est centrifuge (450 g, 2 min). Les
culots provenant d'un nombre de botes suffisant pour l'exprimentation envisage sont
combins et remis en suspension
25
dans un volume de milieu frais estim suffisant pour
obtenir une densit approximative de 10
6
cellules/ml. Un comptage des cellules en prsence
de Bleu Trypan est ralis (cf 2.1.3.2.2.1 ) et la densit de la suspension est alors ajuste
6 x 10
4
cellules/ml. Cette suspension sera distribue de manire homogne dans une plaque de
96 puits fonds plats, raison de 200 l par puits, soit 1.2 x 10
4
cellules, en excluant la
colonne 1 qui servira de "blanc". La plaque multipuits ainsi prpare est alors place dans
l'incubateur pour 22 26 h.

25
Cette remise en suspension ncessite une dizaine d'aspiration/dispensation l'aide d'une propipette
95
2.1.3.2.3 Mise en contact des cellules avec les substances tester (Jour 1)
Toutes les solutions sont ralises dans le milieu de culture. La solution-mre de la
substance tester est prpare extemporanment et dilue dans une "plaque de prparation"
(dilutions gomtriques successives) suivant le schma prsent la Figure 2.1-2.

Figure 2.1-2 : Configuration de la "plaque de prparation" des solutions de toxiques

Colonnes
Ranges 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Test 1 A D
B
l
a
n
c

S
o
l
.
-
m

r
e

D
i
l
.

1
/
2

D
i
l
.

1
/
4

C
o
n
t
r

l
e

D
i
l
.

1
/
8

D
i
l
.

1
/
1
6

D
i
l
.

1
/
3
2

C
o
n
t
r

l
e

D
i
l
.

1
/
6
4

D
i
l
.

1
/
1
2
8

D
i
l
.

1
/
2
5
6

Test 2 E H
B
l
a
n
c

S
o
l
.
-
m

r
e

D
i
l
.

1
/
2

D
i
l
.

1
/
4

C
o
n
t
r

l
e

D
i
l
.

1
/
8

D
i
l
.

1
/
1
6

D
i
l
.

1
/
3
2

C
o
n
t
r

l
e

D
i
l
.

1
/
6
4

D
i
l
.

1
/
1
2
8

D
i
l
.

1
/
2
5
6


A l'aide d'une pipette multi-canaux, 50 l sont prlevs de chaque puits, colonne par colonne,
et transfrs vers les puits correspondants de la plaque de culture cellulaire, en mlangeant par
aspiration/dispensation. Pour viter toute contamination, le travail est effectu dans l'ordre
suivant : colonnes 1, 5, 9 et ensuite de la solution toxique la plus dilue (colonne 12) vers la
plus concentre (colonne 2). La plaque de culture est alors replace dans l'incubateur pour le
temps test (gnralement, 3 h).
2.1.3.2.4 Irradiation UVA et visible (Jour 1)
Aprs incubation, les plaques sont entoures de ruban adhsif, transfres dans un bain-
marie 4C dans la chambre froide, exposes aux sources lumineuses dcrites au 2.3.1.4 ,
ramenes en salle de culture et rapidement dcontamines l'aide d'un chiffon imbib de
solution antiseptique; le ruban adhsif retir, les plaques sont replaces dans l'tuve pour 45 h.
2.1.3.2.5 Mesure MTT (Jour 3)
Aprs centrifugation des plaques (400 g, 2 min), le surnageant des puits est aspir avec
prcautions et remplac par 200 l de solution de MTT dans le PBS (0.5 mg/ml). Aprs 2 h
d'incubation, la solution MTT est aspire avec prcaution et 150 l de DMSO sont distribus
dans les puits. Aprs agitation (vortex, 700 rpm, 15 min) et dissolution complte des cristaux,
les mesures d'absorbance 540 nm et 620 nm sont ralises dans les 30 min. Le bruit de fond
est minimis en retranchant la mesure A
620 nm
de la mesure A
540 nm
en chaque point (abs);
96
la moyenne des mesures de la colonne 1 ("blanc") est galement retranche de chaque mesure.
La proportion de cellules vivantes par puits est donc calcule :

% cell. vivantes = abs puits - (abs moyen "blanc") * 100
(abs moyen "contrle") - (abs moyen "blanc")

2.1.3.3 Traitement des rsultats
Les courbes "survie cellulaire" en fonction du "logarithme de concentration du
cytotoxique" ont t ajustes aux points exprimentaux en minimisant une fonction cot
l'aide d'un logiciel original (FADHA) bas sur un simplex modifi (Dubois et al., 1989).
L'algorithme consiste choisir 2N points dans un espace N dimensions (N = nombre de
paramtres), calculer la fonction cot pour ces 2N points, puis rechercher d'autres points
dans cet espace, l'aide de transformations gomtriques lmentaires. Aprs chaque
transformation, la fonction cot est recalcule et le point le plus mauvais est remplac par un
point meilleur, de sorte que l'algorithme converge vers un point correspondant la valeur la
plus faible de la fonction cot. Lorsqu'une solution optimale a t trouve, l'algorithme remet
cette solution en question en "explosant", c'est--dire en recommenant la procdure partir
d'autres points (2N-1) de l'espace. La nouvelle solution trouve est compare la prcdente
et le processus recommence jusqu' ce que le seuil de prcision fix soit atteint (diffrence
entre 2 solutions ~ 10
-8
); la convergence vers la meilleure solution est alors assure, quels que
soient la dispersion et le nombre de points exprimentaux et ce, indpendamment de
l'initialisation des paramtres (Abi Khalil et al., 1986; Dubois et al., 1989).
La fonction cot value a la forme :
( )

=
n
i
i i i W m m p F . ) (
2

dans laquelle p reprsente le point de l'espace pour lequel la fonction cot est value, n le
nombre de points, m
i
la mesure exprimentale la concentration C
i
, i m la mesure calcule la
concentration C
i
et W
i
le poids attribu la mesure m
i
.
Nous avons pu ajuster les points de toutes nos expriences positives un modle sigmode
simple (Gompertz, ordre 1), de la forme :

C k
e N N
.
.

=
dans laquelle C reprsente la concentration teste, N le pourcentage de cellules vivantes la
concentration C, N le pourcentage de cellules vivantes la concentration 0 et k un paramtre.
Afin de pouvoir juger arbitrairement de la qualit de l'ajustement, la valeur N n'est pas fixe
97
100 %, mais est considre comme un second paramtre optimiser (Abi Khalil et al., 1986;
Dubois et al., 1989).
2.2 DOSAGE DE LA 8-OXO-7,8-DIHYDRO-2'-DESOXYGUANOSINE
PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
COUPLEE A UNE DETECTION ELECTROCHIMIQUE
2.2.1 Dtecteur ampromtrique et coulomtrique
Nous avons employ au cours de ce travail 2 types de dtecteurs, ampromtrique et
"coulomtrique
26
". Les systmes ampromtriques comportent une lectrode de travail plane
en carbone vitreux monte dans une configuration de type "flux tangentiel" (Figure 2.2-1);
bien que l'efficacit de ce type de dtecteur ne soit que de 5 10 %, ils prsentent un courant
rsiduel faible, ce qui permet d'obtenir un rapport signal-bruit optimal et donc une trs haute
sensibilit.

Figure 2.2-1 : Cellules de dtection ampromtrique employes dans ce travail


Cellule TL-5A Cellule CC-5

Les systmes coulomtriques sont constitus d'une lectrode de carbone poreux travers
laquelle passe l'entiret de l'effluent chromatographique. Leur efficacit est proche de 100 %
et ils sont donc thoriquement 10 20 fois plus sensibles que les autres dtecteurs

26
La terminologie employe par le fabriquant n'est pas correcte; il s'agit en ralit d'un dtecteur
ampromtrique haut degr de conversion.
98
ampromtriques; ils prsentent cependant un courant rsiduel important, ce qui rduit cet
avantage de sensibilit seulement un facteur 2 ou 3. La combinaison en srie de plusieurs
cellules forme une barrette d'lectrodes (coularray) qui permet une dtection plusieurs
potentiels simultans (Figure 2.2-2).

Figure 2.2-2 : Cellule de dtection coulomtrique et barrette d'lectrodes (4 lectrodes de
travail)


2.2.2 Ractifs et matriel
2.2.2.1 Ractifs
Les ractifs suivants sont obtenus chez :
Merck (Allemagne) le NaH
2
PO
4
.2 H
2
O (p.a.)
le mthanol (p.a., distill avant emploi)
l'ure (trs pur)
le dodcylsulfate de sodium (p.a.)
l'actate de sodium (p.a.)
le MgCl
2
(Ph.Eur.)
l'acide actique 96% (p.a.)
le NaCl (p.a.)
le glutathion rduit (p.a.)
l'actone (p.a.)
Aldrich (USA) l'alcool isoamylique (Grade Bioch.)
le peroxyde d'hydrogne (solution aqueuse 3 %)
Sigma (USA) l'ADN de sperme de saumon
la nuclase P1 (Penicillium citrinum; EC 3.1.30.1)
la dsoxyribonuclase I (bovine pancreas; EC 3.1.21.1)
la RNase A (bovine pancreas, heat-inactivated; EC 3.1.27.5)
la catalase
la 2'-dsoxyguanosine (dG)
la 2'-dsoxyadnosine (dA)
la 2'-dsoxycytidine (dC)
la thymidine (T), la guanosine (G) et l'adnosine (A)
la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine (8-oxodG)
le msylate de dferoxamine (95 %)
le chlorhydrate de DL-histidine
Calbiochem (USA) la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine (8-oxoG)
99
Bhringer Mannheim
(Allemagne)
la solution de protinase K (Tritirachium album; EC 3.4.21.14)
la solution de phosphatase alcaline (calf intestine; EC 3.1.3.1)
la solution d'ARN 16S- et 23S-ribosomial (E. coli)
UCB (Belgique) le saccharose (tout pur)
le citrate tri-sodique (Ph.Eur.)
Lab-Scan (Belgique) le chloroforme (p.a.)
Carlo Erba (Italie) le LiCl (99 %)
Stella (Belgique) la solution antiseptique (mlange thanol:ther, 97.1:2.9, v/v)
Janssen (Belgique) le Tris base
27
(Bioch. Grade)
Chemie KG Keppler +
Reiff (Allemagne)
l'EDTANa
2
H
2


L'eau "Millipore", utilise pour prparer toutes les solutions, est de l'eau dsionise,
distille et passe sur un systme de purification 4 cartouches (Millipore, USA).
2.2.2.2 Matriel
Le systme de chromatographie liquide haute performance (CLHP) est constitu des
lments suivants (2 dtecteurs sont coupls en srie, UV puis lectrochimique) : (i) une
pompe modle 305 couple un module manomtrique 805 (Gilson, France); (ii) un injecteur
Rheodyne 7125 avec boucle d'injection de 200 l (USA); (iii) une cartouche prcolonne
Ultrasphere C
18
28
(15 x 4.6 mm i.d.) (Alltech, USA); (iv) une colonne Ultrasphere C
18

(particules sphriques de 5 m, 250 x 4.6 mm i.d.) (Beckmann, USA), entoure d'une jaquette
d'eau maintenue 30C; les premiers essais de sparation ont cependant t raliss l'aide
d'une colonne -Bondapak C
18
(particules irrgulires de 10 m; 30 cm x 3.9 mm i.d.)
(Waters, USA) et d'une colonne Chrompack C
18
(particules irrgulires de 5 m; 2 cartouches
de 10 cm x 2.3 mm i.d. en srie) (Chrompack, The Netherlands); (v) un dtecteur UV
Holochrome HM (245 nm, 0.5 AUFS) (Gilson, France); (vi) un dtecteur ampromtrique
constitu d'un bloc d'lectrodes TL-5A (comprenant une lectrode de carbone vitreux, une
lectrode de rfrence Ag/AgCl et une contre-lectrode en acier inoxydable; cf Figures 2.2-7
et 2.2-8) (BAS, USA) coupl une unit ampromtrique A.S.I. ED-110 (Tacussel, France)
(+700 mV vs Ag/AgCl; 0.2 0.5 nA fond d'chelle); et (vii) une carte d'acquisition de
donnes 2 x 2 canaux, pilote par un logiciel d'intgration sous Windows 3.11 (Borwin,
France).

27
Tris = tris(hydroxymthyl)-aminomthane
28
C
18
= Silice greffe de chanes hydrocarbones octadcyles
100
Quelques analyses ont t ralises en utilisant les dtecteurs suivants : (i) un dtecteur
UV barrette de diodes modle 168, interfac au systme d'intgration Gold sous GEM
(Beckman, USA); (ii) un dtecteur ampromtrique constitu d'un bloc d'lectrodes CC-5
(comprenant une lectrode double en carbone vitreux connecte en mode srie, une lectrode
de rfrence Ag/AgCl et une contre-lectrode en acier inoxydable, cf Figures 2.2-2 2.2-3)
coupl une unit ampromtrique LC-4 (BAS, USA) (+700 mV vs Ag/AgCl; 0.1 0.5 nA)

Figure 2.2-3 : Gomtrie des cellules ampromtriques employes dans ce travail

Entretoise Electrode auxiliaire Electrode de travail
TL-5A
CC-5
Entretoise Electrode auxiliaire Electrode de travail
TL-5A
CC-5



fond d'chelle); ce systme peut travailler avec une contre-pression leve et est donc
connect avant le dtecteur UV; et (iii) un dtecteur ampromtrique de type Coularray (ESA,
USA) quip de 4 lectrodes en srie, associes des lectrodes de rfrence en palladium et
des contre-lectrodes en platine.
2.2.2.3 Conditions chromatographiques
La phase mobile isocratique, constitue d'un mlange de 92.5 % de tampon aqueux
(NaH
2
PO
4
.2 H
2
O 0.05 M, EDTA 1 mM, pH "tel quel", 5.45) et de 7.5 % de mthanol, est
filtre sur une membrane de Tflon 0.45 M (Sartorius, USA) et soigneusement dgaze dans
un bain ultrason. Le dbit est de 1 ml/min; la temprature de la colonne est de 30C; 100 l
sont injects.
Le bloc d'lectrodes TL-5A ou CC-5 est dmantel tous les 3 4 jours et soigneusement
rinc l'eau "Millipore" et au mthanol; l'lectrode de travail est dlicatement polie avec un
papier longues fibres imbib de mthanol, ce qui permet de compenser la faible diminution
de signal observe au cours du temps. Aucun polissage alumine n'a t requis au cours des 4
101
annes d'utilisation du systme. Trois lectrodes de rfrence, conserves en suspension dans
une solution de NaCl 3M, sont utilises en rotation, tous les 3 4 jours.
2.2.2.4 Synthse de la 8-oxodG
Lorsque nous avons entam ce travail, la 8-oxodG n'tait pas commercialement
disponible; aussi avons-nous ralis un essai de synthse par oxydation de la dG et ce, dans 2
buts : (i) dvelopper la sparation chromatographique entre dG et 8-oxodG sous dtection
UV, afin de situer le pic de base oxyde avant toute tentative de branchement du dtecteur
lectrochimique; et (ii) isoler la 8-oxodG par chromatographie liquide afin de pouvoir
l'employer en tant qu'talon.
Cette synthse est base sur la raction d'Udenfriend, dcrite pour l'hydroxylation de
nombreux composs aromatiques (Udenfriend et al., 1954; Kasai et Nishimura, 1984); il s'agit
d'une raction de type Fenton (fer
II
, EDTA et oxygne), catalyse par l'acide ascorbique. Nous
avons opt pour la variante propose par Kasai (Kasai et Nishimura, 1984) qui permet de
raliser la synthse de la 8-oxodG en prsence uniquement de perhydrol et d'acide ascorbique
sans ajouter d'ions mtalliques; elle prsente un rendement infrieur mais facilite les tapes de
purification ultrieures (Frenkel et al., 1991). Le mcanisme de la raction n'est pas connu
avec certitude, mais le radical

OH est certainement impliqu (Kasai et Nishimura, 1984). Il


semble que des ions mtalliques en traces amorceraient une raction de Fenton, l'acide
ascorbique permettant de recycler l'ion mtallique oxyd (Eq. 2.2-4) (Halliwell et Gutteridge,
1999).
H
2
O
2
+ M
n+


OH + OH
-
+ M
(n+1)+



Acide ascorbique

Dix mg de dG sont incubs une nuit 37C dans 10 ml d'une solution 50 mM en H
2
O
2
,
14 mM en acide ascorbique, 0.13 M en phosphate, pH 6.8. Aprs destruction de l'excs de
perhydrol par 50 g de catalase (1 h 37C), la solution est concentre environ 2 ml
(vaporateur rotatif sous vide), additionne de 2 volumes d'actone et laisse une nuit 4C.
Le surnageant est dcant, vapor sec, repris dans 5 ml d'eau et dilu en fonction de la
sensibilit applique aux dtecteurs de CLHP.
Cette synthse nous a fourni suffisamment de 8-oxodG pour mettre au point la sparation
chromatographique dG 8-oxodG en dtection UV (cf Section 3.2.1.1). Nos projets de
102
purification par CLHP semi-prparative de la 8-oxodG sont devenus inutiles de par la
commercialisation de ce nucloside.
2.2.2.5 Prparation des solutions talons
Les solutions aqueuses de 8-oxodG et de dG sont prpares et dilues en prenant des
prcautions de nettoyage et de rinage afin d'viter toute trace de mtal qui pourrait catalyser
l'oxydation de la dG. Une solution de travail, contenant environ 4 pmoles de 8-oxodG et
20 nmoles de dG, est prpare par combinaison et dilutions de 2 solutions mres (~ 1.40 mg
de 8-oxodG
29
dans 10 ml et ~ 12.70 mg de dG
30
dans 50 ml). Cette solution et toutes les
dilutions intermdiaires sont aliquotes et congeles 20C; chaque solution n'est
dcongele qu'une seule fois, juste avant l'emploi.
La contamination en 8-oxodG de la dG utilise pour la prparation des talons est
dtermine par CLHP en prparant des dilutions individuelles des 2 solutions mres; cette
contamination est d'environ 1.7 par 10
5
dG, ce qui n'est pas ngligeable en regard du niveau
de 8-oxodG dans l'talon (~ 20 par 10
5
dG).
2.2.2.6 Prparation des solutions d'extraction et de digestion
Tampon H : une solution 300 mM en saccharose, 25 mM en Tris et 2 mM en EDTA
,

pH 7.3
Tampon HM : une solution 300 mM en saccharose, 25 mM en Tris, 2 mM en EDTA,
6 mM en glutathion rduit, 2 mM en msylate de dferoxamine et 8mM en DL-
histidine, pH 7.3
Tampon DES : une solution 1M en LiCl, 2M en ure, 50 mM en Tris, 5 mM en EDTA
et 2 % en dodcylsufate de sodium, pH 8.0
Solution d'actate de sodium : une solution 3M en actate de sodium, pH 7.0
Tampon TE : une solution 10 mM en Tris et 1 mM en EDTA, pH 7.4
Solution de digestion : une solution 0.5 M en actate de sodium et 0.11 M en MgCl
2
,
pH 5.1
Solution de nuclase P1 : 400 U/ml dans l'eau (conservation, environ 3 mois 4C)
2.2.3 Dosage de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire
L'extraction et la digestion de l'ADN cellulaire sont adaptes de (Maidt et Floyd, 1996),
avec quelques modifications, notamment au niveau des tampons et de la squence des

29
Mr = 283.2
30
Mr = 267.2
103
oprations; tout le travail est ralis sous conditions d'clairage faible de manire viter une
photooxydation ventuelle. Une validation complte de la mthode d'analyse fait l'objet de la
Section 3 de ce travail.
2.2.3.1 Conservation des chantillons
Aprs le traitement gnotoxique tudi, les cellules sont transfres dans un tube Falcon
de 15 ml, laves 2 reprises par 1/2 volume de PBS
31
, transfres l'aide de 1 ml de PBS
dans un microtube de 1.5 ml, centrifuges (900 g, 2 min), dcantes, dlicatement
superposes de 250 l de tampon HM et congeles -80C pendant maximum 3 semaines.
Lors de la validation, certains essais ont t raliss avec un tampon de conglation ne
contenant pas d'antioxydant (tampon H).
2.2.3.2 Extraction de l'ADN
Un culot cellulaire correspondant environ 10
7
cellules, conserv 80C sous tampon
HM (cf prcdent), est rapidement dgel, mis en suspension (vortex), additionn de 5 l de
protinase K et de 250 l de tampon DES et incub 55C pendant 2 h. La solution visqueuse
est alors extraite 2 reprises par 500 l d'un mlange glac de chloroforme : alcool
isoamylique (24 : 1) (15 min d'agitation, 5 min de centrifugation 1800 g). Le surnageant
final, ainsi que tout matriel visqueux adhrant l'interface, est alors transvas dans un
microtube
32
de 2 ml et additionn de 33 l de la solution d'actate de sodium et de 1 ml
d'thanol 94 glac; le tube est lentement mlang par retournement jusqu' apparition du
filament d'acides nucliques et incub 1 h -20C. Aprs centrifugation (1800 g, 5 min), le
culot est rinc 2 fois par de l'thanol 70 et 1 fois par de l'thanol 94 (suspension dans 500 l
de solvant glac et 2 min de centrifugation 1800 g), sch 5 10 min sous un courant doux
d'azote, mis en suspension dans 250 l de tampon TE et laiss dissoudre 4C pendant
maximum une nuit.
2.2.3.3 Digestion enzymatique de l'ADN
La solution d'ADN dans le tampon TE (cf prcdent) est additionne de 25 l de
solution de digestion, dnature (100C pendant 5 min, puis 0C pendant 5 min), additionne
de 4 U de nuclase P1 et incube 37C pendant 1 h; aprs addition de 8 l de Tris 1 M et de
2 U de phosphatase alcaline, la solution est rincube 37C pendant 1 h. Aprs addition de

31
Mise en suspension dans 1/2 volume de PBS et centrifugation (900 g, 2 min)
32
Les tubes sont pralablement lavs (2 rinages avec la solution antiseptique, 2 rinages l'eau, 2 rinages avec
la solution antiseptique) et schs t ambiante
104
4 l d'acide actique 5.8 M, la solution est maintenue 4C l'obscurit pendant un
maximum de 8 h avant chromatographie (injection de 100 l).
2.2.3.4 Induction de bases oxydes
Lors de l'tude de validation, nous avons besoin de cellules dans lesquelles la 8-oxodG est
induite diffrents taux. Les cellules P388D1 ncessaires l'exprimentation sont prleves,
dnombres et centrifuges (900 g, 2 min) comme au 2.1.3.2.2.1 ; le culot cellulaire est lav
2 fois par 1/2 volume de PBS et remis en suspension dans un volume de PBS de manire
obtenir une densit de 10
7
cellules/400 l. Les cellules sont transfres dans une bote de Ptri
de 30 mm de diamtre, additionnes de H
2
O
2
jusqu' 20 mM et exposes sans couvercle aux
UVC (tube germicide Sylvania G8T5 plac 5 cm de la surface du liquide; t ambiante; 2
15 min). Il y a notamment photolyse du perhydrol et gnration de radicaux hydroxyles qui
attaquent les biomolcules cellulaires (Halliwell et Gutteridge, 1999) :

H
2
O
2
UVC


2

OH


Les cellules sont alors immdiatement traites comme dcrit au 2.2.3.1 en remplaant le
tube Falcon par un microtube de 1.5 ml.
2.3 INDUCTION ET PHOTOACTIVATION DES PORPHYRINES
ENDOGENES
2.3.1 Ractifs et matriel
2.3.1.1 Ractifs
Le chlorhydrate d'acide -aminolvulinique ( -ala), le ractif de Folin et l'albumine
bovine fraction V 96 % (rf. A-4503) proviennent de chez Sigma (USA). Les autres ractifs
sont de qualit pour analyse et proviennent soit de chez Merck (Allemagne) ou de chez
Aldrich (USA). Les porphyrines sont extraites par un mlange HClO
4
1 M : mthanol (1 : 1).
2.3.1.2 Matriel
Les mesures spectrophotomtriques UV/visible sont ralises sur un spectrophotomtre
Ultrospec (Pharmacia, Sude). Les spectres UV du polythylne et du milieu de culture ont
t relevs sur un spectrophotomtre barrette de diodes (Hewlett-Packard). Les mesures et
spectres de fluorescence sont ralises sur un Luminescence Spectrometer Aminco-Bowman
Series 2 (Sim Aminco, USA). Dans certaines expriences, les cellules ont t lyses l'aide
d'une sonde ultrasons Soniprep 150 (Sanyo Gallenkamp PLC, Royaume-Uni).
105
2.3.1.3 Microscopie
Le microscope utilis est un Axiovert S100TV (Zeiss, Allemagne), quip en
pifluorescence ( lampe xnon); une roue filtres Lambda 10-2 (Sutter, USA) dote d'un
obturateur rapide permet la slection des filtres d'excitation. L'objectif utilis est de type
NoFluar, 25 x immersion (Zeiss, Allemagne). La camra couple au microscope est une
Hamammatsu Orca-2 (capteur CCD 12 bits refroidi 50C), pilote par le logiciel AQM
(Kinetic Imaging, Royaume-Uni). Pour l'examen des porphyrines, les longueurs d'onde
d'excitation, du miroir dichroque et d'mission sont respectivement (nm) 425 20, 460 et 590
(long pass) (Gaullier et al., 1995); les filtres de densit neutre sont de type 0.06 (6 % de
transmission) et 0.25 (25 % de transmission) (Zeiss, Allemagne).
2.3.1.4 Sources lumineuses
2.3.1.4.1 Mesure des intensits lumineuses
2.3.1.4.1.1 Dfinitions
Les conditions d'irradiation sont en fait dfinies par 3 paramtres, (i) le spectre de la
source, qui dpend des caractristiques propres de la lampe; (ii) le dbit de fluence, l'nergie
radiante, traversant une petite cible sphrique imaginaire transparente contenant le point
considr, par unit de surface et par unit de temps; pour une lampe donne, il dpend de la
distance la source et de l'angle incident et s'exprime en W/m ou en mW/cm (IUPAC,
1996); et (iii) le temps d'exposition.
La fluence, l'nergie reue par unit de surface, exprime en Joules/m (J/m) ou en
millijoules/cm (mJ/cm) prend en compte les 2 derniers paramtres; elle est en effet gale au
produit du dbit de fluence par le temps d'exposition exprim en secondes (IUPAC, 1996).
Comme les rponses photobiologiques dpendent principalement du nombre de photons reus
et non de l'intensit du rayonnement (rciprocit des effets, cf 1.3.1), la "dose de lumire"
est en fait caractrise par la fluence.
2.3.1.4.1.2 Choix d'un appareil de mesure
Les systmes de mesure actuels consistent d'un botier et d'une tte de mesure dont les
caractristiques dpendent de la source mesurer. Trois grands types de dtecteurs sont
utiliss (James, 1991; International Light, 1999; Ophir, 2000): (i) les dtecteurs
calorimtriques dans lesquels l'nergie est absorbe, ce qui provoque une augmentation de
temprature, convertie en signal lectrique par un thermocouple; ces dtecteurs prsentent une
rponse quasi indpendante de la longueur d'onde; (ii) les photodiodes qui convertissent
directement les photons reus en courant lectrique; ils montrent une rponse fortement
106
dpendante de la longueur d'onde et doivent tre fabriqus, filtrs et calibrs pour des sources
ou des bandes de longueurs d'onde prcises; et (iii) les dtecteurs pyrolectriques qui
mesurent l'apparition de charges de surface sur un cristal qui prsente un diple permanent,
dont le degr de polarisation varie avec la temprature; ils ne peuvent voir que des signaux
pulss et ncessitent un mcanisme obturateur de type chopper l'entre.
En fonction des activits prvues dans le laboratoire, l'appareil de mesure devait pouvoir
mesurer des tubes fluorescents UVA, UVB et UVC, des lampes visibles et une lampe au
xnon filtre travers un monochromateur. Afin d'viter l'achat de plusieurs tte de mesure
diffrentes, notre choix s'est port sur un dtecteur de type thermopile, un dtecteur
calorimtrique form de thermocouples empils, la rponse quasi indpendante de la
longueur d'onde (Figure 2.3-1).

Figure 2.3-1 : Courbe de rponse du dtecteur thermopile

Dtecteur
thermopile

(Ophir, 2000)

Ce dtecteur prsente cependant de gros inconvnients. Il est sensible aux infrarouges et il
ragit la chaleur dgage par les lampes ou par l'exprimentateur; il continue notamment
enregistrer un signal (thermique) lev lorsqu'il est expos une lampe chaude teinte
Comme il n'existe pas de filtre infrarouge transparent aux UV, nous avons choisi de mesurer
les intensits travers une bote de culture contenant 6 ml de milieu complet; ceci permet une
filtration efficace de la chaleur tout en prsentant l'avantage de mesurer la dose totale de
lumire (UVB, UVA et visible) qui arrive rellement au niveau des cellules. Le dtecteur
reste cependant sujet une forte drive thermique et, aprs quelques minutes de mesures, le
thermopile s'chauffe et enregistre un bruit de fond lev; aprs 5 minutes de mesure, un
107
repos d'au moins 2 heures permet de retrouver le "zro" calibr prcdemment dans
l'obscurit.
Le dtecteur utilis pour l'ensemble de ces expriences est un Nova display, coupl une
tte Thermopile Surface Absorber 2A (Ophir Optronics, USA); c'est un absorbeur large, dans
la gamme 190 20000 nm (60 W 2 W; temps de rponse, 1.2 s) (Figure 2.3-1).
2.3.1.4.2 Source UVA
La lampe UVA, construite au laboratoire, est constitue de 4 tubes fluorescents typiques
des lampes bronzer les plus employes (Diffey, 1999); il s'agit de tubes Cleo 15 W (28.8 cm
x 16 mm diam.) (Philips, Hollande), monts en parallle sur un support (les 4 tubes sont
aligns et espacs de 4 cm) et aliments par des ballasts standards de 36W/40W combins
avec un starter S10. La lampe est place 23.4 cm au-dessus de la couche de cellules
irradies; le dbit de fluence est mesur au niveau des cellules, travers une bote de culture
contenant 6 ml de milieu complet, l'aide de la sonde thermopile dcrite au 2.3.1.4.1.2 .
2.3.1.4.2.1 Spectre de la lampe UVA
Le spectre de la lampe fourni par le fabriquant est prsent en Figure 2.3-2. Nous avons
confirm ce spectre en cours de travail par un relev sur un spectrographe Oriel coupl une
barrette de diodes Instaspec. La calibration de longueur d'onde a t ralise grce une
lampe au xnon, un filtre interfrentiel HBW 10 nm et un monochromateur Oriel.
Ce spectrographe nous a permis de contrler la longueur d'onde des bandes d'mission;
sans calibration au niveau intensit, il n'a cependant pu nous fournir un spectre correct des
intensits relatives des diffrentes longueurs d'onde.
La lampe Cleo offre un spectre continu de 300 425 nm, avec un maximum environ
354 nm; elle exhibe en fait les raies du mercure environ 365, 406, 436, 546, 580 et 630 nm.
Elle prsente un rapport d'mission UVB/UVA de 1.2 % (donnes du fabriquant).
2.3.1.4.2.2 Dbit de fluence
Comme il est fortement recommand de s'assurer de l'uniformit de la radiation par
rapport au champ expos (James, 1991), nous avons ralis une mire (7 x 5 carrs de 4 cm de
ct) afin de caractriser l'htrognit spatiale et temporelle du dbit de fluence. Cette mire
a t centre sous la lampe et les mesures ont t ralises dans les mmes conditions que
pour les cellules (sonde thermopile centre dans le carr de mesure, 23.4 cm de la lampe,
travers une bote de culture contenant 6 ml de milieu complet). La Figure 2.3-3 prsente les
rsultats obtenus 3 reprises au cours de ce travail (mesures espaces d'environ 6 mois). La
108
forme des botes de culture est matrialise dans une configuration d'irradiation typique de
celles que nous avons ralises.

Figure 2.3-2 : Spectre d'mission des tubes Cleo



(Philips, 2000)

Figure 2.3-3 : Distribution spatiale du dbit de fluence sous la lampe UVA (mW/cm)
(3 mesures espaces de 6 mois)

Coordonnes 1 2 3 4 5 6 7

A
0.194
0.158
0.203
0.263
0.233
0.275
0.294
0.280
0.312
0.306
0.305
0.324
0.285
0.289
0.304
0.243
0.239
0.253
0.170
0.167
0.186

B
0.234
0.184
0.232
0.300
0.264
0.308
0.348
0.315
0.358
0.351
0.337
0.370
0.326
0.321
0.345
0.286
0.271
0.289
0.200
0.194
0.212

C
0.243
0.190
0.243
0.313
0.264
0.312
0.362
0.324
0.364
0.372
0.345
0.378
0.344
0.329
0.351
0.288
0.277
0.292
0.215
0.199
0.218

D
0.222
0.167
0.223
0.298
0.233
0.281
0.342
0.283
0.332
0.352
0.298
0.346
0.325
0.282
0.321
0.275
0.242
0.268
0.198
0.173
0.196
E
0.186
0.122
0.180
0.247
0.179
0.229
0.283
0.215
0.266
0.289
0.231
0.279
0.273
0.219
0.263
0.224
0.185
0.219
0.169
0.134
0.160
Tube 1
Tube 2
Tube 3
Tube 4
109
Comme le montre cette figure, la fluctuation spatiale est suprieure la fluctuation
temporelle; cette dernire est probablement due des difficults repositionner la lampe
exactement au mme endroit et la mme hauteur. En moyennant la surface des botes par
carr avec le dbit de fluence auquel ce carr est expos, nous pouvons estimer un dbit de
fluence moyen environ 0.31 mW/cm. La dispersion spatiale observe est invitable et
comparable des dispersions publies (James, 1991).
2.3.1.4.3 Source Visible
La lampe visible, construite au laboratoire, est constitue de 3 lampes filament de
tungstne Spotone R95 de 75W (Philips, Hollande), montes en forme de trfle sur un support
(les 3 spots sont arrangs en cercle et se touchent aux extrmits). La lampe est place
50.6 cm au-dessus de la couche de cellules irradies; le dbit de fluence est mesur au niveau
des cellules, travers une bote de culture contenant 6 ml de milieu complet, l'aide de la
sonde thermopile dcrite au 2.3.1.4.1.2 .
2.3.1.4.3.1 Spectre de la lampe visible
Le spectre de la lampe fourni par le fabriquant est prsent en Figure 2.3-4. Nous avons
confirm ce spectre en cours de travail comme dcrit au 2.3.1.4.2 .
Cette lampe offre un spectre continu commenant 370 nm et se continuant au-del de
850 nm; l'mission est trs faible en-dessous de 400 nm et maximale environ 725 nm.
2.3.1.4.3.2 Dbit de fluence de la lampe visible
La distribution de dbit de fluence a galement t mesure pour la lampe visible en
procdant comme dcrit au 2.3.1.4.2 . La Figure 2.3-5 prsente les rsultats obtenus 2
reprises au cours de ce travail (mesures espaces d'environ 6 mois); la forme des botes de
culture est matrialise dans une configuration d'irradiation typique de celles que nous avons
ralises.
Nous pouvons tirer les mmes conclusions que pour la lampe UVA. En moyennant la
surface des botes par carr avec le dbit de fluence auquel ce carr est expos, nous pouvons
estimer un dbit de fluence moyen environ 11.9 mW/cm.

110
Figure 2.3-4 : Spectre d'mission typique d'une lampe incandescente de type similaire au
Spotone



(Philips Lighting, 1992)

Figure 2.3-5 : Distribution spatiale du dbit de fluence sous la lampe visible (mW/cm)
(2 mesures espaces de 6 mois)

Coordonnes 1 2 3 4 5 6 7

A
7.82
7.70

10.01
9.54
11.74
11.54
12.06
11.69
10.10
9.76
7.88
7.78
6.10
6.05

B
8.58
8.53

11.97
11.52
13.72
13.53
13.51
13.35
11.75
11.60
9.84
9.59
7.51
7.28

C
7.45
7.22

10.85
10.30
13.52
13.34
14.22
13.93
12.76
12.65
10.47
10.22
7.98
7.73

D
6.12
6.35

9.65
9.67
13.25
13.12
13.86
13.66
12.10
11.79
9.85
9.34
7.09
6.96
E
5.36
5.68

8.77
8.71
11.01
11.04
11.07
10.46
9.25
8.78
7.12
7.01
4.82
5.04
111
2.3.1.4.4 Transmission optique du polythylne, du milieu de culture et du filtre utilis
Sont prsents ci-dessous (Figure 2.3-6) les spectres de transmission du polythylne des
botes ainsi que du milieu de culture de la ligne P388D1 (milieu prlev 24 h aprs mise en
culture de 5 x 10
6
cellules/6 ml; trajet optique, 1 cm).
Certains essais ont t raliss en posant sur les botes un filtre Hoya UV-34 (Newport
Industrial Glass, USA) de 3 mm d'paisseur, de manire liminer toute trace d'UVB dans le
spectre mis par la source UVA (Figure 2.3-7)

Figure 2.3-6 : Spectres de transmission du polythylne des botes de culture et du milieu








112
Figure 2.3-7 : Spectre de transmission du filtre Hoya UV-34

(Newport Industrial Glass, 1994)
2.3.2 Mthode d'induction des porphyrines
Les cellules P388D1 ou HBL ncessaires l'exprimentation sont prleves, dnombres
et centrifuges comme dcrit au 2.1.3.2.2 . Le culot cellulaire est remis en suspension dans
un volume de milieu complet de manire obtenir une densit (i) de 0.83 x 10
6
cellules/ml
(ligne P388D1); ou (ii) de 0.125 x 10
6
cellules/ml (ligne HBL). Pour la plupart des
expriences, 6 ml de cette suspension sont transfrs dans une bote de culture de 25 cm.
Pour certaines expriences sur les cellules HBL, 15 ml sont transfrs dans une bote de
culture de 75 cm. Aprs un repos de 22 26 h dans l'incubateur, les botes sont additionnes
de 100 l (botes de 25 cm) ou de 300 l (botes de 75 cm) d'une solution aqueuse
extemporane d'acide -aminolvulinique (-ala) et replaces dans l'incubateur pour le temps
de chargement requis.
2.3.3 Dosage fluorimtrique des porphyrines intra- et extra-cellulaires
L'extraction des porphyrines par un mlange HClO
4
1 M : mthanol (1 : 1) (Quintanilla-
Vega et al., 1995) monomrise les agrgats de porphyrines, ce qui permet une mesure fiable
en fluorescence (Gomer et al., 1985). Comme nous sommes intresss par une mesure relative
(vrification de l'induction de porphyrines et cintique d'volution des porphyrines totales) et
non pas absolue, les rsultats sont simplement exprims en units de fluorescence par mg de
protines.
113
2.3.3.1 Ligne P388D1
Les cellules, charges en -ala comme dcrit au 2.3.2 , sont immdiatement centrifuges
(900 g, 2 min). Le culot, lav 2 fois par 1/2 volume de PBS
33
, et le milieu de culture sont
congels -20C jusqu' extraction (maximum 2 semaines). Aprs dconglation (10
15 min t ambiante), le culot cellulaire est additionn de 1 ml du mlange d'extraction, agit
(vortex) et centrifug (1800 g, 2 min); 1 ml de milieu de culture est trait de la mme manire.
Les surnageants sont transfrs dans le fluorimtre pour mesures et relevs de spectres.
Dans le but de relever les spectres de fluorescence pH physiologique, quelques culots
dcongels sont repris dans 1 ml de PBS et soniqus (2000 W, 30 s); les milieux de culture
correspondants sont dilus 1/2 dans le PBS.
2.3.3.2 Ligne HBL
Aprs chargement des cellules en -ala comme dcrit au 2.3.2 (botes de 75 cm), le
milieu de culture est soutir et congel. Le tapis de cellules est rinc par 2 x 5 ml de PBS,
additionn de 800 l de mlange d'extraction, soigneusement racl l'aide d'un grattoir strile
et rcupr dans un microtube de 2 ml. Cette opration est renouvele et les 2 solutions sont
combines et centrifuges (1800 g, 2 min); les surnageants sont conservs -20C pendant 2
semaines.
Aprs dconglation, 1 ml du milieu de culture est additionn de 1 ml du mlange
d'extraction, agit (vortex) et centrifug (1800 g, 2 min). Le surnageant ainsi que l'extrait
cellulaire sont transfrs dans le fluorimtre pour mesures et relevs de spectres.
2.3.4 Dosage des protines
Le dosage des protines a t ralis suivant la mthode photomtrique de Lowry (Lowry
et al., 1951) telle que modifie par Peterson (Peterson, 1977).
2.3.4.1 Prparation des solutions talons et des ractifs
Les solutions talons sont prpares par dilution d'une solution stock d'albumine bovine
Fraction V (10 mg/ml), de manire raliser un talonnage dans la gamme de 0 200 g/ml.
La solution de lyse est une solution de dodcylsulfate de sodium (0.2 %) dans du NaOH
0.2 M. Le ractif CTC est une solution de Na
2
CO
3
(10 % m/v), de CuSO
4
.5H
2
0 (0.1 % m/v) et
de tartrate sodico-potassique (0.2 % m/v). Le ractif A est un mlange quivolumes de ractif

33
Mise en suspension dans 1/2 volume de PBS et centrifugation (900 g, 2 min)
114
CTC, de dodcylsulfate de sodium (10 %), de NaOH (0.8 M) et d'eau. Le ractif B est le
ractif de Folin, dilu 1/6 dans l'eau.
2.3.4.2 Dosage
Le culot rsiduel d'extraction des porphyrines ( 2.3.3 ) est additionn de 0.5 ml de
solution de lyse, incub 60C pendant une heure et additionn de 0.5 ml d'eau (Quintanilla-
Vega et al., 1995). Vingt cinq et 50 l de cette solution sont alors dilus 1ml avec de l'eau.
Un ml de cet extrait cellulaire ou de solution talon est additionn de 1 ml de ractif A,
incub 10 min t ambiante, additionn de 0.5 ml de ractif B et immdiatement mlang
(vortex). Aprs 30 min d'incubation, l'absorbance est mesure 750 nm contre un blanc
ractif prpar dans les mmes conditions en remplaant la solution de protines par de l'eau.
2.3.5 Examen en microscopie de fluorescence
2.3.5.1 Ligne P388D1
Les cellules, charges en -ala comme dcrit au 2.3.2 , sont tales sur une lame de
microscope, couvertes d'une lamelle et examines en immersion; afin de ralentir le bleaching
de la fluorescence, un filtre de densit neutre (Zeiss, 0.25) est incorpor sur le trajet optique
d'excitation.
2.3.5.2 Ligne HBL
Les cellules sont ensemences sur une lame de microscope dans une bote de Ptri,
laisses 24 h dans l'incubateur et charges en -ala comme dcrit au 2.3.2 . La lame est
soigneusement extraite de la bote de Ptri, couverte d'une lamelle et examine en immersion.
L'talement important des cellules, et donc leur paisseur trs mince, se traduit par un
bleaching rapide, ncessitant un filtre de densit neutre plus important (Zeiss, 0.06). Ce filtre
ne laisse cependant pas passer suffisamment de lumire pour un examen direct de la
fluorescence et l'acquisition d'image ncessite des temps de pose de plusieurs secondes. Afin
de permettre la visualisation des contours cellulaires, l'image obtenue sera donc combine
avec une image de microscopie visible et ce, l'aide du logiciel Kromascan (Kinetic Imaging,
Royaume-Uni).
2.3.6 Irradiation UVA et visible
2.3.6.1 Pour les mesures de 8-oxodG (ligne P388D1)
Les cellules une fois charges en -ala comme dcrit au 2.3.2 , les botes de culture de
25 cm sont fermes hermtiquement, transfres dans un bain-marie 4C dans la chambre
115
froide et exposes aux sources lumineuses dcrites au 2.3.1.4 pendant le temps requis. Les
cellules sont alors immdiatement traites comme dcrit au 2.2.3.1 .
2.3.6.2 Pour le test "comte"
2.3.6.2.1 Ligne P388D1
Les cellules une fois charges en -ala comme dcrit au 2.3.2 , les botes de culture de
25 cm sont fermes hermtiquement, transfres dans un bain-marie 4C et exposes aux
sources lumineuses dcrites au 2.3.1.4 pendant le temps requis. Les cellules sont alors
transfres dans un tube Falcon de 15 ml, laves par 3 ml de PBS
34
et remises en suspension
35

dans 5 ml de PBS dont 15 l (~ 3 x 10
4
cellules) sont couls dans 300 l de gel d'agarose
point de fusion bas comme dcrit dans le 2.4.2.1 .
2.3.6.2.2 Ligne HBL
Les cellules une fois charges en -ala comme dcrit au 2.3.2 , les botes de culture de
25 cm sont fermes hermtiquement, transfres dans un bain-marie 4C et exposes aux
sources lumineuses dcrites au 2.3.1.4 pendant le temps requis. Les cellules sont alors
rinces 2 reprises par 1 ml de la solution de trypsinisation, additionnes de 0.5 ml de la
mme solution, laisses en contact temprature ambiante jusqu' dcrochage (2 6 min) et
additionnes de 3 ml de PBS contenant 10 % de srum ftal de buf . Les cellules sont
ensuite transvases dans un tube Falcon de 15 ml, laves par 3 ml de PBS
36
et remises en
suspension
21
dans 1 ml de PBS dont 15 l (~ 3 x 10
4
cellules) sont couls dans 300 l de gel
d'agarose point de fusion bas comme dcrit dans le 2.4.2.1 .
Ce procd de dcrochage, valid en collaboration avec Mrs. G. Dehon et E. Kinnaert,
n'induit pas de cassures de chanes (Thses en cours de ralisation).
2.4 L'ESSAI "COMETE" (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS)
2.4.1 Ractifs et matriel
2.4.1.1 Ractifs
Les agaroses point de fusion bas et normal (electrophoresis grade) ainsi que la solution
de bromure d'thidium 10 mg/ml sont obtenus chez Gibco Life Technologies (Ecosse); le
NaOH (p.a.), le KCl (p.a.) et le Triton X-100 (pour GC) proviennent de chez Merck,

34
Mise en suspension dans le PBS et centrifugation (900 g, 2 min)
35
Cette remise en suspension ncessite quelques oprations d'aspiration/dispensation l'aide d'une pipette
automatique; il est indispensable de procder en douceur pour viter toute fragmentation d'ADN
36
Mise en suspension dans le PBS et centrifugation (450 g, 2 min)
116
Allemagne, les lames de microscope (26 x 76 mm) et les couvre-lames (24 x 50 mm) de chez
Vel (Belgique). Les enzymes Endonuclase III (Endo III) et Formamidopyrimidine
glycosylase (FPG) ont t obtenues auprs du Dr Andrew Collins (Rowett Research Institute,
Aberdeen, Ecosse) et l'enzyme T4 endonuclase V auprs du Dr Karel Angelis (Institut de
Botanique Exprimentale de l'Acadmie Tchque des Sciences, Praha, Rpublique Tchque).
Ces enzymes, fournies sous forme d'extraits protiques partiellement purifis afin d'liminer
les activits nuclasiques non spcifiques (Angelis et al., 1999), ont t employes aux
dilutions recommandes par leurs producteurs. Les autres ractifs ont t dcrits
prcdemment ( 2.2.2.1 ).
2.4.1.2 Prparation des solutions et des lames de microscope
Le tampon de lyse est une solution 2.5 M en NaCl, 10 mM en Tris et 100 mM en
EDTA, pH 10.0.
La solution de lyse est un mlange Tampon de lyse : DMSO : Triton X-100 (89 : 10 :
1, v/v); elle est prpare journellement et quilibre 4C avant emploi.
La solution de dnaturation alcaline est une solution environ 0.3 M en NaOH (19.2 g
pour 1.6 litres) et 1 mM en EDTA; la quantit ncessaire une lectrophorse est
prpare extemporanment.
Le tampon de neutralisation est une solution 0.4 M en Tris, pH 7.5.
Une solution d'agarose point de fusion bas 0.8 % dans le PBS est dispense en
fractions de 300 l dans des microtubes de 1.9 ml. Quelques heures avant emploi, les
gels sont liqufis par chauffage 60C et quilibr 37C.
La solution de digestion enzymatique est une solution 0.1 M en KCl, 0.5 mM en
EDTA et 40 mM en HEPES contenant 0.2 mg/ml d'albumine.
Les solutions d'enzymes Endo III et T4 endonuclase V telles que reues sont
dgeles, dispenses en fractions de 2 l et stocke 80C. Les solutions d'emploi
sont prpares par addition une de ces parties aliquotes de 2 ml de solution de
digestion enzymatique; si ncessaire, elles peuvent tre dispenses en fractions de
320 l et stockes 80C.
La solution d'enzyme FPG telle que reue est dgele, dispense en fractions de 2 l et
stocke 80C. La solution intermdiaire est prpare par addition une de ces
parties aliquotes de 198 l de solution de digestion enzymatique contenant 10 % de
glycrol; elle est alors dispense en fractions de 10 l et stocke 80C. La solution
117
d'emploi est prpare par addition une de ces parties aliquotes de 300 l de solution
de digestion enzymatique.
La solution d'emploi de bromure d'thidium (20 g/ml) est prpare par dilution de la
solution stock.
Les lames de microscope sont pr-traites (couche d'accrochage) par immersion rapide
dans une solution 1 % d'agarose point de fusion normal (maintenue environ 70C)
et sches temprature ambiante pendant une nuit.
2.4.1.3 Matriel
La cuve d'lectrophorse est une Horizon 20-25 (Gibco Life Technologies, Ecosse),
maintenue environ 18C par un bain d'eau. Le gnrateur de tension est un Power Pac 200
de Bio-Rad (Etats-Unis).
Le systme de microscopie et d'analyse d'images a t dcrit au 2.3.1.3 . Pour le
bromure d'thidium, les longueurs d'onde d'excitation, du miroir dichroque et d'mission sont
respectivement (nm) 540 12.5, 565 et 605 27.5. L'acquisition et l'analyse d'images sont
ralises l'aide du logiciel ddi Komet 4.0 (Kinetic Imaging, Royaume-Uni).
2.4.2 Mode opratoire
2.4.2.1 Prparation des lames
L'ensemble des oprations s'effectue sous lumire inactinique; un maximum de 24 lames
peut tre trait par lectrophorse.
Un mlange de 300 l de la solution d'agarose point de fusion bas et de 15 l d'une
suspension de cellules individualises (environ 3 x 10
4
cellules, cf 2.3.6.2 ) est
immdiatement coul sur une lame de microscope, superpos d'un couvre-lame et dpos sur
une plaque de mtal maintenue sur glace fondante. Aprs solidification du gel, le couvre-lame
dlicatement enlev, la lame est immerge dans la solution de lyse et maintenue 4C
pendant au minimum 1 h, au maximum 4 semaines.
Les lames sont retires de la solution de lyse, rinces rapidement 2 reprises par la
solution de dnaturation, soigneusement disposes cte cte dans le bac d'lectrophorse et
immerges dans la solution de dnaturation. Aprs 40 min, une tension de 25 V (soit
0.7 V/cm, le courant tant rapidement ajust 300 mA par ajout ou retrait de solution) est
applique pendant 20 min.
Les lames sont enleves de la cuve, essuyes au verso, rinces par le tampon de
neutralisation (3 x 5 min), essuyes au verso, immerges pendant 10 min dans de l'thanol
118
absolu refroidi 20C et sches temprature ambiante pendant une nuit. Elles peuvent
alors tre stockes plusieurs mois l'abri de la poussire et de l'humidit.
Pour la mesure en microscopie de fluorescence, les lames sont rhydrates par 200 l
d'eau (10 min sous couvre-lame), additionnes de 10 l de solution de bromure d'thidium
(10 min sous couvre-lame), rinces 5 reprises l'eau, essuyes au verso, additionnes de
100 l d'eau, couvertes d'un couvre-lame et places 4C jusqu' lecture.
2.4.2.2 Traitement par les endonuclases de rparation
Aprs retrait de la solution de lyse (cf prcdent), les lames sont essuyes au verso,
rinces par la solution de digestion enzymatique (3 x 5 min), essuyes au verso, additionnes
de 50 l de la solution d'endonuclase d'emploi, couvertes d'un couvre-lame et incubes sur
un bain-marie maintenu 37C. Le couvre-lame est enlev dlicatement, les lames sont
rinces rapidement 2 reprises par la solution de dnaturation et disposes dans le bac
d'lectrophorse comme dcrit au prcdent.
2.4.2.3 Organisation pratique du travail
Chaque point exprimental consiste en 2 lames de microscope sur chacune desquelles 50
comtes sont mesures. Afin de minimiser les variations exprimentales (voir Section 5.3.1),
les lames sont rparties alatoirement sur l'ensemble des lectrophorses ncessites par
l'exprience et mesures en aveugle dans un ordre galement alatoire.
2.4.3 Mesure des comtes
2.4.3.1 Paramtres gomtriques
37

Les pionniers de l'essai comte mesuraient simplement le rapport F
x
/ F
0
, dans lequel F
x

reprsente l'intensit de la fluorescence x m du centre de la comte et F
0
la fluorescence au
centre de la tte, x tant choisi pour optimiser le rapport F
x
/ F
0
de contrles positifs (Ostling
et Johanson, 1984). Le tail length (longueur de queue) qui apparat proportionnel l'intensit
des stress appliqus (Singh et al., 1988) est un paramtre "visuel", mesurable sans
instrumentation particulire et qui a t fort employ. Il est cependant relativement imprcis
estimer et, de plus, partir d'une certaine dose, il "sature" et la taille de la queue reste
constante. Le rapport diamtre de tte / longueur de queue a galement t propos (Olive,
1989). L'introduction d'analyse d'images a permis de proposer la notion de tail moment
(moment de queue), initialement dfini comme le produit du tail DNA (proportion d'ADN

37
Certains paramtres mesurs dans l'essai comte apparaissant ambigus en fonction des auteurs, nous avons
conserv la terminologie anglaise.
119
dans la queue) par le tail length (Olive et al., 1990); il est prsent connu sous le nom de
extent tail moment. Ce paramtre prsente l'avantage de tenir compte la fois du plus petit
fragment ayant migr (distance de migration, mesure par le tail length) mais aussi des
fragments simplement tirs (ADN prsent dans toute la queue, ou tail DNA). En raison de la
difficult apprcier le tail length, une dfinition du moment plus proche de la dfinition
mcanique a ensuite t propose; il s'agit du Olive tail moment, le produit du tail DNA et de
la distance sparant les centres de masse de la tte et de la queue (Hellman et al., 1995).

Figure 2.4-1 : Exemples de comtes (essai comte en milieu fortement alcalin)

Cellules P388D1 non stresses Cellules P388D1 stresses
(Ethylmthylsulfonate, 2 mM, 6 h)





































C
A
T
H
O
D
E

T Q


T Q

















A
N
O
D
E




T : Centre de masse de la tte
Q : Centre de masse de la queue


Divers paramtres gomtriques ont galement t proposs, comprenant le comet length
(Kent et al., 1995), le leading edge moment (Bocker et al., 1997), le tail inertia qui tient
galement compte de la forme de la comte (Hellman et al., 1995) et le comet moment qui
envisage la comte dans sa globalit (Kent et al., 1995).
La plupart des tudes se basent en fait sur le tail DNA ou sur une variante du tail moment,
la dfinition de ce dernier pouvant varier suivant l'auteur.
120
2.4.3.2 Mesure par le logiciel Komet
Le logiciel est bas sur l'analyse du profil d'intensit intgre. A l'exception de la surface
de la comte qui est mesure directement partir des donnes de l'image, tous les paramtres
estims sont bass sur les intensits de fluorescence intgres dans la direction verticale
(perpendiculaire la direction d'lectrophorse) (Figure 2.4-2).

Figure 2.4-2 : Profils d'intensit calculs par le logiciel Komet



Le profil "cell" est mesur dans la ROI (region of interest), un rectangle qui encadre la
comte; le profil est dlimit gauche comme droite partir de seuils fixs par l'utilisateur.
Du profil "cell", est soustrait le profil "background", mesur dans un petit rectangle parallle
la ROI et encadrant une zone vierge. A partir du point d'intensit maximale du profil comet
obtenu, le profil gauche de la tte (head) est dessin vers la gauche; le profil droit de la tte
est simplement la symtrie du profil gauche. Le profil de la queue (tail) est calcul par simple
soustraction de ce profil head partir du profil comet.
Le logiciel calcule alors 35 paramtres rpartis en 2 groupes : (i) les mesures
gomtriques et densitomtriques pures sur tous les profils; et (ii) les paramtres drivs qui
sont communment employs pour l'interprtation des donnes.
Ces 35 paramtres sont mesurs pour 2 x 50 comtes dans chaque exprience, ce qui noie
vite l'exprimentateur dans un flot de chiffres. L'utilit pratique de tous les paramtres
121
mesurs est loin d'tre avre et nous avons tenu compte dans l'ensemble de nos travaux des 2
paramtres drivs les plus communment employs, le tail DNA et le Olive tail moment.
2.4.3.3 Options appliques au logiciel Komet
La camra est pilote en mode 12 bits; les temps de pose varient de 20 100 ms suivant
l'intensit de la coloration (rglage standardis pour tous les oprateurs). Les paramtres sont
rgls comme suit; seuls les head threshold et tail threshold sont rgulirement ajusts en
fonction de l'image mesurer :
Head threshold : entre 1 et 5
Smoothing value : 1
Tail break length : 10
Tail threshold : 5 20
Background height : 20
Saturation limit : 10
Saturation : 4095
Fluorescence : on
Autobackground : on
Stop on saturation : on
Head symmetry : on
Tail from centre of cell : off
2.5 METHODES STATISTIQUES
Les mthodes statistiques sont dcrites dans les sections 3 6, juste avant les rsultats
qu'elles concernent. Les calculs ont t effectus l'aide du tableur Excel de Microsoft en
programmant les fonctions requises partir des fonctions statistiques du module de base.
Certains tests ont t raliss l'aide des logiciels spcialiss Analyse-it et Systat, ce qui
est chaque fois clairement indiqu dans le texte.
Pour l'ensemble des tests, le niveau de signification retenu correspond au seuil 0.05.




122
3. Rsultats et Discussion :

Dveloppement et validation du
dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-
2'-dsoxyguanosine
dans l'ADN cellulaire
123
3.1 INTRODUCTION : LES METHODES DE DOSAGE DE LA 8-OXO-
7,8-DIHYDRO-2'-DESOXYGUANOSINE (8-oxodG)

Depuis l'introduction du dosage de la 8-oxodG par CLHP couple une dtection
lectrochimique (CLHP-EC) (Floyd et al., 1984), ce compos est devenu un biomarqueur de
choix et a fait l'objet de nombreuses tudes analytiques. Pratiquement toutes les mthodes ont
t appliques, incluant la LC-MS (Dizdaroglu et al., 2001), la LC/MS/MS (Ravanat et al.,
1998a), la GC-MS (Dizdaroglu, 1994), l'lectrophorse capillaire (Guarnieri et al., 1994; Poon
et al., 1995), les techniques immunologiques (Degan et al., 1991; Musarrat et Wani, 1994;
Yarborough et al., 1996; Sato et al., 1998), l'immuno-cytologie (Nehls et al., 1997), le post-
marquage en fluorescence (Sharma et al., 1990) et en
32
P (Cadet et al., 1992). Les rsultats
sont rapports en nmoles 8-oxodG par mg d'ADN ou, plus souvent, en 8-oxodG par 10
5
dG.
L'lution alcaline (Pflaum et al., 1997), le droulement alcalin (akaline unwinding)
(Czene et Harms Ringdahl, 1995), l'lectrophorse (Muller et al., 1998) et l'essai comte
(Evans et al., 1995; Collins et al., 1997c) ont t galement appliqus pour mesurer les
fragmentations d'ADN aprs traitement par la FPG, une glycosylase qui enlve presque
spcifiquement la 8-oxodG pour former un site AP hydrolys en milieu alcalin. Ces mthodes
plus douces dtectent des taux de 8-oxodG sensiblement infrieurs ceux mis en vidence par
les autres techniques; mais les essais de comparaison CLHP-EC / comte-FPG ne montrent en
fait aucune corrlation (Gedik et al., 1998). D'une part, il se peut que les tapes d'extraction
et/ou de digestion de l'ADN soient sujettes des artefacts oxydatifs, gnrant la 8-oxodG via
une raction de type Fenton. D'autre part, il est possible que les mthodes FPG sous-estiment
les taux de 8-oxodG; en effet, cette enzyme ne rvle les lsions groupes que comme une
seule fragmentation et il se peut que des lsions lui soient inaccessibles en fonction du
contexte de squence (ESCODD, 2001).
En fait, l'heure actuelle, le dbat reste largement ouvert quant aux taux de base de la
8-oxodG dans l'ADN cellulaire (ESCODD, 2001).
Il est en tout cas acquis que les rsultats GC-MS publis pendant plusieurs annes sont
entachs d'un facteur d'erreur de 100 10000 (Cadet et al., 1998; Dizdaroglu, 1998). Ceci
tait d l'tape de silylation haute temprature; une drivation temprature ambiante
(England et al., 1998) et en prsence d'un rducteur (Jenner et al., 1998) ou de pyridine
(Rodriguez et al., 2000) limine totalement cet artefact. Nos essais prliminaires en GC-MS
ont cependant montr que la technique restait fort capricieuse et gnrait des artefacts
oxydatifs qui nous semblent toujours difficiles contrler.
124
3.2 DEVELOPPEMENT DU DOSAGE DE LA 8-oxodG DANS L'ADN
CELLULAIRE PAR CLHP COUPLEE A UNE DETECTION
ELECTROCHIMIQUE

Lorsque nous avons commenc ce travail, de nombreuses publications avaient abord le
problme du dosage de la 8-oxodG, prsentant des solutions contradictoires et des jugements
parfois premptoires reposant sur peu de preuves analytiques. Le cas de la GC-MS voqu ci-
dessus est un exemple extrme de la confusion qui pouvait rgner dans la littrature.
Le dveloppement de la mthode et la justification de nos choix analytiques ne pouvant
tre prsents qu' travers une discussion des donnes existantes, nous avons choisi de
rassembler ici les rsultats et leur discussion.
3.2.1 Choix des conditions chromatographiques
3.2.1.1 Sparation
La plupart des mthodes publies sparent les nuclosides sur une colonne octadcyle
compose de particules de 5 10 m (Frenkel et Klein, 1993; Helbock et al., 1998). La
sparation des nuclotides, beaucoup plus polaires, requiert un contre-ion de type
ttrabutylammonium et un gradient de pH peu compatible avec une dtection lectrochimique
haute sensibilit (Werner, 1993).
La plupart des mthodes procdent en conditions isocratiques. Les phases mobiles utilises
consistent en un tampon aqueux contenant de 5 10 % de solvant organique, mthanol ou
actonitrile; les tampons diffrent quant leur composition en sels et leur pH varie de 4 6
suivant les auteurs. Aprs examen des conditions publies, nous avons retenu la
phase mobile la plus simple (Bonatti et al., 1994), constitue d'un mlange de 90 % de tampon
aqueux (NaH
2
PO
4
.2H
2
O 0.05 M, pH 5.5) et de 10 % de mthanol. Nous avons cependant
ajout 1 mM d'EDTANa
2
H
2
au tampon aqueux. Cet agent complexant est en effet
recommand pour la dtection lectrochimique car il permet de minimiser les fluctuations de
ligne de base et de rduire le pic d'injection, phnomnes attribus au relargage de traces
d'ions mtalliques par l'appareillage (Verbiese-Genard, 1984).
Nous avons utilis cette phase mobile pour tester diffrentes colonnes C18 utilises dans
le laboratoire et ce, sous dtection UV, afin de pouvoir tablir les paramtres
chromatographiques avant toute tentative de branchement du dtecteur lectrochimique. Nous
avons donc oxyd un talon de dG ( 2.2.2.4) pour gnrer suffisamment de 8-oxodG pour

125
Figure 3.2-1 : Comparaison de 3 colonnes C
18
pour la sparation dG 8-oxodG
38

s
o
x
y
g
u
a
n
o
s
i
n
e

dG dG dG dG
8-oxodG
8-oxodG 8-oxodG

s
o
x
y
g
u
a
n
o
s
i
n
e

o
x
y
d

s
o
x
y
g
u
a
n
o
s
i
n
e

o
x
y
d

s
o
x
y
g
u
a
n
o
s
i
n
e

o
x
y
d

e

(A) Waters Bondapak C
18


(B) Chrompack C
18

(C) Beckmann
Ultrasphere ODS
10 m; 30 cm x 3.9 mm i.d. 5 m; 20 cm x 3 mm i.d. 5 m; 25 cm x 4.6 mm i.d.
(1 ml/min) (0.6 ml/min)
(1 ml/min)

Phase mobile : 95 % de tampon aqueux (0.05 M en NaH
2
PO
4
.2H
2
O et 1 mM en EDTANa
2
H
2
) et 5 % de
mthanol; dtection UV, 260 nm, 50 mV fond d'chelle; 1 cm = 10 min

126

38
Remarque : la mise au point a t tale sur plusieurs semaines; les quantits injectes et les rapports
8-oxodG/dG diffrent entre le trac (A) et les tracs (B) et (C).
une dtection UV. La Figure 3.2-1-A montre que cette oxydation induit effectivement
l'apparition d'un pic aprs la dG (Kasai et Nishimura, 1984; Frenkel et al., 1991). L'identit de
ce pic sera par la suite confirme par une injection d'un talon de 8-oxodG de puret certifie
sous dtection lectrochimique. Sur la colonne Bondapak, les 2 pics, symtriques et
parfaitement rsolus, apparaissent cependant fort prs du pic d'injection; nous n'avons pu les
reculer que modestement par diminution de la teneur en mthanol de la phase mobile (Figure
3.2-1-A) jusqu' 2.5 %. La colonne Chrompack ne spare pas les 2 pics qui, de plus,
prsentent un tailing important (Figure 3.2-1-B). Cette observation confirme en fait d'autres
sparations peu satisfaisantes observes au laboratoire avec ce matriel. La colonne
Beckmann nous a, par contre, apport toute satisfaction, savoir des pics symtriques,
parfaitement rsolus et prsentant un temps de rtention satisfaisant (Figure 3.2-1-C),
modulable par des variations faibles de la teneur en mthanol.
A l'exception de l'adnine, les valeurs de pKa des nuclobases sont hors de la zone de pH
optimale de la silice (pH 2 7) et l'influence du pH sur la sparation est donc minimale
(Werner, 1993). Nous avons rapidement test la zone de pH 4 6 sans observer de
modification importante dans les temps de rtention et la squence d'lution des nuclosides
ainsi que dans la rponse lectrochimique de la 8-oxodG
39
; nous avons donc limin l'tape
d'ajustement de pH du tampon et travaillons au pH du mlange NaH
2
PO
4
- EDTANa
2
H
2

(pH ~ 4.5).
L'injection d'extraits biologiques d'acides nucliques a confirm que la colonne Beckmann
Ultrasphere ODS, associe une phase mobile constitue de 92.5 % de tampon aqueux
(0.05 M en NaH
2
PO
4
.2H
2
O et 1 mM en EDTANa
2
H
2
) et 7.5 % de mthanol, convenait
parfaitement la rsolution de la dG et de la 8-oxodG dans ces mlanges complexes. Les
temps de rtention montrant une forte dpendance de la temprature, nous avons choisi de
thermostatiser la colonne lgrement au-dessus de la temprature ambiante, 30C.
3.2.1.2 Dtection
3.2.1.2.1 Choix du potentiel de travail
La plupart des mthodes emploient soit une dtection ampromtrique sur carbone
vitreux, soit une dtection coulomtrique. En fonction du matriel et de notre exprience,
nous nous sommes orient vers la premire option. Nous avons choisi le potentiel de

39
Les tudes de voltamtrie en fonction du pH sur lectrode de carbone vitreux montrent que le courant
d'oxydation gnr par la 8-oxodG disparat pH < 2 et augmente fortement pour les pH suprieurs 10; une
forte adsorption s'observe partir de pH 9 (Oliveira Brett et al., 2000).
127
travail, 700 mV, partir du voltamogramme hydrodynamique tabli dans nos conditions
chromatographiques, et ce 2 concentrations (Figure 3.2-2).

Figure 3.2-2 : Voltamogrammes hydrodynamiques tablis pour la 8-oxodG

(A) 2 pmoles 8-oxodG
0.0 E+0
5.0 E+4
1.0 E+5
1.5 E+5
0 200 400 600 800 1000
Potentiel (mV)









C
o
u
r
a
n
t

(
u
n
i
t

s

a
r
b
i
t
r
a
i
r
e
s
)

(B) 45 pmoles 8-oxodG
0 E+0
1 E+6
2 E+6
0 200 400 600 800 1000
Potentiel (mV)









C
o
u
r
a
n
t

(
u
n
i
t

s

a
r
b
i
t
r
a
i
r
e
s
)


n =3; les barres correspondent l'tendue des valeurs.
Colonne Beckmann Ultrasphere ODS 5 m; 25 cm x 4.6 mm i.d.; phase mobile, 92.5 % de tampon
aqueux (0.05 M en NaH
2
PO
4
.2H
2
O et 1 mM en EDTANa
2
H
2
) et 7.5 % de mthanol; 1 ml/min; 30C;
cellule BAS TL-5A; potentiels vs Ag/AgCl.

128
3.2.1.2.2 Comportement lectrochimique de la 8-oxodG
Les purines substitues s'oxydent aisment sur une lectrode de carbone vitreux. Les
groupements polaires influencent fortement le potentiel anodique en fonction de la position de
substitution dans la squence suivante : C
8
>> C
2
~ C
6
; la formation d'un lien glycosidique en
N
9
augmente le potentiel d'oxydation du noyau d'environ 300 mV. Les effets marqus des
substituants permettent par exemple les dosages voltamtriques d'analogues nuclosidiques en
prsence de leurs produits de dgradation (Kenley et al., 1985).
La Figure 3.2-3 (Goyal et al., 1997) prsente les voltamogrammes de la guanosine (G) et
de la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine (8-oxoG); le pic IA observ pour la guanosine correspond
l'oxydation de 8-oxoG, ce qui a permis aux auteurs de conclure que l'oxydation de G passe
en fait par la 8-oxoG et que celle-ci, une fois gnre l'lectrode, s'oxyde immdiatement
dans une raction quasi-rversible (Goyal et al., 1997). La coulomtrie de G et 8-oxoG
dmontre l'implication de respectivement 4 et 2 lectrons dans le processus d'oxydation
(Goyal et al., 1997).

Figure 3.2-3 : Voltamogrammes de la guanosine (a) et de la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine (b)
enregistrs sur 2 lectrodes (voltammtrie cyclique, pH 5.9, 0.25 mM, 50 mV/sec)


Graphite pyrolytique Carbone vitreux
(Goyal et al., 1997)

L'analyse des produits finaux d'oxydation de G et de 8-oxoG (Goyal et al., 1997) montre
(Figure 3.2-4) : (i) pH 3, la formation d'un dimre et de 2 produits secondaires; (ii) pH 7,
129
la formation d'un seul produit, la guanidinohydantone. Le ribose n'intervenant pas dans le
mcanisme suppos d'oxydation, il nous semble fort probable que la 8-oxodG s'oxyde suivant
le mme schma.

Figure 3.2-4 : Produits d'oxydation de la guanosine et de la 8-oxo-7,8-dihydro-guanosine
l'lectrode de carbone vitreux
H
2
N
HN
N
N
H
N
Ribose
8-oxo-7,8-dihydro-guanosine
O
HN
NH
2
N
H
N
H
H
N
O
H
2
N
HN
N
2-amino-4,5,6-
trioxypyrimidine
O
NH
2
NH
N
N
N
Ribose Dimre
(majeur)
O
H
2
N
HN
N
N
H
N
O
O
O
O
H
2
N C NH-Ribose
O
pH 7
pH 3
ure riboside
5-guanidinohydantone
O
O
H
2
N
HN
N
N
N
Ribose
Guanosine
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9


D'aprs (Goyal et al., 1997)
3.2.2 Digestion enzymatique
Plusieurs conditions opratoires ont t proposes pour la digestion enzymatique de
l'ADN (Dizdaroglu, 1985; Floyd et al., 1986; Frenkel et al., 1991; Claycamp, 1992; Frenkel et
Klein, 1993; Harris et al., 1994). Elles diffrent dans (i) la squence des oprations (digestion
et dphosphorylation squentielle ou simultane); (ii) la combinaison d'enzymes de digestion
(DNase I, combine ou pas avec une dnaturation thermique, suivie par un traitement par la
nuclase P1; dnaturation thermique et nuclase P1) et de dphosphorylation
(phosphodiestrase de serpent; phosphatase alcaline ou acide; combinaison des
phosphodiestrases I et II et de la phosphatase alcaline); (iii) le cofacteur mtallique (Zn
++
ou
Mg
++
), la temprature (37 ou 70C) et le pH (5.4 ou 7.0) de la digestion par la nuclase P1; et
(iv) l'limination ou pas des enzymes avant injection dans le chromatographe.
130
En raison des nombreux artefacts oxydatifs dcrits, nous avons dvelopp la mthode la
plus douce et la plus simple possible. Cependant, la nuclase P1 tant une nuclase simple-
brins (active la fois sur l'ADN et sur l'ARN), elle requiert une dnaturation thermique
pralable de l'ADN. D'aprs la littrature, les 2 nuclosides seraient stables 100C pendant
au moins 15 min (Floyd et al., 1990).
3.2.2.1 Mthode retenue : Conditions de digestion et stabilit des bases tudies
Nous avons opt pour une digestion squentielle : dnaturation 100C pendant 5 min,
digestion en nuclotides monophosphates par 4 units
40
de nuclase P1 pH 5.4 et 37C en
prsence de Mg
++
pendant 1 h, digestion en nuclosides par 2 units
41
de phosphatase alcaline
pH 8.4 et 37C pendant 1 h, acidification pH 4.7 par addition d'acide actique et injection
dans le chromatographe.

Tableau 3.2-1 : Comparaison de diffrentes conditions de digestion

% recouvr
(n = 6; moyenne cart talon)
Echantillon Conditions de digestion
dG
(5 nmoles)
p
(a)
8-oxo-dG
(11 pmoles)
p
(a)

pH 5.4 (1 h) 98.7 1.5 0.08
ns
100.6 3.8 0.70
ns

pH 5.4 (2 h) 101.5 2.4 0.12
ns
95.8 3.3 0.009
**

pH 7.0 (1 h) 99.1 1.8 0.27
ns
100.0 2.6 0.97
ns

Solution
aqueuse
d'talons
pH 7.0 + DNase I (1 h) 101.8 2.9 0.12
ns
98.2 4.0 0.23
ns

Quantit mesure
(n = 6; moyenne cart talon)
Echantillon Conditions de digestion
nmoles dG p
(b)
8-oxodG / 10
5
dG p
(c)

pH 5.4 (1 h) 107.6 2.7 13.5 0.6
pH 5.4 (2 h) 106.7 3.2 13.5 0.3
pH 7.0 (1 h) 95.4 11 13.3 0.6
ADN de
sperme de
saumon
(185 g)
pH 7.0 + DNase I (1 h) 110.1 1.4
0.009
**

13.4 0.5
0.85
ns


(a)
probabilit du test comparant la moyenne recouvre 100 % (test t de conformit de la moyenne ou one-
sample t-test)
(b)
probabilit du test de Kruskal-Wallis comparant les niveaux mesurs suivant les 4 mthodes de digestion
(c)
probabilit du test ANOVA comparant les niveaux mesurs suivant les 4 mthodes de digestion



40
Une unit libre 1.0 mole/min de nuclotides solubles dans l'acide partir d'ARN pH 5.3 37C
41
Une unit hydrolyse 1 mole/min de 4-nitrophnyl-phosphate 37C
131
Au moment de notre mise au point, peu d'auteurs avaient rellement compar les
conditions opratoires. Seule Frenkel a rapport qu'un traitement par la nuclase P1 pH 5.4
peut tre une source de perte de 8-oxodG, vitable pH 7.0; de plus, l'addition de DNase I
semble susceptible d'amliorer les rendements de digestion (Frenkel et al., 1991). Nous avons
donc compar la digestion d'talons aqueux et d'ADN de sperme de saumon ces 2 pH, en
prsence et en l'absence de DNase I (Tableau 3.2-1).
Dans ce tableau, nous remarquons (i) qu'un traitement trop long d'talons aqueux par la
nuclase P1 pH 5.4 induit effectivement une perte significative en 8-oxodG; (ii) que la
digestion de l'ADN est lgrement moins efficace et surtout moins reproductible pH 7.0; la
teneur en 8-oxodG tant exprime par rapport la dG, sa mesure n'est cependant pas affecte
par ce phnomne; et (iii) l'ajout de DNase I n'apporte rien.
3.2.2.2 Nuclase P1 : quantit et stabilit
La nuclase P1 est achete sous forme d'une poudre lyophilise que nous reconstituons
dans de l'eau et conservons 4C. Le lot A, dissous depuis 3 mois au moment de l'exprience,
contient 247 U/mg; le lot B, dissous extemporanment, contient 408 U/mg.
Nous avons digr des aliquotes de 184 g d'ADN de sperme de saumon suivant la
mthode retenue en comparant les 2 lots d'enzyme que nous avons tests diffrents taux
(Figure 3.2-5).

Figure 3.2-5 : Digestion d'ADN de sperme de saumon (184 g) par 2 lots de nuclase P1.

0
20
40
60
80
100
120
140
2.47 4.08 2.04 3.05 4.07 5.09
Lot A (247 U/mg) Lot B (408 U/mg)
Units de Nuclase P1 (2 lots)
d
G

(
n
m
o
l
e
s
)
0
5
10
15
20
8
-
o
x
o
d
G

p
a
r

1
0
5

d
G
dG
8-oxodG

Les barres correspondent aux tendues des valeurs (n = 3).
lot A (247 U/mg; reconstitu depuis 3 mois)
lot B (408 U/mg; reconstitu extemporanment)
132
Il apparat donc qu'une solution aqueuse de nuclase P1 est stable 4C pendant au moins
4 mois, sans perte apparente d'efficacit; pour 184 g d'ADN, une quantit de 2 U apparat
suffisante. Nous obtenons pour nos extraits biologiques environ 100 g d'ADN et entre 100 et
200 g d'ARN; en ajoutant 4 U de nuclase P1 dans notre mlange de digestion, nous
conservons donc une marge de scurit.
3.2.2.3 Elimination des protines enzymatiques
Plusieurs mthodes d'limination des enzymes ont t proposes, incluant une
prcipitation par solvant suivie d'une vaporation sec (Frenkel et al., 1991; Muniz et al.,
1995; Douki et al., 1997; Ni et al., 1997), une extraction des nuclosides par le chloroforme
(Kohda et al., 1990; Morin et al., 1998), une ultracentrifugation (Verna et al., 1998) ou une
ultrafiltration (Shigenaga et al., 1990; Morin et al., 1998). Toute tape additionnelle pouvant
tre une source d'oxydation artefactuelle de la dG, nous avons d'abord test l'injection du
milieu de digestion non purifi et n'avons en fait rencontr aucune interfrence
chromatographique ou lectrochimique due ces enzymes, pour peu que la colonne de garde
soit remplace tous les 3 4 mois.
3.2.2.4 Discussion et conclusion
Une heure de digestion avec 4 units de nuclase P1 s'est avre suffisante pour tous les
chantillons tests jusqu' prsent, incluant de l'ADN de sperme de saumon et des extraits de
cellules stresses et non stresses, en prsence d'ARN. Aucun pic tardif n'a t dtect dans
nos chromatogrammes UV, ce qui indique un processus de digestion efficace (Frenkel et al.,
1991). Pour certaines conditions de stress (H
2
O
2
+ UVC), nous avons cependant observ un
petit massif de pics, dtectables uniquement en lectrochimie, apparaissant de manire
reproductible environ 160 min.
Depuis notre travail, il est apparu que (i) la phosphatase acide ne devrait pas tre
employe; son site catalytique comporte du fer qui induit la formation de 8-oxodG (Moller et
al., 1998); (ii) la combinaison de 2 enzymes (nuclase P1 et phosphatase alcaline) est aussi
efficace pour l'analyse de la 8-oxodG que la combinaison de 4 enzymes (nuclase P1,
phosphodiestrases I et II et phosphatase alcaline) (Ravanat et al., 1998b; Wood et al., 2000;
Dizdaroglu et al., 2001); et (iii) la cintique enzymatique de la nuclase P1 peut tre modifie
par la prsence de lsions dans l'ADN, mais elle parvient couper au niveau de la plupart des
modifications connues, l'exception notable des lsions formamido (Falcone et Box, 1997)
133
3.2.3 Extraction de l'ADN cellulaire
3.2.3.1 Choix des conditions opratoires
Les mthodes d'extraction dcrites commencent gnralement par une lyse des cellules en
prsence de protinase K (Maidt et Floyd, 1996) ou de pronase E (Finnegan et al., 1995)
suivie par une tape de purification et de prcipitation (thanol ou isopropanol).
Une lyse de 2.5 h 55C en prsence d'ure, de SDS et de protinase K nous est apparue
suffisante pour dgrader la matrice cellulaire. Un traitement prolong, prconis par certains
auteurs (Zhang et al., 1997a), n'est pas ncessaire.
Les mthodes de purification peuvent tre groupes en 5 catgories :
(i) extraction des solutions d'ADN par du phnol, du chloroforme et de l'alcool
isoamylique (Fraga et al., 1990; Shigenaga et al., 1990; Laws et Adams, 1996;
Gupta et al., 1997);
(ii) extraction par du chloroforme et de l'alcool isoamylique (Maidt et Floyd, 1996);
(iii) prcipitation en 2 tapes avec un lavage intermdiaire par l'thanol ("mthode
pronase") (Adachi et al., 1995; Finnegan et al., 1995);
(iv) extraction en phase solide sur des rsines changeuses d'ions (Kvam et Tyrrell,
1997a), sur hydroxyapatite (Floyd et al., 1986) ou, plus rcemment, sur iodure de
sodium ("mthode chaotropique") (Nakae et al., 1995; Helbock et al., 1998); et
(v) extraction par un automate ddi (Yamamoto et al., 1992), ventuellement sous
atmosphre d'hlium ou d'argon (Wilson et al., 1993; Takeuchi et Morimoto, 1994;
Nakajima et al., 1996).
L'extraction au phnol a fait l'objet de pas mal de dbats dans la littrature, la puret et
l'tat d'oxydation du ractif jouant probablement un rle dans l'oxydation artefactuelle de la
dG (Claycamp, 1992; Haegele et al., 1994; Harris et al., 1994; Shigenaga et al., 1994;
Finnegan et al., 1995; Helbock et al., 1998). Cette tape n'tant pas indispensable, nous avons
prfr viter de travailler avec un ractif aussi peu fiable. Nos essais prliminaires avec la
"mthode pronase" n'ont montr aucun avantage, en terme de rendement d'extraction, de
formation ventuelle d'artefact (Tableau 3.2-2) ou de vitesse de travail. De plus, la remise en
solution de l'ADN avant la seconde tape de prcipitation requiert un temps considrable. En
ce qui concerne la mthode NaI que nous n'avons pas encore pu valuer, ses auteurs
revendiquent un recouvrement plus constant d'ADN, moins d'oxydation artefactuelle et une
extraction plus rapide (Nakae et al., 1995; Helbock et al., 1998). Une validation de ce procd
134
n'est cependant pas disponible et l'impact rel de la mthode sur les taux de 8-oxodG reste par
ailleurs controvers (Haegele et al., 1998). L'extraction de l'ADN est en effet relativement
variable avec la mthode liquide/liquide que nous utilisons, mais cette variabilit peut tre
compense par l'utilisation de dG comme talon interne.

Tableau 3.2-2 : Extraction par 2 mthodes de purification de l'ADN :
extraction liquide/liquide avec du chloroforme : alcool isoamylique
(24:1), suivie d'une prcipitation par l'thanol
double prcipitation par l'thanol
Les chantillons ont t spars en 2 parties aliquotes qui ont t extraites
par chacune des mthodes. Rsultats d'une seule exprience.

Cellules P388D1 Extraction liquide/liquide Double prcipitation par l'thanol
g ADN extrait
(a)

8-oxodG
par 10
5
dG
g ADN extrait

(a)

8-oxodG
par 10
5
dG
Non stresses 89 0.9 95 0.7
Non stresses 66 1.0 70 0.9
+ H
2
O
2
20 mM+ UVC 5 min 78 29.5 93 28.9
+ H
2
O
2
20 mM+ UVC 10 min 138 35.2 80 33.1
+ H
2
O
2
20 mM+ UVC 15 min 65 41.7 68 41.0
+ UVA 15 min

87 0.9 125 1.0

(a)
Estim partir de l'absorbance UV 260 nm (1 A
260
= 50 g/ml d'ADN)

Un traitement RNase (par la RNase A, ventuellement combine avec la RNase T1) est
frquemment appliqu pendant la phase de lyse (Maidt et Floyd, 1996) ou en tape finale
additionnelle (Fiala et al., 1989; Beehler et al., 1992; Laws et Adams, 1996; Verna et al.,
1998). Dans nos mains, la digestion RNase A pendant la lyse s'est avre peu efficace. Les
bases de l'ARN n'interfrant ni avec la digestion de l'ADN ni avec la chromatographie, cette
tape a t simplement supprime comme propos prcdemment (Haegele et al., 1994).
3.2.3.2 Discussion et conclusion
En conclusion, la mthode retenue
42
, classique, a pu tre applique l'entiret de ce
travail sans rencontrer de problme particulier.
Elle est vraisemblablement, comme l'ensemble des mthodes, soumise des artefacts
oxydatifs (cf 3.4.1). Ceux-ci semblent cependant relativement bien contrls, les taux de

42
Lyse des cellules en prsence d'ure, de SDS et de protinase K; purification par extraction liquide/liquide
avec un mlange chloroforme : alcool isoamylique; prcipitation par actate de sodium et thanol; lavage.
135
base de 8-oxodG tant reproductibles et proches des taux rencontrs dans nombre de
publications.
Signalons 2 mthodes originales qui prsentent cependant certains dfauts :
(i) une limination enzymatique de la guanine par la guanase pour rduire les artefacts
oxydatifs (Herbert et al., 1996). Cette mthode requiert cependant une double injection de
l'chantillon pour mesurer, d'une part la guanine, d'autre part la 8-oxodG aprs action de la
guanase; de plus, la 8-oxodG serait galement substrat de la guanase (Helbock et al., 1998).
(ii) un traitement lgant consistant exciser l'ADN par l'endonuclase FPG pour librer
la 8-oxodG qui, aprs sparation de l'ADN, est mesure par chromatographie (Jaruga et al.,
2000; Rodriguez et al., 2000). Cette mthode, qui permet d'obtenir des taux de base
extrmement faibles pour des chantillons non stresss, prsente cependant le mme
inconvnient potentiel que les techniques FPG dcrites au 3.1, savoir que toutes les lsions
ne sont peut-tre pas accessibles l'enzyme.
3.3 VALIDATION DE LA METHODE ANALYTIQUE
La mthode de dosage de la 8-oxodG dans l'ADN de cellules en culture a t valide
suivant le Guide de validation analytique de la SFSTP (Caporal-Gautier et al., 1992), aux
points de vue spcificit, linarit, prcision, exactitude, robustesse, stabilit des analytes et
seuils de dtection et de quantification.
Nous avons dlibrment choisi de raliser cette tude sur des chantillons de cellules
svrement stresses (20 mM H
2
O
2
+ UVC). Ces conditions extrmes induisent en effet de
nombreuses lsions oxydatives aux bases, mais aussi des liens croiss ADN-protines et des
lsions dipyrimidines, dimres cyclobutanes et photoproduits (6-4). Ceci nous permet donc
d'assurer la capacit de la mthode CLHP mesurer de manire fiable les bases 8-oxodG et
dG dans un ADN portant une grande varit de lsions.
La dfinition, ventuellement le protocole particulier suivi, l'analyse statistique, les
rsultats et leur discussion seront prsents pour chacun des paramtres de validation valus.
3.3.1 Spcificit
3.3.1.1 Dfinition
La spcificit d'une mthode reprsente sa facult mesurer sans quivoque l'analyte en
prsence des autres constituants, des impurets et des produits de dgradation qui peuvent tre
prsents dans la matrice de l'chantillon (Commission of the European Communities -
Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
136
3.3.1.2 Protocole
3.3.1.2.1 Dtection UV
Les pics UV de l'ADN ont t identifis par co-injection d'talons de puret certifie et
d'un chantillon biologique stress. Leur identit et puret ont t vrifies l'aide d'un
dtecteur barrette de diodes par un algorithme bas sur une analyse factorielle volutive
(window evolving factor analysis). Cette mthode ralise une srie d'analyses en composantes
principales (PCA)
43
partir des donnes d'une petite matrice de dimension constante se
dplaant paralllement l'lution du pic
44
. Les valeurs propres de chaque PCA sont portes
en fonction du temps et, chaque instant, le nombre de valeurs propres qui mergent
significativement du bruit de fond correspond au nombre de composs en colution cet
endroit du pic. L'analyse factorielle volutive tire profit, la fois, de l'information spectrale
classique et de l'information complmentaire contenue dans l'agencement des spectres en
fonction du temps de rtention; elle permet donc de spcifier si un pic est "pur", mais aussi
quel moment les impurets surviennent dans le pic, et ce, en temps rel (Gilliard, 1993).
Cette mthode, implmente dans le logiciel du dtecteur Gold, prsente l'avantage certain
d'tre applicable sans connaissance pralable des spectres UV des composants.
Les conditions optimales permettant d'assigner la puret des pics ont t observes
(Gilliard et al., 1993), savoir une vitesse d'acquisition des donnes de 1 HZ et une
absorbance maximale de 0.4 AU. Les coefficients de corrlation croise (cross-correlation
coefficients) ont t dtermins grce au logiciel Gold entre 200 et 400 nm pour chaque paire
de pics assigns.
Les pics de l'ARN ont t identifis en comparant les temps de rtention avec ceux de pics
obtenus par digestion d'un ARN ribosomal du commerce.
3.3.1.2.2 Dtection lectrochimique
Les pics de la 8-oxodG et de la 8-oxoG ont t identifis par co-injection d'talons de
puret certifie. L'identit et la puret du pic de 8-oxodG ont t dtermines par la
comparaison des rapports de signaux mesurs diffrents potentiels pour un chantillon

43
Dans une analyse en composantes principales, les spectres, signaux mesurs en fonction de c longueurs d'onde
et de p temps, sont reprsents dans une matrice D. Comme les variables sont corrles, le rang de D, la
dimension de l'espace dans laquelle l'ensemble des lments de D coexistent, est en relation directe avec le
nombre de composs prsents dans le "spectro-chromatogramme". Si un pic est pur, une seule composante
principale (un seul vecteur, caractris par une "valeur propre") suffit rendre compte de la variabilit observe
dans les donnes; en cas de co-lution de 2 composs, 2 vecteurs orthogonaux deviennent ncessaires pour
dcrire la matrice, et ainsi de suite (Gilliard, 1993).
44
Avec un pas de 5, par exemple, la PCA portera sur les spectres 1 5, puis 6 10, puis 11 15, etc
137
stress. Un essai d'tablissement de voltamogramme hydrodynamique a galement t tent
l'aide d'un dtecteur de type Coularray.
3.3.1.3 Rsultats
3.3.1.3.1 Dtection UV
3.3.1.3.1.1 Analyse factorielle volutive
L'analyse factorielle volutive (Figure 3.3-1) ne dmontre pas d'interfrence dans les pics
de guanosine, 2'-dsoxyguanosine, thymidine, adnosine et 2'-dsoxyadnosine. Par contre,
les pics pour la cytidine, l'uridine et la 2'-dsoxycytidine ne sont pas mono-composants; ils
co-luent ou luent dans le pic d'injection. Leur rsolution est possible (Zhao et al., 1994),

Figure 3.3-1 : Chromatogramme UV des nuclosides obtenus par digestion enzymatique des
acides nucliques. Cellules P388D1 stresses (20 mM H
2
O
2
+ 10 min UVC)
-0.1
0.1
0.3
0.5
0 5 10 15 20
Temps (min)
S
i
g
n
a
l

(
A
.
U
.
)
2
1
3
4
5

Dtection UV; 245 nm; 0.5 AUFS
1 = guanosine
2 = 2'-dsoxyguanosine
3 = thymidine
4 = adnosine
5 = 2'-dsoxyadnosine
Le graphique sous le chromatogramme est une prsentation visuelle en temps rel de l'homognit
des pics telle que mesure par le dtecteur barrette de diodes. Le nombre de lignes horizontales
reprsente le nombre de composs dtects par l'algorithme d'analyse factorielle volutive; une seule
ligne horizontale indique un pic homogne, mono-composant.

138
mais inutile pour l'analyse qui nous proccupe; elle exigerait des temps d'analyse
sensiblement plus longs ou un systme gradient que nous prfrons viter en dtection
lectrochimique.
3.3.1.3.1.2 Coefficients de corrlation spectrale
Pour les diffrentes bases dont les pics sont purs, le Tableau 3.3-1 montre une excellente
corrlation croise entre les spectres UV d'talons de puret certifie et d'extraits cellulaires.

Tableau 3.3-1 : Coefficients de corrlation croise entre les spectres UV (200 400 nm)
d'talons et d'extraits cellulaires. Rsultats d'une seule exprience.

Pic Comparaison avec le pic de
mme temps de rtention
provenant de :
Cellules P388D1
non stresses
Cellules P388D1
stresses
(H
2
O
2
+ UVC 10 min)
guanosine ARN ribosomal 0.999963 0.999874
2'-dsoxyguanosine dG talon 0.999998 0.999992
thymidine dT talon 0.999998 0.999998
adnosine ARN ribosomal 0.999989 0.999982
2'-dsoxyadnosine dA talon 0.999994 0.999998

3.3.1.3.2 Dtection lectrochimique
3.3.1.3.2.1 Rapport de pics diffrents potentiels
Le Tableau 3.3-2 montre les rapports de pic obtenus diffrents potentiels pour un talon
et pour un extrait de cellules stresses. Le chromatogramme lectrochimique obtenu partir
de cellules stresses est prsent en Figure 3.3-2.

Tableau 3.3-2 : Identification de la 8-oxodG dans des cellules soumises un stress oxydatif.
Rapports de pics diffrents potentiels.
(n = 3; entre parenthses, tendue des valeurs)

Potentiels
(mV)
8-oxodG
talon
Cellules stresses
(H
2
O
2
+ UVC 10 min)
700 / 650 1.11 (1.07 1.14) 1.15 (1.12 1.20)
700 / 600 1.45 (1.38 1.51) 1.44 (1.43 1.50)
700 / 550 3.00 (2.89 3.12) 3.03 (2.76 3.24)
700 / 500 4.00 (3.83 4.63) 4.09 (3.61 5.49)
650 / 600 1.31 (1.22 1.40) 1.27 (1.20 1.32)
600 / 550 2.47 (2.40 2.60) 2.16 (1.98 2.34)
600 / 500 3.40 (3.16 3.87) 3.05 (2.58 3.97)
550 / 500 1.38 (1.28 1.54) 1.41 (1.21 1.87)

139
Figure 3.3-2 : Chromatogramme lectrochimique des nuclosides obtenus par digestion
enzymatique des acides nucliques. Cellules P388D1 stresses (20 mM H
2
O
2
+
10 min UVC)

-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
0 5 10 15 20
Temps (min)
S
i
g
n
a
l

(
n
A
)
1
2

Dtection ampromtrique; 700 mV vs Ag/AgCl; 2 nAFS
1 = 8-oxo-7,8-dihydro-2'-guanosine (8-oxoG)
2 = 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine (8-oxodG) (environ 6 pmoles injectes)

L'tablissement du rapport de pics diffrents potentiels est particulirement fastidieux
car, chaque variation de potentiel, un temps trs long est requis pour stabiliser la surface de
l'lectrode. En outre, le signal pour un chantillon non stress est si faible que nous n'avons
pas russi le dtecter des potentiels infrieurs 700 mv, ce qui nous a empch d'tablir
l'identit et la puret du pic.
3.3.1.3.2.2 Essais sur dtecteur barrette d'lectrodes
Nous avons essay d'tablir un voltamogramme hydrodynamique pour des chantillons
non stresss sur un dtecteur barrette d'lectrodes. La Figure 3.3-3 prsente les
chromatogrammes (i) d'une solution talon contenant 20 nmoles de dG et 4 pmoles de
8-oxodG; (ii) d'une solution talon contenant 2.5 nmoles de dG et 500 fmoles de 8-oxodG; et
(iii) d'un extrait biologique obtenu partir de cellules non stresses (environ 100 fmoles,
comme dtermin par ampromtrie). Ces chromatogrammes ont t enregistrs 4 potentiels
140
simultans
45
, 250, 275, 300 et 325 mV; cependant, l'lectrode 4 (325 mV), vraisemblablement
dfectueuse, s'est comporte de manire erratique pendant ces essais.

Figure 3.3-3 : Chromatogramme des nuclosides obtenus par digestion enzymatique des
acides nucliques. Dtecteur barrette d'lectrodes.
Potentiels : (1) 250 mV; (2) 275 mV; (3) 300 mV; (4) 325 mV

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0
-20
-10
0
10
Retention time (minutes)
R
e
s
p
o
n
s
e
(
n
A
)
4
2
1
3


Etalon
500 fmoles
8-oxodG


141

45
Les potentiels d'un dtecteur "coulomtrique" sont fixs par rapport une lectrode solide de palladium et sont
donc diffrents des potentiels ampromtriques fixs par rapport une lectrode Ag/AgCl.
Etalon
4 pmoles
8-oxodG

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0


-4.0
-2.0
0.0
2.0
4.0
Retention time (minutes)
R
e
s
p
o
n
s
e
(
n
A
)
4
2
1
Extrait biologique blanc
100 fmoles
8-oxodG

3


Ces essais nous ont permis de constater que la distribution des potentiels sur plusieurs
lectrodes dilue en fait le signal qui sombre rapidement dans le bruit de fond. Il n'apparat
donc pas possible d'tablir un voltamogramme ou de mesurer des rapports de potentiel pour
des taux aussi faibles sur un Coularray, du moins sur le matriel que nous avons test.
3.3.1.4 Discussion et conclusion
Pour un biomarqueur, il n'est gnralement pas possible de reconstituer une matrice ne
contenant pas l'analyte. L'tude de la spcificit repose donc entirement sur la slectivit du
dtecteur et, en fonction de la mthode de dtection, l'homognit du pic chromatographique
est plus ou moins facile vrifier. Dans nos conditions, la mthode d'extraction tant
relativement spcifique des acides nucliques et les pics dus l'ARN n'interfrant, ni avec la
8-oxodG, ni avec la dG, nous ne prsumions aucune interfrence de la matrice cellulaire.
En dtection UV, en fonction de la similarit spectrale et de la rsolution
chromatographique, l'analyse factorielle volutive peut dtecter entre 0.3 et 9 % d'impurets
(Gilliard et al., 1993). Notre tude dmontre donc que les pics de guanosine, 2'-
dsoxyguanosine, thymidine, adnosine et 2'-dsoxyadnosine sont essentiellement
homognes, mme pour un chantillon svrement stress.
En dtection ampromtrique, l'tude de slectivit, base sur le rapport des pics
enregistrs diffrents potentiels, prsente de nombreuses limitations : (i) elle ne peut, dans le
meilleur des cas, dtecter que de 5 10 % d'impurets; (ii) elle est inapplicable des taux trs
142
faibles d'analytes, tels que mis en vidence dans un chantillon non stress; et (iii) elle exige
des quantits importantes de matriel biologique. Nos donnes montrent que, mme si le
faible pic observ dans les chantillons blanc n'est pas pur, le compos apparaissant suite au
stress oxydatif appliqu est bien la 8-oxodG.
3.3.2 Linarit
3.3.2.1 Dfinitions
La linarit d'une mthode analytique est sa capacit obtenir des rsultats proportionnels,
directement ou par une transformation mathmatique bien dfinie, la concentration de
l'analyte dans l'chantillon et ce, l'intrieur d'un certain intervalle (Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994). La linarit
rfre la rponse globale du systme (NCCLS, 1992).
3.3.2.2 Protocole
Les courbes concentration rponse du dtecteur ont t dtermines pour des solutions
aqueuses et un extrait d'acides nucliques enrichi en dG, T, dA et 8-oxodG et ce, 8 niveaux
de concentration sur 4 jours. L'extrait d'acides nucliques a t prpar partir de 5 x 10
cellules P388D1 non stresses, par simple monte en chelle de la mthode applique en
routine; cet extrait a t repris dans 9.25 ml de tampon TE et aliquot en 36 microtubes de
220 l; ceux-ci ont t enrichis, stocks 4C, digrs enzymatiquement et analyss suivant
notre protocole gnral. La mesure de la linarit en prsence de la matrice cellulaire permet
galement la dtermination de l'exactitude.
8
3.3.2.2.1 Solutions d'enrichissement
Les concentrations des solutions d'enrichissement ont t choisies partir d'un pr-test de
linarit. Une solution-mre est prpare par pese d'environ 5.5 mg de dG, 5.1 mg de dC,
4.9 mg de dT et 5.5 mg de dA, ajout de 1350 l d'une solution environ 11.3 M de 8-oxodG
et addition d'eau ad 5.0 ml. A partir des dilutions dtailles au Tableau 3.3-3, les solutions
aqueuses et ADN sont enrichies comme suit :
- solution aqueuse : 269 l d'eau + 30 l d'enrichissement
- solution ADN : 220 l de solution aliquote d'ADN + 30 l d'enrichissement
46
L'extrait d'ADN provenant de 5 x 10
8
cellules est repris dans 9.25 ml, dispens en parties
aliquotes de 220 l qui sont additionnes de 30 l de solution d'enrichissement. Dans le
procd valider, la digestion enzymatique porte sur un extrait provenant de 10 cellules
7

46
Aprs digestion enzymatique, le volume total de la solution ADN sera de 299 l
143
repris dans 250 l. La quantit d'acides nucliques dans chaque tube est donc trs proche de
celle ralise en routine; elle quivaut :
cellules 10 18 . 1 soit cellules 220 . 0
25 . 9
10 50 7
8


Cette concentration a t choisie afin d'valuer la linarit dans les conditions extrmes
pouvant tre retrouve en pratique; 20 % de variation globale sont en effet tout fait possibles
en raison d'une inexactitude dans le comptage de cellules et/ou d'une fluctuation dans le
rendement d'extraction de l'ADN.

Tableau 3.3-3 : Dilution des solutions d'enrichissement et ajouts raliss

Enrichissement dans 30 l
A partir
de
+ l d'eau 8-oxodG
(pmoles)
Dilution
l
(a)
dG
(nmoles)
T
(nmoles)
dA
(nmoles)
Solution 1 --- --- 94.04 121.14 130.65
Solution 2 Sol. 1 150 94.66 93.18
Solution 3 400 300 53.74 70.32 74.66
Sol. 1 300 35.26 45.43 48.99
Solution 5 Sol. 1
--- 123.05
500 72.34 100.50
Sol. 1 69.22
Solution 4 500 46.15
150 750 15.67 20.51 20.19 21.78
Solution 6 Sol. 5 100 3.13 4.04 4.36
Solution 7 Sol. 5 900 2.05 2.02
Solution 8 200 800 0.63 0.82 0.87
(a)
Ces valeurs d'enrichissements tiennent compte de la 8-oxodG qui contamine la dG
400 4.10
100 1.57 2.18
Sol. 6 0.81


3.3.2.2.2 Conditions chromatographiques
Tous les chromatogrammes ont t enregistrs dans les conditions de routine avec pour
dtecteur lectrochimique la cellule TL5A. Le systme est laiss sous flux la nuit, un dbit
de 0.2 ml/min, dtecteur coup, afin d'viter tout problme de cristallisation dans
l'appareillage.
3.3.2.3 Etude de la linarit
Pour chaque jour, les droites D1 et D2, correspondant l'une aux solutions aqueuses, l'autre
aux solutions ADN, ont t calcules par rgression linaire. Les pentes (a1 et a2), les
ordonnes l'origine (b1 et b2) et les coefficients de dtermination (R) ont t calculs pour
chacune des droites selon les quations classiques.
144
3.3.2.3.1 Conditions d'application
La mthode des moindres carrs non pondre suppose quelques conditions d'application :
les indterminations ne portent que sur les termes dpendants
la distribution des erreurs sur les variables dpendantes doit tre normale ou
proche de la normale
les erreurs rsiduelles sont alatoires, indpendantes, de moyenne nulle et de
variances identiques (condition d'homognit des variances ou homoscdasticit)
De par la nature des erreurs dans un dosage chromatographique, nous avons considr
dans ce travail que les observations se distribuaient a priori selon une courbe gaussienne ou
proche de la gaussienne
3.3.2.3.2 Liste des symboles
Les symboles utiliss sont ceux de (Caporal-Gautier et al., 1992)
x
ij
valeur brute indpendante Y
ij
Variable transforme
valeur brute dpendante y
ij
Y
Yj
m
x
y

moyenne gnrale des valeurs Y des k
groupes
ij

moyenne des valeurs Y de chaque groupe j j indice de groupe
ij
i indice des valeurs individuelles dans le
groupe j
s cart talon
k nombre de groupes CV coefficient de variation
nombre d'observations du groupe j s variance n
j
n nombre moyen de valeurs par groupe smax variance la plus leve
N nombre total d'observations y dans
l'ensemble des k groupes
Sx

cart talon estim de la variable x
ij ij ij
m

moyenne de n valeurs du groupe j
j
Sy

cart talon estim de la variable y
j ij ij
moyenne des moyennes m de groupes R coefficient de corrlation
j


moyenne gnrale des valeurs x des k
groupes
R coefficient de dtermination
ij
moyenne gnrale des valeurs y des k
groupes
ij
ddl nombre de degrs de libert

risque de premire espce

3.3.2.3.3 Calcul de la droite de rgression
La mthode des moindres carrs permet de calculer :
( ) ( )
( )

= =
= =
=
k
1 j
2
n
1 i
ij
ij
k
1 j
n
1 i
ij
j
j
x - x
y - y . x - x
b la pente :
l'ordonne l'origine : x . b y a =
145
la covariance :
( ) ( )
1 N
y - y . x - x
y Sx
ij
k
1 j
n
1 i
ij
ij ij
j

= =
le coefficient de corrlation :
ij ij
ij ij
Sy . Sx
y Sx
R =
le coefficient de dtermination : R

Les calculs sont effectus l'aide du tableur Excel, par la fonction "DROITE.REG" qui,
sous sa forme matricielle, nous fournit les donnes principales. L'exactitude des calculs a t
vrifie manuellement l'aide de quelques exemples.
3.3.2.3.4 Comparaison de l'ordonne l'origine avec zro
Pour chacune des droites tablies, nous avons calcul :
s
R
:
( ) ( )
2 N
x - x . b y - y
s
k
1 j
n
1 i
2
ij
2
k
1 j
n
1 i
2
ij
R
j j

=

= = = =
la variance de l'ordonne l'origine:
( )

+ =

= =
k
1 j
n
1 i
2
ij
R
j
x - x
x
N
1
. s a s
le rapport :
sa
a
t calc =

Si le t ainsi calcul est infrieur au t lu dans la table de Student pour le seuil 0.05 et
(N 2) ddl, l'ordonne l'origine n'est pas significativement diffrente de 0 au seuil 0.05.
Alternativement, la probabilit exacte du t calcul est obtenue par la fonction
"LOI.STUDENT" du tableur Excel.
(0.05; N-2)
3.3.2.3.5 Comparaison des pentes de la "droite aqueuse" et de la "droite ADN"
Afin de pouvoir utiliser des talons prpars dans l'eau pour la quantification dans un
chantillon, il faut dmontrer que le dosage dans l'eau est comparable celui ralis dans un
chantillon, donc que les pentes b et b des 2 droites ne diffrent pas significativement.
1 2
Nous avons donc calcul :
la variance de chaque pente :
( )

= =

=
k
1 j
nj
1 i
2
ij
R
x x
s
b s
146
le rapport :

2 1
2 1
calc
b s b s
b b
t
+

=
Si le t ainsi calcul est infrieur au t
(0.05; N1+N2 - 4)
lu dans la table de Student pour le seuil
0.05 et (N1 + N2 4) ddl, les 2 pentes ne sont pas significativement diffrentes au seuil 0.05.
Alternativement, la probabilit exacte du t calcul est obtenue par la fonction
"LOI.STUDENT" du tableur Excel.
3.3.2.3.6 Test d'homognit des variances intra-groupe
Les tests "existence d'une pente significative" et "validit de la droite de rgression (dfaut
d'ajustement)" sont bass sur des procdures ANOVA; celles-ci sont connues pour tre
relativement robustes vis--vis de leurs critres d'application. Cependant, en chromatographie,
les tudes de linarit qui englobent un domaine exprimental tendu peuvent prsenter des
coefficients de variation homognes et donc une forte htroscdasticit, les variances tant
alors concentration-dpendantes. Afin de vrifier si les variances sont homognes ou pas,
nous avons utilis le test de Cochran, tel que recommand par le National Committee for
Clinical Laboratory Standards amricain (NCCLS, 1992).
On calcule donc :
l'ingalit : ) 1 n ; k ; (
nj
1 j
j
C
s
max s
C
=
< =

La variable C est simplement le rapport de la plus grande variance sur la somme de


l'ensemble des variances des k groupes j. Si l'ingalit est vrifie avec C
(0.05; k; n - 1)
lu dans la
table de Cochran, les variances des diffrents groupes j ne sont pas significativement
diffrentes au seuil 0.05.
En cas de variances non homognes, nous avons procd une transformation
logarithmique des donnes, transformation recommande dans le cas de variances
concentration-dpendantes (Caporal-Gautier et al., 1992; NCCLS, 1992).
3.3.2.3.7 Test de signification statistique de la pente
Ce test consiste comparer les variations dues la rgression la variation rsiduelle, qui
provient des erreurs exprimentales et d'ajustement. La "variation de rgression" est attribue
entirement la rgression de y par rapport x, alors que l'autre composante mesure
l'inaptitude de la rponse y tomber exactement sur la droite de rgression (NCCLS, 1992).
147
La variation totale est donc rpartie suivant le tableau d'analyse de variance ci-dessous
(Tableau 3.3-4).

Tableau 3.3-4 : Test de signification statistique de la pente

Source de variation ddl Somme des carrs Variance F calcul
( )

= =
=
k
1 j
nj
1 i
2
ij y y T
( )

=
=
k
1 j
2
j j x x . n . b I

= I s I

= I T R
2 N
R
s I

R
I
s
s
F =


Variation totale N - 1
Variation due la
rgression
1




Variation rsiduelle N - 2

Si le F calcul est suprieur au F tabulaire F
(; 1; N - 2)
, on conclut l'existence d'une pente
significative, donc une dpendance linaire, au seuil de probabilit considr. La probabilit
exacte du F calcul est obtenue par la fonction "LOI.F" du tableur Excel.
Remarquons que ce F calcul est en fait directement affich par Excel, si les donnes
statistiques de la formule "DROITEREG" sont prsentes sous leur forme matricielle.
3.3.2.3.8 Test de validit de la droite de rgression : test du dfaut d'ajustement
Ce test permet de comparer les erreurs exprimentales (S
E
) et d'ajustement (S ) qui
forment la variation rsiduelle. La premire composante mesure l'inaptitude rpter de
manire identique les rsultats pour un taux donn en analyte; la seconde composante est
appele le dfaut d'ajustement (lack of fit). Si les donnes sont significativement non linaires
l'erreur due au dfaut d'ajustement sera significativement suprieure l'erreur exprimentale
pure (NCCLS, 1992). La variation rsiduelle est donc rpartie suivant le tableau d'analyse de
variance ci-dessous (Tableau 3.3-5).
I

Tableau 3.3-5 : Test de validit de la droite de rgression

Source de variation ddl Somme des carrs Variance F calcul
( )

= =
=
k
1 j
nj
1 i
2
j ij y y E
k N
E
s E

E
L
s
s
F =

= E R L
2 k
L
s L

Erreur exprimentale N - k


Variation rsiduelle k - 2


148
Si le F calcul est infrieur au F tabulaire F
(; k - 2; N - k)
, l'ajustement est considr comme
valide, au seuil de probabilit considr. La probabilit exacte du F calcul est obtenue par la
fonction "LOI.F" du tableur Excel.
Remarquons que cette valeur F calcule est identique la valeur G de la note de guidance
" Evaluation of the linearity of quantitative analytical methods" propose par le NCCLS
(NCCLS, 1992). Nous avons test les limites de cette mthode d'valuation de la linarit. Il
apparat notamment que, dans les cas o la prcision exprimentale est excellente, la
rpartition de la variation rsiduelle en erreur et en dfaut d'ajustement n'a que peu de
signification; par exemple, le dplacement d'un seul point sur 30 peut suffire compltement
modifier les conclusions d'un test. La note de guidance du NCCLS est consciente de cet tat
de choses et conclut que l'valuation visuelle de la linarit reste la meilleure technique
(NCCLS, 1992).
3.3.2.4 Rsultats
3.3.2.4.1 Linarit du dosage de la 8-oxodG
3.3.2.4.1.1 Donnes et graphiques
Le Tableau 3.3-6 prsente les donnes mesures respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". La Figure 3.3-4 prsente les donnes sous forme de 4
graphiques portant, par jour, les points exprimentaux et les 2 droites de rgression. Nous
constatons de visu une trs bonne corrlation entre la rponse lectrochimique et les quantits
ajoutes ainsi qu'un excellent paralllisme entre les droites obtenues en milieu aqueux et en
milieu biologique. Les Figures 3.3-5 et 3.3-6 prsentent les donnes des 4 jours, pour,
respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique, ainsi que les
droites moyennes sur lesquelles a port l'tude de linarit.
Les Figures 3.3-5 et 3.3-6 montrent que le signal lectrochimique baisse de jour jour.
En fait, notre habitude de laisser le systme sous flux la nuit ( 3.3.2.2.2), donc de passer de la
phase mobile faible dbit sur la surface de l'lectrode hors potentiel, induit un effet de
passivation qui provoque une rduction gnrale des courants d'oxydation le jour suivant. Un
simple polissage avec du mthanol suffit cependant restaurer le signal d'origine. Nous
avons, par la suite, arrt le flux pendant la nuit, ce qui nous a permis de maintenir le signal
lectrochimique relativement constant de jour jour; ce phnomne, identique pour les 2
cellules lectrochimiques, sera dmontr par la seconde tude de linarit sur le dtecteur CC-
5 ( 3.3.2.6).
149
Tableau 3.3-6 : Donnes de l'tude de linarit pour la 8-oxodG

Signal pour 1 nAFS :
Enrichissement
pmoles
injectes
dans 100 l
Jour
La solution
aqueuse
La solution
ADN
1 31.45 1 1235136 1249151
2 1178250 1185659
3 1115368 1155828
4 1030183 1086940
2 24.19 1 958236 975115
2 876459 890544
3 843470 849729
4 780226 799355
3 17.97 1 712761
2 660008 656934
622479 636301
4 598295 591420
4 11.79 1 465597
425458 430707
3 411883
4 388858 387320
5
703628
3

450363
2
410059
5.24 1 198811 215187
2 202199 193256
3 187984 191908
4 179777 175707
6 1.05 42075 46585
44417 40955
38396 41810
41410 44792
7 0.52 1 20581 22813
2 22080 23503
3

1
2
3
4
20747 25574
4 18750 25268
8 0.21 1 10064 15547
2 11225 13741
3 10712 15918
4 11766 14939
ADN blanc
(non enrichi)
---- 1 ---- 4299
---- 2 ---- 6457
---- 3 ---- 9836
---- 4 ---- 9813




150
Figure 3.3-4 : Droites de rgression journalires pour la 8-oxodG
(z : solution aqueuse; : solution ADN)

Jour 1
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Solution aqueuse
Solution ADN
Jour 2
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Solution aqueuse
Solution ADN




Figure 3.3-5 : 8-oxodG. Solutions aqueuses. Points exprimentaux mesurs pendant
Jour 3
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Solution aqueuse
Solution ADN
Jour 4
0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Solution aqueuse
Solution ADN

les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.990)


0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4
151

Figure 3.3-6 : 8-oxodG. Solutions ADN. Points exprimentaux mesurs pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.991)

0.0E+00
2.0E+05
4.0E+05
6.0E+05
8.0E+05
1.0E+06
1.2E+06
1.4E+06
0 5 10 15 20 25 30 35
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4


3.3.2.4.1.2 8-oxodG : Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
Le Tableau 3.3-7 montre que les ordonnes l'origine ne sont pas significativement
diffrentes de 0, qu'il s'agisse de la "droite aqueuse" ou de la "droite ADN".

Tableau 3.3-7 : Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
t
(0.05; 6)
= 2.447; t
(0.05; 7)
= 2.365

"Droite aqueuse"
(n = 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a -2091 1869 878 6061
sa 3639 5868 3395 3267
t calcul 0.575 0.318 0.259 1.855
p 0.586
NS
0.761
NS
0.805
NS
0.113
NS

"Droite ADN"
(n = 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
3899 1050 3302
3313 6690
1.18 0.244 0.436 0.491
p 0.278
NS
0.814
NS
0.676
NS
0.638
NS

a 2918
sa 4296 6725
t calcul

152
3.3.2.4.1.3 8-oxodG : Comparaison des pentes
Comme les Figures 3.3-5 et 3.3-6, le Tableau 3.3-7 montre que les pentes des "droites
aqueuses" ainsi que celles des "droites ADN" diffrent sensiblement de jour jour. Cette
variation de pente peut tre attribue au stockage des chantillons avant l'analyse. En effet, la
dG s'oxyde lentement en 8-oxodG (cf 3.3.8). Cet artefact, conjugu la passivation de
l'lectrode (cf 3.1.1.4.1.1) explique vraisemblablement le lger basculement des pentes
observ dans notre tude.
Par contre, au sein du mme jour, la "droite aqueuse" et la "droite ADN" sont parallles,
au seuil 0.05 pour les jours 1, 2 et 3; au seuil 0.01 pour le jour 4.

Tableau 3.3-7 : Comparaison des pentes des droites de rgression
t
(0.05; 64)
= 1.998
Jour 2
(0.05; 12)
= 2.178; t
(0.05; 13)
= 2.160; t
(0.05; 14)
= 2.145; t

"Droite aqueuse"
(n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 3 Jour 4
1.000 0.999 1.000 1.000
b 39431

36838 35095 32464
sb 226 365 211 203
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calcul 6.03 4.13 8.97
p 5 x 10
-05 ***
0.001
**
1 x 10
-06 ***

"Droite ADN"
(n = 9 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 1.000 1.000 0.999 0.999
b 39626 37132 35817 33600
sb 219 284 442 444
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calcul 6.96 2.51 3.54
p 7 x 10
-6 ***
0.025
*
0.003
**

Comparaison entre
"Droite ADN" et
"Droite aqueuse"
(n = 8 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calcul 0.621 0.635 1.47 2.33
p 0.545
NS
0.536
NS
0.164
NS
0.037
*

Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et
"Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 36)

t calcul 0.612
p 0.543
NS

R
153
3.3.2.4.1.4 8-oxodG : Tests pour la linarit de la "droite aqueuse"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.469
C
(0.05; 8; 3)
= 0.4377
Comme le C
calcul
est suprieur au C
tabul
, les variances ne peuvent tre considres
homognes au seuil de probabilit 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dpendantes;
nous avons donc procd une transformation log log des donnes afin de rendre les
variances homognes pour la suite des tests.
b. Test de signification statistique de la pente
Aprs transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur
tabulaire :
F = 10585


calcul

F
(0.05; 1; 30)
= 4.171
p du F
calcul
= 8 x 10
-40

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 4.967

3.3.2.4.1.5
F
(0.05; 6; 24)
= 2.508
p du F
calcul
= 0.002
Nous concluons l'existence d'une association linaire significative seulement au
seuil 0.001. Rappelons les considrations dveloppes sur ce test de dfaut d'ajustement
( 3.3.2.3.7). Dans le cas prsent, la transformation des donnes a fortement rduit les carts
entre les valeurs, "augmentant" artificiellement leur prcision et mettant en dfaut le test.
L'examen visuel des donnes nous permet cependant d'affirmer, sur base non statistique, que
la relation linaire existe.
8-oxodG : Tests pour la linarit de la "droite ADN"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.405
C
(0.05; 9; 3)
= 0.4027
154
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 4569


F
(0.05; 1; 34)
= 4.130
p du F
calcul
= 8 x 10
-38

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F = 0.305


calcul

F
(0.05; 7; 27)
= 2.373
p du F
calcul
= 0.945
Comme le F
calcul
est infrieur au F
tabul
, , nous concluons l'existence d'une association
linaire significative.
3.3.2.4.2 Linarit du dosage de la 2'dsoxyguanosine
3.3.2.4.2.1 Donnes et graphiques
Le Tableau 3.3-8 prsente les donnes mesures respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". Les Figures 3.3-7 et 3.3-8 prsentent les donnes des 4
jours, pour, respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique,
ainsi que les droites moyennes sur lesquelles a port l'tude de linarit.
L'enrichissement numro 1 tant trop lev, un plafonnement du pic tait manifeste dans
les "solutions ADN"; ces points n'ont donc pas t considrs.

155
Tableau 3.3-8 : Donnes de l'tude de linarit pour la 2'dsoxyguanosine

Signal pour 1 AFS :
Enrichissement
nmoles
injectes
dans 100 l
Jour
La solution
aqueuse
La solution
ADN
1 41.16 1 224275 267365
2 215986 241211
3 216732 253741
4 208681 256108
2 31.66 1 163756 231806
2 156656 208053
157679 3 216248
4 154900 219978
3 23.52 1 119888 200921
2 115995 194544
3 114643 170570
4 115724 192549
4 15.43 1 77214 150479
2 75498 146222
3 75020 127748
4 75987 143353
5 6.86 1 34901 105070
2 34485 100984
3 34851 102059
4 33916 91513
6 1.37 1 6829 51697
2 6818 70445
3 6835 56780
4 6680 70234
7 0.69 1 3360 43036
2 3426 69255
3 3510 56388
4 3303 68768
8 0.27 1 1296 67979
2 1267 59577
3 1276 66886
4 1296 59068
---- 1 ---- 45800
---- 2 ---- 45148
---- 3 ---- 65516
ADN blanc
(non enrichi)
---- 4 ---- 54159




156
Figure 3.3-7 : 2'dsoxyguanosine. Solutions aqueuses. Points exprimentaux mesurs pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.998)

0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4



Figure 3.3-8 : 2'dsoxyguanosine. Solutions ADN. Points exprimentaux mesurs pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.975)

0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4



157
3.3.2.4.2.2 2'dsoxyguanosine : Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
Le Tableau 3.3-9 montre que l'ordonne l'origine n'est pas significativement diffrente
de 0 pour la "droite aqueuse". La dG endogne tant en quantit fort importante, ce test est
forcment ngatif pour la "droite ADN".

Tableau 3.3-9 : 2'dsoxyguanosine. Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
t
(0.05; 6)
= 2.447

"Droite aqueuse"
(n = 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a -1870 -1326 -1453 -643
sa 1918 1845 2019 987
t calcul 0.975 0.719 0.720 0.651
p 0.367
NS
0.499
NS
0.499
NS
0.539
NS

"Droite ADN"
(n = 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 52262 60791 59532 59876
sa 5510 5236 3588 2854
t calcul 9.49 11.61 16.60 20.98
p 1. 10
-5

***
2 x 10
-5

***
3 x 10
-6

***
8 x 10
-7

***


3.3.2.4.2.3 2'dsoxyguanosine : Comparaison des pentes
Comme le montre le Tableau 3.3-10, toutes les droites sont de pentes parallles et il n'y a
ni effet "jour", ni effet "matrice", au seuil de probabilit de 0.05.


158
Tableau 3.3-10 : 2'dsoxyguanosine. Comparaison des pentes des droites de rgression
t
(0.05; 12)
= 2.178; t
(0.05; 60)
= 2.000

"Droite aqueuse"
(n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 0.998 0.998 0.998 0.999
b 5345 5132 5144 5007
sb 91 88 96 47
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calcul 1.681 0.091 1.280
p 0.119
NS
0.929
NS
0.225
NS

"Droite ADN"
(n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 0.979 0.973 0.986 0.992
b 5999 5112 4836 5271
sb 363 345 236 188
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
1.771 0.658 1.439
p 0.102
NS
0.523
NS
0.176
NS

Comparaison entre
"Droite ADN" et
"Droite aqueuse"
(n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calcul 1.747 0.057 1.205 1.362
p 0.106
NS
0.955
NS
0.251
NS
0.198
NS

Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et
"Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 32)

t calcul 0.909
p 2.000
NS

t calcul


3.3.2.4.2.4 2'dsoxyguanosine : Tests pour la linarit de la "droite aqueuse"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.657
C
(0.05; 8; 3)
= 0.4377
Comme le C
calcul
est suprieur au C
tabul
, les variances ne peuvent tre considres
homognes au seuil de probabilit 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dpendantes;
nous avons donc procd une transformation log log des donnes afin de rendre les
variances homognes pour la suite des tests.
159
b. Test de signification statistique de la pente
Aprs transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur
tabulaire :
F
calcul
= 134756


F
(0.05; 1; 30)
= 4.171
p du F
calcul
= 2 x 10
-56

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 6.035

3.3.2.4.2.5
F
(0.05; 6; 24)
= 2.508
p du F
calcul
= 0.0006
Nous concluons l'existence d'une association linaire significative seulement au
seuil 0.0006. Rappelons les considrations dveloppes sur ce test de dfaut d'ajustement
( 3.3.2.3.7). Dans le cas prsent, la transformation des donnes a fortement rduit les carts
entre les valeurs, "augmentant" artificiellement leur prcision et mettant en dfaut le test.
L'examen visuel des donnes nous permet cependant d'affirmer que la relation linaire existe.
2'dsoxyguanosine : Tests pour la linarit de la "droite ADN"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.229
C
(0.05; 8; 3)
= 0.4377
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 1164


F
(0.05; 1; 30)
= 4.171
p du F
calcul
= 1.5 x 10
-25

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
160
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 1.317


F
(0.05; 6; 24)
= 2.508
p du F
calcul
= 0.288
Comme le F
calcul
est infrieur au F
tabul
, , nous concluons l'existence d'une association
linaire significative.
3.3.2.4.3 Linarit du dosage de la thymidine
3.3.2.4.3.1 Donnes et graphiques
Le Tableau 3.3-11 prsente les donnes mesures respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". Les Figures 3.3-9 et 3.3-10 prsentent les donnes des 4
jours, pour, respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique,
ainsi que les droites moyennes sur lesquelles a port l'tude de linarit.

Tableau 3.3-11 : Donnes de l'tude de linarit pour la thymidine

Signal pour 1 AFS :
Enrichissement
nmoles
injectes
dans 100 l
Jour
La solution
aqueuse
La solution
ADN
1 40.51 1 68034 88184
2
64402 78281

66296

1
80051
3
86655
4
63000 92375
2 31.17
53036
2

49584 65515
3
49345 67333
4
49084 76065
3 23.15 1
40113 68000
2
37462 67680
3
37841 67287
4
37266 63371
4 15.19 1
26032 56051
2
25003 53956
3
24270 42935
4
24963 52572

161
Tableau 3.3-11 (Suite) : Donnes de l'tude de linarit pour la thymidine

Signal pour 1 AFS :
Enrichissement
nmoles
injectes
dans 100 l
Jour
La solution
aqueuse
La solution
ADN
5 6.75 1
11962 42323
2
11425 40133
2281
3
11228 40001
4
11056 33706
6 1.35 1
18727
2
2122 26669
3
2130 19166
4
2187 30053
7 0.68 1
1042 15025
2
1088 30886
3
1120 20485
4
1082 29820
8 0.27 1
406 30262
2
453 20348
3
387 28454
4
369 21803
---- 1 ----
17487
---- 2 ----
16815
---- 3 ----
29092
ADN blanc
(non enrichi)
---- 4 ----
19747

Figure 3.3-9 : Thymidine. Solutions aqueuses. Points exprimentaux mesurs pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.998)

0.E+00
1.E+04
2.E+04
3.E+04
4.E+04
5.E+04
6.E+04
7.E+04
8.E+04
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4

162
Figure 3.3-10 : Thymidine. Solutions ADN. Points exprimentaux mesurs pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.942)

0.E+00
1.E+04
2.E+04
3.E+04
4.E+04
5.E+04
6.E+04
7.E+04
8.E+04
9.E+04
1.E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (nmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4


3.3.2.4.3.2 Thymidine : Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
Le Tableau 3.3-12 montre que l'ordonne l'origine n'est pas significativement diffrente
de 0 pour la "droite aqueuse". Le dT endogne tant en quantit fort importante, ce test est
forcment ngatif pour la "droite ADN".

Tableau 3.3-12 : Thymidine. Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
t
(0.05; 6)
= 2.447; t
(0.05; 7)
= 2.365

"Droite aqueuse"
(n = 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 203 278 -33 342
sa 245 208 298 301
t calcul 0.828 1.334 0.110 1.135
p 0.439
NS
0.231
NS
0.916
NS
0.300
NS

"Droite ADN"
(n = 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 21345 24767 24486 24263
sa 3088 3167 2973 1628
t calcul 6.913 7.821 8.237 14.907
p 2 x 10
-4 ***
1 x 10
-4 ***
8 x 10
-5 ***
1 x 10
-6 ***


163
3.3.2.4.3.3 Thymidine : Comparaison des pentes
Comme le montre le Tableau 3.3-13, toutes les droites sont de pentes parallles et il n'y a
ni effet "jour", ni effet "matrice", au seuil de probabilit de 0.05.

Tableau 3.3-13 : Thymidine. Comparaison des pentes des droites de rgression
t
(0.05; 12)
= 2.178; t
(0.05; 13)
= 2.160; t
(0.05; 14)
= 2.145; t
(0.05; 64)
= 1.998

"Droite aqueuse"
(n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 1.000 1.000 1.000 0.999
b 1690 1590 1620 1564
sb 12 10 14 15
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calcul 6.470 1.705 2.712
p 3.E-05
***
0.114
NS
0.019
*

"Droite ADN"
(n = 9 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 0.940 0.902 0.906 0.976
b 2001 1577 1513 1693
sb 207 212 199 109
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calcul 1.432 0.219 0.795
p 0.174
NS
0.830
NS
0.440
NS

Comparaison entre
"Droite ADN" et
"Droite aqueuse"
(n = 8 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calcul 1.499 0.062 0.535 1.175
p 0.158
NS
0.951
NS
0.602
NS
0.261
NS

Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et
"Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 36)

t calcul 0.134
p 0.893
NS



3.3.2.4.3.4 Thymidine : Tests pour la linarit de la "droite aqueuse"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.451
C
(0.05; 8; 3)
= 0.4377
164
Comme le C
calcul
est suprieur au C
tabul
, les variances ne peuvent tre considres
homognes au seuil de probabilit 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dpendantes;
nous avons donc procd une transformation log log des donnes afin de rendre les
variances homognes pour la suite des tests.
b. Test de signification statistique de la pente
Aprs transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur
tabulaire :
F
calcul
= 46424


F
(0.05; 1; 30)
= 4.171
p du F
calcul
= 2 x 10
-49

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 1.910

3.3.2.4.3.5
F
(0.05; 6; 24)
= 2.508
p du F
calcul
= 0.120
Nous concluons l'existence d'une association linaire significative au seuil 0.05.
Thymidine : Tests pour la linarit de la "droite ADN"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.207
C
(0.05; 9; 3)
= 0.4027
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 551


F
(0.05; 1; 34)
= 4.130
p du F
calcul
= 1 x 10
-22

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
165
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 1.538
F
(0.05; 7; 27)
= 2.373
p du F
calcul
= 0.197
Nous concluons l'existence d'une association linaire significative au seuil 0.05.
3.3.2.4.4 Linarit du dosage de la 2'-dsoxyadnine
3.3.2.4.4.1 Donnes et graphiques
Le Tableau 3.3-14 prsente les donnes mesures respectivement pour les "solutions
aqueuses" et les "solutions ADN". Les Figures 3.3-11 et 3.3-12 prsentent les donnes des 4
jours, pour, respectivement, les mesures obtenues en milieu aqueux et en milieu biologique,
ainsi que les droites moyennes sur lesquelles a port l'tude de linarit.

Tableau 3.3-14 : Donnes de l'tude de linarit pour la 2'-dsoxyadnine

Signal pour 1 AFS :
Enrichissement
nmoles
injectes
dans 100 l
Jour
La solution
aqueuse
La solution
ADN
1 43.70 1 137898 183561
2 133288 162285
3 132796 178479
4 131142 189395
2 33.61 1 109839 166371
2 100091 140796
3 101827 144513
4 112123 159692
3 24.97 1 82783 137272
2 74195 132962
3 136386
4 81151 128795
4 16.39 1 52364 110130
2 50836 109674
3 51530 91363
4 50422 107852
5 7.28 1 23957 82779
2 22890

80047
3 23709 83341
4 21941 70397

76406

166
Tableau 3.3-14 (Suite) : Donnes de l'tude de linarit pour la 2'-dsoxyadnine

Enrichissement
nmoles
injectes
dans 100 l
Jour
Signal pour 1 AFS :
6 1.46 1 4357 40460
2 4605 57658
3 4641 45631
4 4248 61720
7 0.73 1 2224 35544
2 2324 60303
3 1979 46577
4 2121 60442
8 0.29 1 826 59530
2 810 50515
3 741 58264
4 889 49681
---- 1 ---- 39297
---- 2 ---- 37677
---- 3 ---- 58592
ADN blanc
(non enrichi)
---- 4 ---- 48275


Figure 3.3-11 : 2'-dsoxyadnine. Solutions aqueuses. Points exprimentaux mesurs
pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.997)

0.0E+00
2.0E+04
4.0E+04
6.0E+04
8.0E+04
1.0E+05
1.2E+05
1.4E+05
1.6E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4



167
Figure 3.3-12 : 2'-dsoxyadnine. Solutions ADN. Points exprimentaux mesurs pendant
les 4 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.963)

0.0E+00
2.0E+04
4.0E+04
6.0E+04
8.0E+04
1.0E+05
1.2E+05
1.4E+05
1.6E+05
1.8E+05
2.0E+05
0 10 20 30 40 50
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3
Jour 4


3.3.2.4.4.2 2'-dsoxyadnine : Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
Le Tableau 3.3-15 montre que l'ordonne l'origine n'est pas significativement diffrente
de 0 pour la "droite aqueuse". Le dA endogne tant en quantit fort importante, ce test est
forcment ngatif pour la "droite ADN".

Tableau 3.3-15 : 2'-dsoxyadnine. Comparaison des ordonnes l'origine avec zro
t
(0.05; 6)
= 2.447; t
(0.05; 7)
= 2.365

"Droite aqueuse"
(n = 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 292 237 514 200
sa 839 576 441 1965
t calcul 0.349 0.411 1.165 0.102
p 0.739 0.696 0.288 0.922
"Droite ADN"
(n = 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
a 44270 52447 52171 52318
sa 4704 4448 4609 2196
t calcul 9.410 11.790 11.319 23.824
p 3 x 10
-5
7 x 10
-6
9 x 10
-6
6 x 10
-6

168
3.3.2.4.4.3 2'-dsoxyadnine : Comparaison des pentes
La comparaison des pentes montre une diffrence significative entre les pentes des
"droites aqueuses" (Tableau 3.3-16); le faible cart-talon sur les pentes est responsable de ce
phnomne; un examen visuel des droites ne prsente en fait pas de diffrence flagrante. Les
"droites aqueuses" et "droites ADN" sont parallles et il n'y a donc pas d'effet "matrice", au
seuil de probabilit de 0.05.

Tableau 3.3-16 : 2'-dsoxyadnine. Comparaison des pentes des droites de rgression
t
(0.05; 12)
= 2.178; t
(0.05; 13)
= 2.160; t
(0.05; 14)
= 2.145; t
(0.05; 64)
= 1.998

"Droite aqueuse"
(n = 8 + 8)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 0.999 1.000 1.000 0.995
b 3207 3015 3033 3134
sb 38 26 20
Jour 3 / Jour 4
88
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3
t calcul 4.231 0.567 1.115
p 1 x 10
-3 ***
0.581
NS
0.287
NS

"Droite ADN"
(n = 9 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
R 0.965 0.950 0.946 0.989
b 3744 2951 2919 3167
sb 292 276 286 136
Jour 1 / Jour 2 Jour 2 / Jour 3 Jour 3 / Jour 4
t calcul 1.973 0.082 0.783
p 0.069
NS
0.936
NS
0.447
NS

Comparaison entre
"Droite ADN" et
"Droite aqueuse"
(n = 8 + 9)
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
t calcul 1.823 0.228 0.398 0.204
p 0.091
NS
0.823
NS
0.697
NS
0.841
NS

Comparaison entre "Droite moyenne ADN" et
"Droite moyenne aqueuse" (n = 32 + 36)

t calcul 0.552
0.583 p
NS



169
3.3.2.4.4.4 2'-dsoxyadnine : Tests pour la linarit de la "droite aqueuse"
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.572
C
(0.05; 8; 3)
= 0.4377
Comme le C
calcul
est suprieur au C
tabul
, les variances ne peuvent tre considres
homognes au seuil de probabilit 0.05. Elles apparaissent en fait concentration-dpendantes;
nous avons donc procd une transformation log log des donnes afin de rendre les
variances homognes pour la suite des tests.
b. Test de signification statistique de la pente
Aprs transformation, nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur
tabulaire :
F
calcul
= 40923


F
(0.05; 1; 30)
= 4.171
p du F
calcul
= 1 x 10
-48

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F = 1.132

3.3.2.4.4.5 2'-dsoxyadnine : Tests pour la linarit de la "droite ADN"
calcul

F
(0.05; 6; 24)
= 2.508
p du F
calcul
= 0.374
Nous concluons l'existence d'une association linaire significative au seuil 0.05.
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Nous calculons le C de Cochran et le comparons la valeur tabulaire :


C
calcul
= 0.190
C
(0.05; 9; 3)
= 0.4027
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de signification statistique de la pente
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 881
170
F
(0.05; 1; 34)
= 4.130
p du F
calcul
= 7 x 10
-26

Comme la probabilit du F
calcul
est extrmement faible, nous concluons l'existence d'une
pente significative.
c. Test de validit de la droite de rgression
Nous calculons le F de Fischer et le comparons la valeur tabulaire :
F
calcul
= 1.213
F
(0.05; 7; 27)
= 2.373
p du F
calcul
= 0.330
Nous concluons l'existence d'une association linaire significative au seuil 0.05.
3.3.2.4.5 Rsum de l'tude de linarit
Pour rsumer les principales conclusions de cette tude, le Tableau 3.3-17 compare les
caractristiques et rsultats des tests statistiques pour les "droites aqueuses moyennes" et
"droites ADN moyennes".
3.3.2.5 Discussion et conclusion
Afin de prendre en compte tous les paramtres analytiques, les protocoles recommandent
d'enrichir en analytes aussi tt que possible dans la procdure. Comme des bases nucliques
extractibles ne peuvent tre introduites de manire exacte dans les lysats cellulaires
47
, nous
avons dcid d'enrichir de l'ADN extrait juste avant l'tape de digestion enzymatique. Les
solutions d'ADN sont cependant relativement visqueuses et leur dispensation en aliquotes s'est
avre particulirement dlicate. Ainsi, pour les bases normales, dont les taux endognes sont
levs par rapport aux enrichissements, ces variations invitables dans la dispensation de
l'ADN se refltent dans les courbes de calibration "droites ADN" et dans leurs coefficients de
dtermination. Ce problme n'est quasi pas apparent pour la 8-oxodG dont le taux endogne
est similaire aux enrichissements les plus bas.
Mme dans ces conditions peu favorables, nous pouvons conclure que la mthode
d'analyse prsente une excellent linarit. En pratique quotidienne, la quantification des
chantillons est donc ralise partir de 2 talons injects en duplicata.



47
Le problme se posait principalement pour la 8-oxodG.
171
Tableau 3.3-17 : Rsum de l'tude de linarit

Base
Zone de concentration
(a)
8-oxodG
0.2 32 pmoles
dG
0.3 41 nmoles
dT
0.3 41 nmoles
dA
0.3 44 nmoles
Solutions aqueuses
n 32 32 32 32
Coefficient de dtermination R 0.990 0.998 0.998 0.997
Ord. origine cart talon 1679 10391 -1323 980 197 276 311 677
Pente cart talon

35957 647 5157 47 1616 13 3097 30
p du test de Cochran
(homoscdasticit)
p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05
Transformation ventuelle log - log log - log log - log log - log
p du test pour l'existence d'une
pente
8 x 10
-40 ***
2 x 10
-56 ***
2 x 10
-49 ***
1 x 10
-48 ***

p du test de dfaut d'ajustement 0.002
**
0.0006
***
0.120
NS
0.374
NS

Solutions ADN
n 36 32 36 36
Coefficient de dtermination R 0.993 0.975 0.942 0.963
Ord. origine cart talon 4441 8174 58115 2360
non
24223 1335 51265 2154
Pente cart talon

36473 540 5304 155 1607 68 3038 102
p du test de Cochran
(homoscdasticit)
p > 0.05
NS
p > 0.05
NS
p > 0.05
NS
p > 0.05
NS

Transformation ventuelle non non non
p du test pour l'existence d'une
pente
8 x 10
-38 ***
1.5 x 10
-25 ***
1 x 10
-22 ***
7 x 10
-26 ***

p du test de dfaut d'ajustement 0.945
NS
0.288
NS
0.197
NS
0.330
NS

p du test pour le paralllisme de
la "droite aqueuse" et de
la "droite ADN"
0.543
NS
2.000
NS
0.893
NS
0.583
NS



(a)
enrichissement pour 100 l
3.3.2.6 Linarit de la 8-oxodG sur le dtecteur CC-5
Pour la 8-oxodG, la zone infrieure de cette tude de linarit (200 fmoles) est suprieure
notre "limite de quantification"; en effet, les extraits d'chantillons non stresss nous
amnent injecter des quantits de l'ordre de 100 fmoles, qui devient donc notre limite
oblige.
En cours de travail, nous avons eu l'occasion de transfrer notre mthode sur un dtecteur
ampromtrique lgrement plus sensible, le dtecteur CC-5; nous avons profit de l'occasion
pour raliser une courte tude de linarit sur talons aqueux aux niveaux bas de
172
concentration. Entre les jours d'injection, le flux a t coup de manire viter une
passivation de l'lectrode.
3.3.2.6.1 Rsultats
Le Tableau 3.3-18 et la Figure 3.3-13 prsentent les rsultats sur 3 jours d'analyse. Le
Tableau 3.3-19 rsume les paramtres de la droite moyenne.

Tableau 3.3-18 : Etude de linarit pour la 8-oxodG sur le dtecteur lectrochimique CC-5

Signal pour 1 nAFS
Quantit injecte
(pmoles)
Jour 1 Jour 2 Jour 3
4.196 314640 305516 346694
1.574 121098 114549 126586
1.049 83179 75343 81195
0.525 47587 42075 38094
0.262 23698
12100
19763 19788
0.105 8698 8497


Figure 3.3-13 : 8-oxodG. Solutions aqueuses. Points exprimentaux mesurs pendant
les 3 jours et droite de rgression moyenne.
(R = 0.994)

0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
3.0E+05
3.5E+05
4.0E+05
0 1 1 2 2 3 3 4 4 5
Enrichissement (pmoles / 100 l)
S
i
g
n
a
l
Jour 1
Jour 2
Jour 3

173
Tableau 3.3-19 : Rsum de l'tude de linarit sur dtecteur CC-5
0.1 4.2 pmoles

Base
Zone de concentration
(a)
8-oxodG
Solutions aqueuses
n 18
Coefficient de dtermination R 0.994
Ord. origine cart talon 1193 2683
p du test de Cochran
(homoscdasticit)
Pente cart talon

76412 1416
p < 0.05
Transformation log - log
p du test pour l'existence d'une
pente
1 x 10
-18 ***
p du test de dfaut d'ajustement 0.780
NS

3.3.2.6.2 Conclusion
Cette courte tude nous permet de constater que le dtecteur CC-5 prsente galement une
rponse linaire, qui se poursuit au moins jusqu' 100 fmoles. Le problme de passivation de
l'lectrode ( 3.3.2.4.1.3) semble entirement rsolu lorsque le flux chromatographique est
coup entre les squences d'analyse.
3.3.3 Exactitude
3.3.3.1 Dfinition
L'exactitude exprime l'troitesse de l'accord entre la valeur qui est accepte comme vraie
et la valeur trouve. Elle est le plus souvent exprime en terme de pourcentage de
recouvrement par le dosage de quantits d'analyte connues ajoutes (Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
3.3.3.2 Protocole
3.3.3.2.1 Calcul des taux de recouvrement
Les rsultats obtenus lors de l'tude de linarit ont permis d'valuer la validit des droites
mesures en solution aqueuse et en prsence de la matrice biologique et de les comparer;
l'exactitude est estime sur base des donnes obtenues en prsence de la matrice biologique
("droite ADN") par rapport au systme de rfrence considr, la droite d'talonnage ralise
en milieu aqueux ("droite aqueuse").
174
Pour chaque point exprimental, nous avons donc effectu le changement de variable
suivant :
%
ment enrichisse
100
. x
b
a y
Y
j
blanc
1
1 i
i
|
.
|

\
|

=
Dans cette quation, rappelons que Y
i
reprsente le taux de recouvrement, a
1
et b
1
sont les
coefficients de rgression de la "droite aqueuse" considre
48
, y
i
le signal mesur pour le
niveau de concentration considr (enrichissement
j
) et x
blanc
le niveau endogne estim
partir de la "droite ADN" par la mthode des ajouts doss
49
.
3.3.3.2.2 Test de validit des moyennes
Aprs avoir vrifi l'homoscdasticit par le test de Cochran ( 3.3.2.3.5), nous avons
test la validit des moyennes en comparant les erreurs inter-groupes et les erreurs intra-
groupes. Les variances ont donc t rparties suivant le Tableau 3.3-20.

Tableau 3.3-20 : Test pour la validit des moyennes
F calcul Source de variation ddl Somme des carrs Variance
Variation totale N - 1 ( )

= =
=
k
1 j
nj
1 i
2
ij Y Y T
Variation intra-
groupes
N - k
( )

=
=
k
1 j
2
jj j Y Y . n . b E
k N
E
s E


Variation inter-
groupes
k - 1

= E T C
1 k
C
s C


E
C
s
s
F =


Si le F calcul est infrieur au F tabulaire F
(; k - 1; N - k)
, les moyennes sont considres
comme valides, au seuil de probabilit considr car les variations des observations entre les
diffrents groupes sont dues aux erreurs exprimentales. La probabilit exacte du F calcul est
obtenue par la fonction "LOI.F" du tableur Excel.

48
"Droite aqueuse du jour" pour la 8-oxodG, de manire tenir compte du phnomne de passivation de
l'lectrode; "droite aqueuse moyenne" pour les autres bases
49
Nous avons prfr estimer le taux endogne par la mthode des ajouts doss; en effet, la prcision sur les
mesures blanc est mdiocre en raison (i) pour la 8-oxodG, de signaux extrmement proches de la limite de
dtection; et (ii) pour les autres bases, du problme de dispensation de la solution visqueuse d'ADN.
175
3.3.3.2.3 Calcul du recouvrement moyen
La moyenne, l'cart talon et l'intervalle de confiance du recouvrement ont t calculs
pour tous les niveaux d'enrichissement considrs.
L'intervalle de confiance est calcul classiquement :
N
s . t ) 1 N ; (


3.3.3.3 Rsultats
3.3.3.3.1 Dosage de la 8-oxodG
3.3.3.3.1.1 Donnes

Le Tableau 3.3-21 prsente les donnes transformes.
Tableau 3.3-21 : Taux de recouvrement pour la 8-oxodG

Enrichissement
pmoles ajoutes
dans 100 l
Jour
Taux de recouvrement
(%)
1 31.45 1 100.59
2 102.14
3 104.54
4 105.71
2 24.19 1 102.04
2 99.67

100.81
17.97 1
3 99.84
4
3 99.05
2

100.06
11.79 1
98.89
3 100.57
4
4 99.75
2 98.62
3 98.59
99.17 4
5 5.24 1 103.30
2

98.93
3 103.24
4 98.78
6 1.05


1 108.62
2 100.31
3 108.26
4 109.22

176
Tableau 3.3-21 (Suite) : Taux de recouvrement pour la 8-oxodG

Enrichissement
pmoles ajoutes
dans 100 l
Jour
Taux de recouvrement
(%)
0.52
2 110.24
3 (127.26)
4 103.72
8 0.21 1
2 (149.23)
3 (189.42)
4
7 1 102.22

(167.67)
(107.55)

3.3.3.3.1.2
Les points obtenus pour l'enrichissement 8 s'cartent fortement de 100 %, ce qui peut
s'expliquer par la variabilit dans la dispensation de l'ADN. Cet enrichissement est en effet
particulirement faible (210 fmoles), proche du taux de base; ce niveau de concentration ne
sera donc pas pris en compte pour la suite de l'tude.
Le point "127.26" de l'enrichissement 7 semble tre une valeur aberrante. La taille de
l'chantillon (n = 4) est trop faible pour tester cette valeur (Kringle, 1994). Nous l'cartons
nanmoins pour la mme raison que ci-dessus.
Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calcul et compar la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.364
C
(0.05; 7; 3)
= 0.4800
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de validit des moyennes
Le F de Fischer est calcul et compar la valeur tabulaire :
F
calcul
= 2.427
F
(0.05; 6; 21)
= 2.573
p du F
calcul
= 0.063
NS

Nous concluons que les variations entre les observations des diffrents groupes sont bien
dues l'erreur exprimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
Recouvrement moyen = 102.11
Ecart talon = 3.54
177

Intervalle de confiance du biais = de 0.7 3.5
Intervalle de confiance
(p = 0.05)
= de 100.7 103.5
(p = 0.05)

Le biais, bien que statistiquement significatif au seuil 0.05, est peu important; en effet,
avec un cart talon de 3.54, la limite suprieure de confiance du biais est infrieure s, c'est-
-dire la rptabilit de la mthode.
3.3.3.3.2 Dosage de la 2'-dsoxyguanosine
3.3.3.3.2.1 Donnes
Le Tableau 3.3-22 prsente les donnes transformes.

Tableau 3.3-22 : Taux de recouvrement pour la 2'-dsoxyguanosine

Enrichissement
nmoles ajoutes
dans 100 l
Jour
Taux de recouvrement
(%)
2 31.66 1 106.82
2 92.27
3
4
1
97.29
99.58
3 23.52 118.33
2 113.07
3 93.31
4 111.43
4 15.43 1 116.94
2 111.59
3 88.38
4 107.98
5 6.86 1 134.73
2 123.18
3 126.22
4 96.41
6 1.37 1 (-80.78)
2 (184.23)
3 (-8.93)
4 (181.26)
7 0.69 1 (-406.39)
2 (334.83)
3 (-28.92)
4 (321.05)
8 0.27 1 (746.89)
2 (153.07)
3 (669.64)
4 (117.10)

178
Les points obtenus pour les enrichissements 6 8 s'cartent fortement de 100 %, ce qui
peut s'expliquer par la variabilit dans la dispensation de l'ADN. Ces enrichissements sont en
effet faibles, proches du taux de base endogne; ces niveaux de concentration ne seront donc
pas pris en compte pour la suite de l'tude.
3.3.3.3.2.2 Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calcul et compar la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.469
C
(0.05; 4; 3)
= 0.6841
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de validit des moyennes
Le F de Fischer est calcul et compar la valeur tabulaire :
F
calcul
= 2.111
F
(0.05; 3; 12)
= 3.490
p du F
calcul
= 0.152
NS

Nous concluons que les variations entre les observations des diffrents groupes sont bien
dues l'erreur exprimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
Recouvrement moyen = 108.6


Le biais, statistiquement significatif au seuil 0.05, est certainement d aux problmes de
dispensation des solutions aqueuses d'ADN (collode rversible fortement visqueux).
Ecart talon = 13.36
Intervalle de confiance
(p = 0.05)
= de 101.5 115.7
Intervalle de confiance du biais
(p = 0.05)
= de 1.5 15.7
3.3.3.3.3 Dosage de la thymidine
3.3.3.3.3.1 Donnes


Le Tableau 3.3-23 prsente les donnes transformes.
179
Tableau 3.3-23 : Taux de recouvrement pour la thymidine

Enrichissement
nmoles ajoutes
dans 100 l
Jour
Taux de recouvrement
(%)
1 40.51 1 95.04
2 79.92
3 92.71
4 101.44
2 31.17 1 107.41
2 78.55
3 82.16
4 99.50
3 23.15 1 112.38
2 111.53
3 110.48
4 100.01
4 15.19 1 122.59
2 114.05
3 69.17
4 108.42
5 6.75 1 150.02
2 129.96
3 128.75
4 71.07
6 1.35 1 (-330.95)
2 (32.90)
3 (-310.86)
4 (187.97)
7 0.68 1 (-1001.11)
2 (452.24)
3 (-500.84)
4 (354.56)
8 0.27 1 (987.70)
2 (-1283.41)
3 (573.41)
4 (-950.13)


Les points obtenus pour les enrichissements 6 8 s'cartent fortement de 100 %, ce qui
peut s'expliquer comme prcdemment (cf 3.3.3.3.2 ).
180
3.3.3.3.3.2 Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calcul et compar la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.572
C
(0.05; 5; 3)
= 0.5981
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
b. Test de validit des moyennes
Le F de Fischer est calcul et compar la valeur tabulaire :
F
calcul
= 1.376
F
(0.05; 4; 12)
= 3.056
p du F
calcul
= 0.289
NS

Nous concluons que les variations entre les observations des diffrents groupes sont bien
dues l'erreur exprimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
Recouvrement moyen = 103.3
Ecart talon = 13.36
Intervalle de confiance
(p = 0.05)
= de 93.5 113.0
Intervalle de confiance du biais
(p = 0.05)
= de - 6.5 13.0
Il n'y a aucun biais dans la dtermination de dT; l'imprcision relative (14 %) est due aux
problmes de dispensation des solutions visqueuses d'ADN.
3.3.3.3.4 Dosage de la 2'dsoxyadnosine
3.3.3.3.4.1 Donnes
Le Tableau 3.3-24 prsente les donnes transformes.
Les points obtenus pour les enrichissements 6 8 s'cartent fortement de 100 %, ce qui peut
s'expliquer comme prcdemment (cf 3.3.3.3.2 ).

181
Tableau 3.3-24 : Taux de recouvrement pour la 2'dsoxyadnosine

Enrichissement
nmoles ajoutes
dans 100 l
Jour
Taux de recouvrement
(%)
1 43.70 1 95.17
2 79.45
3 91.41
4 99.48
2 33.61 1 107.21
2 82.64
3 86.21
4 100.79
3 24.97 1 106.69
2 101.12
3 105.55
4 95.73
4 16.39 1 109.10
108.20 2
3 72.12
4 104.61
5 7.28 1 124.22
2 112.10
3 126.71
4 69.32
6 1.46 1 (-317.01)
2 (64.21)
3 (-202.39)
4 (154.25)
7 0.73 1 (-851.98)
2 (245.70)
3 (-362.81)
4 (251.86)
8 0.29 1 (528.59)
2 (-470.63)
3 (388.23)
4 (-563.03)

3.3.3.3.4.2 Taux de recouvrement moyen
a. Test d'homognit des variances intra-groupes
Le C de Cochran est calcul et compar la valeur tabulaire :
C
calcul
= 0.564
C
(0.05; 5; 3)
= 0.5981
Comme le C
calcul
est infrieur au C
tabul
, les variances peuvent tre considres homognes
au seuil de probabilit 0.05.
182
b. Test de validit des moyennes
Le F de Fischer est calcul et compar la valeur tabulaire :
F
calcul
= 0.694
F
(0.05; 4; 12)
= 3.056
p du F
calcul
= 0.608
NS

Nous concluons que les variations entre les observations des diffrents groupes sont bien
dues l'erreur exprimentale.
c. Calcul du recouvrement moyen
Recouvrement moyen = 98.9
Ecart talon = 15.3
Intervalle de confiance
(p = 0.05)
= de 91.7 106.1
Intervalle de confiance du biais
(p = 0.05)
= de - 8.3 6.1
Il n'y a aucun biais dans la dtermination de dA; l'imprcision relative (15 %) est due aux
problmes de dispensation des solutions visqueuses d'ADN.
3.3.3.3.5 Rsum de l'tude d'exactitude
Afin de rsumer les principales conclusions de cette tude, le Tableau Tableau 3.3-25
compare les rsultats obtenus pour les diffrentes bases.

Tableau 3.3-25 : Rsum de l'tude relative l'exactitude

8-oxodG dG dT dA
Niveau
enrichi
(pmoles)
Taux de
recouvr
t

%
(m s)
Niveau
enrichi
(nmoles)
Taux de
recouvr
t

%
(m s)
Niveau
enrichi
(nmoles)
Taux de
recouvr
t

%
(m s)
Niveau
enrichi
(nmoles)
Taux de
recouvr
t

%
(m s)
31.45 103 6 41.16 (plafonne) 40.51 92 9 43.70 91 9
24.19 101 9 31.66 99 6 31.17 92 14 33.61

120 34
107 7

n 28
94 12
17.97 100 7 23.52 109 11 23.15 109 6 24.97 102 5
11.79 99 8 15.43 106 13 15.19 104 24 16.39 99 18
5.24 101 9 6.86 120 17 6.75 7.28 109 27
1.05
0.52 112 7
16 20 20
p du test de Cochran p > 0.05
NS
p > 0.05
NS
p > 0.05
NS
p > 0.05
p du test de validit
des moyennes
NS

0.063
NS
0.152
NS
0.289
NS
0.608
NS

intervalle de confiance
du biais
0.7 3.5 1.5 15.7 - 6.5 13.0 - 8.3 6.1

183
3.3.3.4 Discussion et conclusion
Le taux de recouvrement moyen est proche de 100 % pour les 4 bases tudies. Les carts
talons relativement levs observs pour dG, dT et dA, ainsi que le biais de dG proviennent
de la prcision de la mthode mais surtout de la difficult inhrente une dispensation
correcte des solutions visqueuses d'ADN.
Mme dans ces conditions peu favorables, la mthode permet d'obtenir une exactitude
largement acceptable.
3.3.4 Prcision
3.3.4.1 Dfinition
La prcision, ou fidlit, d'une procdure d'analyse exprime l'troitesse de l'accord entre
les rsultats de tests individuels lorsque la procdure est applique de manire rpte sur des
prises d'essai multiples d'un chantillon homogne. La prcision dpend de facteurs tels que
l'oprateur, l'quipement, l'environnement, le temps et les ractifs. Elle peut tre tudie
2 niveaux : (i) la rptabilit "intra-jour", qui exprime la prcision sous les mmes conditions
opratoires pendant un intervalle de temps court; et (ii) la reproductibilit, qui exprime la
variabilit "inter-jours", ou "totale" (Caporal-Gautier et al., 1992; Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
3.3.4.2 Protocole
3.3.4.2.1 Prparation des chantillons
Ces paramtres ont t tudis sur des chantillons de cellules P388D1 "blancs"
50
et
stresses 3 niveaux diffrents; les cellules ont t exposes aux UVC 3 temps d'irradiation
diffrents (5, 10 et 15 min) en prsence de 20 mM d'H
2
O
2
, dispenses en parties aliquotes
d'environ 10
7
cellules et stockes 20C sous tampon H. Tous les chantillons ont t
analyss au cours de 4 jours diffrents en triplicate (3 rptitions du processus analytique
complet, y compris l'extraction de l'ADN). Aprs les 2 premiers jours, l'lectrode a t polie
avec du mthanol pour vrifier que l'tat de surface de l'lectrode
51
n'influait pas sur les
rsultats analytiques.

50
Non stresss
51
Cette exprience a t ralise avant de dcouvrir l'origine de l'effet de passivation de l'lectrode
184
3.3.4.2.2 Analyse des rsultats
Notre schma exprimental offre l'avantage d'estimer plusieurs composantes de
l'imprcision en poolant plusieurs spcimens et jours d'analyse, et ce par une analyse de
variance.
3.3.4.2.2.1 Conditions d'application
Les conditions d'application de l'analyse de variance sont les suivantes : (i) toutes les
observations sont statistiquement indpendantes l'une de l'autre; (ii) chaque observation
provient d'une population de distribution normale ou proche de la normalit; et (iii) chaque
observation a la mme variance de population (homoscdasticit).
De par la nature des erreurs dans un dosage chromatographique, nous avons considr
dans ce travail que les observations se distribuaient a priori de manire normale ou proche de
la normale. Le nombre d'observations par groupe (3) nous semble trop faible pour tester
l'homognit des variances, aussi supposerons-nous une homoscdasticit.
3.3.4.2.2.2 Liste des symboles
Soient I jours, J spcimens (niveaux de concentration) et K rplicats par chantillon.
On dfinit : 1. la moyenne de chaque chantillon :
K
x
x
K
1 k
ijk
. ij

=
=

2. la moyenne de chaque jour :
JK
x
x
J
1 j
K
1 k
ijk
. . i

= =
=

3. la moyenne de chaque spcimen :
IK
x
x
I
1 i
K
1 k
ijk
. j .

= =
=

4. la moyenne globale :
IJK
x
. . . x
I
1 i
J
1 j
K
1 k
ijk

= = =
=


3.3.4.2.2.3

Analyse de variance 2 facteurs
Les donnes ont t analyses pour la dG, la 8-oxodG et le rapport 8-oxodG par 10
5
dG
par une analyse de variance 2 facteurs (2-way analysis of variance) avec 2 effets alatoires,
jour et spcimen (ou niveau de stress) qui a permis de rpartir les variances selon le Tableau
3.3-26 (Kleinbaum et Kupper, 1978).

185
Tableau 3.3-26 : Analyse de variance 2 niveaux applique l'tude de la prcision

Source de
variation
ddl Somme des carrs Carr moyen F calcul
(a)
Variation due au
jour
I - 1
( )

=
=
I
1 i
2
. . i . . . x x D

1 I
D
s D


I
D
s
s

Variation due au
spcimen
J - 1
( )

=
=
J
1 j
2
. j . . . . x x S

I
S
s
s

Interaction jour
X spcimen
(I - 1)(J - 1)
= R S D T I

) 1 I )( 1 J (
I
s I

=


R
I
s
s

Variation
rsiduelle
IJ(k - 1)
( )

= =
=
I
1 i
J
1 j
2
. . . ij x . x R

) 1 K ( IJ
R
s R



Variation totale IJK - 1
( )

= = =
=
I
1 i
J
1 j
K
1 k
2
ijk . . . x x T


1 J
S
s S


1 IJK
T
s T



(a)
Comme nous considrons 2 effets alatoires, les 2 premires statistiques F sont calcules par rapport la
variance de l'interaction (Kleinbaum et Kupper, 1978).

Les composantes de la variance reprsentent l'incrment de la variance totale rsultant du
facteur considr; elles sont calcules comme suit (Anderson et Bancroft, 1952; Kleinbaum et
Kupper, 1978) :
Composante jour =
JK
S S I D

Composante spcimen =
IK
S S I S

Composante interaction =
K
S S r I

Composante rsiduelle = S
R


Ce qui permet d'estimer les coefficients de variation et donc la prcision analytique
(Anderson et Bancroft, 1952) :
CV% (Prcision intra-jour) =
. . . x
100 * rsiduelle Composante

CV% (Prcision totale) =
. . . x
100 * jours - inter Composante rsiduelle Composante +

186
3.3.4.3 Rsultats
3.3.4.3.1 Donnes
Le Tableau 3.3-27 prsente les donnes des dosages dans l'ADN cellulaire; les rsultats
sont exprims en pmoles de 8-oxodG, en nmoles de dG et en 8-oxodG par 10
5
dG.

Tableau 3.3-27 : Rsultats des dosages dans l'ADN cellulaire

Echantillon 8-oxodG
(pmoles/100 l)
dG
(nmoles/100 l)
8-oxodG
par 10
5
dG
Jour 1 Blanc - 1 0.14 16.59 0.83
Blanc - 2 0.17 16.73 1.03
Blanc - 3 0.16 16.97 0.97
5 min - 1 3.50 15.76 22.22
5 min - 2 3.36 15.48 21.68
5 min - 3 3.29 15.45 21.28
10 min - 1 5.16 14.19 36.34
10 min - 2 5.10 14.74 34.58
10 min - 3 5.50 15.25

36.07
15 min - 1 6.69 14.80 45.18
15 min - 2 6.48 14.45 44.88
15 min - 3 6.90 15.73 43.91
Jour 2 Blanc - 1 0.16 14.57 1.12
Blanc - 2 0.15 14.63 1.01
Blanc - 3 0.15 16.73 0.88
5 min - 1 3.26 15.00 21.75
5 min - 2 3.11 14.50 21.45
5 min - 3 3.56 16.14 22.04
10 min - 1 5.31 14.69 36.11
10 min - 2 5.51 15.15 36.39
10 min - 3 5.53 15.87 34.81
15 min - 1 7.37 16.16 45.62
15 min - 2 7.08 15.67 45.22
15 min - 3 7.21 16.24 44.38
Jour 3 Blanc - 1 0.15 17.07 0.87
Blanc - 2 0.23 17.05 1.33
Blanc - 3 0.10 10.66 0.93

187
Tableau 3.3-27 (Suite) : Rsultats des dosages dans l'ADN cellulaire

Echantillon 8-oxodG
(pmoles/100 l)
dG
(nmoles/100 l)
8-oxodG
par 10
5
dG
Jour 3 5 min - 1 3.60 17.19 20.96
(suite) 5 min - 2 3.54 16.92 20.92
5 min - 3 3.34 15.96 20.94
10 min - 1 5.60 16.03 34.94
10 min - 2 5.67 16.43 34.48
10 min - 3 5.90 16.41 35.95
15 min - 1 6.63 15.59 42.54
15 min - 2 7.81 17.50 44.62
15 min - 3 6.45 15.28 42.22
Jour 4 Blanc - 1 0.17 15.28 1.08
Blanc - 2 0.18 14.30 1.27
Blanc - 3 0.15 12.13 1.24
5 min - 1 2.67 11.25 23.77
5 min - 2 3.63 15.76 23.04
5 min - 3 3.72 17.09 21.75
10 min - 1 4.68 14.34 32.62
10 min - 2 5.32 15.14 35.12
10 min - 3 5.41 15.38 35.17
15 min - 1 7.42 16.55 44.85
15 min - 2 6.91 15.91 43.43
15 min - 3 7.25 16.34 44.38

3.3.4.3.2 Analyse de variance pour la 8-oxodG
Le Tableau 3.3-28 prsente l'analyse de variance pour le dosage de la 8-oxodG exprime
en pmoles de 8-oxodG par 100 l de milieu de digestion (ce qui correspond 3.35 x 10
7

cellules). Nous observons l' effet "spcimen" attendu, mais ni effet "jour", ni interaction "jour
X spcimen".
188
Tableau 3.3-28 : Analyse de variance pour la 8-oxodG (exprime en pmoles/100 l )

Source de
variation
ddl
Somme des
carrs
Carr moyen F
Probabilit
du F observ
Signification Variance CV %
Jour 3 0.31 0.10 1.07 0.410 NS 0.001 0.68
Spcimen 3 314.04 104.68 1066.50 8 x 10
-12
*** 8.72 74.04
J X S 9 0.88 0.10 1.17 0.347 NS 0.005 1.72
Rsidu 32 2.69 0.08 0.08 7.27
Totale 47 317.93

CV% intra-jour = 7.27 %
CV% total = 7.29 %

3.3.4.3.3 Analyse de variance pour la dG
Le Tableau 3.3-29 prsente l'analyse de variance pour le dosage de la dG exprime en
nmoles de dG par 100 l de milieu de digestion (ce qui correspond 3.35 x 10
7
cellules).
Nous n'observons ni effet "spcimen", ni effet "jour", ni interaction "jour X spcimen". Il n'y a
donc aucun effet du stress tudi sur l'extractabilit de l'ADN.

Tableau 3.3-29 : Analyse de variance pour la dG (exprime en nmoles/100 l )

Source de
variation
ddl
Somme des
carrs
Carr moyen F
Probabilit
du F observ
Signification Variance CV %
Jour 3 6.70 2.23 1.02 0.429 NS 0.003 0.44
Spcimen 3 2.85 0.95 0.43 0.734 NS -0.10 -----
J X S 9 19.71 2.19 1.12 0.379 NS 0.08 1.79
Rsidu 32 62.75 1.96 1.96 9.05
Totale 47 92.01

CV% intra-jour = 9.05 %
CV% total = 9.05 %

3.3.4.3.4 Analyse de variance pour la 8-oxodG par 10
5
dG
Le Tableau 3.3-30 prsente l'analyse de variance pour le dosage de la 8-oxodG exprime
en 8-oxodG par 10
5
dG. Comme le montrent les coefficients de variation, la prcision est
nettement amliore par l'emploi de dG comme talon interne, ce qui permet d'liminer le
paramtre du rendement de l'extraction d'ADN.
189
Tableau 3.3-30 : Analyse de variance pour la 8-oxodG (exprime en 8-oxodG par 10
5
dG )

Source de
variation
ddl
Somme des
carrs
Carr moyen F
Probabilit
du F observ
Signification Variance CV %
Jour 3 4.84 1.61 1.30 0.333 NS 0.03 0.79
Spcimen 3 3407.02
2.26 *
12731.06
12697.41 4232.47 4.6 x 10
-14
*** 352.60 73.39
J X S 9 11.18 1.24 0.044 0.23 1.88
Rsidu 32 17.63 0.55 0.55 2.90
Totale 47

CV% intra-jour = 2.90 %
CV% total = 2.98 %

Nous observons l'effet "spcimen" attendu, mais pas d'effet "jour". Avec la prcision
amliore, nous constatons prsent une lgre interaction jour X spcimen (p = 0.044).
L'examen des donnes nous montre que cette interaction devrait tre principalement due aux
chantillons blanc, peut-tre cause d'une oxydation artefactuelle en cours de stockage
(l'tendue de variation des donnes varie de 0.83-1.03, jour 1; 0.88-1.12, jour 2; 0.87-1.33,
jour 3; 1.08-1.24, jour 4; n = 3).

Figure 3.3-14 : Relation entre le contenu en 8-oxodG et le niveau de stress (temps
d'irradiation UVC en prsence de 20 mM H
2
O
2
). Les points reprsentent la
moyenne (n = 12, except pour le temps 2 min, o n = 3) et les barres l'cart
talon.
0
10
20
30
40
0 4 8 12 1
Temps d'irradiation (min)
8
-
o
x
o
d
G

/

1
0
5

d
G
6

190
La Figure 3.3-14 met en vidence la prcision par rapport aux niveaux de 8-oxodG induits
par les conditions de stress appliques.
3.3.4.4 Discussion et conclusion
A notre connaissance, jusqu' ce travail, pratiquement aucune donne n'a t publie quant
la prcision du dosage de la 8-oxodG. Les seules donnes disponibles, obtenues sur des
chantillons non stresss, font tat d'une variation d'environ 14 %, mais aucune analyse
statistique n'a t entreprise (Takeuchi et al., 1994).
Le dosage de la dG n'est influenc par aucun des facteurs tudis, "spcimen" (niveau de
stress) et "jour d'analyse". D'autre part, le dosage de la 8-oxodG permet de diffrencier les
niveaux de stress des diffrents chantillons sans influence du facteur "jour d'analyse". Le
calcul des rsultats en "8-oxodG par 10
5
dG" permet de rduire la variabilit d'extraction de
l'ADN et de ramener la prcision un excellent niveau (CV %, ~ 3 %). Si nous considrons
que le plus gros de la variation rencontre dans l'analyse des bases provient de l'extraction de
l'ADN, une variation globale de 7 9 % dans le recouvrement de l'ADN peut tre estime, le
taux de recouvrement tant indpendant du niveau de stress et du jour d'analyse.
Ce travail indique galement que les nombreuses modifications de l'ADN induites par un
traitement agressif, oxydation et irradiation UVC, n'empchent pas la digestion par la
nuclase P1. Ce rsultat est important car , lorsque nous avons commenc cette tude,
l'efficacit de cette enzyme tait frquemment mise en doute dans la littrature, notamment
lors de la controverse ne de la discordance entre les rsultats obtenus par HPLC-EC et GC-
MS (Cadet et al., 1998; Dizdaroglu, 1998; Dizdaroglu et al., 2001).
3.3.5 Sensibilit
3.3.5.1 Dfinition
La sensibilit est la capacit de la mthode ragir de faibles variations de la
concentration en analyte. Il s'agit de la variation minimale qu'il faut imposer la grandeur
dterminer (la concentration en analyte) pour obtenir une variation significative du signal
mesur (Caporal-Gautier et al., 1992).
3.3.5.2 Protocole
La sensibilit a t estime partir des rsultats bruts de l'tude de prcision.
Une sensibilit en rapport avec les mesures de routine a t dtermine, c'est--dire que le
signal brut du dtecteur a t d'abord corrig par le signal d'un talon externe de 8-oxodG
(moyenne de 4 injections); ceci permet de moduler les variations jour jour de la rponse
191
lectrochimique et de tenir compte de la passivation de l'lectrode. Comme il est impossible
d'introduire des taux connus de 8-oxodG dans l'ADN cellulaire, la grandeur "concentration en
analyte" a t estime partir des donnes du premier jour de l'tude de prcision; nous avons
ainsi considr que le premier essai triplicate dosait de manire exacte les diffrentes
concentrations. Cette supposition raisonnable est conforte par la bonne rptabilit du
processus analytique.
3.3.5.3 Calcul
La courbe "rponse du dtecteur" en fonction de "concentration"et la variabilit totale ont
t calcules partir des donnes des 3 jours suivants pour estimer la sensibilit; celle-ci est
calcule partir de la pente (b) de la courbe et de l'cart talon du signal (S
E
) estim partir
d'une analyse de variance identique celle de l'tude de prcision.
La sensibilit, la variation minimale de concentration en analyte qui donne une variation
dtectable du signal, est alors calcule :
Sensibilit =
b
SE

Une sensibilit statistiquement significative, c'est--dire la variation minimale de
concentration en analyte qui donne une variation statistiquement significative du signal, est
alors calcule en accord avec (Caporal-Gautier et al., 1992) :
Sensibilit = | |
b
S
. 2 . t t
E
2 / 1
1) - N ; 1 ( 1) - N /2; 1 ( +
3.3.5.4 Rsultats
3.3.5.4.1 Donnes
Le Tableau 3.3-31 prsente les rsultats bruts qui ont permis de calculer la sensibilit. Les
Figures 3.3-15 et 3.3-16 prsentent les courbes "signal" en fonction de "concentration".
192
Tableau 3.3-31 : Rsultats bruts de l'tude de prcision (Concentrations estimes partir du
jour 1; Signaux obtenus aux dtecteurs, jours 2 4)

Concentration
(pmoles inj)
Jour
dG
(signal)
8-oxodG
(signal)
8-oxodG
(signal corr. par un
talon externe
(a)
)
8-oxodG
(signal corr. par un
talon externe
et par dG)
0.16 2 143044 15726 0.131 9.179E-07
143581 14230 0.119 8.275E-07
164259 14162 0.118 7.198E-07
3 167586 14396 0.088 5.227E-07
167323 21927 0.133 7.974E-07
104625 9576 0.058 5.570E-07
4 147010 15075 0.094 6.422E-07
137576 16611 0.104 7.561E-07
116682 13718 0.086 7.362E-07
3.38 2 114266 108534 0.906 7.930E-06
110468 103457 0.864 7.819E-06
122909 118276 0.987 8.034E-06
3 123541 164433 1.001 8.099E-06
121629
114731
161643 0.984 8.086E-06
152622 0.929 8.094E-06
4 82851 117901 0.738 8.911E-06
116056 160064 1.002 8.637E-06
125848 163903 1.026 8.155E-06
5.25 2 111911 176449 1.473 1.316E-05
115390 183378 1.531 1.327E-05
120901 183774 1.534 1.269E-05
3 115209 255697 1.556 1.350E-05
118089 258643 1.574 1.333E-05
117940 269302 1.639 1.389E-05
4 105604 206213 1.291 1.223E-05
111533 234511 1.468 1.317E-05
113312 238584 1.494 1.318E-05

(a)
Le standard externe est une solution aqueuse de 8-oxodG injecte 4 reprises chaque jour
193
Tableau 3.3-31 (Suite) : Rsultats bruts de l'tude de prcision

Concentration
(pmoles inj)
Jour
dG
(signal)
8-oxodG
(signal)
8-oxodG
(signal corr. par un
talon externe)
8-oxodG
(signal corr. par un
talon externe
et par dG)
6.69 2 123092 245198 2.047 1.663E-05
119317 235610 1.967 1.649E-05
123683 239693 2.001 1.618E-05
3 112059 302788 1.842 1.644E-05
125767 356388 2.169 1.724E-05


109839 294553 1.792 1.632E-05
4 121870 327214 2.049 1.681E-05
117161 304624 1.908 1.628E-05
120364 319785 2.002 1.664E-05


Figure 3.3-15 : Signal corrig par l'talon externe en fonction de la quntit injecte de
8-oxodG
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Quantit injecte (pmoles)
S
i
g
n
a
l

c
o
r
r
i
g


p
a
r
l
e

s
t
a
n
d
a
r
d

e
x
t
e
r
n
e

194
Figure 3.3-16 : Signal corrig par l'talon externe et par le signal de dG en fonction de la
quantit injecte de 8-oxodG
0.0E+00
2.0E-06
4.0E-06
6.0E-06
8.0E-06
1.0E-05
1.2E-05
1.4E-05
1.6E-05
1.8E-05
2.0E-05
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Quantit injecte (pmoles)
S
i
g
n
a
l

c
o
r
r
i
g


p
a
r
l
e

s
t
a
n
d
a
r
d

e
x
t
e
r
n
e

e
t

p
a
r

d
G

3.3.5.4.2 Calcul de la sensibilit
La sensibilit a t calcule en exprimant le paramtre dterminer, la concentration, en
8-oxodG et en 8-oxodG par 10
5
dG; l'influence de la correction du signal mesur par l'talon
de dG, dtermin en dtection UV, a galement t envisage (Tableau 3.3-32).


Tableau 3.3-32 : Sensibilit du processus analytique entier

Rgression "concentration" en fonction du
"signal" (n = 36)
Expression de la
concentration (x)
Variance r Pente
Sensibilit
Sensibilit
statistiquement
significative
8-oxodG (pmoles)
Le signal (y) est :
8.03 x 10
-3
0.285 0.31 pmoles 8-oxodG 1.65 pmoles 8-oxodG
8.76 x 10
-14
0.9963 2.44 x 10
-6
0.12 pmoles 8-oxodG 0.64 pmoles 8-oxodG
8-oxodG par 10
5
dG
Le signal (y) est :



8.03 x 10
-3
0.9833 0.042 2.13 8-oxodG
par 10
5
dG
11.15 8-oxodG
par 10
5
dG
8.76 x 10
-14
0.9970 3.61 x 10
-7
0.82 8-oxo-dG
par 10
5
dG
4.31 8-oxodG
par 10
5
dG
0.9829

corrig par l'talon
externe (8-oxodG)
corrig par l'talon
externe (8-oxodG) et
l'talon interne (dG)
corrig par l'talon
externe (8-oxodG)
corrig par l'talon
externe (8-oxodG) et
l'talon interne (dG)
195
3.3.5.5 Discussion et conclusion
La sensibilit statistiquement significative reprsente 1.65 pmoles de 8-oxodG injectes,
ce qui correspond 11.15 8-oxodG par 10
5
dG; lorsque le signal lectrochimique est corrig
pour le recouvrement de l'ADN en utilisant dG comme talon interne, la sensibilit est
sensiblement rduite, passant 0.64 pmoles de 8-oxodG injectes, ce qui correspond 4.31
8-oxodG par 10
5
dG.
3.3.6 Seuils de dtection et de quantification
3.3.6.1 Dfinitions
Le seuil de dtection est la plus petite quantit d'une substance examiner dans un
chantillon pouvant tre dtecte, mais non quantifie comme une valeur exacte. Le seuil de
dtection est gnralement un paramtre des essais limites.
Le seuil de quantification est la plus petite quantit d'une substance examiner dans un
chantillon pouvant tre dose dans les conditions exprimentales dcrites avec une prcision
et une exactitude dfinies (Caporal-Gautier et al., 1992; Commission of the European
Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
Ces paramtres n'ont pas t investigus pour la dG; en effet, les quantits dtecter dans
les chantillons sont toujours fort importantes, largement suprieures aux limites analytiques.
3.3.6.2 Rsultats et discussion
La limite infrieure de dtection de la 8-oxodG a t dfinie classiquement comme la
quantit injecte donnant un rapport signal-bruit de 3, soit 0.05 pmoles ou 50 fmoles (Figure
3.3-17). La limite infrieure de quantification (n = 8; CV = 20 %) a t estime au niveau du
signal le plus bas que nous ayons obtenu dans un chantillon non stress, soit 0.1 pmoles ou
100 fmoles.
Bien que ces donnes soient du mme ordre que la plupart de celles renseignes par les 28
laboratoires participant au projet ESCODD SCODD, 2001) ou celles

52
(Tableau 3.3-33) (E
rencontres dans la littrature [limite de dtection, 20 (Floyd et al., 1986; Laws et Adams,
1996), 40 (Schilderman et al., 1993), 70 (Rosen, 1997) et 250 (Herbert et al., 1996) fmoles],
certains auteurs prsentent des limites impressionnantes qui nous sont tout fait hors
d'atteinte [1.76 fmoles dtectes avec (Adachi et al., 1995) ou sans (Nakae et al., 1995)
algorithme de rduction du bruit de fond].

52
ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage): projet europen de comparaison
inter-laboratoires des mthodes de dosage de la 8-oxodG (cf 3.3.9)
196
Figure 3.3-17 : Trac typique obtenu pour une quantit de 50 fmoles de 8-oxodG.
-0.15
-0.1
-0.05
0 5 10
Temps (min)
S
i
g
n
a
l

(
n
A
)
8-oxo-dG


Tableau 3.3-33 : Limites de dtection telles que renseignes par les diffrents laboratoires
participant au projet ESCODD.

Mthode analytique Limite de dtection de la
8-oxodG
Dfinition de la limite
CLHP- ampromtrie 50 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- ampromtrie 30 fmoles
CLHP- ampromtrie 1 nM
CLHP- coulomtrie 50 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 30 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 75 fmoles Rapport signal / bruit > 5
CLHP- coulomtrie 0.001 M Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 16 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 20 fmoles Un pic clairement spar de la ligne de base
CLHP- coulomtrie <1 nM Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 1.25-2.5 fmoles
(en fonction du bruit)
Rapport signal / bruit > 5

197
Tableau 3.3-33 (suite): Limites de dtection telles que renseignes par les diffrents
laboratoires participant au projet ESCODD.

Mthode analytique Limite de dtection de la
8-oxodG
Dfinition de la limite
CLHP- coulomtrie 35 fmoles Rapport signal / bruit > 2
CLHP- coulomtrie 10 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 0.1 nM Rapport signal / bruit > 5
CLHP- coulomtrie 100 fmoles Dernier point de la courbe de calibration.
Rapport signal / bruit satisfaisant
CLHP- coulomtrie 50 fmoles %CV de rplicats < 10%
Ecart statistiquement significatif entre 2
concentrations (p<0.05)
CLHP- coulomtrie 0.1 nM Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 18 fmoles Bas sur rapport signal / bruit
CLHP- coulomtrie 60 fmoles Un pic clairement spar de la ligne de base
CLHP- coulomtrie 15 fmoles Rapport signal / bruit > 5
CLHP- coulomtrie 100 fmoles Rapport signal / bruit > 1.2
CLHP- coulomtrie 20 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP- coulomtrie 50 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP-MS/MS 3.5 fmoles Rapport signal / bruit > 3
CLHP-MS/MS 2.5 fmoles Rapport signal / bruit > 3
GC/MS 50 fmoles
GC/MS n.a. Rapport signal / bruit > 2
GC-MS 1 fmoles Rapport signal / bruit > 3

3.3.7 Robustesse
3.3.7.1 Dfinition
La robustesse d'une procdure d'analyse est sa capacit rendre des rsultats exacts en
prsence de faibles changements de conditions exprimentales susceptibles de se produire
dans l'utilisation de cette procdure (Caporal-Gautier et al., 1992; Commission of the
European Communities - Directorate General Industry, 1993; USP XXIII, 1994).
3.3.7.2 Protocole
La robustesse a t classiquement tudie par un plan factoriel en testant 4 paramtres
(Caporal-Gautier et al., 1992). Une variation exprimentale (2 niveaux) des paramtres
susceptibles de varier en routine et qui pourraient s'avrer critiques a t ralise : (i) le
contenu en 8-oxodG de l'ADN (cellules exposes 20 mM H
2
O
2
sous irradiation UVC de 5 et
15 min); (ii) le contenu en mthanol de la phase mobile de CLHP (7.0 et 8.0 %); (iii) la
198
temprature de la colonne chromatographique (25C et 35C); et (iv) la quantit d'ADN
digre et injecte (ADN de 10
7
et de 2 x 10
7
cellules). Une srie de 8 analyses a permis de
tester ces 4 paramtres, l'interaction triple des 3 premiers paramtres tant affecte au
quatrime (aliasing). Les intervalles de confiance sont alors calculs pour la valeur "effet du
paramtre" un niveau de probabilit de 0.05. Si cet intervalle de confiance contient zro,
l'effet de ce paramtre ou de cette interaction est considr comme nul. Si zro est l'extrieur
de l'intervalle, le rsultat de la mesure est influenc par la variation des paramtres en cause.
3.3.7.3 Rsultats
Le Tableau 3.3-34 prsente les rsultats de l'tude de robustesse.

Tableau 3.3-34 : Robustesse du procd analytique

Echantillon Paramtre Interactions
Rsultat
8-oxodG
/ 10
5
dG
(a)
B
(b)
C
(c)
D
(d)
A X B A X C B X C
1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 13.70
2 1 -1 -1 1 -1 -1 1 49.91
3 -1 1 -1 1 -1 1 -1 14.73
4 1 1 -1 -1 1 -1 -1 51.85
5 -1 -1 1 1 1 -1 -1 15.72
6 1 -1 1 -1 -1 1 -1 53.05
7 -1 1 1 -1
8 1
17.80

-1 -1 1 13.91
1 1 1 1 1 1 45.66
Effet du
paramtre
-0.78 -0.23 -0.81 -0.59 -0.53 -1.52
Intervalle de
confiance
(e)

de :
:


1.79
33.82


-16.80
15.24


-16.25
15.78


-16.83
15.21


-16.60
15.43


-16.55
15.49


-17.54
14.50

NS NS NS
Signification
statistique
(e)
S NS NS NS
A




(a)
Niveau de stress (H
2
O
2
+ UVC pendant 5 et 15 min)
(b)
% de mthanol dans la phase mobile (7 et 8 %)
(c)
t de la colonne (25 et 35C)
(d)
ADN de 10
7
et de 2 x 10
7
cellules
(e)
p = 0.05
199
3.3.7.4 Discussion et conclusion
Le seul paramtre significatif est en fait le "niveau de stress"; la mthode est donc robuste
face de faibles variations dans les paramtres tudis, savoir le contenu en mthanol de la
phase mobile, la temprature de la colonne et la quantit d'ADN digre.
3.3.8 Stabilit des analytes
3.3.8.1 Dfinition
Pour les biomarqueurs du stress oxydatif, un paramtre de validation supplmentaire
s'impose; il convient en effet de dmontrer qu'il n'y a pas une production artefactuelle de ce
marqueur en cours de stockage, d'extraction et d'analyse.
3.3.8.2 Protocole
Une dmonstration complte exigerait que le vritable taux de base de la 8-oxodG soit
tabli par une mthode dfinitive, qui reste un dfi analytique considrable et l'objet de
nombreuses controverses (Collins et al., 1996; Collins et al., 1997a; Cadet et al., 1998;
Dizdaroglu, 1998; Halliwell et Gutteridge, 1999). Nos avons donc tudi les sources possibles
d'artefact oxydatif de notre mthode.
Le processus analytique, relativement long, ne peut tre ralis en une seule journe de
travail; nous avons donc tudi les points d'arrt possibles dans le processus ainsi que leur
effet sur le taux en dG oxyde : (i) stockage entre prparation de l'chantillon et extraction de
l'ADN; (ii) stockage entre extraction de l'ADN et digestion enzymatique; et (iii) stockage
entre digestion enzymatique et analyse CLHP.
3.3.8.3 Rsultats
Le Tableau 3.3-35 dmontre l'effet de suspension du processus analytique sur les taux
mesurs en 8-oxodG. Il s'avre qu'un stockage prolong chacune des diffrentes tapes tend
augmenter l'oxydation artefactuelle de la dG. Soulignons notamment que le stockage entre
digestion enzymatique et chromatographie ne doit pas tre prolong, mme 20C.
La chromatographie peut cependant tre ralise le jour de digestion avec une excellente
stabilit (Tableau 3.3-36).
200
Tableau 3.3-35 : Influence du stockage diffrents points du processus analytique
Conditions de stockage
Stockage avant
extraction
Stockage entre
extraction et
digestion
Stockage entre
digestion
enzymatique et
chromatographie
Echantillon
Tampon H
-20C
Tampon TE
4C
Mlange de
digestion
-20C
8-oxodG
par 10
5
dG
(tendue des
valeurs; n = 3)
une nuit une nuit non
(a)
0.83 1.03
une nuit une nuit 1 jour 0.69 0.95
une nuit une nuit 3 jours 1.48 3.19
une nuit 2 jours non 0.88 1.12
une nuit 4 jours non 1.00 1.35
2 jours une nuit non 0.87 1.33
2 jours 4 jours non 1.08 1.27
6 jours une nuit non 1.81 2.13
Cellules non
stresses
8 jours une nuit non 1.65 2.09
une nuit une nuit non 24.9 25.3
une nuit 2 jours non 25.6
(b)
2 jours une nuit non 24.1 25.5
2 jours 4 jours non 24.6 25.8
6 jours une nuit non
8 jours 25.7 26.7
25.1 26.4
Cellules stresses
(5 min H
2
O
2
+
UVC)
une nuit non

(a)
"non" signifie que la chromatographie est ralise le jour de la digestion, avec stockage sur glace, dans l'obscurit.


(b)
Une seule valeur disponible
Tableau 3.3-36 : Influence du stockage entre digestion enzymatique et chromatographie.
Donnes d'une seule exprience reprsentative.

talon aqueux
(rapport du signal 8-oxodG / dG)
Echantillon stress
(rapport du signal 8-oxodG / dG)
Temps entre la fin
de la digestion
enzymatique et
l'injection (h)
Stockage 4C Stockage 25C Stockage 4C Stockage 25C
8.59 8.59 1.83 1.83
2 8.65 8.46 1.85 1.86
4

8.56 8.55 1.82 1.80
6 8.50 8.57 1.84 1.82
8 8.74 8.70 1.82 1.87
Moyenne 8.61 8.57 1.83 1.84
cart talon 0.09 0.08 0.01 0.03
CV (%) 1.05 0.99 0.67 1.58
0
201
Aprs extraction, prcipitation et lavage, les fibres d'ADN doivent tre compltement
dissoutes dans le tampon TE avant digestion enzymatique; cette tape exigeant plusieurs
heures, l'extrait peut tre laiss 4C une nuit, ce qui permet la chromatographie le jour de la
digestion. Ce stockage ne devrait toutefois pas tre prolong au-del de 2 jours.
Alors que l'analyse par elle-mme (extraction, digestion et chromatographie) peut tre
aisment ralise en 2 jours complets, un plan exprimental exige souvent que les chantillons
biologiques soient stocks un certain temps avant analyse. Le Tableau 3.3-35 montre qu'un
stockage de plus de 2 jours 20C sous tampon H augmente le taux en 8-oxodG
d'chantillons non stresss. Une tendance similaire est galement observe dans les
chantillons stresss, mais un degr moindre. Des essais de stockage 80C avec addition
d'antioxydants des doses qui rduisent drastiquement le taux de 8-oxodG dans l'analyse de
l'ADN de fibroblastes (Kvam et Tyrrell, 1997a, b) (tampon HM, contenant glutathion,
dferoxamine et histidine) n'ont pas amlior la stabilit (aprs 3 4 jours de stockage, le taux
de 8-oxodG par 10 dG tait de 1.6 0.3; n = 7; une forte augmentation du niveau de base,
compar aux donnes du Tableau 3.3-35).
5
Nous avons alors ralis que toutes ces donnes ont t obtenues lors de l'addition
"brutale" de tampon de stockage aux cellules compactes par centrifugation. Cette addition
provoque une mise en suspension partielle et une dispersion certaine des cellules dans le
tampon. Un essai de dispersion complte des cellules dans le tampon par agitation au vortex
et stockage 80C montre une oxydation svre en seulement une nuit; de plus, cet effet ne
peut tre empch par les antioxydants (Tableau 3.3-37). Cependant, lorsque des cellules
compactes sont dlicatement superposes d'un tampon HM et stockes 80C, des niveaux
sensiblement rduits en 8-oxodG peuvent tre mesurs (Tableau 3.3-37). La meilleure
protection pour l'ADN semble donc de demeurer empaquet dans les cellules.
53
Bien que nous n'ayons pas test d'autres variations dans la composition de ce tampon,
celui-ci peut probablement tre optimis; notre connaissance, la littrature ne fournit aucune
indication sur ce point.

53
Lors de la dispensation du tampon, le jet plus ou moins vigoureux de la micro-pipette atteint le culot
202
Tableau 3.3-37 : Influence du stockage entre prparation de l'chantillon et extraction.

Stockage pr-extraction
(a)

Traitement avant
conglation
Conditions de
conglation
Temps

8-oxodG
par 10
5
dG
(tendue des valeurs)

n
une nuit Mise en suspension
dans le tampon de
stockage
Tampon HM
(b)
-80C une nuit 2.31 2.50 3
une nuit 0.42 1
2 jours 0.28 0.70 2
6 jours
2
9 jours
0.33 0.47
0.53 0.67 2
7 jours 0.61 0.75
0.23 0.45 2
Compactage par
centrifugation et
superposition
dlicate du tampon
de stockage
Tampon HM
(b)
-80C
15 jours 2
Tampon H -80C 2.29 2.78 3


3.3.8.4
(a)
Entre extraction et digestion, stockage 4C sous tampon TE, une nuit; chromatographie le mme jour que la
digestion enzymatique avec stockage intermdiaire sur glace dans l'obscurit
(b)
Le tampon HM est le tampon H supplment de 4 mM de glutathion rduit, de 2 mM de dferoxamine et de
8 mM d'histidine
Discussion et conclusion
3.3.8.4.1 Formation artefactuelle de la 8-oxodG pendant le stockage
Une conservation prolonge des chantillons chacune des tapes du processus est
susceptible d'entraner l'oxydation de la dG et reprsente probablement une source majeure de
problmes; remarquons que la plupart des articles publis ne mentionnent ni le plan
d'excution du travail, ni les temps ou conditions de conservation des chantillons.
La gnration de 8-oxodG partir du stockage avait dj t dmontre (Wilson et al.,
1993; Helbock et al., 1998), mais une squence d'oprations susceptible de rsoudre le
problme n'a pas t tudie. La chlation des mtaux par la dferoxamine a t propose
pour augmenter la stabilit des nuclosides digrs (Shigenaga et al., 1994), mais aucune
donne n'est disponible au-del de 48 h.
Le plan exprimental propos dans ce travail, pratique, garantit une minimisation effective
des artefacts oxydatifs.
3.3.8.4.2 Formation artefactuelle de la 8-oxodG pendant le traitement des chantillons
Un travail considrable est encore requis pour clarifier les taux de 8-oxodG dans des
chantillons non stresss ainsi que les mcanismes de sa formation en cours de travail et de
stockage. Des oprations triviales, commises par inadvertance, induisent la formation de
8-oxodG, ce qui peut tre difficile mettre en vidence. Nous avons pu, par exemple,
observer une contamination des solutions digres par les ions mtalliques relargus par
203
l'aiguille d'une seringue de chromatographie ge; ceci rsulte en une augmentation rapide,
continue et extrmement svre de la 8-oxodG que nous avons pu suivre par injections
rptes de la solution.
Une tude rcente a conclu que l'oxydation de la dG en cours de travail pouvait tre
rduite par (i) l'utilisation de chimiques taux faibles en mtaux de transition; (ii) un travail
basse temprature; (iii) des temps d'incubation limits; et (iv) l'addition d'un antioxydant de
type nitroxyde toutes les tapes. Les 3 premires recommandations sont dj appliques
dans notre protocole qui rsulte en niveaux de blanc comparables ceux atteints dans cette
tude (Hofer et Moller, 1998).
Comme nous l'avons vu dans notre discussion des tests bass sur les essais FPG ( 3.1), il
est possible que toutes les mthodes d'extraction induisent une oxydation artefactuelle svre.
Soulignons cependant que si les techniques glycosylases approchent les taux cellulaires rels,
ceux-ci seront nettement infrieurs aux performances de dtection des mthodes
lectrochimiques actuelles, qui sont cependant considrables. Seules les mthodes LC-MS-
MS peuvent esprer approcher de telles valeurs, mais condition de disposer de quantits
considrables de matriel biologique (Ravanat, 2001) (~ 250 g d'ADN par injection, soit 5
10 fois plus que dans notre procdure).
Signalons qu'une mthode originale vient d'tre dveloppe (Douki et al., 2001), qui
permet d'introduire un vritable talon interne de 8-oxodG dans l'ADN cellulaire. Le
traitement des cellules par un endoproxyde synthtis base d'isotope
18
O
2
permet de former
de la 8-oxodG marque isotopiquement, distinguable en spectromtrie de masse de la
8-oxodG forme artefactuellement. A l'aide de cet talon interne, les mthodes d'extraction de
l'ADN cellulaire vont enfin pouvoir tre compares de manire objective; nous collaborons
cette tude programme pour janvier 2002.
3.3.9 Validation inter-laboratoires
Nous participons au programme ESCODD, dans le cadre du programme "Quality of life
and management of living ressources (1998 to 2002)"; contrat d'action concerte N QLK1-
1999-00568; coordinateur, Dr A. Collins, Rowett Research Institute, U.K. Il s'agit d'une
comparaison inter-laboratoire des mthodes chromatographiques dveloppes pour l'analyse
de la 8-oxodG, dans le but d'tablir le taux basal rel de l'ADN en ce nuclotide oxyd. Ce
programme en cours nous permet de comparer les rsultats obtenus par notre mthode ceux
d'autres quipes.
204
3.4 DISCUSSION ET CONCLUSION
3.4.1 Intrt du dosage de la 8-oxodG
Comme nous l'avons vu dans la Section 1.2, la 8-oxodG, biomarqueur ubiquiste du stress
oxydatif au niveau de l'ADN, est forme la fois par les radicaux hydroxyles, les oxydations
mono-lectroniques, l'oxygne singulet et le peroxynitrite.
3.4.1.1
Le Tableau 3.4-1 (Kasai, 1997) donne une ide des trs nombreuses tudes ralises sur
l'induction de ce marqueur. Nous n'avons gure la place de dvelopper ici toutes les tudes qui
se sont ajoutes depuis, mais nous avons pu compiler une revue exhaustive des effets pro-
oxydants des radiations lumineuses au niveau de la guanine (Duez et al., 2001) qui sera
prsente plus avant.
Le taux d'excrtion urinaire de la 8-oxodG est mesur dans des tudes de biomonitoring
qui tentent d'valuer le stress oxydatif global de l'organisme humain en rponse diffrentes
conditions environnementales (Shigenaga et al., 1989; Loft et Poulsen, 1998; Poulsen et al.,
1998)
Conformation de la 8-oxodG
3.4.1.1.1 En solution aqueuse
Dans sa forme monomre en solution aqueuse, le produit majeur d'oxydation de la guanine
prsente 4 tautomres principaux dont la forme (6,8-dicto-) est prdominante (Figure 3.4-1 ,
forme 8OG1). Afin de reflter cette ralit, le nom "8-hydroxy-2'-dsoxyguanosine (8-
OHdG)" initialement donn au nucloside oxyd tombe en dsutude. Les calculs
thermodynamiques ont montr que ces transitions tautomres sont bien des processus permis
et indiquent la squence suivante de stabilit : 8OG1 > 8OG2 >>> 8OG3 > 8OG4 (Gu et
Leszczynski, 1999). Les donnes obtenues en RMN montrent la prsence d'environ 15 % de
tautomres mineurs, principalement la forme 8OG2 pour laquelle une
implication dans le msappariement de base (cf 1.1.2.2) et l'induction de mutations pourrait
tre galement concevable (Venkateswarlu et Leszczynski, 1998; Gu et Leszczynski, 1999).
3.4.1.1.2 Dans l'ADN
Une tude RMN n'a pas montr de modifications structurales globales lors de l'inclusion
de 8-oxodG:dC dans un dodcanuclotide auto-complmentaire. La guanine prend, comme en
solution aqueuse, la forme (6,8-dicto-). La configuration la plus stable de 8-oxodG dans la
paire de bases est en anti et l'appariement 8-oxodG:dC se fait en conformation Watson-Crick
205
Tableau 3.4-1 : Quelques conditions capables d'induire la 8-oxodG
(Etudes sur animaux et tudes cliniques)

Espce animale Organe Traitements induisant la 8-oxodG
Rat rein bromate de potassium, nickel, cuivre, cobalt, nitrilo-triactate de
fer, adriamycine, streptozotocine, benzo[a]pyrne
foie cuivre, cobalt, ciprofibrate, simfibrate, di(2-thylhexyl)phtalate,
di(2-thylhexyl)adipate actoxime, mnadione, acides
perfluorooctanoque et perfluorodcanoque, nitroalkanes,
cyclopentanone oxime, aflatoxine B1, 2,3,7,8-ttrachlorodibenzo-
p-dioxine, 2-amino-3[8-dimthylimidazo-4,5-f]quinoxaline, N,N'-
diphnyl-p-phnylnediamine, mlange de pesticides,
N-nitrosodithylamine
glande mammaire

dimthylhydrazine
poumon

acides gras insaturs
pancras 4-hydroxyaminoquinoline 1-oxyde
colon
silice
urine 2-nitropropane, paraquat, hydroquinone
Souris foie rayons X, lutoskyrine, fer, aroclor, azidothymidine, ttrachloro-
p-hydroquinone, pentachlorophnol, phnytone, haloactate,
poumon nitrosamine, fume de diesel,
peau esters de phorbol, UV, 7,12-dimthylbenz[a]anthracne
moelle osseuse benzne
Poisson foie crosotes, nitrofurantone, H
2
O
2
, sdiments contamins
Hamster rein dithylstilboestrol, estradiol
foie estradiol


Etudes chez l'homme Organe Conditions induisant la 8-oxodG
foie hpatite chronique
rein carcinome rnal
poumon et
muqueuse orale
cigarette
estomac Helicobacter pylori
sein cancer
cerveau vieillissement, Parkinson,
srum et/ou
cellules sanguines
cigarette, radiations ionisantes, amiante, maladie auto-immune,
exercice, charbon, vieillissement, anmie de Fanconi, diabte
urine maladie granulomateuse chronique, vieillissement, cigarette,
exercice, benzne, fume de diesel, fibrose kystique, cancer, silice
sperme acide ascorbique, cigarette

D'aprs une revue par (Kasai, 1997)
206

Figure 3.4-1 : Les 4 tautomres principaux de la guanine en solution aqueuse


H
2
N
HN
N
N
H
H
N
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H
2
N
HN
N
O
OH
H
2
N N
H
OH
OH
N
H
N
H
2
N N
H
H
N
OH
O
N
N
N
8OG1 (85 %) 8OG3
8OG2 8OG4
N
N


D'aprs (Oliveira Brett et al., 2000)

via 3 liens hydrognes (Figure 3.4-2) (Oda et al., 1991). Des simulations informatiques ont
galement montr que la 8-oxodG peut tre accommode dans une squence de bases normale
(Ninaber et Goodfellow, 1998).
Le mme travail men sur une paire 8-oxodG:dA montre que la 8-oxodG existe sous forme
de 2 tautomres qui sont en quilibre et s'changent lentement. Comme prcdemment, le
composant majeur est la forme (6,8-dicto-) mais la base est ici en configuration syn. Celle-ci,
probablement favorise par l'encombrement strique entre base et glucide et par une rpulsion
de charges, permet la formation de liens hydrognes (Figure 3.4-2) favorables une paire de
bases qui s'empile sans problme dans l'hlice (Kouchakdjian et al., 1991; Ninaber et
Goodfellow, 1998). Il semble que la conformation de la base vis--vis du groupement
glucidique dpend de nombreuses interactions locales qui favorisent un basculement (flip) de
la base via les liens hydrognes (Ninaber et Goodfellow, 1998).
Les calculs et l'exprience ont montr que les squences 5'-dGdG-3' taient
particulirement sujettes l'oxydation, le dG situ en 5' d'un autre dG tant le plus facilement
oxyd. Il a mme t suggr que les attaques oxydantes "glisseraient" le long de la chane
d'ADN pour aboutir sur ces squences. Cet effet serait d l'empilement de dG et des
interactions lectrostatiques qui modifieraient sensiblement le potentiel d'ionisation de la base
en 5', l'orbitale molculaire occupe la plus haute, riche en nergie, se concentrant sur cette
base (Prat et al., 1998). Le calcul montre galement que la 8-oxodG d'une squence
5'-(8-oxodG)dG-3' serait plus facile oxyder que la 8-oxodG isole (Prat et al., 1998).
207
Figure 3.4-2 : Appariement normal 8-oxodG:dC (anti-anti) et
msappariement 8-oxodG:dA (syn-anti)

N
NH
N
N
N
N
O
O
N
H
H
N
N
O
O
N
H
H
N
N
N
H
H
N
H
H
O
H
N
N
N
N
H
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H
H
dC
8-oxodG dA
5'
3'
5'
3'
8-oxodG
H


3.4.1.2 Rparation et mutagnicit de la 8-oxodG
3.4.1.2.1 Rparation
Les tudes sur E. coli ont permis de mettre en vidence un systme de rparation de la
8-oxodG par excision de bases (BER, cf 1.1.5.2). Ce mcanisme repose sur 2 protines
(Figure 3.4-3) dont les homologues ont t identifis chez les eukaryotes : (i) une 8-oxodG
glycosylase/AP lyase, clone chez E. coli (FPG)
54
, la levure (yOGG1) et l'homme (hOGG1)
55
;
et (ii) une adnine-DNA glycosylase/AP lyase qui limine les adnines msapparies (dA:dG,
dA:8-oxodG et dA:dC), MutY, dont une activit analogue a t mise en vidence chez
l'homme (hMutY dans les mitochondries et protine non identifie dans le noyau) (Boiteux et
Radicella, 1999; Le Page et al., 1999). Des donnes rcentes montrent cependant que la
rparation de la 8-oxodG est nettement moins performante que celle d'autres lsions

54
L'activit principale de FPG s'exerce sur les paires de bases 8-oxodG:dC
55
Curieusement l'enzyme humaine prsente 2 mcanismes ractionnels : (i) une activit glycosylase/lyasique
envers les paires de bases 8-oxodG:dC et une activit glycosylase seule envers les msappariement 8-oxodG:T >
G > A (Bjoras et al., 1997)
208
Figure 3.4-3 : Rparation de la 8-oxodG chez E. coli

(Boiteux et Radicella, 1999)

endognes frquentes (dA:U et dA:site AP) (Cappelli et al., 2000). Chez l'homme, une voie de
rparation alternative a galement t mise en vidence (Jaiswal et al., 1998)
Le mcanisme de rparation par excision de nuclotides (NER, cf 1.1.5.3) est plutt
adapt la rparation d'adduits volumineux qui dforment l'hlice; il est cependant capable de
reconnatre et de rparer de petits adduits comme la 8-oxodG ou les glycols de thymine. Chez
E. coli en tous cas, le NER semble plutt fonctionner en back-up du BER pour la rparation
des guanines oxydes (Le Page et al., 1999). Chez l'homme, il s'agit d'une voie mineure de
rparation de ces lsions (Bohr et al., 1998).
3.4.1.2.2 Mutagnicit
3.4.1.2.2.1 Donnes in vitro
Des ractions d'extensions d'amorces ont permis de montrer que, in vitro, les ADN
polymrases ne sont pas bloques par la 8-oxodG et peuvent incorporer la fois l'adnine et la
cytosine en face d'une guanine oxyde (Tableau 3.4-2). De plus, il semble que la
configuration syn:anti ressemble suffisamment une paire de bases Watson-Crick pour que
l'activit de relecture/excision de pol I et pol III soit incapable de retirer une adnine
msincorpore en face d'une 8-oxodG (Shibutani et al., 1991; Le Page et al., 1998).
Il apparat donc que, en fonction de la polymrase implique, la formation d'une paire de
bases 8-oxodG(syn):dA(anti) puisse provoquer une mutagense en cours de rplication (Le
Page et al., 1998).
209
Le contexte de la squence de bases encadrant la lsion influe sur la rparation et les
msappariements, ce qui commence peine tre envisag; dans certaines squences, la
combinaison d'une rparation inefficace et d'un msappariement important pourrait augmenter
de 100 1000 fois le potentiel mutagne de la 8-oxodG (Hatahet et al., 1998).

Tableau 3.4-2 : Incorporation in vitro de nuclotides en face d'une 8-oxodG

Polymrase tudie Base incorpore (rapport dC/dA)
polymrases associes la rplication
(pol , pol , pol III)
1/200 1/3
Polymrases associes la rparation
(pol , pol I)
4/1 7/1

D'aprs (Shibutani et al., 1991)
3.4.1.2.2.2 Donnes ex vivo
A l'aide de vecteurs plasmidiques, la spcificit et la frquence de mutation de 8-oxodG
ont t tudies chez des procaryotes et des eucaryotes. Les mutations prdominantes sont des
transversions G:C T:A. Cependant, la base oxyde s'est avre faiblement mutagne in
vivo avec, dans chaque cas, une frquence mutationelle infrieure 7 %, ce qui suggre
l'existence de mcanismes intra-cellulaires capables de corriger la lsion (Le Page et al., 1998;
Tan et al., 1999). En fait, chez les mammifres, les cintiques de rparation des paires de
bases 8-oxodG:dA et 8-oxodG:dC sont fort diffrentes; 8-oxodG:dA est rplique avant
rparation alors que 8-oxodG:dC est rpare avant rplication. La rplication de 8-oxodG:dA
peut donc procder avant rparation complte, ce qui se traduit par une incorporation d'un T
en face du A, donc par une transversion G T (Le Page et al., 1999).
3.4.2 Intrt de la mthode valide
A notre connaissance, notre validation du dosage de la 8-oxodG dans l'ADN de cellules en
culture est la premire tude de validation publie pour un biomarqueur du stress oxydatif
(Duez et al., 2000b). Les performances analytiques que nous avons tudies sont la
spcificit, la linarit, l'exactitude, la prcision, la robustesse, la stabilit des analytes et les
seuils de dtection et de quantification.
L'identit et la puret des pics de dG et de 8-oxodG a t contrle dans des chantillons
svrement stresss. Nous avons montr que le niveau de stress ne gne ni l'extraction ni la
digestion enzymatique de l'ADN. Il est prsent acquis que l'expression des rsultats
relativement l'talon interne qu'est la dG amliore significativement la prcision et la
210
sensibilit du dosage. La mthode est robuste vis--vis de petites variations des conditions
chromatographiques et le plan d'excution des oprations propos dans ce travail minimise la
formation artefactuelle de l'analyte. Il reste cependant indispensable que des blanc adquats
soient inclus dans chaque srie de dosages de manire pouvoir dtecter la formation
ventuelle d'artefacts.
3.4.3 Conclusions
La validation des mthodes analytiques, largement reconnue comme le meilleur garde-fou
contre la production de donnes non fiables, devient peu peu une exigence absolue dans de
nombreux domaines. A travers la dtermination de la 8-oxodG, une base modifie qui
prsente un risque mutagne non ngligeable, nous avons illustr dans ce travail les tapes
requises pour appliquer le concept de validation analytique un marqueur du stress oxydatif.
Les limitations de la mthode ont t soulignes, notamment la difficult assurer
l'identit du pic de 8-oxodG aux basses concentrations, la problmatique de la formation
d'artefacts et la dtectabilit "limite" de la mthode (50 fmoles injectes).
En nous basant sur les donnes obtenues, mais en gardant l'esprit les limitations
soulignes, nous concluons que la mthode analytique est des plus fiables. Le dosage de la
8-oxodG par CLHP couple une dtection lectrochimique fournit des donnes consistantes
qui permettent de dtecter dans l'ADN cellulaire de manire sre une augmentation de ce
biomarqueur.
211
4. Rsultats et Discussion :

Photoactivation des porphyrines
endognes et induction de 8-oxodG
212
4.1 INDUCTION DES PORPHYRINES ENDOGENES
Nous avons induit la synthse des porphyrines endognes par incubation des cellules avec
l'acide -aminolvulinique. Comme nous le dtaillons dans le paragraphe ci-dessous ( 4.1.1
), cette mthode, fort utilise dans le cadre de la thrapie photodynamique, permet une
synthse effective des porphyrines en contournant le rtrocontrle ngatif exerc par l'hme.
4.1.1 Gnralits sur les porphyrines
Les porphyrines sont des molcules caractrises par un macrocycle de 20 atomes de
carbone et de 4 atomes d'azote. La nomenclature exacte de cette classe de molcules s'avrant
excessivement complexe, une nomenclature semi-systmatique, base sur une douzaine de
noms triviaux, est toujours accepte (Milgrom, 1997). De petites variations sur le mme cycle
ttrapyrrolique mnent une extraordinaire diversit de molcules.
La fonction principale des porphyrines consiste lier des ions mtalliques qui sont ainsi
au centre d'vnements biochimiques fondamentaux. En effet, de par les modifications de
potentiel redox induites par le ligand porphyrine et son environnement protique, le systme
biologique peut utiliser son profit les proprits redox et de coordination du mtal.
4.1.1.1 Biosynthse de l'hme et des porphyrines
4.1.1.1.1 Voie de biosynthse
Dans les tissus mammifres, la biosynthse de l'hme procde en 8 tapes enzymatiques
distribues entre les mitochondries et le cytosol (Figure 4.1-1).
La premire enzyme, la -aminolvulinate synthase (ALA synthase), catalyse la
condensation de la glycine et du succinylCoA pour former l'acide -aminolvulinique (-ala).
La seconde, la -aminolvulinate dshydratase (ALA dshydratase), catalyse la condensation
de 2 molcules de -ala pour former le porphobilinogne (PBG). Quatre molcules de PBG
s'assemblent pour former le ttrapyrrole uroporphyrinogne III en 2 tapes catalyses
respectivement par l'hydroxymthylbilane synthase (HMB synthase) (condensation tte--
queue de 4 molcules de PBG par une srie de dsaminations pour former un ttrapyrrole
linaire) et l'uroporphyrinogne III synthase (URO synthase)
56
. La cinquime enzyme,
l'uroporphyrinogne dcarboxylase (URO dcarboxylase), catalyse le retrait squentiel des 4
groupements carboxyliques des chanes latrales actates pour former le coproporphyrinogne

56
L'URO synthase catalyse galement, par une voie mineure, la formation de l'isomre uroporphyrinogne I.
Celui-ci est galement un substrat pour l'URO dcarboxylase qui forme alors le coproporphyrinogne I, un
apparent "cul-de-sac" mtabolique.
213
III. Ce compos entre alors dans la mitochondrie o la coproporphyrinogne oxydase (Copro
oxydase) catalyse la dcarboxylation de 2 des 4 acides propioniques en vinyles pour former le
protoporphyrinogne IX. Ce compos est oxyd en protoporphyrine IX (PPIX) par la
protoporphyrinogne oxydase (Proto oxydase) qui enlve 6 atomes d'hydrogne. La
ferrochlatase insre alors dans le cycle un ion ferreux pour former l'hme (Milgrom, 1997;
Desnick, 1999).
4.1.1.1.2 Sites de synthse et rgulation
La moelle osseuse et le foie sont les sites principaux de synthse mais toutes les cellules
de l'organisme sont capables de fabriquer l'hme ncessaire leurs besoins.
Les 8 enzymes agissent de concert, mais le matriel gntique est dispers sur diffrents
chromosomes. L'tape limitante de la synthse se situe au niveau de l'ALA synthase dont 2
formes distinctes, "rythrocytaire" et "non-rythrocytaire", sont encodes par des gnes
spars.
Dans le foie et la plupart des autres tissus, mais pas dans les cellules rythrocytaires, un
rtrocontrle ngatif est exerc par l'hme; celui-ci diminue la stabilit de l'ARN messager
codant pour l'ALA synthase et interfre avec la translocation mitochondriale de la protine.
L'ALA synthase hpatique est rgule de manire coordonne avec la synthse des
cytochromes P450 et ragit aux mmes inducteurs (Kennedy et Pottier, 1992; Desnick, 1999).
Lors de la diffrenciation des cellules rythrocytaires, les activits des enzymes de la
biosynthse de l'hme augmentent de manire coordonne. L'ALA synthase rythrocytaire est
encode sur le chromosome X et exprime plus haut niveau que l'enzyme hpatique. De fait,
dans l'rythrocyte en dveloppement, la rgulation de l'HMB synthase pourrait tre l'tape
limitante. De plus, un mcanisme de contrle spcifique rgule le transport intracellulaire du
fer (Kennedy et Pottier, 1992; Moore, 1993; Desnick, 1999).
4.1.1.2 Les porphyries
Les porphyries sont des affections rsultant de perturbations dans la voie de biosynthse
de l'hme. Elles sont habituellement classes, en fonction du site primaire de surproduction et
d'accumulation des prcurseurs ou des porphyrines elles-mmes, en "hpatiques"
(symptomatologie principalement neuro-viscrale) et "rythropotiques" (avec surtout une
photosensibilisation cutane). Il peut cependant y avoir des traits communs dans certains
types d'affections (Tableau 4.1-1). Les hormones strodes, certains mdicaments et
l'alimentation influencent la voie de biosynthse, prcipitant ou aggravant la svrit de
certaines porphyries. Les porphyries correspondent donc des maladies cogniques, dans
214
lesquelle des facteurs gntiques, physiologiques et environnementaux (le soleil)
interagissent.

Figure 4.1-1 : Voie de synthse des porphyrines



(Desnick, 1999)

215
Tableau 4.1-1 : Classification des porphyries

Type / Porphyrie
Enzyme
dficiente
Mode de
transmission
(a)
Photo-
sensibilit
Symptmes
Neuro-
viscraux
Signes biochimiques
(b)
Porphyries hpatiques Urine Fces
Dficience en -ala
dshydratase
ALA
dshydratase
AR + -ala,
COPRO III
---
Porphyrie intermittente aigu HMB synthase AD + -ala, PBG ---
Coproporphyrie hrditaire COPRO oxydase AD + + -ala, PBG,
COPRO III
COPRO III
Porphyrie variegata PROTO oxydase AD + + -ala, PBG,
COPRO III
COPRO III,
PP IX
Porphyrie cutane tardive URO
dcarboxylase
AD + URO I, 7-
carboxylate
porphyrine
ISOCOPRO
Porphyries rythropotiques
Porphyrie rythropoetique
congnitale
URO synthase AR +++ URO I COPRO I
Protoporphyrie rythropotique Ferrochlatase AD + PP IX


(a)
AR, autosomique rcessive; AD, autosomique dominante; XLR, rcessive lie X.
(b)
-ala, acide -aminolvulinique; PBG, porphobilinogne; COPRO I, coproporphyrine I; COPRO III,
coproporphyrine III; ISOCOPRO, isocoproporphyrine; URO I, uroporphyrine I; PPIX, protoporphyrine IX

D'aprs (del C. Battle, 1993; Desnick, 1999)
Les porphyrinognes, incolores et non fluorescents, sont les intermdiaires
biosynthtiques alors que les porphyrines, l'exception de la PPIX, ne sont que des produits
secondaires qui ont chapp la voie de biosynthse par oxydation irrversible du
porphyrinogne correspondant. Elles ne possdent pas de fonction biologique mais sont
responsables, de par leur couleur pourpre et leur fluorescence, de l'apparence spectaculaire de
l'urine
57
et des rythrocytes ainsi que des problmes de photosensibilit de certains patients
(Milgrom, 1997; Desnick, 1999).
4.1.1.3 Utilisation des porphyrines en thrapie et diagnostic photodynamique
Le terme de thrapie photodynamique (PDT) a t initialement imagin par von Tappeiner
en 1907 pour dcrire une application clinique de l'illumination d'une tumeur photosensibilise
par de l'osine; l'utilisation des porphyrines en administration systmique a dj t propose
pour cet usage en 1913 (Szeimies et al., 1996).

57
C'est ainsi que Hippocrate aurait t le premier dcrire un cas de porphyrie, en l'an 480 (Rimington, 1993).
216
4.1.1.3.1 Thrapie et diagnostic photodynamique
La PDT est en fait un procd en 2 tapes qui utilise une combinaison de mdicament et
de lumire pour induire une destruction tissulaire localise. Un photosensibilisant est d'abord
administr par voie intraveineuse, orale ou topique et s'accumule dans le tissu cible. Cette
molcule, non toxique dans son tat natif, est ensuite active par la lumire pour devenir
cytotoxique et dgrader le tissu. L'efficacit de la majorit de ces agents repose sur la
prsence d'oxygne et la formation d'espces ractives via un processus de Type II. Deux
mcanismes agissent en concert pour assurer une slectivit ce processus : (i) l'agent
photodynamique, choisi pour tre prfrentiellement capt et/ou retenu par le tissu cible,
souvent un tissu noplasique; et (ii) l'irradiation lumineuse, restreinte la zone vise. La
technique est galement applique la dtection de tissu cancreux; il s'agit alors de
diagnostic photodynamique (PDD) (Nishioka, 1998).
Les proprits curatives de la PDT seraient en fait dues plusieurs phnomnes : (i) la
mort directe des cellules tumorales; (ii) la destruction ou l'occlusion du tissu vasculaire
alimentant la tumeur; (iii) la libration de mdiateurs de l'inflammation et le recrutement vers
le site tumoral de cellules inflammatoires qui contribuent la destruction de la tumeur; et
(iv) une raction immunitaire envers la tumeur traite, mcanisme qui contribuerait au
contrle long terme de la tumeur (Dougherty et al., 1998).
La PDT est cependant svrement restreinte dans son champ d'application, la fois par la
profondeur de pntration limite de la lumire dans les tissus, par la dpendance du
phnomne vis--vis de l'oxygne et par une inhomognit de distribution du
photosensibilisant dans la tumeur. Les zones profondes, ischmiques ou hypoxiques ne sont
quasi pas touches par ce procd qui semble rserv des destructions de tissu superficiel,
utiles nanmoins en dermatologie, gastro-entrologie, urologie et pneumologie (Dougherty et
al., 1998; Moan et al., 1998; Nishioka, 1998).
4.1.1.3.2 Drivs d'hmatoporphyrine et Photofrin
Une prcipitation en milieu acide de prparations brutes d'hmatoporphyrine a fourni un
mlange complexe de porphyrines (monomres, dimres et oligomres), le hematoporphyrin
derivative (HPD) qui a t fort utilis; sa purification partielle a permis d'obtenir le
Photofrin, qui est devenu le photosensibilisant le plus employ en pratique clinique
(Dougherty et al., 1998). Ce driv est capt de manire efficace par les tumeurs mais son
administration systmique conduit une photosensibilit cutane prolonge; les patients
217
courent en effet le risque de ractions phototoxiques svres et ce, pendant plusieurs semaines
(Szeimies et al., 1996).
Les mcanismes qui prsident la distribution prfrentielle des porphyrines dans les
tumeurs sont encore peu connus et pourraient dpendre de certaines caractristiques des tissus
tumoraux, comme par exemple l'expression de rcepteurs protiques de densit faible
58
, un
pH infrieur, la prsence de macrophages, un large espace interstitiel, un tissu vasculaire
permable, un drainage lymphatique compromis, un collagne nouvellement synthtis
58
ou
une densit importante en lipides (Dougherty et al., 1998).
L'emploi du Photofrin requiert des fluences de 50 500 J/cm de lumire rouge;
l'hyperthermie induite peut contribuer l'effet photodynamique. Pour des applications ne
ncessitant pas une pntration tissulaire profonde (~ 1.5 mm), une irradiation 410 nm est
cependant plus efficace que 630 nm (Dougherty et al., 1998).
4.1.1.3.3 L'acide -aminolvulinique
Pour pallier les effets secondaires des drivs de type Photofrin, l'administration d'acide
-aminolvulinique (-ala ), un prcurseur mtabolique de la synthse des porphyrines situ
aprs l'tape rtro-contrle par l'hme, est prsent largement applique.
L'administration, topique
59
, orale ou systmique (Calzavara-Pinton et al., 1996; Szeimies
et al., 1996), de -ala induit en fait cette voie de biosynthse avec accumulation de
protoporphyrine IX (PPIX) car la conversion de PPIX en hme apparat relativement lente.
Bien que toutes les cellules semblent capables de synthtiser l'hme, la PPIX s'accumule
principalement dans les tissus de surface (piderme, conjonctive, muqueuses, surfaces
sreuses, endomtre, urothlium) ou dans des tissus capables de scrter vers des surfaces
(glandes salivaires, sbaces et mammaires, foie, vsicules sminales). Par contre, les tissus
majeurs d'origine msodermique (muscles, tissus connectifs, cartilage, moelle osseuse, sang)
ne dveloppent pas de fluorescence significative aprs une seule dose de -ala in vivo.
Remarquons cependant que, in vitro, ces cellules deviennent gnralement capables
d'accumuler la PPIX.
Il semble donc que, en fonction du type cellulaire ou de l'environnement, les cellules
puissent diffrer dans leur capacit synthtiser l'hme ou capter le -ala ; il est galement
possible que certains mcanismes de rtro-contrle ou certaines cintiques enzymatiques en
amont de la ferrochlatase soient spcifiques (Kennedy et Pottier, 1992). Un taux faible de fer

58
Qui lie les porphyrines
59
La pntration travers une couche corne tumorale est particulirement efficace
218
libre intra-cellulaire semble un lment essentiel la production de PPIX (Pourzand et al.,
1999) ce qui est dmontr par des expriences conduites en prsence de chlateurs (Chang et
al., 1997).
La biosynthse de PPIX aprs administration de -ala est particulirement active dans les
cellules tumorales, ce qui offre un moyen de localiser (PDD) ou de dtruire (PDT)
slectivement ces cellules par photoactivation. Les raisons de cette slectivit, qui n'est
cependant pas absolue (Martin et al., 1995; Messmann et al., 1998), restent encore obscures.
Diffrentes sources lumineuses visibles ont t dcrites pour les applications cliniques de
PDT, incluant des sources non-cohrentes, filtres ou non, et des sources cohrentes (laser
argon 630 et 635 nm). Les fluences appliques vont de 15 250 J/cm (Szeimies et al., 1996).
4.1.1.3.4 Photosensibilisants de nouvelle gnration
Les profils d'efficacit et de scurit de la technique (Fuchs et al., 2000) semblent corrects
et devraient tre encore amliors par les modalits de traitement en dveloppement (choix de
longueur d'onde, protocoles d'irradiation, dveloppement de nouveaux sensibilisants et
d'adjuvants (Langer et al., 1999), amlioration de l'administration des photosensibilisants)
(Dougherty et al., 1998).
Une recherche active dans ce domaine a notamment permis de dvelopper de nouveaux
photosensibilisants chimiquement purs, prsentant un maximum d'absorption vers 650 nm et
n'induisant quasi pas de photosensibilit cutane. Diffrents composs sont en phase d'tude
clinique, parmi lesquels des ester de -ala (Peng et al., 1996), le driv de benzoporphyrine
monoacide A, le mono-aspartyl-chlorine e6, l'tiopurpurine d'tain, le texaphyrine de lutcium
et les phthalocyanines (He et al., 1998; Nishioka, 1998).
4.1.2 Rsultats : Spectroscopie de fluorescence
D'aprs la littrature, une incubation avec l'acide -aminolvulinique permettrait d'induire
la fois un driv insoluble dans l'eau, la PPIX, et des composs solubles, probablement les
uro- et/ou coproporphyrines (Dietel et al., 1996). Nous avons donc procd un examen
spectroscopique du lysat cellulaire et du milieu de culture.
4.1.2.1 Fluorescence intracellulaire
Les spectres de fluorescence ont t relevs pH physiologique sur un lysat brut obtenu
par sonication des cellules dans le PBS. Un relev systmatique a montr l'apparition d'une
fluorescence dans les cellules incubes en prsence de -ala (Figure 4.1-2). Nous avons pu
tablir les maxima d'excitation et d'mission , respectivement, 413 et 636 nm, en accord avec
219
les spectres de fluorescence publis pour la PPIX (Gomer et al., 1985; Quintanilla-Vega et al.,
1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997).

Figure 4.1-2 : Spectroscopie de fluorescence intracellulaire
Mesures dans le PBS
650 mV; 5 nm/s
Spectres d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 16 nm
Spectres d'mission : bande passante excitation, 2 nm; bande passante mission, 2 nm
Spectres d'excitation
P388D1 "blanc"
0
2
4
6
8
10
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
S
i
g
n
a
l
650 nm
675 nm
700 nm
725 nm
750 nm

Spectres d'excitation
P388D1 + -ala 1 mM (6 h)
0
2
4
6
8
10
12
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
S
i
g
n
a
l
650 nm
675 nm
700 nm
725 nm
750 nm

220
Spectres d'mission
P388D1 "blanc"
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
550 600 650 700 750 800 850
(nm)
S
i
g
n
a
l
326 nm
338 nm
351 nm
364 nm
376 nm
413 nm

Spectres d'mission
P388D1 + -ala 1 mM (6 h)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
550 600 650 700 750 800 850
(nm)
S
i
g
n
a
l
326 nm
338 nm
351 nm
364 nm
376 nm
413 nm



En milieu HClO
4
aqueux 1 M : mthanol
60
(1 : 1, v/v), ces maxima passent ,
respectivement, 408 et 604 nm, avec apparition d'un second maximum d'mission 664 nm
(Figure 4.1-3), ce qui est galement en accord avec les caractristiques spectrales de la PPIX
(Gomer et al., 1985; Quintanilla-Vega et al., 1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997).

60
Pour les dosages, les porphyrines sont extraites dans ce milieu qui assure une monomrisation des agrgats.
221
Figure 4.1-3 : Spectroscopie de fluorescence intracellulaire
Mesures dans le mlange HClO
4
aqueux 1 M : mthanol (1 : 1, v/v)
650 mV; 5 nm/s
Spectre d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm
Spectres d'mission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm
Spectres d'excitation - P388 D1
mission = 604 nm
0
0.1
0.2
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
S
i
g
n
a
l
Blanc
d-ala 300 M (3 h)

Blanc
-ala 300 M (3 h)

Spectres d'mission - P388 D1
excitation = 406 nm
0
0.1
0.2
550 600 650 700 750 800 850
(nm)
S
i
g
n
a
l
Blanc
d-ala 300 M (3 h)

Blanc
-ala 300 M (3 h)
4.1.2.2 Fluorescence extracellulaire
Les spectres de fluorescence ont t relevs pH physiologique sur un milieu de culture
dilu par du PBS. Un relev systmatique a montr l'apparition d'une fluorescence dans les
cellules incubes en prsence de -ala (Figure 4.1-4). Nous avons pu tablir les maxima
d'excitation et d'mission respectivement 399 nm et 620 nm; un second maximum
d'mission se devine vers 675 680 nm. Ces donnes sont en accord avec les spectres de
222
fluorescence publis pour les porphyrines solubles, uro- et/ou coproporphyrines (Gomer et al.,
1985; Quintanilla-Vega et al., 1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997).

Figure 4.1-4 : Spectroscopie de fluorescence extracellulaire
650 mV; 5 nm/s
Spectres d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 16 nm
Spectres d'mission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm
Spectres d'excitation
Milieu P388D1 "blanc"
0
0.5
1
1.5
2
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
S
i
g
n
a
l
610 nm
620 nm
636 nm
650 nm
675 nm
700 nm
725 nm
750 nm

Spectres d'excitation
Milieu P388D1 + -ala 1 mM (6 h)
0
0.5
1
1.5
2
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
S
i
g
n
a
l
610 nm
620 nm
636 nm
650 nm
675 nm
700 nm
725 nm
750 nm

223
Spectres d'mission
Milieu P388D1 "blanc"
0
0.1
0.2
550 600 650 700 750 800 850
(nm)
S
i
g
n
a
l
400 nm
470 nm

Spectres d'mission
Milieu P388D1 + -ala 1 mM (6 h)
0
0.1
0.2
550 600 650 700 750 800 850
(nm)
S
i
g
n
a
l
400 nm
470 nm


En milieu HClO
4
aqueux 1 M : mthanol (1 : 1, v/v), ces maxima passent ,
respectivement, 404, 603 et 660 nm (Figure 4.1-5), ce qui est galement en accord avec les
caractristiques spectrales des porphyrines hydrosolubles (Quintanilla-Vega et al., 1995;
Dietel et al., 1996).
224
Figure 4.1-5 : Spectroscopie de fluorescence extracellulaire
Mesures dans le mlange HClO
4
aqueux 1 M : mthanol (1 : 1, v/v)
650 mV; 5 nm/s
Spectres d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm
Spectres d'mission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm
Spectres d'excitation - Milieu P388 D1
mission = 602 nm
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
S
i
g
n
a
l
Blanc
d-ala 300 M (3 h)
Spectres d'mission - Milieu P388 D1
excitation = 405 nm
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
550 600 650 700 750 800 850
(nm)
S
i
g
n
a
l
Blanc
d-ala 300 M (3 h)
Blanc
-ala 300 M (3 h)
Blanc
-ala 300 M (3 h)

4.1.2.3 Discussion
Les pics de fluorescence intracellulaire observs dans les chantillons blanc sont a priori
tonnants; en effet, les seuls fluorophores endognes sont le tryptophane (
exc.
275 nm;
m.
,
350 nm), le NADH (
exc.
340 nm;
m.
, 470 nm), les flavines (
exc.
450 nm;
m.
, 520 nm)et
les porphyrines (
exc.
405 nm;
m.
, 635 nm) (Stepp et al., 1998). Un examen attentif montre
que les pics importants observs sont exactement (i) dans un rapport 1/2 avec la longueur
225
d'onde d'mission pour les spectres d'excitation ; et (ii) dans un rapport 2/1 avec la longueur
d'onde d'excitation pour les spectres d'mission . Il s'agit en ralit d'un dfaut inhrent tous
les systmes monochromateurs; les rpliques d'ordre n de la longueur d'onde fixe sont
galement slectionnes. Les filtres qui auraient pu permettre de pallier cet inconvnient
n'taient cependant pas disponibles au moment de nos mesures.
4.1.3 Rsultats : Cintique d'induction
4.1.3.1 Fluorescence intracellulaire
La cintique de fluorescence, mesure sur 8 heures d'incubation avec 1 mM de -ala,
montre un plateau dans la production de PPIX; ce plateau est dj atteint aprs
approximativement 2 heures d'incubation (Figure 4.1-6). Nous remarquons que pratiquement
aucune fluorescence n'est induite par une concentration en -ala de 100 M.
Figure 4.1-6 : P388D1 + -ala : Cintique d'apparition de la fluorescence intracellulaire
(PPIX). Mesures dans le mlange HClO
4
aqueux 1 M : mthanol (1 : 1, v/v)
0
0.5
1
1.5
0 2 4 6 8
Temps d'incubation (h)
S
i
g
n
a
l

/

m
g

p
r
o
t

i
n
e
s
1 mM
300 M
100 M
Concentration en -ala


Les points reprsentent la moyenne et les barres correspondent l'tendue des valeurs (n = 3)
(pour les donnes obtenues 100 M, les barres sont infrieures la taille du point).
650 mV; acquisition de 1 point/s pendant 20 s; excitation, 406 nm (bande passante, 4 nm); mission,
604 nm (bande passante, 8 nm).

226
4.1.3.2 Fluorescence extracellulaire
La cintique de fluorescence, mesure sur 8 heures d'incubation avec 1 mM de -ala,
montre une excrtion continue de porphyrines solubles (Figure 4.1-7). Nous remarquons que
pratiquement aucune fluorescence n'est induite par une concentration en -ala de 100 M.

Figure 4.1-7 : P388D1 + -ala : Cintique d'apparition de la fluorescence extracellulaire
(porphyrines solubles). Mesures aprs dilution dans le mlange HClO
4
aqueux
1 M : mthanol (1 : 1, v/v)
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8
Temps d'incubation (h)
S
i
g
n
a
l

/

m
g

p
r
o
t

i
n
e
s
1 mM
300 M
100 M
Concentration en -ala

Les points reprsentent la moyenne et les barres correspondent l'tendue des valeurs (n = 3)
(pour les donnes obtenues 100 M, les barres sont infrieures la taille du point).
650 mV; acquisition de 1 point/s pendant 20 s; excitation, 405 nm (bande passante, 4 nm); mission,
602 nm (bande passante, 4 nm).

4.1.4 Rsultats : Microscopie de fluorescence
La Figure 4.1-8 montre une image en microscopie de fluorescence de cellules P388D1
incubes pendant 3 h avec 300 M de -ala. La fluorescence apparat rpartie de manire
diffuse dans l'ensemble du cytosol avec des spots intenses et une dlimitation nette de la
membrane plasmique. La zone noire observe dans la plupart des cellules correspondrait,
d'aprs les donnes de la littrature, au noyau cellulaire (Moan et al., 1990; Gaullier et al.,
1995; Krammer et berriegler, 1996).
227

Figure 4.1-8 : Image obtenue en microscopie de fluorescence. Cellules P388D1 incubes en
prsence de -ala (300 M, 3 h).



Objectif 25 X immersion; les longueurs d'onde d'excitation, du miroir dichroque et d'mission sont,
respectivement, 425 20 nm, 460 nm et 590 nm (long pass); un filtre de densit neutre (Zeiss, 0.25) est
incorpor sur le trajet optique d'excitation.
4.1.5 Discussion et conclusion
L'incubation des cellules P388D1 avec l'acide -aminolvulinique induit l'apparition d'une
espce fluorescente intracellulaire, avec un plateau entre 2 et 4 h d'incubation, ainsi que
l'excrtion continue d'une seconde espce fluorescente. Les donnes spectrales, obtenues la
fois pH physiologique et en milieu HClO
4
: mthanol, sont en accord avec celles publies
pour la protoporphyrine IX (espce intracellulaire) et les porphyrines hydrosolubles (espces
228
excrtes, uro et/ou coproporphyrines), suggrant que le traitement appliqu induit bien les
composs escompts.
Il nous semble peu probable que les porphyrines solubles puissent tre synthtises
partir de la PPIX en excs. Leur formation par oxydation des porphyrinognes correspondants
et leur excrtion pourrait tre due des "fuites" dans le cycle de synthse de l'hme, la
coordination des cintiques enzymatiques n'tant peut-tre pas absolue dans ces conditions
extra-physiologiques. La rgulation des enzymes du cycle de synthse de l'hme apparat en
fait extrmement complexe et commence peine tre tudie (Afonso et al., 1999).
4.2 RESULTATS : PORPHYRINES ET DEGATS
PHOTODYNAMIQUES AUX ACIDES NUCLEIQUES
4.2.1 Induction de bases oxydes
Pour la premire fois, nous montrons que l'activation photodynamique des cellules traites
par l'acide -aminolvulinique induit la formation de 8-oxodG et de 8-oxoG, et ce aussi bien
pour les radiations UVA que les radiations visibles (Figure 4.2-1).

Figure 4.2-1 : Production de guanines oxydes par irradiation lumineuse.
Chromatogramme CLHP aprs digestion enzymatique des acides nucliques.













Cellules P388D1 incubes en prsence de -ala (1 mM, 3 h) et irradies pendant 30 min
(4C; 560 mJ/cm pour la lampe UVA; 21.4 J/cm pour la lampe visible).
Conditions chromatographiques valides dans la Section 3. Dtection ampromtrique sur
carbone vitreux (700 mV vs Ag/AgCl).

229
4.2.1.1 Identification de la 8-oxodG
L'identit du pic de la 8-oxodG a t confirme par co-injection avec un talon et par
comparaison des rapports de signaux acquis diffrents potentiels (Tableau 4.2-1).

Tableau 4.2-1 : Identification de la 8-oxodG dans des cellules P388D1 soumises un des
stress photooxydants tudis (-ala, 1 mM, 3 h suivi de 30 min d'irradiation
UVA , 560 mJ/cm) .
Rapports de pics diffrents potentiels.
(n = 3; moyennes; entre parenthses, tendue des 3 x 3 valeurs)

Potentiels
(mV)
8-oxodG
talon
Cellules stresses
(-ala + UVA)
700 / 650 1.10 (1.02 1.15) 1.03 (1.00 1.06)
700 / 600 1.49 (1.30 1.70) 1.46 (1.41 1.51)
700 / 550 2.35 (1.94 2.90) 2.57 (2.41 2.84)
650 / 600 1.36 (1.19 1.58) 1.42 (1.37 1.47)
650 / 550 2.14 (1.78 2.69) 2.51 (2.34 2.76)
600 / 550 1.59 (1.21 2.11) 1.77 (1.64 1.96)

4.2.1.2 Photooxydation de l'ADN et de l'ARN
Le pic attribu la 8-oxoG sur le chromatogramme (Figure 4.2-1) est bien un pic de
l'ARN; il disparat en effet compltement lorsque les acides nucliques sont traits par un
mlange RNase A et RNase T1 et purifis par prcipitation avant l'tape de digestion par la
nuclase P1. L'identit du pic a t confirme par co-injection avec un talon depuis peu
disponible commercialement.
La mthode tant entirement optimise pour l'analyse de la dG et de la 8-oxodG, le pic de
la guanosine plafonne dans la plupart des chantillons, ce qui rend toute mesure du rapport
8-oxoG/10
5
G impossible. Comme il nous semblait que le pic de 8-oxoG tait toujours
beaucoup plus lev que le pic de 8-oxodG, nous avons dos les 4 bases G, dG, 8-oxoG et
8-oxodG dans quelques chantillons afin de vrifier ce phnomne (Tableau 4.2-2).
L'ARN apparat en effet systmatiquement plus sensible la photooxydation que l'ADN.

230
Tableau 4.2-2 : Comparaison de la photooxydation de l'ADN (8-oxodG) et de l'ARN
(8-oxoG) aprs induction des porphyrines dans les cellules P388D1.

Source de lumire Echantillon
(a)
n
(b)
Temps d'irradiation
(min)
8-oxodG
par 10
5
dG
(c)
8-oxoG
par 10
5
G
(c,d)
Contrle 6 --- --- 0.49 0.17 0.55 0.17
NS

Lumire visible 4 visible 30 2.11 0.48 8.15 0.28
***

Lampe UVA 1 UVA 5 0.70 2.90
1 UVA 20 2.66 11.20
1 UVA 30 4.54 24.30
1 UVA 40 5.68 21.72
3 UVA 60 10.37 2.19 26.61 0.53
**

Cellules contrle
+ milieu trait
(e)
3 UVA 60 0.79 0.16 1.03 0.15
NS

Cellules traites
+ milieu contrle
(e)

3 UVA 60 5.74 0.40 25.86 2.04
**




4.2.2
(a)
Les cellules P388D1 ont t incubes en prsence de -ala (1 mM, 3 h)
(b)
Irradiation 4C (0.31 mW/cm pour la lampe UVA; 11.9 mW/cm pour la lampe visible)
(c)
Moyenne cart talon
(d)
Test t de Student pour la diffrence entre l'induction de 8-oxodG et de 8-oxoG
(***, p< 0.001; **, p < 0.01; NS, p > 0.05)

(e)
Les chantillons ont t prpars et irradis comme dcrit en 4.2.2.3
Paramtres impliqus dans la photooxydation de l'ADN
4.2.2.1 Influence de la temprature d'irradiation et du temps de chargement en acide -
aminolvulinique
Nous nous attendions ce que l'oxydation de l'ADN soit temprature-dpendante. En
effet, les taux de 8-oxodG sont la rsultante de 3 mcanismes diffrents, dont les cintiques
sont probablement influences par la temprature, savoir (i) la photodestruction de la PPIX;
(ii) la resynthse continue de porphyrines en cours d'irradiation; et (iii) l'excision de la base
oxyde par les mcanismes cellulaires de rparation
61
.
Lorsque nous irradions 4C, l'oxydation de l'ADN dpend du temps de chargement en
acide -aminolvulinique (Figure 4.2-2), en accord avec la cintique d'induction de PPIX de
la Figure 4.1-6.

61
Remarquons que le base excision repair, le mcanisme principal de rparation des lsions 8-oxodG, est bien
temprature-dpendant mais reste en partie fonctionnel 4C. A partir de mesures d'incision, l'tape limitante
des mcanismes de rparation, Hjertvik et al ont montr que, entre 37C et 4C, la vitesse d'incision de bases
mthyles passe d'environ 6000 300 cassures simple-brin par cellule par minute (Hjertvik et al., 1998).
231
Figure 4.2-2 : Influence du temps de chargement en acide -aminolvulinique (1 mM).
Irradiation 4C
0
1
2
3
4
5
Contrle 1 3 5
Temps de chargement (h)
8
-
o
x
o
d
G

p
a
r

1
0
5

d
G
Non irradi
UVA
Visible

NS
NS
NS
*
**
***
***
***
***
Cellules P388D1 incubes en prsence de -ala (1 mM, 3 h) et irradies pendant 30 min
(4C; 560 mJ/cm pour la lampe UVA; 21.4 J/cm pour la lampe visible).
Les points reprsentent la moyenne et les barres correspondent la SEM (n = 6).
Test t de Student pour la diffrence vis-vis des contrles respectifs
(***, p< 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05)

Nos essais de traitement 37C marquent une tendance similaire mais se sont avrs peu
reproductibles. Cette forte variabilit est due une importante condensation observe
l'intrieur des botes de culture pendant l'irradiation cette temprature. A 4C par contre, la
faible condensation qui se forme en dbut d'irradiation disparat en quelques minutes.
Comme nous n'avons pu rsoudre le problme de manire satisfaisante, nous avons
poursuivi le reste du travail en irradiant 4C.
4.2.2.2 Influence de la dose de lumire et de la concentration en acide -
aminolvulinique
La formation de 8-oxodG crot avec la dose de lumire, celle-ci tant module par le
temps d'irradiation (Figure 4.2-3). Cette augmentation pourrait tre due la plus grande
probabilit qu'une cellule individuelle en suspension absorbe la lumire au fur et mesure de
232
Figure 4.2-3 : Influence du temps d'irradiation (dose de lumire) sur la production de
8-oxodG
0
4
8
12
16
0 20 40 60
Temps d'irradiation (min)
8
-
o
x
o
d
G

p
a
r

1
0
5

d
G
Lumire visible (11.9 mW/cm)
UVA (0.31 mW/cm)

Cellules P388D1 incubes en prsence de -ala (1 mM, 3 h) et irradies (4C).
Les points reprsentent la moyenne et les barres correspondent l'tendue des valeurs (n = 3).


Figure 4.2-4 : Influence de la concentration en acide -aminolvulinique sur la production de
8-oxodG
0
2
4
6
0 500 1000 1500 2000
Dose en acide -aminolvulinique (M)
8
-
o
x
o
d
G

p
a
r

1
0
5

d
G
Lumire visible (11.9 mW/cm)
UVA (0.31 mW/cm)

Cellules P388D1 incubes en prsence de -ala (1 mM) et irradies.
(4C; 30 min, correspondant 560 mJ/cm pour la lampe UVA et 21.4 J/cm pour la lampe visible).Les
points reprsentent la moyenne et les barres correspondent l'tendue des valeurs (n = 3).

233
l'irradiation; elle pourrait galement suggrer une vitesse faible de photodestruction de la
PPIX ou une resynthse continue de porphyrines fraches partir de l'acide -
aminolvulinique prsent dans le milieu de culture.
Nous n'avons pas mis en vidence d'effet de la concentration en acide -aminolvulinique
dans le domaine tudi (300 1600 M) (Figure 4.2-4).
4.2.2.3 Influence des porphyrines intra- et extracellulaires
L'influence des porphyrines intracellulaires et des porphyrines excrtes dans le milieu de
culture a t tudie en croisant avant irradiation le surnageant de cellules contrles et de
cellules charges en acide -aminolvulinique (Figure 4.2-5).
Le surnageant des cellules traites par -ala ne prsente pas d'effet photodynamique sur
les cellules contrles (Figure 4.2-6). L'effet de l'irradiation lumineuse sur les cellules charges
en -ala est systmatiquement infrieur l'effet observ en prsence du milieu de chargement;
ce qui pourrait s'expliquer par une synthse rduite en PPIX pendant l'irradiation dans le
milieu contrle au fur et mesure de la dpltion en -ala intracellulaire.

Figure 4.2-5 : Protocole appliqu pour tudier l'influence des porphyrines intra- et
extracellulaires

-ala Contrle -ala
1mM 1mM
Pr-incubation (3h)
Centrifugation
Croisement des milieux
de culture
Mise en suspension
Irradiation UVA
Analyse 8-oxo-dG
-ala Contrle -ala
1mM 1mM
Pr-incubation (3h)
Centrifugation
Croisement des milieux
de culture
Mise en suspension
Irradiation UVA
Analyse 8-oxo-dG

234
Figure 4.2-6 : Effet photodynamique des porphyrines intra- et extracellulaires

0
5
10
0 10 20 30 40 60
Temps d'irradiation (min)
8
-
o
x
o
d
G

p
a
r

1
0
5

d
G
Cellules Traites
+ Milieu Trait
Cellules Traites
+ Milieu Contrle
Cellules Contrle
+ Milieu Trait

Cellules P388D1 incubes en prsence de -ala (1 mM, 3 h) et irradies aprs l'change des milieux de
culture dcrit en Figure 4.2-5
(30 min; 4C; 0.31 mW/cm pour la lampe UVA; 11.9 mW/cm pour la lampe visible).
Les points reprsentent la moyenne et les barres correspondent l'tendue des valeurs (n = 3).

4.3 RESULTATS : TESTS DE CYTOTOXICITE MTT
Les courbes de survie ont t tablies pour l'effet ltal de diffrentes doses de -ala
combines avec des irradiations UVA et visibles, et ce dans les conditions suivantes : 3 h de
chargement en -ala et 30 min d'irradiation 4C (soit 560 mJ/cm pour la lampe UVA et
21.4 J/cm pour la lampe visible) (Figure 4.3-1). Une comparaison avec les Figures 4.2-2 et
4.2-4 montre que, pour des combinaisons de lumire et de -ala induisant une faible mortalit
cellulaire, des dommages significatifs sont induits dans l'ADN.
235
Figure 4.3-1 : Cytotoxicit de l'acide -aminolvulinique combin avec des radiations UVA
et visibles
Irradiation UVA
0
50
100
10 100 1000 10000
Concentration en -ala (M)
%

c
e
l
l
u
l
e
s

v
i
v
a
n
t
e
s

Irradiation UVA

Irradiation visible
0
50
100
10 100 1000 10000
Concentration en -ala (M)
%

c
e
l
l
u
l
e
s

v
i
v
a
n
t
e
s

Irradiation Visible
Cellules P388D1 incubes en prsence de -ala (3 h) et irradies (4C; UVA 30 min, soit 560 mJ/cm;
lumire visible 30 min, soit 21.4 J/cm). Les courbes ont t ajustes l'ensemble des rsultats de 2
expriences en quadruplicat (les points et reprsentent, respectivement, les expriences 1 et 2).
236
4.4 DISCUSSION
4.4.1 La problmatique de la carcinogense solaire, des UVA et de la
8-oxodG
Comme nous l'avons soulign dans l'introduction (Section 1.4), le potentiel carcinogne
de la lumire solaire serait principalement une consquence de l'excitation directe des
chromophores de l'ADN par les UVB pour former des photoproduits dimres au niveau des
sites dipyrimidiques (Peak et Peak, 1989). Les UVA sont cependant des carcinognes
complets, jouant un rle la fois d'initiateur et de promoteur (de Laat et al., 1997). Leur
contribution la carcinogense cutane (10 20 %) s'ajouterait de manire arithmtique
celle des UVB (Kelfkens et al., 1990).
Les radiations UVA gnrent des modifications oxydatives dans l'ADN, incluant cassures
de chanes, sites abasiques et liens croiss (Peak et Peak, 1989) mais aussi une base oxyde, la
8-oxodG (Tableau 4.4-1). Ces proprits mutagnes sont mdies par des radicaux libres et
l'implication majeure de l'oxygne singulet (
1
O
2
), probablement form via un mcanisme de
photosensibilisation de Type II, a t tablie (Kelfkens et al., 1990; Kvam et Tyrrell, 1997b).
Une contribution du radical hydroxyle (

OH) (Rosen et al., 1996) n'a pu tre exclue (Kelfkens


et al., 1990) ou confirme (Kvam et Tyrrell, 1997b). Les photosensibilisants endognes
impliqus dans la gnration du
1
O
2
ne sont cependant pas encore identifis. A partir de
donnes spectroscopiques, le NADP, le NADPH, la bilirubine (Rosenstein et al., 1983), les
porphyrines (Cadet et al., 1997; Pflaum et al., 1998) et la riboflavine (Yamamoto et al., 1992)
ont t suspects mais aucune indication de leur possible implication dans un vnement
carcinogne n'a encore t rapporte in vivo.
Outre ces effets initiateurs, rappelons que les UVA peuvent galement induire certaines
voies de signalisation intracellulaires ainsi que des facteurs de transcription impliqus
notamment dans la prolifration et la diffrenciation (cf 1.3.4.2.5).

237
Tableau 4.4-1 : Donnes publies quant la photoinduction de la 2'-dsoxyguanosine dans
l'ADN

Source de
lumire
principale
(a)

Type d'chantillon
Dose de lumire
applique
(J / cm)
8-oxodG
dans l'ADN
(8-oxodG/10
5
dG)

Rfrences
ADN en solution 0.1 - 2.5 17 - 2200
(Wei et al., 1996; Zhang et
al., 1997a; Zhang et al.,
1997b; Wei et al., 1998a; Wei
et al., 1998b)
UVC
Cellules in vitro (Hela et CHO) 0.001 - 1 0.6 - 22
(Zhang et al., 1997a; Douki et
al., 1999)
ADN en solution 2.5 - 30 18 - 140
(Zhang et al., 1997a; Zhang
et al., 1997b; Liu et al., 1998)
Cellules in vitro (cellules
pidermiques de souris 291.09;
cellules pithliales de rat ARL-
18; cellules Hela; carcinome
epidermode humain A431)
0.2 - 20 0.16 - 4.6
(Beehler et al., 1992; Rosen
et al., 1996; Zhang et al.,
1997a; Liu et al., 1998)
Kratinocytes BALB/c MK-2 0.1 - 0.75 2 - 27.1
(Stewart et al., 1996)
Cellules CHO 0.025 - 0.15 1.1 - 1.6
(Douki et al., 1999)
Animaux
(b)
(piderme) 2 - 5
(c)
(chronique)
5.9 - 8.8
(Wei et al., 1998b)
UVB
Homme (piderme) 2 x MED
(d)
Taux levs dtects
(immunomarquage)
(Ahmed et al., 1999)
ADN en solution 0.1 - 40 3.5 - 77
(Ito et al., 1993; Arimoto-
Kobayashi et al., 1997; Ito et
Kawanishi, 1997a; Wamer et
al., 1997; Zhang et al., 1997a;
Zhang et al., 1997b; Liu et
al., 1998)
Cellules pithliales de rat
ARL-18
0 - 20 2 - 3.75
(Rosen et al., 1996)
Fibroblastes de peau humaine
CRL 1634
0 - 80 1.5 - 7.8
(Wamer et Wei, 1997)
Fibroblastes primaires de peau
humaine FEK4
0 - 120 5 - 17
(Kvam et Tyrrell, 1997b)
Cellules lymphoblastodes
humaines TK6 en croissance
exponentielle
Pas d'effet
Cellules Hela
Cellules de carcinome
epidermode humain A431
(Liu et al., 1998)
confluence
(e)



0 - 120


3.5 - 6


(Kvam et Tyrrell, 1997b)
Cellules de mlanome humain
(GLL19) en croissance
exponentielle
0 - 120 4.8 - 13.8
(Kvam et Tyrrell, 1997b)
0 - 120
(Kvam et Tyrrell, 1997b)
0 - 40 2 - 3.5
(Zhang et al., 1997a)
Cellules pithliales de rat
ARL-18
0 - 20 Aucun effet sans
photosensibilisant
(Verna et al., 1998)
UVA
0 - 2.5 Aucun effet sans
photosensibilisant
en croissance
exponentielle

238
Tableau 4.4-1 (Suite) : Photoinduction de la 2'-dsoxyguanosine dans l'ADN
1 - 4.7




UVA (suite) Cellules CHO
0 - 100

0 - 100

1 - 2.9
(Douki et al., 1999)

(Douki et al., 1999)
ADN en solution n.a.
(f)
230
(Mauthe et al., 1995)
Lumire
visible
Cellules in vitro (lymphome de
souris L5178Y; fibroblastes
embryonnaires de poumon
humain VA13; embryon de
cobaye; carcinome mammaire
humain MCF-7)
n.a.
(f)
Aucun effet sans
photosensibilisant
(Yamamoto et al., 1992;
Mauthe et al., 1995)
ADN en solution 1.68 684
(Fischer-Nielsen et al., 1992)
UVC + UVB
+ UVA
Cellules CHO V79 4.56 10 - 13 (Fischer-Nielsen et al., 1993)
UVA + UVB Animaux
(b)
(piderme) 33.5
2 - 6
(c)
(chronique)
11.3
6 - 15
(Hattori-Nakakuki et al.,
1994; Hattori et al., 1996)
Lumire
solaire
Cellules CHO 160 - 460 2 - 21
(Douki et al., 1999)
UVL9 (dficientes en
rparation par excision de
nuclotides)
AT3-2 (rparation-
comptentes)





(a)
Les conditions exprimentales (bandes UV, lampes, filtres, radiomtres et lignes cellulaires) varient selon
les auteurs; les caractristiques sont dtailles dans chaque rfrence.
(b)
Souris nues
(c)
Dose totale
(d)
MED = dose minimale rythmale
(e)
Les auteurs ont galement dtermin sur ce modle le spectre d'action pour la formation de 8-oxodG
(irradiation avec des longueurs d'onde quasi- monochromatiques)
(f)
n.a. : donnes non disponibles

Le spectre d'action pour la formation de la 8-oxodG dans l'ADN a t dtermin
62
sur des
fibroblastes humains primaires confluence (Figure 4.4-1) (Kvam et Tyrrell, 1997b).
Ces donnes, ajustes par la fluence solaire des diffrentes bandes de longueur d'onde,
montrent que les radiations UVA (au-dessus de 334 nm) et visibles courtes causent
pratiquement toute l'oxydation de la guanine par la lumire solaire (Figure 4.4-2).

62
Par CLHP avec dtection lectrochimique
239
Figure 4.4-1 : Spectre d'action : rendements relatifs en 8-oxodG et en dimres bipyrimidiques

(Kvam et Tyrrell, 1997)
Rendements relatifs en 8-oxodG

Rendements relatifs en dimres bipyrimidiques
Spectre d'action pour la carcinogense cutane humaine (cf Fig. 1.4-4)

Les donnes sont calcules pour la couche basale de l'piderme humain (70 m paisseur)
Les spectres pour la carcinogense et les dimres bipyrimidiques sont normaliss 1 302 nm; le spectre
pour la 8-oxodG est normalis pour que les rendements en dimres et en 8-oxodG soient gaux 365 nm
Figure 4.4-2 : Spectre d'action : vitesses de production compares de 8-oxodG et des dimres
bipyrimidiques


(Kvam et Tyrrell, 1997)
Vitesse de production de 8-oxodG 1 h p.m.
S Vitesse de production de 8-oxodG 9 h a.m.
Vitesse de production des dimres bipyrimidiques 1 h p.m.
U Vitesse de production des dimres bipyrimidiques 9 h a.m.

Les donnes sont calcules pour la couche basale de l'piderme humain (70 m paisseur) et un spectre
solaire mesur en juillet Albuquerque, Nouveau-Mexique.
Les spectres sont normaliss 1 pour la 8-oxodG 405 nm
240
La phase de croissance des cellules influence de manire diverse l'induction de 8-oxodG
par les UVA (Kvam et Tyrrell, 1997b) (Tableau 4.4-1), ce qui indique que d'autres facteurs
non encore identifis participent probablement au phnomne. Le spectre d'action pour
l'induction de lsions reconnues par la FPG
63
a galement t tabli sur des cellules
mammifres; ce spectre montre 2 zones de dgt maximal, de 290 315 nm et de 400 450
nm, avec un minimum environ 350 nm (cf Section 5.6.2).
Le rle de la 8-oxodG et des autres bases oxydes vis--vis de la carcinogense solaire
reste cependant incertain (Kvam et Tyrrell, 1997b; Douki et al., 1999); les spectres
mutationnels (cf 1.4.3.3) indiquent en effet une contribution mineure des lsions oxydatives
au processus global de mutagense UV. Mme dans la rgion UVA, un rle majeur peut tre
attribu aux lsions dipyrimidiques, qui mnent des transitions G:C A:T, alors que la
mutation signature attendue pour la 8-oxodG et certaines autres lsions oxydatives, la
transversion G:C T:A, ne reprsente qu'une fraction des mutations induites (Kvam et al.,
1994). De plus, bien que les dimres bipyrimidiques et la 8-oxodG soient induits des
vitesses similaires par l'ensemble du spectre solaire (Douki et al., 1999), la base oxyde
pourrait tre rpare de manire plus efficace; elle est en effet excise un taux 1.5 fois
suprieur celui des dimres (Reardon et al., 1997).
4.4.2 Porphyrines et dommages l'ADN
Le prsent travail montre que l'activation lumineuse des porphyrines drives de l'acide -
aminolvulinique induit des dgts oxydatifs l'ADN cellulaire, dgts qui dpendent
essentiellement de la dose de lumire. Les radiations UVA et visibles sont toutes deux
photoactives; les 2 sources utilises dans ce travail mettant en partie dans la bande de Soret
des porphyrines, aux alentours de 410 nm. Ce chromophore majeur pourrait tre impliqu
dans l'effet observ (Pflaum et al., 1998), en accord avec les spectres d'action pour l'induction
de 8-oxodG dans l'ADN cellulaire (Kvam et al., 1994; Kielbassa et al., 1997) ( 4.4.1).
Rappelons que les porphyrines ont longuement t suspectes d'tre des
photosensibilisants endognes (del C. Battle, 1993; Pflaum et al., 1994; Friedberg et al., 1995;
Cadet et al., 1997; Halliwell et Gutteridge, 1999). A partir de descriptions de phnotypes
cellulaires malins mais aussi d'tudes menes sur le comportement mtabolique gnral des
cellules cancreuses, il a mme t propos que les troubles et anomalies du mtabolisme de

63
FPG : formamidopyrimidine glycosylase; cette endonuclase reconnat principalement les purines oxydes,
induisant des cassures de chane mesures par lution alcaline dans les tudes mentionnes ici.
241
l'hme puissent constituer une lsion gnrale initiatrice de la carcinogense (del C. Battle,
1993).
4.4.2.1 Porphyrines et dommages aux acides nucliques
Les dommages induits par une irradiation lumineuse des porphyrines ont t
principalement tudis pour des composs exognes sur de l'ADN en solution (Moan et al.,
1990; Kvam et al., 1994).
La photoactivation des drivs d'hmatoporphyrine (HpD) provoque des cassures simple-
brin et des sites alcali-labiles (Moan et al., 1990); diffrents drivs de porphyrines, qu'ils se
lient ou pas l'ADN, induisent la photodgradation de la guanine pour former une srie de
photoproduits, parmi lesquels la 8-oxodG (Kvam et al., 1994). La lumire combine au HpD
n'induit cependant des dgts que dans l'ADN simple-brin, ce qui a t expliqu par le fait que
ces drivs ne se lient pas l'ADN (Kawanishi et al., 1986). Le compactage dans la
chromatine protgeant l'ADN des dgts oxydatifs (Enright et al., 1996), l'ARN et l'ADN
simple-brin, form localement par le dploiement de la double-hlice pendant la transcription
et la rplication, pourraient donc tre d'importantes cibles. Nos rsultats (Figure 4.2-1 et
Tableau 4.2-2) montrent que l'ARN est effectivement plus sensible la dgradation
photodynamique que l'ADN. Cependant, la plupart de l'ARN tant cytosolique plutt que
nuclaire, nos donnes pourraient simplement indiquer que les espces oxydantes sont
gnres principalement dans le cytosol.
Bien qu'une plus grande sensibilit de l'ARN aux dgts oxydatifs induits par les UVA ait
dj t rapporte (Wamer et Wei, 1997), aucune consquence biologique n'a t dcrite.
Selon nous, il est probable que les cassures de chanes concomitantes l'attaque oxydative
mnent simplement une inactivation de l'ARN oxyd et sa dgradation.
Seules les porphyrines qui se lient aux cellules sont capables de sensibiliser celles-ci. Les
uroporphyrines, qui sont hydrosoluble et capables de gnrer du
1
O
2
par photoactivation, n'ont
aucune activit photosensibilisante (Moan et al., 1990). Ceci est en accord avec nos donnes
qui montrent que les porphyrines solubles excrtes dans le milieu de culture n'induisent pas
de dgt photodynamique l'ADN cellulaire (Figure 4.2-6).
4.4.2.2 Localisation intracellulaire des porphyrines et dommage l'ADN
Aprs synthse dans la mitochondrie, la PPIX se relocalise dans le cytoplasme, se lie aux
membranes mais ne s'accumule pas dans le noyau (Gaullier et al., 1995; Krammer et
berriegler, 1996) (Figure 4.1-8).
242
Pour le HpD exogne, la fluorescence porphyrique est visible au niveau de la membrane
nuclaire, alors que le noyau lui-mme n'exhibe aucune fluorescence significative (Moan et
al., 1990). Des changes de chromatides surs et des aberrations chromosomiques ont t
induites par photoactivation du HpD; les chromosomes sont principalement endommags au
niveau des rgions tlomrique et centromrique qui sont supposes tre en contact avec la
membrane nuclaire (Moan et al., 1990). Au cours de la phase initiale d'exposition la
lumire, il est possible que le HpD puisse en fait se relocaliser dans le noyau (Moan et al.,
1988; Krammer et berriegler, 1996). Une telle relocalisation, qui a galement t propose
pour les phthalocyanines (He et al., 1998) et dmontre pour la meta-(ttrahydroxyphnyl)-
chlorine (Rousset et al., 2000) n'a pas t encore mise en vidence pour la PPIX. A l'heure
actuelle, nous ne pouvons donc prciser si l'effet photodynamique que nous montrons est
direct (gnration de
1
O
2
proximit de l'ADN) ou indirect (amplification des radicaux
gnrs par la proxydation lipidique de la membrane nuclaire). Des vnements purement
cytosoliques sont effectivement capables d'induire des mutations, un mcanisme mdi par
des espces radicalaires (Wu et al., 1999).
Comme la PPIX est synthtise dans les mitochondries, il est possible qu'une partie,
peut-tre mme la majorit, des dgts 8-oxodG soit en fait localise dans l'ADN
mitochondrial (ADNmt). Cet ADN reprsente environ 1 % de l'ADN total et son
recouvrement par les mthodes d'extraction de l'ADN nuclaire (ADNn) est estim environ
70 %, ce qui implique une contamination faible d'ADNmt dans l'ADNn (Richter et al., 1988).
Cependant, l'extraction de l'ADNmt pour les tudes de dgts oxydatifs reprsente encore un
dfi considrable, de nombreux artfacts se rencontrant au cours de l'isolation de l'organelle;
les valeurs publies relatives aux dgts oxydatifs de base de l'ADN mitochondrial varient
d'un facteur suprieur 60000 (Beckman et Ames, 1999) et les consquences biologiques de
son oxydation sont encore largement inconnues.
Afin de vrifier si l'ADN nuclaire est bien touch par le phnomne de photooxydation
de la PPIX, nous avons donc prfr procder des mesures de type comte qui seront
prsentes dans le chapitre 5 de ce travail.
4.4.2.3 Activit pro-oxydante de l'acide -aminolvulinique
Diffrentes tudes ont dmontr que l'acide -aminolvulinique est, par lui-mme, un pro-
oxydant capable d'endommager l'ADN (clivage et production de 8-oxodG) et de gnrer un
produit de dgradation alkylant. Ses proprits pro-oxydantes permettraient notamment
d'expliquer les syndromes neurologiques qui se manifestent lors d'une dficience en activit
243
de l'HMB synthase, dficience observe dans certaines porphyries (Tableau 4.1-1), dans les
intoxications au plomb et la tyrosinmie de Type I. De plus, les attaques oxydantes et
alkylantes de l'ADN par l'acide -aminolvulinique pourraient lucider les proprits
carcinognes du plomb (Monteiro et al., 1989; Hermes-Lima et al., 1991; Fraga et al., 1994;
Hiraku et Kawanishi, 1996; Neal et al., 1997; Douki et al., 1998).
Le -ala augmente la production d'espces ractives de l'oxygne et la peroxydation
lipidique (Monteiro et al., 1989; Hermes-Lima et al., 1991); il inhibe la prolifration cellulaire
et affecte le rapport GSH/GSSG et l'activit de la catalase (Neal et al., 1997). Les proprits
oxydantes de l'acide -aminolvulinique vis--vis de l'ADN ont d'abord t mises en vidence
sur de l'ADN isol, mais seulement en prsence de Cu
II
et, dans une moindre mesure, en
prsence de Fe
II
(Fraga et al., 1994; Hiraku et Kawanishi, 1996); l'ADN simple-brin s'avre
plus sensible que l'ADN duplex. Le traitement de rats par l'acide -aminolvulinique induit la
formation de 8-oxodG dans le foie (Fraga et al., 1994). L'acide -aminolvulinique pourrait en
fait promouvoir sa propre auto-oxydation par le fer; il est en effet capable de relarguer du fer
de la ferrritine (Oteiza et al., 1995) et un traitement chronique de rats par le -ala mobilise le
fer dans le cerveau et le foie (Demasi et al., 1996).
Au point de vue mcanistique, l'oxydation catalyse par les mtaux convertit le -ala en
acide 4,5-dioxovalrique (DOVA); concentration leve, 2 molcules de -ala peuvent
galement se condenser spontanment en un driv dihydropyrazine qui s'oxyde en prsence
de Cu
II
en une pyrazine (Hiraku et Kawanishi, 1996). Ces processus d'oxydation majeur et
mineur rsulteraient en ROS capables d'endommager l'ADN. Le DOVA est en outre un
alkylant efficace de la guanine, au niveau du nucloside et de l'ADN (Douki et al., 1998).
Dans l'ensemble de nos expriences, nous n'avons mis en vidence aucune toxicit de
l'acide -aminolvulinique dans des conditions d'obscurit, que ce soit en terme de
cytotoxicit (aucun effet jusque 6 mM, 48 h) ou de dommages oxydatifs l'ADN. Il est
cependant possible qu'une accumulation de -ala entame les dfenses antioxydantes de la
cellule et qu'un traitement pro-oxydant additionnel, l'irradiation de la PPIX induite, finisse par
totalement dpasser ces capacits de dfense. Les dgts l'ADN pourraient donc provenir,
non pas directement de l'effet photodynamique, mais plutt d'une surcharge gnrale en
espces radicalaires.
244
4.4.3 Implications possibles de l'effet photodynamique mis en vidence
4.4.3.1 La carcinogense solaire
La rgulation fine de la synthse de l'hme est encore largement inconnue, si ce n'est le
rtro-contrle bien connu exerc par l'hme sur l'ALA synthase ( 4.1.1.1.2). Par exemple, les
diffrences observes dans la synthse de porphyrines partir de -ala exogne
64
, en fonction
du tissu ou du statut prolifratif des cellules sont encore inexpliques (Dougherty et al., 1998);
de mme, les phases de synthse physiologique de l'hme et les facteurs dclenchants ne sont
toujours pas identifis. Les schmas complexes de rgulation, diffrents en fonction des
conditions d'obscurit ou d'clairage et qui commencent peine tre lucids (Afonso et al.,
1999), pourraient peut-tre prsenter une implication dans la carcinogense solaire.
Des tudes prcdentes (Pflaum et al., 1994; Pflaum et al., 1998), bases sur l'lution
alcaline aprs FPG, ont en effet montr que les dgts photooxydatifs l'ADN dpendent du
type cellulaire et pourraient se corrler avec le taux basal en porphyrines; la gnotoxicit de la
lumire visible, mesure par l'induction des micro-noyaux, et la cytotoxicit ne deviennent
significatives qu'aprs induction de la synthse des porphyrines.
Nous formons l'hypothse qu'une cellule de la couche basale de la peau en phase active de
synthse d'hme serait susceptible, suite une exposition solaire naturelle ou artificielle, de
subir une photooxydation de PPIX, accompagne de la production d'espces radicalaires et de
dommages oxydatifs l'ADN. En l'absence de production d'hme, et donc de rtro-contrle,
la synthse endogne d'acide -aminolvulinique ne serait pas un facteur limitant
65
; ce qui
pourrait donc impliquer une synthse et une photodgradation continues de la PPIX, les
dgts l'ADN croissant avec la dose de lumire et finissant par excder les capacits de
rparation cellulaires.
4.4.3.2 La thrapie photodynamique (PDT)
L'utilisation clinique des thrapies photosensibilisantes a men une srie d'tudes de
gnotoxicit. Les investigations menes sur la PDT base de HpD et de phthalocyanines ont
montr que la mutagnicit varie en fonction du locus du gne cible tudi (Deahl et al.,
1993), de la dose de PDT, de la nature du photosensibilisant, du dlai entre l'addition du
photosensibilisant et l'application de lumire (He et al., 1998), des capacits de rparation

64
Diffrences mises profit en thrapie et diagnostic photodynamique (cf 4.1.1.3.3)
65
C'est aussi le cas pour notre modle exprimental dans lequel le -ala est continuellement disponible pendant
l'irradiation
245
cellulaires, du statut p53 (Evans et al., 1997) et de la sensibilit de la cellule aux effets ltaux
du traitement (Ramakrishnan et al., 1989).
Une revue exhaustive (Fuchs et al., 2000) des donnes obtenues pour les porphyrines
mne la conclusion que le risque rel d'un carcinome de la peau secondaire un traitement
PDT topique semble trs faible. Les auteurs mettent en balance le potentiel gnotoxique et les
proprits pro-oxydantes videntes de cette thrapie avec les proprits antioxydantes et
antimutagnes des porphyrines elle-mmes. Tout semble indiquer que, lorsque la dose
combine de porphyrine et de lumire est suffisante pour tuer effectivement les cellules, la
probabilit de maintenir des dommages gntiques serait extrmement faible. Cette revue
souligne galement le manque de preuves pouvant indiquer un taux lev de cancer en cas de
syndrome de photosensibilisation porphyrique d une accumulation cutane de PPIX; il
semble que la raction la lumire de ces patients soit telle qu'ils subissent en fait une
vritable thrapie photodynamique qui dtruit les cellules photoactives.
Ceci pourrait ne pas tre le cas pour des dosages photodynamiques plus faibles qui
pourraient tre rencontrs dans des cellules, normales ou prdisposes au cancer
66
, qui
synthtiseraient des taux physiologiques de PPIX sous des conditions normales ou excessives
d'exposition solaire.
Bien qu'une thrapie potentiellement carcinogne soit acceptable pour le traitement de
cancers, l'application de la PDT d'autres pathologies telles que les infections bactriennes
(van der Meulen et al., 1997) ou l'acn (Ramstad et al., 1997) mrite certainement des tudes
risque-bnfice pousses.
4.4.3.3 Le diagnostic photodynamique
La photoactivation (le plus souvent par les UVA) des porphyrines induites par
administration de -ala permet une dtection in situ des tumeurs, une voie de recherche
activement poursuivie (Dougherty et al., 1998). Comme nous l'avons soulign, il y a
cependant une forte variation de la synthse des porphyrines en fonction du tissu ou de la
tumeur et la spcificit de la dtection est plus ou moins absolue.
En fonction de l'organe, des longueurs d'onde employes, de la fluence, des schma
d'administration de lumire et d'acide -aminolvulinique, un risque de dommage oxydatif
l'ADN de cellules normales ou pr-cancreuse ne peut tre exclu. Cei devrait videment tre
investigu.

66
Par exemple les cellules dont le p53 est inactiv par une mutation; rappelons que des lots clonaux de telles
cellules sont frquents dans les zones exposes au soleil ( 1.4.5.1.2.1)
246
4.5 CONCLUSIONS
Une revue globale de la mutagense solaire montre que la problmatique est
extraordinairement complexe. Les lsions oxydatives monomres semblent n'avoir que des
consquences mineures dans le phnomne (cf 4.4.1) mais leur implication ne peut
cependant tre exclue (Kvam et Tyrrell, 1997b; Douki et al., 1999). De fait, certains
mcanismes de mutation, induites de manire plus efficace par les UVA et la lumire visible
que par les UVB et UVC, restent en partie inexpliqus, notamment au niveau des paires de
bases A:T (Kvam et Tyrrell, 1997b).
Mme si le rle de la 8-oxodG elle-mme s'avrait mineur dans la mutagense solaire,
rappelons que cette base est avant tout considre comme un biomarqueur sensible; elle
indique que les dfenses cellulaires ont t suffisamment malmenes pour que l'ADN soit
oxydativement endommag. Sa prsence prouve ds lors qu'il est tout fait possible que
d'autres bases oxydes, lsions monomres ou tandem, peut-tre non encore mises en
vidence, soient induites.
L'implication de la photodestruction de la PPIX sur les dgts l'ADN demande que la
rgulation fine de la synthse de l'hme soit mieux connue pour en tablir les phases dans le
cycle cellulaire. Ceci permettrait notamment d'valuer le risque d'exposition solaire des
moments peut-tre cruciaux.

247
5. Rsultats et Discussion :

Essai "comte"et photoactivation
des porphyrines endognes
248
5.1 L'ESSAI COMETE
5.1.1 Principe
L'essai comte, qui fait partie des mthodes d'estimation de cassures de chanes, se ralise
en plusieurs tapes :
(i) les cellules sont soumises au traitement valuer; elles sont ensuite spares sous
forme d'une suspension de cellules individualises, rinces et coules sur une lame
de microscope dans un gel d'agarose point de fusion bas;
(ii) les lames sont traites par une solution de lyse, contenant une concentration leve
en sel et un dtergent;
(iv)

(iii) elles sont alors rinces et places dans une solution de dnaturation au pH requis
pour le test de manire permettre un droulement et une dnaturation de l'ADN,
soumises une lectrophorse, rinces et sches;
aprs fixation d'un fluorophore, les structures obtenues, qui prsentent une forme de
comtes, c'est--dire de noyaux munis d'une "queue" s'talant vers l'anode (Figure
5.1-1), sont examines en microscopie de fluorescence et mesures grce un
logiciel d'analyse d'images.
Figure 5.1-1 : Exemples de comtes (essai comte en milieu fortement alcalin)

Cellules P388D1 non stresses Cellules P388D1 stresses
(Ethylmthylsulfonate, 2 mM, 6 h)





































C
A
T
H
O
D
E

T Q


T Q

















A
N
O
D
E




T : Centre de masse de la tte
Q : Centre de masse de la queue
249
En fonction du pH de la solution de dnaturation/lectrophorse, 3 types d'essai comte
sont distingus : (i) une solution "neutre" (en fait, pH 7.5 9.5) relche les super-hlices des
nuclodes et permet la migration des fragments double-brins (Ostling et Johanson, 1984); (ii)
une solution "faiblement alcaline"(pH 12.1) dnature l'ADN, permettant la migration des
fragments simple-brins; et (iii) une solution "fortement alcaline"(pH > 13) rvle les sites
alcali-labiles sous forme de cassures supplmentaires (Fairbairn et al., 1995).
5.1.2 Mcanisme
La fragmentation induirait un tat de relaxation des super-hlices d'ADN qui, sous l'effet
du champ lectrique, s'tirent et/ou migrent vers l'anode et ce, d'autant plus que la densit de
cassures de chanes est leve.
En milieu neutre, les fragments double-brins restent accrochs des structures
nucleodiques. Une seconde lectrophorse, perpendiculaire la premire, ne montre aucune
migration provenant de la queue initiale; seuls des fragments provenant de la tte sont librs
dans la direction perpendiculaire. Les fragments double-brins ne font donc que s'tirer
(Klaude et al., 1996). En milieu alcalin par contre, une seconde lectrophorse montre une
migration, la fois partir de la tte et de la queue. Il semble donc qu'il existe 2 types de
fragments mono-brins, des fragments de petite taille, capables de se dplacer librement, et des
fragments de grande taille, en partie non individualiss et enchevtrs au niveau du noyau, qui
ne peuvent que s'tirer (Klaude et al., 1996).
La plupart des agents gnotoxiques induisant 5 10000 fois plus de cassures simple-brins
que double-brins, l'introduction de la technique alcaline a permis d'atteindre une sensibilit
nettement suprieure (Singh et al., 1988).
La signification biologique des lsions simple-brins observes n'est cependant pas connue;
la plupart sont rapidement rpares et ne sont pas significativement ltales ou mutagnes
(Rojas et al., 1999). Les effets biologiques induits par une fragmentation double-brins sont
plus svres que ceux provoqus par des cassures simple-brins, la rparation s'avrant
nettement plus dlicate (Olive et al., 1991).
5.1.3 Applications de l'essai comte
L'essai comte connat de plus en plus d'applications dans des domaines divers; il a t
appliqu en gnotoxicit (Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999), en cotoxicologie (Cotelle
et Ferard, 1999), en biomonitoring (Kassie et al., 2000; Moller et al., 2000), en radiobiologie
(Olive, 1999), l'tude des mcanismes de rparation (Speit et Hartmann, 1995; Alapetite et
250
al., 1997), l'tude des agents alkylants (Monteith et Vanstone, 1995) et des agents oxydants
(Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999), l'tude de formation de liens croiss (Pfuhler et
Wolf, 1996), la dtection de l'apoptose (Fesus et al., 1991); son utilisation a galement t
propose en thrapeutique pour mettre en vidence des sous-populations de cellules
rsistantes ou hypoxiques (Olive et al., 1990; Olive et al., 1998).
Une revue rcente, trs complte, recense les nombreux agents tests par le test comte
pour leur gnotoxicit (Rojas et al., 1999); ceux-ci incluent notamment des mtaux, des
pesticides, des opiacs, des nitrosamines, des agents anticancreux. L'essai est apparemment
trs (trop ?) sensible; environ 85 % des agents tests donnent en effet une rponse positive
dont la signification biologique reste obscure (cf 1.4.2.1). Remarquons cependant un biais
certain de publication, beaucoup plus de gnotoxiques que de non-gnotoxiques ayant t
tests ce jour.
5.2 LA PLACE DE L'ESSAI COMETE DANS LES TESTS DE
GENOTOXICITE
5.2.1 Gnotoxiques et tests de gnotoxicit
Un gnotoxique est habituellement dfini comme "un agent qui induit une rponse
positive dans un essai biologique dont le point final est gntique" (Brusick, 1994). Cette
dfinition, qui considre que tous les types de dgts l'ADN se traduisent par une
gnotoxicit, n'est cependant pas indicatrice d'un risque. Il s'agit simplement d'un moyen
pratique de classer les composs en 2 groupes, "gnotoxique" et "non-gnotoxique" (Brusick,
1994).
La gnotoxicit, telle que dfinie ci-dessus, semble tre une proprit assez gnrale des
composs chimiques. Elle doit donc tre value globalement, partir d'un faisceau de
preuves; une conclusion ne peut tre base que sur un profil de rponses obtenu travers une
batterie de tests. Comme il est frquent que l'ensemble des tests raliss diverge quant
l'indication du risque, l'apprciation du danger pos par un compos ne peut alors reposer que
sur une interprtation raisonne de l'ensemble des preuves (Brusick, 1994; IARC, 1999;
Muller et al., 1999; Albertini et al., 2000) .
La complexit du problme est immense et les autorits rglementaires tentent de mettre
au point une valuation du danger en dfinissant (i) une batterie type de tests qui permettrait
de classer les produits; mais surtout (ii) une stratgie permettant d'adapter et de complter
cette batterie pour confirmer ou infirmer un risque impliqu par des rsultats douteux ou
251
positifs (Brusick, 1994; EEDP, 1995; Rueff et al., 1996; IARC, 1999; Kim et Margolin, 1999;
Marzin, 1999; Muller et al., 1999; Waters et al., 1999; Albertini et al., 2000).
Le problme reste entier pour les mcanismes pigntiques de carcinognicit qui ne sont
gnralement pas valus dans ces tests (IARC, 1999; Tsuda et al., 1999).
5.2.2 Les diffrents tests de gnotoxicit
Les tests de gnotoxicit peuvent tre groups en 3 catgories : (i) les indicateurs
gnraux du potentiel gnotoxique, qui incluent les test bactriens de mutagnicit, les tests
de dommages l'ADN, les mthodes cytogntiques et les tests pour l'induction d'enzymes
microsomiales; (ii) les biomarqueurs de l'exposition d'organismes entiers des agents
gnotoxiques (cf 1.2.9); et (iii) les intgrateurs des effets gnotoxiques, qui valuent un
point final sur des organismes entiers, lsions cancreuses chez les adultes et morphologies
aberrantes d'embryons ou de larves (EEDP, 1995).
Nous n'aborderons dans ce travail que la premire catgorie d'indicateurs, les tests de
gnotoxicit in vitro court terme, qui seront rapidement dcrits.
5.2.2.1 Les tests de mutagnicit
5.2.2.1.1 Test bactrien de Ames
Ce test mesure la frquence de rversion de mutation de souches de Salmonella
typhimurium auxotrophes pour l'histidine, en prsence et en l'absence de S9, un systme
d'activation microsomial mammifre. Une base de donnes considrable est tablie pour ce
test de mutagnicit, certainement le plus employ au monde et rcemment adapt l'chelle
de micro-mthode (Marzin, 1999). En fonction de la souche employe, des mutations par
substitution de base et de dcalage du cadre de lecture (frameshift) peuvent tre dtectes
(Brusick, 1994; EEDP, 1995).
5.2.2.1.2 Test bactrien Mutatox
Ce test mesure la rversion du caractre luminescent d'une souche de Vibrio fischeri dont
la luminescence a t abolie par une mutation (EEDP, 1995).
5.2.2.1.3 Mouse lymphoma assay
Une mutation forward de cellules murines L5178Y htrozygotes au niveau du locus
thymidine kinase (Tk
+/-
) vers un gnotype homozygote Tk
-/-
permet celles-ci de pousser en
prsence de 5-trifluoro-thymidine, un analogue de thymidine toxique pour l'hmizygote
(Brusick, 1994).
252
5.2.2.1.4 Test HPRT
Une mutation forward de lymphocytes au niveau du gne codant pour l'hypoxanthine-
guanine phosphoribosyltransfrase (HPRT) rend ces cellules rsistantes l'analogue 6-
thioguanine; ce gne, localis sur le chromosome X, rpercute diverses mutations, incluant
des substitutions de paires de bases, des dltions et des recombinaisons de chromosomes
htrologues (Albertini et al., 2000).
5.2.2.2 L'estimation des dommages primaires l'ADN
5.2.2.2.1 Mesure d'adduits l'ADN
Tous les adduits l'ADN dcrits dans la partie 1.1 et 1.2 de ce travail peuvent tre
mesurs l'aide de nombreuses mthodes analytiques; l'adduit 8-oxodG que nous avons
envisag est un des adduits principaux, indicateur d'un stress oxydatif au niveau de l'ADN.
5.2.2.2.2 Unscheduled DNA synthesis
Ce test mesure l'incorporation de thymidine tritie au cours des processus de rparation de
l'ADN aprs lsion gnotoxique.
5.2.2.2.3 Dtection d'ADN endommag
Le "test 3-D" utilise de l'ADN plasmidique adsorb sur des plaques multi-puits. Aprs
traitement gnotoxique, l'ADN est soumis l'action d'un extrait protique reproduisant
diverses ractions de rparation en prsence de dsoxynuclotides monophosphates
digoxygnyls. L'incorporation des dsoxynuclotides marqus est ensuite mesure par
chimioluminescence. Une variante procde de mme sur des cellules en culture, lyses in situ
aprs le traitement gnotoxique (Marzin, 1999).
5.2.2.3 L'estimation des dommages primaires l'ADN par mesure de la fragmentation
5.2.2.3.1 L'essai comte
L'essai comte fait partie de ces mthodes qui permettent la quantification (i) de cassures
de chanes primaires, directement induites par une attaque gnotoxique; (ii) de cassures de
chanes secondaires, apparaissant au cours des phnomnes de rparation; et (iii) de
nombreuses autres lsions qui peuvent tre transformes en cassures de chane par des
moyens chimiques (certaines lsions, comme les sites AP, peuvent tre rvles par un
traitement fortement alcalin) ou enzymatiques (les enzymes de rparation excisent
spcifiquement certaines lsions, gnrant soit un site AP, soit une cassure) (Epe et Hegler,
1994). En fonction du pH, les techniques permettent galement la distinction entre
fragmentations double-brins (milieu proche de la neutralit) et simple-brins (milieu alcalin,
dnaturation des chanes d'ADN).
253
5.2.2.3.2 La sdimentation en gradient de sucrose
Les molcules d'ADN sdimentant des vitesses diffrentes en fonction de leur taille, la
fragmentation peut tre value par des mthodes de centrifugation en gradient de sucrose.
La technique est cependant sujette de nombreux artfacts, dont certains dpendent des
proprits physiques de l'ADN lui-mme (Ahnstrom, 1988).
5.2.2.3.3 le "DNA unwinding"
Aprs droulement en milieu alcalin, les fragments d'ADN sont spars en fonction de
leur taille par chromatographie sur hydroxyapatite (Ahnstrom, 1988; Chicca et al., 1996).
5.2.2.3.4 La cytomtrie de flux
L'acridine orange met une fluorescence, verte lorsqu'elle est lie par de l'ADN double-
brin et orange par de l'ADN simple-brin; les 2 fluorescences sont mesures grce un
cytomtre de flux (Rydberg, 1984).
5.2.2.3.5 L'lution sur filtre
Les cellules sont lyses sur un filtre polymre et lues par des solutions de diffrents pH;
les profils d'lution en fonction du temps permettent d'estimer la fragmentation (Kohn et al.,
1976; Ahnstrom, 1988; Munzer et al., 1988; Epe et Hegler, 1994).
5.2.2.3.6 Les techniques visco-lastiques
La viscosit de l'extrait d'ADN, fonction de la fragmentation, est mesure par des
mthodes physiques (Ahnstrom, 1988).
5.2.2.3.7 L'lectrophorse en champ puls
Un champ puls travers une srie d'lectrodes disposes gomtriquement permet une
haute rsolution des fragments d'ADN de masse molculaire leve (Ahnstrom, 1988)
(Frenkel et Klein, 1993; Smeets et al., 1993). Elle convient mieux l'tude des fragmentations
double-brins que l'lectrophorse courant fixe (Frenkel et Klein, 1993; Yu et Anderson,
1997)
5.2.2.3.8 La sdimentation de nuclodes
En fonction de l'tat de fragmentation de l'ADN, qui conditionne le reploiement de la
double hlice, les nuclodes, structures nuclaires obtenues par lyse mnage des cellules,
sdimentent de manire diffrente en gradient de sucrose (Ahnstrom, 1988).
5.2.2.3.9 La technique "halo"
Aprs lyse mnage des cellules coules dans un gel d'agarose, les nuclodes se relchent
pour former un halo autour d'un noyau dense d'ADN. En fonction de la fragmentation, le halo
254
sera plus important. C'est une technique similaire un essai comte dont on omettrait la phase
d'lectrophorse (Thomas et Thomas, 1989; Wang et al., 1997; Sestili et Cantoni, 1999).
5.2.2.4 Les analyses cytogntiques
Ces tests permettent la mise en vidence d'aberrations chromosomiques (i) dans la
structure des chromosomes; ces effets clastogniques sont induits par une attaque directe de
l'ADN, une rplication sur une matrice (template) endommage ou une interfrence dans la
synthse de l'ADN; et (ii) dans le nombre des chromosomes; aneuplodie et polyplodie sont
induites par des dgts aux lments associs au faisceau mitotique, des dommages aux sous-
structures chromosomiques, des altrations physiologiques et des dgts mcaniques
(Albertini et al., 2000).
5.2.2.4.1 Les aberrations chromosomiques
Les cellules sont bloques en mtaphase par addition de colchicine, fixes sur lames,
colores par du Giemsa et examines au microscope pour reprer les aberrations
chromosomiques telles que cassures, dltions ou aneuplodie. Un marquage par hybridation
avec des sondes fluorescentes (FISH) permet de localiser les lsions et d'amliorer
sensiblement la qualit de la dtection. La frquence maximale d'aberrations chromosomiques
est observe dans les cellules en mtaphase de la premire gnration aprs exposition au
toxique (Albertini et al., 2000).
5.2.2.4.2 Les micronoyaux
Les micronoyaux sont des particules intracellulaires, contenant de l'ADN nuclaire et
dtectables par examen microscopique; leur taille est dfinie entre 1/20 et 1/5 d'un noyau et
elles peuvent par exemple contenir un chromosome ou un morceau de chromosome (Muller et
al., 1999). Ils sont mis en vidence par un blocage de la mitose par la cytochalasine-B avant la
cytocinse, ce qui gnre donc des cellules binucles.
Cette technique, fortement utilise, est en cours de validation au niveau international.
Couple aux techniques FISH, elle permet la mise en vidence de clastognes et d'aneugnes
ainsi que l'estimation de paramtres fondamentaux comme le retard de mitose (frquence de
cellules binucles), l'apoptose (frquence de noyaux condenss), la fragmentation et/ou perte
de chromosome et la non-disjonction de chromosomes.
5.2.2.4.3 Les changes de chromatides surs
Les changes de chromatides surs sont des changes rciproques d'ADN entre les loci
apparemment identiques des 2 chromatides surs d'un chromosome dupliqu. Bien que la
frquence d'changes de chromatides surs soit augmente par un gnotoxique qui induit des
255
dommages capables d'interfrer avec la rplication, leur mcanisme de formation reste
inconnu et leur signification biologique obscure (Albertini et al., 2000).
5.2.2.5 Les tests de transformation cellulaire
Ces tests valuent les transformations histologiques qui accompagnent la carcinogense;
ils se pratiquent par exemple sur des lignes de fibroblastes murins (C3H, Balb/3T3) ou des
cellules d'embryon de hamster (SHE).
5.2.2.6 Un exemple de batterie de tests
Dans le cadre de ICH (International conference on harmonisation of technical
requirements for registration of pharmaceuticals for human use), un effort a t entrepris en
vue d'un consensus sur une batterie minimale de tests et une stratgie d'valuation. La batterie
actuellement obligatoire pour les mdicaments comprend (i) un test de mutation sur bactrie;
(ii) un test in vitro, soit une valuation cytogntique des dgts chromosomiques dans une
ligne cellulaire mammifre, soit un mouse lymphoma assay; et (iii) un test in vivo des
dommages chromosomiques aux cellules hmatopotiques (Muller et al., 1999).
5.3 VALIDATION DE L'ESSAI COMETE
La technique comte tant implante dans le laboratoire au cours du prsent travail, nous
avons donc dcid de procder une validation de la mthode afin d'assurer la qualit des
donnes gnres. Remarquons cependant qu'une validation classique ne s'applique pas ce
type de mesures. En effet, les paramtres estims, le Olive tail moment et le tail DNA, sont
drivs de mesures semi-quantitatives et relatives ( 2.4.3.1); pour chaque cellule mesure, ils
dpendent notamment d'un rapport de signaux de fluorescence.
D'autre part, un goupe de travail (Comet assay working group), compos de spcialistes
du domaine, n'a pas pu dduire une mthode plus approprie qu'une autre parmi les
diffrentes variantes publies; il conclut simplement que "la mthode employe devrait
pouvoir dtecter des agents talons des doses appropries" (Tice et al., 2000).
Nous avons donc tudi sur notre modle cellulaire P388D1 les point suivants :
1. la reproductibilit de la mesure brute
2. la possibilit de mettre en vidence dans notre laboratoire les effets dcrits dans la
littrature pour quelques gnotoxiques, incluant notamment des composs
photooxydants
256
3. la diffrence de sensibilit entre les mesures comte et CLHP en valuant les
chantillons dont les taux de 8-oxodG ont t moduls pour la validation du
dosage CLHP ( 2.2.4.4).
Une fois ces points acquis, nous avons tudi sur les mmes cellules P388D1 traites par
l'acide -aminolvulinique et la lumire le problme de reproductibilit inter-lectrophorses
ainsi que celui de la mise en vidence statistique d'un effet. Ces rsultats font l'objet du 5.4.
5.3.1 Reproductibilit
L'tude
67
a t ralise en considrant la squence typique des oprations d'une mesure de
comte (les paramtres d'acquisition de la camra sont rgls pour chaque lame de manire
standardise, en fonction de l'intensit de la coloration) :
l'oprateur positionne une cellule dans la region of interest (cf 2.4.4.4.2) en
manipulant les commandes de la platine du microscope et rgle la focale qui lui
semble donner la meilleure mise au point;
la camra acquiert l'image et la place en mmoire;
le logiciel mesure les paramtres comtes et prsente visuellement le rsultat de la
mesure (Figure 2.4-2);
si l'oprateur n'accepte pas le rsultat propos, il modifie les seuils head threshold
et/ou tail threshold et remesure les paramtres sur l'image acquise.

Pour tudier l'ensemble du processus, nous avons valu la reproductibilit de mesure :
(i) d'une image acquise;
(ii) d'une mme comte acquise lors de chaque mesure;
(iii) d'une mme comte acquise en conditions relles, c'est--dire en drglant et en
re-rglant pour chaque mesure les coordonnes de la platine du microscope
(carter l'image de la region of interest et l'y ramener) ainsi que la focale;
(iv) d'une srie de comtes par plusieurs oprateurs entrans.


Pour les 3 premiers points tudis, les paramtres head threshold et tail threshold ont t
ajusts avant de commencer les mesures qui ont t ensuite acceptes telles quelles, sans
modifier aucun paramtre, de manire tester la reproductibilit du systme; des mesures qui
auraient t normalement rejetes
68
en pratique courante sont donc incorpores dans les

67
Nous remercions Mme M. Bette et M. G. Dehon de nous avoir apport leur aide pour ces mesures
68
Un examen des profils d'intensit ( 2.4.3.2) permet d'estimer visuellement si la mesure est satisfaisante.
257
rsultats. Pour la comparaison inter-oprateurs, chacun a reu pour consigne de mesurer en
conditions relles et d'appliquer les paramtres de mesure qui lui semblent les plus adquats
en fonction de son exprience.
5.3.1.1 Reproductibilit de la mesure brute d'une image acquise
Une image acquise a t mesure 20 reprises par le logiciel Komet, et ce pour une
cellule "contrle" (non endommage) et pour 2 cellules prsentant respectivement environ 35
et 80 % d'ADN dans la queue. (Tableau 5.3-1).

Tableau 5.3-1 : Paramtres principaux mesurs par le logiciel Komet sur une image acquise

Cellule 1 Cellule 2 Cellule 3
Mesure
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
1 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
2 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
2 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
4 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
5 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
6 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
7 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
8 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
9 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
10 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
11 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
12 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
13 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
14 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
15 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
16 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
17 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 20.86 64.47
18 3008.55 20.86 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47
3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
20 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
m 3008.55 0.92 24.37 0.14 3583.35 38.08 35.53 4.71 2294.23 79.19 64.47 20.86
s 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CV % 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
19


Pour une image place en mmoire, le logiciel est parfaitement reproductible, quel que
soit le niveau de dommages mesur.
258
5.3.1.2 Reproductibilit de la mesure brute d'une mme image acquise lors de chaque
mesure
Une image a t acquise et mesure 20 reprises par le logiciel Komet, et ce pour une
cellule "contrle" (non endommage) et pour 2 cellules prsentant respectivement environ 35
et 80 % d'ADN dans la queue. (Tableau 5.3-2).

Tableau 5.3-2: Paramtres principaux mesurs par le logiciel Komet sur une image acquise
lors de chaque mesure

Cellule 1 Cellule 2 Cellule 3
Mesure
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
1 3151.99 0.79 2105.59 22.34 0.14 3808.3 38.41 36.55 4.84 80.28 50.25 20.96
2 3018.74 0.87 25.38 0.17 3969.24 38.52 61.42 4.93 2129.11 80.8 51.78 21.61
2 3454.02 0.91 35.03 0.18 3510.45 38.34 38.58 4.68 2144.52 81.04 55.84 20.8
4 2998.1 0.63 14.72 0.1 3940.24 38.68 48.73 4.87 2043.93 79.79 50.25 21.25
5 3300.13 0.91 26.4 0.18 3493.99 38.82 36.04 4.79 2255.56 82.08 47.21 20.66
6 3313.45 0.95 3848.01 29.44 0.19 39.17 37.56 4.92 2494.63 80.4 69.54 22.14
7 3094.77 0.86 21.83 0.15 3696.48 33.98 35.03 4.48 2205.4 78.13 50.76 19.73
8 3651.28 1.17 34.01 0.26 3529.26 33.99 33.5 4.44 2264.71 77.29 50.76 20.33
9 3454.28 1.06 26.4 0.2 3776.43 39.21 41.62 4.92 2279.6 79.63 59.9 21.09
10 3110.7 0.83 25.38 0.15 3752.39 39.34 42.13 4.9 2154.45 81.52 47.21 21.13
11 3460.55 1.06 30.46 0.22 3716.33 39.38 38.07 4.87 2145.83 78.76 51.27 19.97
12 3157.21 0.79 25.38 2203.31 0.12 4003.21 39.67 59.9 5.04 82.85 67.51 20.96
13 3593.8 81.49 1.25 35.53 0.26 3972.64 34.83 59.9 4.65 2120.22 48.73 21.43
14 3282.36 0.78 18.27 0.14 3712.41 39.56 36.55 4.8 2061.44 79.97 50.76 21.13
15 2762.69 0.61 14.72 0.1 3777.21 35.05 34.01 4.6 2156.54 80.12 47.72 21.24
16 3176.55 0.73 23.86 2329.24 0.14 3669.3 35.19 45.69 4.57 80.97 62.44 21.78
17 3494.51 1.05 29.44 0.21 3883.81 35.51 37.06 4.64 2183.97 79.23 48.22 20.78
18 3704.31 1.18 31.98 0.26 3918.3 40.28 61.42 4.98 2195.21 80.69 68.53 21.02
19 3506.01 0.91 25.38 0.19 3893.21 35.62 60.41 4.72 2187.37 80.87 47.72 21.47
20 3327.56 0.97 24.37 0.19 4124.96 35.82 57.36 4.86 2237.27 81.55 67.51 21.37
m 3300.65 0.92 26.02 0.18 3799.81 37.47 45.08 4.78 2194.90 80.37 54.70 21.04
s 243.06 0.18 5.94 0.05 170.71 2.16 10.74 0.17 100.60 1.34 8.02 0.57
CV % 7% 19% 23% 6% 28% 4% 24% 4% 5% 2% 15% 3%

Pour des mmes comtes acquises et mesures, les performances du systme sont
nettement infrieures; ce problme, apparent lors du travail courant, ncessite de frquents
ajustements de l'utilisateur. Le paramtre le plus affect est le tail length, ce qui se reflte sur
le Olive tail moment. Les performances sont les moins bonnes dans le cas de cellules non
endommages.
259
5.3.1.3 Reproductibilit de la mesure brute d'une image acquise en conditions relles
Une image a t acquise en drglant et en re-rglant pour chaque mesure la focale ainsi
que les coordonnes de la platine du microscope et mesure 20 reprises par le logiciel
Komet, et ce pour une cellule "contrle" (non endommage) et pour 2 cellules prsentant
respectivement environ 35 et 80 % d'ADN dans la queue. (Tableau 5.3-3).

Tableau 5.3-3 : Paramtres principaux mesurs par le logiciel Komet sur une image acquise
lors de chaque mesure

Cellule 1 Cellule 2 Cellule 3
Mesure
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Olive
Tail
Moment
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
1 3240.56 1.61 36.55 0.27 3803.6 4.89 37.37 44.16 3154.6 84.29 55.84 25.81
2 3320.51 0.79 30.96 0.18 3786.88 34.88 34.01 4.59 3537.1 82.58 73.1 25.42
2 3555.39 1.76 34.52 0.32 3929.79 36.52 40.1 4.8 3349.51 83.95 56.35 24.48
4 3332.52 1.18 25.89 0.21 3556.7 36.93 34.52 4.64 3308.75 83.06 54.82 24.9
5 3426.32 1.07 29.44 0.2 3888.77 34.81 45.69 4.51 3225.14 83.89 52.79 25.51
6 3196.92 0.77 38.07 0.15 4474.02 36.31 57.87 5.17 3242.65 87.28 58.38 26.64
7 3532.14 1.44 38.07 0.32 3770.94 35.86 33.5 4.68 3173.93 85.37 62.94 25.96
8 3620.71 1.44 26.4 0.29 3746.38 37 34.52 4.62 3442.78 81.99 50.76 22.91
9 3410.64 1.02 37.06 0.23 4315.95 40.96 67.51 5.25 3136.31 84.12 55.33 25.81
10 3527.69 1.31 36.55 0.33 3917.25 39.14 35.03 4.95 3014.3 84.54 52.79 25.78
11 3604.25 1.32 34.52 0.23 3761.27 39.48 37.06 4.94 2985.03 86.83 54.31 26.68
3192.74 0.63 0.12 3723.91 36.86 41.62 4.66
(a)

3694.65 1.56 33.5 0.34 4126.27 34.11 37.06 4.83
14 3361.26 1.04 32.49 0.18 4103.54 36.65 53.81 4.95
15 3767.54 1.95 43.65 0.52 3851.93 39.91 36.04 4.9
16 3543.63 1.26 21.32 0.27 3798.37 39.04 37.06 4.81
17 3761.01 1.65 42.64 0.48 3679.49 35.15 33.5 4.53
18 3755.79 1.31 41.62 0.36 3885.38 42.13 33.53 4.53
19 3371.45 1.01 42.13 0.21 3753.43 37.87 37.06 4.67
20 3310.84 1.18 30.46 0.23 3786.35 37.22 37.06 4.7
3476.33 1.27 34.65 0.27 36.98 40.97 4.78 3233.65 84.35 57.04 25.45
s 186.78 0.34 5.98 0.10 219.69 1.99 9.09 0.21 168.60 1.63 6.22 1.06
CV % 5% 27% 4% 17% 38% 6% 5% 22% 4% 5% 2% 11%
12 37.06
13
m 3883.01

(a)
Cette mesure est beaucoup plus longue raliser que celles des Tableaux 5.3-1 et 5.3-2; pour des cellules aussi
endommages, le bleaching nous a empch de raliser plus de 11 mesures

Nous arrivons au mme type de conclusion que prcdemment; la mise au point manuelle
et optique des comtes n'ajoute quasi rien la variabilit de l'acquisition d'image.
260
5.3.1.4 Reproductibilit inter-oprateurs de la mesure brute
Une srie de 10 images diffrentes a t acquise par 3 oprateurs, chaque image tant
acquise par chaque oprateur 3 reprises dans les conditions du 5.3.1.3 (Tableau 5.3-4);
nous avons volontairement choisi des comtes montrant des dgts d'intensits diffrentes.

Tableau 5.3-4 : Paramtres principaux mesurs par le logiciel Komet sur une image acquise
lors de chaque mesure

Oprateur 1 (D.G.) Oprateur 2 (D.P.) Oprateur 3 (B.M.)
Cellule
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
Surface
de la
comte
Tail
DNA
Tail
length
Olive
Tail
Moment
1 3687.33 55.00 40.61 5.44 3683.94 55.79 37.06 5.36 3877.8 58.62 42.13 5.61
3512.28 55.91 3732.79 55.17 5.54 37.06 5.42 41.12 5.29 3630.64 58.23 39.09
3927.18 58.07 42.13 5.60 3813.00 58.62 58.38 37.06 5.56 3399.93 43.65 5.48
2 3667.48 56.37 44.16 7.09 2674.12 58.48 46.7 7.66 2819.39 58.43 39.59 6.78
2727.16 58.20 40.10 6.70 2631.27 55.61 37.06 6.57 2909.79 55.19 38.58 6.50
2567.78 56.35 38.07 6.56 2701.81 57.15 6.58 2963.09 6.89 39.09 58.43 39.09
3 1000.41 0.86 1698.53 0.10 3.55 0.10 0.81 5.58 1526.61 0.59 7.61 0.08
1030.20 0.12 1728.58 0.08 1.02 4.57 0.54 6.09 1606.04 0.92 6.60 0.11
926.47 0.53 3.05 0.07 1707.67 0.52 5.08 0.07 3.55 1358.35 0.37 0.05
4 1149.07 17.68 29.44 1.36 2328.19 14.78 39.09 1.58 30.46 2159.41 12.36 1.25
2454.39 13.79 38.07 1.44 2270.72 15.21 38.07 1.51 2215.85 14.92 36.55 1.45
2685.09 18.89 38.58 1.78 2445.77 17.91 43.65 1.73 1986.97 9.28 30.96 1.01
5 2151.58 2.27 31.98 2.91 0.58 2164.12 2.19 28.43 0.47 3151.99 25.89 0.75
2471.89 3.25 0.83 2.48 32.49 0.66 37.06 2270.98 2636.50 3.04 41.62 0.83
2090.44 2.12 25.89 0.49 2267.84 2.54 29.44 0.65 2637.28 2.46 36.04 0.45
6 5291.02 57.57 53.81 50.25 12.59 51.78 12.12 3420.31 60.38 3655.2 60.79 12.78
4996.3 59.14 12.74 58.21 58.88 12.89 3577.86 54.31 3430.76 58.77 49.24 12.54
3585.17 57.83 54.31 12.27 3741.94 58.99 54.82 12.99 3478.05 58.71 50.25 12.61
7 1925.05 35.89 36.04 4.87 2164.64 39.78 35.03 4.82 2306.25 39.2 28.93 4.77
1933.94 37.82 35.03 5.18 2152.62 34.32 29.44 4.58 2200.96 39.21 30.46 4.72
2036.09 41.61 36.04 5.39 2121.53 38.34 27.92 4.56 2111.34 37.91 29.95 4.42
8 1847.98 43.22 2078.94 45.89 6.49 43.65 43.15 5.78 43.15 1967.64 49.21 6.03
2024.34 48.54 44.67 6.28 2033.48 48.13 43.65 6.07 1860.78 45.80 44.67
1933.94 43.50 41.12 5.81 1917.48 50.30 42.64 6.33 1992.46 49.95 45.69 6.84
9 2432.44 53.09 47.72 10.29 2533.29 57.43 47.21 10.76 2785.42 54.54 47.72 10.74
2578.75 53.43 47.72 10.50 2634.14 57.08 46.19 10.62 2686.40 54.35 47.21 10.60
2563.08 53.54 47.21 10.56 2667.33 58.40 48.22 10.84 2967.27 55.13 46.70 11.07
10 2585.81 48.16 39.59 6.91 2720.63 49.52 7.13 39.09 2944.80 49.82 40.10 7.24
2784.90 48.54 39.59 7.10 2842.38 53.18 40.10 7.39 2789.08 53.56 39.59 7.42
2653.48 50.48 39.59 7.13 2831.93 49.36 38.58 7.11 2729.77 54.35 38.58 7.46
5.8
261
En considrant que les conditions de normalit et d'homoscdasticit sont remplies par les
distributions des mesures de chaque oprateur, une analyse ANOVA 2 facteurs de
classification a t effectue pour chaque paramtre, en considrant un effet alatoire, la
comte mesure, et un effet fixe, l'oprateur (Tableau 5.3-5).

Tableau 5.3-5 : Comparaison de 3 oprateurs analysant 10 images diffrentes
1 facteur alatoire, la comte; 1 facteur fixe, l'oprateur
(***, p< 0.001; **, p<0.01; *, p<0.05)

Paramtre
tudi
Source de
variation
Somme des
carrs
ddl Carr moyen F Probabilit du
F observ
Oprateur 45221.371 2 22610.686 0.30 0.7446
NS
Image 47713707.448 9 5301523.050 22.07 < 0.001
***
Interaction O x I 4323455.649 18 240191.981 3.15 < 0.001
***
Surface de la
comte
60 Rsidu 4578565.862 76309.431
CV% = 10.6 %
Oprateur 13.997 2.57 2 6.998 0.0853
NS

Image 43995.528 9 4888.392 834.39 < 0.001
***

Interaction O x I 105.456 18 5.859 2.15 0.0143
*

Tail DNA
Rsidu 163.663 60 2.728
CV% = 4.3 %
Oprateur 8.722 2 4.361 0.54 0.5857
NS

Image 13517.702 9 1501.967 109.09 < 0.001
***

Interaction O x I 247.828 18 13.768 1.70 0.0638
NS

Tail Length
Rsidu 484.757 60 8.079
CV% = 7.7 %
Oprateur 0.083 2 0.041 0.75 0.4750
NS

Image 1368.776 9 152.086 1812.19 < 0.001
***

Interaction O x I 1.511 18 0.084 1.53 0.1128
NS

Olive Tail
Moment
Rsidu 3.300 60 0.055
CV% = 4.2 %


Il n'y a pas d'effet oprateur, quel que soit le paramtre mesur. Une interaction
oprateur X chantillon se marque cependant aux niveaux de la surface de la comte et du tail
DNA, indiquant que l'oprateur peut influencer la mesure de ces paramtres pour certaines
comtes. L'examen des rsultats bruts montre que cette influence est relativement faible et
peut tre considre comme ngligeable.
262
5.3.1.5 Conclusions
Cette tude montre que le plus grand facteur de variabilit provient de l'tape d'acquisition
d'image, notamment pour le paramtre tail length qui influence ngativement le Olive tail
moment. Lorsque l'oprateur intervient pour corriger les mesures, la reproductibilit
s'amliore sensiblement pour ces 2 paramtres.
Les coefficients de variation mesurs sur 10 cellules diffrentes acquises 3 reprises par 3
oprateurs diffrents sont de l'ordre de 4 % pour les 2 paramtres les plus usits dans la
littrature, le tail DNA et le Olive tail moment.
Nous pouvons donc estimer que la mesure de comtes est globalement fiable et qu'il n'y a
pas, du moins dans nos mains, de diffrence majeure entre oprateurs.
5.3.2 Mise en vidence de quelques effets gnotoxiques dcrits
Quelques effets gnotoxiques publis dans la littrature ont t reproduits au Laboratoire.
Soulignons qu'une comparaison entre ces rsultats et les donnes publies ne peut tre
qu'essentiellement qualitative car chaque auteur teste des cellules et temps de contact
diffrents et emploie une mthode d'valuation du dommage qui lui est propre. Nous
69
avons
expriment sur notre modle P388D1 une srie de gnotoxiques qui prsentent des
mcanismes d'action diffrents : (i) le sulfate de blomycine, un anticancreux
radiomimtique, test 5 concentrations, 10, 25, 50, 75 et 100 g/ml; (ii) l'thyl-
mthanesulfonate (EMS), un agent alkylant monofonctionnel, test 3 concentrations, 2, 5 et
10 mM; (iii) le cis-platine, un agent qui se comporte au niveau biologique comme un alkylant
bifonctionnel et forme de nombreuses liaisons croises, notamment intercatnaires, dans
l'ADN; il a t test seul, la dose de 537 M, et en prsence de 5 mM d'EMS, aux doses de
269 et 537 M; et (iv) la N-nitroso-N-mthyl-thylamine, une nitrosamine qui ne devient
gnotoxique qu'aprs activation mtabolique. La photoactivation des gnotoxiques suivants a
t galement teste : (i) la ciprofloxacine aux concentrations de 30 et 150 M; et (ii) le
chlorhydrate de ttracycline aux concentrations de 1 et 2 M.
En raison du caractre non-gaussien de la plupart des distributions (cf, plus loin, 5.4),
nous avons choisi de prsenter les rsultats sous forme de box plots qui permettent une
comparaison rapide et aise de diffrents chantillons. Ces box plot matrialisent (i) la
mdiane, par la ligne l'intrieur de la bote; (ii) les percentiles 25 et 75, par les extrmits

69
L'ensemble de ces mesures a t ralis avec le concours de Mlle Marjorie Blot, de M. Gilles Dehon et de
M. Laurent Boccart, dans le cadre de leurs mmoires de fin d'tudes. Nous les remercions de leur collaboration
efficace et enthousiaste.
263
infrieure et suprieure de la bote; (iii) les percentiles 10 et 90, par les extrmits des tiges
infrieure et suprieure; et (iv) les valeurs exprimentales extrmes, respectivement
infrieures et suprieures aux percentiles 10 et 90.
5.3.2.1 La blomycine
L'activit biologique de la blomycine requiert de l'oxygne et dpendrait de la formation
de chlates avec le fer; elle attaque le squelette osidique de l'ADN avec formation de sites AP
et cassures de chanes (Jaloszynski et al., 1997). La Figure 5.3-1 prsente les rsultats
obtenus.
A partir de 50 g/ml, un effet manifeste se prsente par une augmentation de la mdiane
des rsultats, mais surtout par une augmentation de la dispersion (inter-quartile range). Dans
la zone de concentrations investigue, il n'y a cependant pas de relation dose-effet pour le
temps tudi. Ces rsultats peuvent tre rapprochs des donnes
70
rapportes par (Anderson et
al., 1994) qui observent des dgts extrmement faibles 10.3 g/ml et des dgts fort
apprciables 103 g/ml (lymphocytes humains, 30 min de contact, mesures de tail moment).

Figure 5.3-1 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose de
sulfate de blomycine (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; 50 comtes
mesures par concentration; dnaturation et lectrophorse pH > 13).
Sulfate de blomycine
(g/ml)
0 10 25 50 75 100
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
Concentration de blomycine
(g/ml)
0 10 25 50 75 100
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40

D'autres donnes montrent (i) un effet quivalent 4 fois le tmoin et 12 fois le tmoin
pour des concentrations de respectivement 10 et 50 g/ml (lymphocytes humains de patients
cancreux, 10 min de contact, somme des scores attribus visuellement aux comtes)
(Jaloszynski et al., 1997); (ii) un effet significatif entre 1.4 et 7 g/ml (leucmie murine
L1210, 48 h, tail length) (Kasamatsu et al., 1995); et (iii) un effet significatif pour les

70
Nous avons converti en g/ml les doses publies en utilisant les facteurs suivants fournis par Sigma : Mr du
compos A2 majoritaire = 1416.58; l'activit moyenne du sulfate de blomycine est de 1.45 U/mg
264
concentrations comprises entre 0.34 et 9.9 g/ml sans relation dose-effet (cellules CHO, 1 h
de contact, tail length) (Miyamae et al., 1997a). Rappelons que la haute sensibilit du
paramtre tail length explique certainement les rsultats rapports aux doses les plus faibles.
5.3.2.2 L'thylmthanesulfonate (EMS)
Les cassures de chanes induites par l'EMS ont une double origine; elles proviennent la
fois de son activit alkylante et des incisions induites par les mcanismes de rparation.
Dans nos rsultats (Figure 5.3-2), les dgts croissent avec la dose d'EMS, de manire
pratiquement proportionnelle pour 6 h d'incubation mais avec un plateau apparent pour 3 h.
Pour les doses plus faibles, les dgts sont moindres aprs l'incubation la plus longue,
refltant probablement la cintique de rparation.
La littrature mentionne (i) de 12 65 % de tail DNA avec relation dose-effet pour des
concentrations comprises entre 1 et 4 mM (ligne rythroleucmique humaine K562, 2 h de
contact) (De Boek et al., 2000); (ii) de 19 38 % de tail moment
71
une dose de 2 mM
(lymphocytes humains, 1 h) ; et (iii) un effet significatif pour les concentrations comprises
entre 27 et 805 M sans relation dose-effet (cellules CHO, 1 h de contact, tail length)
(Miyamae et al., 1997a).

Figure 5.3-2 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose
d'thylmthanesulfonate (cellules P388D1; temps de contact, 3 h et 6h; 100
comtes mesures sur 2 lames par concentration; dnaturation et lectrophorse
pH > 13).
Contrle 2 5 10 2 5 10
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
EMS (mM)
3 heures
EMS (mM)
6 heures
Contrle 2 5 10 2 5 10
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
10
20
30
40
EMS (mM)
3 heures
EMS (mM)
6 heures


71
Note : la dfinition du tail moment de cet auteur est diffrente de celle applique dans ce travail; elle
correspond au produit du tail DNA et du tail length
265
5.3.2.3 Le cis-platine
Le cis-platine forme des liens croiss entre les brins d'ADN, ce qui empche la migration
ventuelle des brins fragments suite un traitement gnotoxique. Nos rsultats (Figure 5.3-3)
montrent qu'effectivement la quantit d'ADN ayant migr en prsence de cet agent est
infrieure celle du contrle; de mme, le traitement concomitant des cellules avec le cis-
platine et l'EMS rduit fortement la migration d'ADN induite par ce dernier. Ces rsultats sont
tout fait en accord avec ceux publis (Pfuhler et Wolf, 1996).

Figure 5.3-3 : Effet du cis-platine sur la migration de l'ADN de cellules contrles et de
cellules traites par l'thylmthanesulfonate (cellules P388D1; temps de
contact, 3 h; 100 comtes mesures sur 2 lames par concentration; dnaturation
et lectrophorse pH > 13).
C
o
n
t
r

l
e
E
M
S

5

m
M
C
i
s
-
P
t

2
6
9

M

+

E
M
S

5

m
M
C
i
s
-
P
t

5
3
7

M

+

E
M
S

5

m
M
C
i
s
-
P
t

5
3
7

M
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100

C
o
n
t
r

l
e
E
M
S

5

m
M
C
i
s
-
P
t

2
6
9

M

+

E
M
S

5

m
M
C
i
s
-
P
t

5
3
7

M

+

E
M
S

5

m
M
C
i
s
-
P
t

5
3
7

M
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40


5.3.2.4 La N-nitroso-N-mthyl-thylamine
Avec ce compos, une lgre augmentation du tail DNA est observe (Figure 5.3-4), mais
aucun effet en ce qui concerne le Olive tail moment; cette diffrence pourrait tre due un
lger effet clastognique, correspondant une faible migration de grosses pices d'ADN.
Nous pouvons donc conclure que, pour le temps et les doses tests, il n'y a qu'un effet trs
limit de ce compos sur notre modle. Les donnes publies montrent une activit de
l'analogue N-nitroso-N-dimthylamine sur des hpatocytes en culture (Ashby et al., 1995) et
sur des cellules de foie humain T5-2E1 et T5-1A2, qui expriment respectivement les
cytochromes CYP2E1 et CYP1A2, mais pas sur des T5-neo qui sont dpourvues d'activit
cytochrome (de 0.135 13.5 M, 1 h de contact) (Barcelo et al., 1998). Une tude in vivo sur
souris a montr un effet comte de la N-nitroso-N-dithylamine sur le foie, le rein et le
poumon, mais pas sur la rate et la moelle osseuse (Miyamae et al., 1998). Les nitrosamines,
266
qui requirent en effet une activation mtabolique pour montrer un effet carcinogne,
pourraient donc tre pratiquement considres comme un contrle ngatif pour notre modle.

Figure 5.3-4 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose de N-
nitroso-N-mthyl-thylamine (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; 50
comtes mesures par concentration; dnaturation et lectrophorse pH > 13).
N-nitroso-N-mthyl-thyl-amine (M)
0 284 568
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
N-nitroso-N-mthyl-thyl-amine (M)
0 284 568
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40

5.3.2.5 La ciprofloxacine et les UVA
Les antibiotiques du groupe des fluoroquinolones
72
possdent des proprits photo-
sensibilisantes importantes; bien que la ciprofloxacine soit une des molcules les moins
phototoxiques, elle se dgrade sous irradiation lumineuse en librant des espces ractives de

Figure 5.3-5 : Effet de l'irradiation UVA de la ciprofloxacine sur le Tail DNA et le Olive tail
moment (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; irradiation, UVA, 4C,
15 min soit 279 mJ/cm; 50 comtes mesures par concentration; dnaturation
et lectrophorse pH > 13).
Contrle UVA 30 150 30 150
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
Ciprofloxacine (M)
+ UVA
Ciprofloxacine (M)
Contrle UVA 30 150 30 150
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
10
20
30
40
Ciprofloxacine (M)
+ UVA
Ciprofloxacine (M)


72
La ciprofloxacine ne possde pas de fluor en position 8; pour les molcules les plus phototoxiques de la srie,
les UVA induisent la perte de cet atome fluor et la formation d'un radical carbne hautement ractif
267
l'oxygne qui induisent une gnotoxicit (Chetelat et al., 1996; Snyder et Cooper, 1999).
Dans nos essais comte (Figure 5.3-5), la ciprofloxacine seule montre un effet comparable
celui des UVA. Ceci pourrait s'expliquer par un manque de slectivit de cet antibiotique
qui peut agir non seulement sur la gyrase bactrienne mais galement sur son analogue
eucaryote, la topoisomrase II (Snyder et Cooper, 1999); ce qui semble confirm par une
lgre augmentation de l'effet avec la dose. Lors de l'exposition la ciprofloxacine et aux
UVA, une augmentation trs importante des dgts est observe; une relation dose-effet
s'observe en Olive tail moment, alors que le tail DNA sature. Ces rsultats sous UV sont du
mme ordre que ceux rapports (lymphome de souris L5178Y, concentrations de 30 300
M, 20 min de contact, illumination par un simulateur solaire, 500 mJ/cm, t de la pice)
(Chetelat et al., 1996).
5.3.2.6 La ttracycline et les UVA
La photodgradation des ttracyclines est un processus bien connu; l'irradiation par les
longueurs d'onde suprieures 290 nm induit un processus de dsamination accompagn par
la gnration de radicaux carbons et de

OH; la gnration d'oxygne singulet a galement


t observe (Witte et al., 1994). La Figure 5.3-6 montre que la ttracycline seule 2 M
induit des effets plus importants que les UVA au niveau de l'ADN. Ceci pourrait tre d un
effet gnotoxique de la ttracycline elle-mme (Witte et al., 1994) ou, malgr toutes nos
prcautions, de faibles expositions la lumire en cours de manipulation. Lors de
l'exposition aux UVA, une forte augmentation de la fragmentation est observe en prsence
de ttracycline. Ces effets, notre connaissance non encore mis en vidence par le test
comte, peuvent tre compars ceux rapports (Witte et al., 1994) par une mthode d'lution
alcaline
73
pH 12.1 (ligne de fibroblastes humains GM 5659, concentrations de 0.5
1.75 mM, illumination par une lampe visible incandescence, 37C, 1h). La diffrence entre
les doses actives, d'un facteur 250, pourrait s'expliquer par (i) une diffrence de sensibilit des
lignes cellulaires; (ii) une diffrence de rendement de l'irradiation (lampe UVA et lampe
visible); et (iii) une diffrence de mthodologie (essai comte pH > 13 et lution alcaline pH
12.1), l'essai comte rvlant en plus les lsions alcali-labiles.

73
Qui mesure les cassures de chanes simple-brin, cf 5.2.2.3.4; ce pH, les sites alcali-labiles ne sont pas mis
en vidence
268
Figure 5.3-6 : Effet de l'irradiation UVA de la ttracycline sur le Tail DNA et le Olive tail
moment (cellules P388D1; temps de contact, 3 h; irradiation, UVA, 4C,
15 min soit 279 mJ/cm; 50 comtes mesures par concentration; dnaturation
et lectrophorse pH > 13).
Contrle UVA 1 M 2 M 1 M 2 M
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
Ttracycline
+ UVA
Ttracycline
Contrle UVA 1 M 2 M 1 M 2 M
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ttracycline
+ UVA
Ttracycline

5.3.3 Diffrence de sensibilit entre les mesures comte et CLHP
Nous avons ralis des mesures comtes sur les chantillons dont les taux de 8-oxodG ont
t moduls pour la validation du dosage CLHP ( 2.2.4.4). Les rsultats prsents la Figure
5.3-7 montrent qu'une fragmentation intense est dj induite par le peroxyde d'hydrogne et
les UVC seuls. En tail DNA, leur effet combin est infrieur un effet additif et ne montre
aucune relation avec la dose d'UVC; en tail moment
74
, par contre, une relation entre la
fragmentation et la dose d'UVC est observe aux doses faibles.
La comparaison de ces rsultats avec les taux de 8-oxodG induits (Figure 5.3-8) tels que
mesurs par CLHP ( 3.3.4.3.4), ne montre aucune relation, l'essai comte tant probablement
quasi satur la dose la plus faible d'UVC. Le traitement terriblement oxydant, appliqu
dlibrment pour la validation CLHP, induit dj une intense fragmentation de l'ADN, mme
pour des niveaux de 8-oxodG relativement modestes.
Signalons que le peroxyde d'hydrogne seul n'induit pas d'augmentation significative de la
8-oxodG sur les cellules P388D1, en tous cas pour la dose fort leve (20 mM) et le temps de
contact (15 min) tudis; cette observation, a priori tonnante, a dj t constate sur un
autre modle (kratinocytes de souris drivs de la ligne 291.09, de 1 20 mM, 15 min)
(Beehler et al., 1992; Przybyszewski et al., 1998).


74
Note : ces mesures ont t ralises avec le logiciel Komet 3.0 qui ne calculait pas le Olive Tail Moment; le
Tail Moment correspond au produit du tail DNA et du tail length et est donc systmatiquement plus lev
269
Figure 5.3-7 : Effet de l'irradiation UVC du peroxyde d'hydrogne sur le Tail DNA et le Tail
moment
74
(cellules P388D1; 20 mM H
2
O
2
; irradiation UVC, t ambiante, 2
15 min; 100 comtes mesures par concentration; dnaturation et
lectrophorse pH > 13; l'chantillon trait par H
2
O
2
et non irradi est rest
en contact avec le peroxyde pendant 15 min).
Temps d'irradiation UVC (min)
0 10 0 2 5 10 15
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
Contrle H
2
O
2
20 mM

Temps d'irradiation UVC (min)
0 10 0 2 5 10 15
T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
40
80
120
160
Contrle
H
2
O
2
20 mM

Figure 5.3-8 : Comparaison de la fragmentation de chanes et des taux de 8-oxodG induits par
irradiation UVC du peroxyde d'hydrogne (cellules P388D1; 20 mM H
2
O
2
;
irradiation UVC, t ambiante, 2 15 min).

0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0 10 20 30 40
8-oxodG par 10
5
dG
T
a
i
l

D
N
A
50
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0 10 20 30 40
8-oxodG par 10
5
dG
T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
50


De gauche droite, les points correspondent : 20 mM H
2
O
2
15 min; 20 mM H
2
O
2
+ UVC 2 min; 20 mM
H
2
O
2
+ UVC 5 min; 20 mM H
2
O
2
+ UVC 10 min; 20 mM H
2
O
2
+ UVC 15 min.
Pour la 8-oxodG, les points reprsentent la moyenne et les barres l'cart talon (n = 12, sauf pour les 2
premiers points o n = 3); pour les donnes comtes, les points reprsentent la mdiane et les extrmits
des barres les percentiles 25 et 75 (100 comtes mesures sur 2 lames)
5.3.4 Conclusion
Aprs avoir tabli la fiabilit des mesures brutes, nous avons vrifi que nous pouvions
mettre en vidence le caractre gnotoxique de composs dcrits : (i)la blomycine et
l'thylmthanesulfonate, qui induisent des cassures de chanes, donc une migration; (ii) le cis-
platine, qui induit des liens croiss, donc une absence de migration; (iii) la ciprofloxacine et la
270
ttracycline, qui induisent des cassures de chanes principalement aprs photoactivation. La
N-nitroso-N-mthyl-thylamine montre une activit trs faible, ce qui indique, comme
attendu, une faible capacit mtabolique de nos cellule.
Comme nous l'avons soulign, il est difficile de comparer exactement les rsultats obtenus
aux donnes de la littrature; mais, globalement, nos donnes sont cohrentes avec celles
publies et parviennent des conclusions semblables.
La mthode dveloppe au laboratoire offre donc des mesures fiables qui permettent de
mettre en vidence les effets gnotoxiques de manire similaire d'autres quipes, objectif
propos, nous le rappelons, par le Comet assay working group (Tice et al., 2000).
5.4 PHOTOOXYDATION DE L'ADN PAR LES PORPHYRINES
INDUITES : REPRODUCTIBILITE INTER-ELECTROPHORESES
ET MISE EN EVIDENCE D'UN EFFET
Les mesures de comtes sont ralises cellule par cellule, ce qui gnre assez rapidement
de grandes quantits de donnes. Des approches statistiques varies sont employes dans la
littrature, mais la plupart d'entre elles apparaissent peu satisfaisantes en raison de la
distribution des donnes, mais aussi parce qu'elles considrent comme unit de comparaison
la cellule (la comte) et non le traitement (Lovell et al., 1999).
Comme le montrent dj les graphiques box-plots prsents dans la section prcdente, la
distribution des mesures apparat rarement normale (gaussienne), excluant l'emploi de
statistiques et de tests paramtriques. De plus, les formes des courbes de distribution varient
avec l'intensit du stress appliqu, un facteur compliquant la transformation des donnes mais
pouvant galement interfrer avec certains tests non-paramtriques bass sur les rangs (Zar,
1996; Conover, 1999; Statsoft, 1999).
Les possibilits de traitement des donnes ont donc t envisages en testant la
reproductibilit de la mthode, chaque run d'lectrophorse reprenant la squence complte
des oprations, de la prparation des chantillons la mesure informatique des images
obtenues.
5.4.1 Protocoles mis en oeuvre
Afin de mettre en vidence une mthodologie permettant de dmontrer statistiquement un
effet photooxydant des porphyrines endognes, les 2 expriences suivantes ont t entreprises :
Exprience A (tude de reproductibilit) : 9 traitements, raliss sur des
chantillons indpendants de cellules, sont analyss au cours de 3 runs
271
d'lectrophorse, 2 lames de microscope rpliquant chaque traitement au sein de
chaque lectrophorse; 50 comtes sont alors mesures par lame, ce qui permet de
comparer les distributions, d'extraire les statistiques reprsentatives des
chantillons de comtes et de comparer ces chantillons en valuant la
reproductibilit inter-lectrophorses
(donc, 9 traitements x 3 runs d'lectrophorse x 2 lames x 50 comtes)
Exprience B : une tude de la relation "dose de lumire effet" permet une
analyse de tendance par comparaison des courbes obtenues en prsence et en
absence de -ala.

5.4.2 Etude de reproductibilit
Une squence d'oprations typique d'un test de routine a t ralise. Les chantillons ont
t prpars le mme jour (Tableau 5.4-1), immergs dans les solutions de lyse au fur et
mesure de la journe et maintenus 4C. Les lectrophorses et le traitement des lames de
microscope ont t raliss dans les 2 jours suivants, raison d'une srie par demi-journe
75
.
Les lames, sches et ranges l'abri de la poussire et de l'humidit, ont t rhydrates,
colores et mesures au hasard dans les 3 semaines qui ont suivi.

Tableau 5.4-1 : Traitements raliss dans le cadre de l'tude de reproductibilit
(Cellules P388D1)

Echantillons Traitement
contrle 1 aucun (ni -ala, ni irradiation )
contrle 2 aucun (ni -ala, ni irradiation)
-ala -ala 300 M 3 h + 30 min 4C sans irradiation
lum irradiation lumire visible, 4C, 30 min (21.4 J/cm)
UVA irradiation UVA, 4C, 30 min (0.56 J/cm)
-ala + lum 30 -ala 300 M 3 h + irradiation lumire visible, 4C, 30 min (21.4 J/cm)
-ala + lum 60 -ala 300 M 3 h + irradiation lumire visible, 4C, 60 min (42.8 J/cm)
-ala + UVA 30 -ala 300 M 3 h + irradiation UVA, 4C, 30 min (0.56 J/cm)
-ala + UVA 60 -ala 300 M 3 h + irradiation UVA, 4C, 60 min (1.12 J/cm)



75
Certains auteurs n'observent aucune modification jusqu' 4 semaines de lyse 4C (Tice et Vazquez, 1998).
Pour (De Boek et al., 2000) au contraire, une lyse prolonge ( partir de 2 semaines) induit des modifications
erratiques. Mais les facteurs confondants sont tels qu'aucune conclusion probante ne peut tre tire quant
l'influence d'une lyse de quelques jours (De Boek, 2001), souvent impose par les contraintes exprimentales.
272
5.4.2.1 Mthode d'valuation du caractre gaussien
Les distributions de comtes ont t values en couplant les 50 mesures de chaque paire
de lames duplicata (mme traitement, mme lectrophorse).
Chaque distribution de comtes chantillonnes a t reprsente sous forme
d'histogrammes, de graphes de probabilits gaussiennes (normal probability plots) et de box
plots (Analyse-It); le caractre gaussien des distributions a t galement value suivant le
test de Shapiro et Wilk (Analyse-It).
5.4.2.1.1 Graphes de probabilits gaussiennes
Les observations sont ranges dans l'ordre croissant et un graphe du quantile normal en
fonction des observations est tabli. La valeur du quantile normal z
j
pour la valeur de rang j
d'une variable avec n observations est calcule comme suit :
(

n
5 . 0 j
z
1
j
Dans cette quation, reprsente la fonction de distribution cumulative normale
inverse (qui convertit la probabilit normale p en valeur normale z).
1

Ce graphe des quantiles normaux donne une droite pour une distribution gaussienne. Un
simple examen visuel permet donc d'apprcier rapidement le caractre gaussien d'une
distribution.
5.4.2.1.2 Test W de Shapiro et Wilk
Le graphe des quantiles normaux n'offre cependant qu'un avis qualitatif et non pas une
dcision base sur un test statistique. Le caractre gaussien de chacune des distributions a
donc t valu l'aide d'un test formel, le test W de Shapiro et Wilk (Shapiro et Wilk, 1965).
Ce test calcule une statistique W, en fait un quotient qui compare une estimation de la
variance, base sur la pente de la rgression des valeurs x
i
sur les rankits, la variance
calcule de manire classique sur l'chantillon.
Aprs rangement des observations, la pente qui permet l'estimation de la variance est
calcule partir d'une srie de n/2 statistiques d'ordre appeles W
(i / n)
:
( )

=
=
n
1 i
i ) n / i ( x . W b
Ces W
(i/n)
, prsents de manire analogue aux rankits, ont t l'origine tabuls jusque n =
50 (Shapiro et Wilk, 1965); les techniques informatiques permettent prsent une
approximation jusque n = 5000 (Royston, 1992).

273
Le carr de cette pente est alors compar la variance observe des x
i
:
( )

=
=
=

|
.
|

\
|
=

=
n
1 i
2
i
2
n
1 i
i ) n / i (
n
1 i
2
i
2
) x x (
x . W
) x x (
b
W

ce qui permet de dterminer une probabilit de rejet de l'hypothse nulle d'galit des 2
estimations de la variance, donc l'hypothse du caractre gaussien (Conover, 1999). Cette
statistique W peut en fait tre assimile au carr d'un coefficient de corrlation linaire dans
une chelle gaussienne (Ryan et Joiner, 1976). Dans ce travail, la statistique et sa probabilit
ont t calcules l'aide du logiciel (Analyse-It).
5.4.2.2 Rsultats et tests du caractre gaussien des distributions
Nous n'avons pas la place de dtailler tous les graphes obtenus sur les 27 chantillons (9
traitements x 3 lectrophorses. Nous avons donc choisi de prsenter (i) quelques exemples
graphiques de distributions reprsentatives de comtes en histogrammes et en graphes de
probabilits gaussiennes; et (ii) l'ensemble des rsultats sous forme d'un graphique comparatif
de box plots et d'un tableau reprenant l'valuation statistique.
5.4.2.2.1 Quelques exemples de distribution de comtes
La Figure 5.4-1 prsente les histogrammes
76
et graphes de probabilits gaussiennes des
mesures ralises sur un chantillon contrle (Contrle 1, lectrophorse 2) et 2 chantillons
stresss (UVA 30, lectrophorse 1; -ala + UVA 30, lectrophorse 3).


76
Pour l'chelle de l'axe X, le domaine des valeurs a t arbitrairement subdivis en 10 classes gales dans
lesquelles les comtes ont t rparties
274
Figure 5.4-1 : Exemples de distribution des comtes (histogrammes et graphes de probabilits
gaussiennes) (Cellules P388D1)


A. Echantillon contrle (Contrle 1, lectrophorse 2)
n = 100 comtes mesures sur 2 lames

Tail DNA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
F
r

q
u
e
n
c
e

-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tail DNA
Q
u
a
n
t
i
l
e

N
o
r
m
a
l

W
Shapiro-Wilk
= 0.3552 (p <0.0001)
non-gaussien



Olive tail moment
0
20
40
60
80
100
120
F
r

q
u
e
n
c
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25
OliveTail Moment
Q
u
a
n
t
i
l
e

N
o
r
m
a
l

W
Shapiro-Wilk
= 0.2477 (p <0.0001)
non-gaussien

275
Figure 5.4-1 Suite (1)


B. Echantillon stress (UVA 30, lectrophorse 1)
n = 100 comtes mesures sur 2 lames

Tail DNA
0
5
10
15
20
25
30
35
F
r

q
u
e
n
c
e

-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tail DNA
Q
u
a
n
t
i
l
e

N
o
r
m
a
l

W
Shapiro-Wilk
= 0.8891 (p <0.0001)
non-gaussien



Olive tail moment
0
5
10
15
20
25
30
35
F
r

q
u
e
n
c
e

-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5
Olive Tail Moment
Q
u
a
n
t
i
l
e

N
o
r
m
a
l

W
Shapiro-Wilk
= 0.8272 (p <0.0001)
non-gaussien
276
Figure 5.4-1 Suite (2)

C. Echantillon stress (-ala + UVA 30, lectrophorse 3)
n = 100 comtes mesures sur 2 lames

Tail DNA
0
5
10
15
20
25
30
F
r

q
u
e
n
c
e

-3
-2
-1
0
1
2
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tail DNA
Q
u
a
n
t
i
l
e

N
o
r
m
a
l

W
Shapiro-Wilk
= 0.9854 (p = 0.3412)
gaussien



Olive tail moment

0
5
10
15
20
25
30
F
r

q
u
e
n
c
e
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 25 27.5
Olive Tail Moment
Q
u
a
n
t
i
l
e

N
o
r
m
a
l



W
Shapiro-Wilk
= 0.9553 (p = 0.0019)
non-gaussien


277
5.4.2.2.2 Prsentation de l'ensemble des rsultats
Les graphiques prsents dans le 5.4.2.2.1 sont typiques des donnes obtenues, comme
le montre une comparaison avec les Figures 5.4-2 et 5.4-3 qui prsentent les box plots de
l'ensemble des expriences. En fonction de l'intensit du stress, la mdiane et la dispersion des
donnes augmentent fortement. Bien que les distribution tendent alors vers une courbe
gaussienne, le test de Shapiro et Wilk n'est qu'exceptionnellement significatif (Tableau 5.4-2),
que ce soit en tail DNA ou en Olive tail moment. Une transformation logarithmique rend
gaussiennes peine quelques distributions au dtriment d'autres (Tableau 5.4-3). Elle ne peut
donc tre applique l'ensemble des chantillons.


Tableau 5.4-2 : Rsultats des test de Shapiro et Wilk sur l'ensemble des donnes : statistique
W et sa probabilit; les chantillons pour lesquels la distribution des comtes
est gaussienne sont souligns (p > 0.05)
(9 traitements; 3 lectrophorses; 100 comtes mesures sur 2 lames)
Donnes non transformes (Cellules P388D1)


Traitement Tail DNA
pour l'lectrophorse
Olive Tail Moment
pour l'lectrophorse
1 2 3 1 2 3
contrle 1 0.7239
p < 0.0001
0.3552
p < 0.0001
0.5967
p < 0.0001
0.5143
p < 0.0001
0.2477
p < 0.0001
0.4481
p < 0.0001
contrle 2 0.6606
p < 0.0001
0.4436
p < 0.0001
0.6938
p < 0.0001
0.4624
p < 0.0001
0.3127
p < 0.0001
0.3791
p < 0.0001
-ala 0.4099
p < 0.0001
0.4025
p < 0.0001
0.3964
p < 0.0001
0.3080
p < 0.0001
0.2451
p < 0.0001
0.2688
p < 0.0001
lum 0.5992
p < 0.0001
0.4992
p < 0.0001
0.3217
p < 0.0001
0.2927
p < 0.0001

UVA 0.8891
p < 0.0001
0.9229
p < 0.0001
0.8511
p < 0.0001
0.8272
p < 0.0001
0.8667
p < 0.0001
0.7356
p < 0.0001
-ala + lum 30 0.8978
p < 0.0001
0.7446
p < 0.0001
0.7169
p < 0.0001
0.8418
p < 0.0001
0.6693
p < 0.0001
0.5511
p < 0.0001
-ala + lum 60 0.9291
p < 0.0001
0.9382
p = 0.0001
0.9589
p = 0.0033
0.8236
p < 0.0001
0.8309
p < 0.0001
0.8255
p < 0.0001
-ala + UVA 30 0.9598
p = 0.0039
0.9937
p = 0.9253
0.9854
p = 0.3412
0.9451
p = 0.0004
0.9806
p = 0.1487
0.9553
p = 0.0019
-ala + UVA 60 0.9748
p = 0.0524
0.9713
p = 0.0278
0.9495
p = 0.0008
0.9556
p = 0.0020
0.9829
p = 0.2208
0.9860
p = 0.3714


278
Figure 5.4-2
Tail DNA
0 20 40 60 80
Contrle 1
Contrle 2
ala
Lum
30 min
UVA
30 min
-ala + lum
60 min
-ala + UVA
60 min
-ala + UVA
30 min
-ala + lum
30 min

: Tail DNA : Rsultats de l'ensemble des expriences (Cellules P388D1)
es
(NS)
()
(NS)
(NS)
(NS)
(NS)
(NS)
()
()
100
Les rsultats sont prsents traitement par traitement avec chaque fois classes de bas en haut l
lectrophorses 1, 2 et 3 (100 comtes mesures sur 2 lames). Entre parenthses, signification du test
de Kruskal-Wallis comparant les 3 lectrophorses (***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p >
0.05) (cf 5.4.2.3); les rsultats surprenants de ce test seront comments dans le 5.4.2.3.2 (Note : 1
chantillon perdu pour le traitement Lum 3)
279
Figure 5.4-3 : Olive tail moment : Rsultats de l'ensemble des expriences (Cellules P388D1)
chantillon perdu pour le traitement Lum 3)
Les rsultats sont prsents traitement par traitement avec chaque fois classes de bas en haut les
lectrophorses 1, 2 et 3 (100 comtes mesures sur 2 lames). Entre parenthses, signification du test
de Kruskal-Wallis comparant les 3 lectrophorses (***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p >
0.05) (cf 5.4.2.3); les rsultats surprenants de ce test seront comments dans le 5.4.2.3.2 (Note : 1
Olive Tail Moment
0 10 20 30
Contrle 1
()
Contrle 2
()
ala
(NS)
Lum
30 min
()
UVA
30 min
(NS)
-ala + lum
60 min
(NS)
-ala + UVA
60 min
()
-ala + UVA
30 min
()
-ala + lum
30 min
()

40
280
Tableau 5.4-3 : Rsultats des tests de Shapiro et Wilk sur l'ensemble des donnes : statistique
W et sa probabilit; les chantillons pour lesquels la distribution des comtes
est gaussienne sont souligns (p > 0.05)
(9 traitements; 3 lectrophorses; 100 comtes mesures sur 2 lames)
Donnes transformes en logarithme dcimal (Cellules P388D1)


Traitement Log
10
Tail DNA
pour l'lectrophorse
Log
10
Olive Tail Moment
pour l'lectrophorse
1 2 3 1 2 3
contrle 1 0.9801
p = 0.1357
0.9229
p < 0.0001
0.9608
p = 0.0046
0.9760
p = 0.0646
0.8916
p < 0.0001
0.9595
p = 0.0037
contrle 2 0.9713
p = 0.0278
0.9558
p = 0.0021
0.9884
p = 0.5406
0.9712
p = 0.0271
0.8859
p < 0.0001
0.9585
p = 0.0032
-ala 0.9369
p = 0.0001
0.9509
p = 0.0009
0.9450
p = 0.0004
0.8781
p < 0.0001
0.9059
p < 0.0001
0.8581
p < 0.0001
lum 0.9744
p = 0.0481
0.9618
p = 0.0054
0.9691
p = 0.0188
0.9369
p = 0.0001

UVA 0.9825
p = 0.2070
0.9568
p = 0.0024
0.9721
p = 0.0321
0.9648
p = 0.0090
0.9755
p = 0.0588
0.9718
p = 0.0305
-ala + lum 30 0.9702
p = 0.0228
0.9640
p = 0.0079
0.9723
p = 0.0332
0.9661
p = 0.0112
0.9790
p = 0.1103
0.9723
p = 0.0331
-ala + lum 60 0.8942
p < 0.0001
0.8366
p < 0.0001
0.9104
p < 0.0001
0.8940
p < 0.0001
0.8743
p < 0.0001
0.9272
p < 0.0001
-ala + UVA 30 0.8445
p < 0.0001
0.8913
p < 0.0001
0.8896
p < 0.0001
0.8830
p < 0.0001
0.8982
p < 0.0001
0.9139
p < 0.0001
-ala + UVA 60 0.9010
p < 0.0001
0.8119
p < 0.0001
0.8152
p < 0.0001
0.9509
p = 0.0010
0.8713
p < 0.0001
0.8599
p < 0.0001

5.4.2.3 Comparaison inter-lectrophorse (tests non-paramtriques)
Suite aux rsultats des tests du caractre gaussien, la possibilit d'employer des tests non-
paramtriques pour comparer les lectrophorses et les chantillons a t tudie. Pour
comparer plus de 2 chantillons, nous avons utilis le test de Kruskal-Wallis, une variante
non-paramtrique des ANOVA, base sur la transformation en rangs (Conover, 1999). Bien
qu'il s'agisse d'une mthode "distribution-free", elle demande en thorie que les distributions
comparer soient similaires, c'est--dire de mmes dispersions et formes. Cette condition est
juge de manire plus (Statsoft, 1999) ou moins (Zar, 1996; Conover, 1999) drastique suivant
les auteurs; il semble que le test de Kruskal-Wallis soit typiquement peu affect si les
variances des populations sont plus ou moins htrognes (Zar, 1996). En cas de comparaison
1996; C
de 2 chantillons, ce test est identique au test de Mann-Whitney (ou test de Wilcoxon) (Zar,
onover, 1999).
281
Avant de comparer les traitements entre-eux et de nous poser des questions quant
es variances admissibles, nous avons commenc par valuer la
des lectrophorses pour les diffrents traitements, ces chantillons pr
fort semblables.
l'htrognit d
reproductibilit sentant
des distribution
.4.2.3.1 Le test de Kruskal-Wallis (ANOVA non-paramtrique) 5
it d'un test de ran somme des rangs d e des
rangs de tous les traitements. Les variables suivantes sont dfinies (Conover, 1999) :
oient k c ns a s de
1
n
k
,
Soit X
i,j
dnotant la j
m
observation du groupe i; les k chantillons comprennent donc
les observ
Soit N le nombre total ati

Le rang 1 est assign su ainsi
de suite; R rs ng l'obs X
i,j
et R
i
la somme des rangs
s au i :
1, ,.,k
Pour tester l'h nu es ons de ion pu ont
identiques" la statistique T est alors dfinie comme suit :
Il s'ag g comparant la 'un traitement la somm
S hantillo latoire
e
tailles n
ations X
1,1
X
k,nk

d'observ ons :
= N i n
la plus petite des N observations, le rang 2 la ivante et
(X
i,j
) rep ente le ra attribu ervation
attribu groupe
= i R j , i ) X ( R o i = 2
ypothse lle "Tout les foncti distribut des k po lations s

=
k
1 i

=
i n
1 j
| =

i
|
.

\ 1 i
i 4
N
n S
T
dans laquelle S reprsente :
|
|
|
.
|

\
|
+
=

ranks
all
2
2
j , i
) 1 N (
N ) X ( R
1
S

La distribution de T tant fort complexe, l'approximation de la distribution chi-carr
k - 1 degrs de libert est utilise de manire gnrale pour valuer la probabilit du T observ
(Conover, 1999). L'ensemble des calculs est ralis l'aide du logiciel (Analyse-It).
| | +
k 2 2
) 1 N ( R 1
=
4 1 N
282
5.4.2.3.2 Rsultats
Les rsultats des 9 comparaisons inter-lectrophorses sont prsents dans le
5.4-4, la fois pour le tail DNA et le Olive tail moment; pour permettre une comparaison de la
signification du test avec la distri
Tableau
bution des diffrents chantillons, sa probabilit est indique
sur les Figures 5.4-2 et 5.4-3 prsentes ci-avant ( 5.4.2.2.2).

Tableau 5.4-4 : Rsultats des test de Kruskal-Wallis comparant les 3 lectrophorses sur
et sa probabilit; les traitements pour
distributions est accepte sont
s; Cellules P388D1)


Traitement Tail DNA Olive Tail Moment
l'ensemble des traitements : statistique T
lesquels l'hypothse nulle d'identit entre
souligns (p > 0.05) (9 traitements; 3 lectrophorses; 100 comtes mesures
sur 2 lame
contrle 1 5.48
p = 0.0645
16.96
p = 0.0002
contrle 2 20.04
P < 0.0001
49.45
p < 0.0001
-ala 5.09 5.18
p = 0.0786

Lum
(a)
V
p = 0.0751
5719.5
p = 0.0787
5901
p = 0.0277
U A 3.85
p = 0.1456
4.99
p = 0.0824
p < 0.0001 p < 0.0001
-ala + lum 30 27.54

22.29

-ala + lum 60 0.71
p = 0.7005
80.61
p = 0.7368
-ala + UVA 30 7.22
p = 0.0270
16.11
p = 0.0003
3.17 -ala + UVA 60
p = 0.2054
7.65
p = 0.0218

(a)
Comme il n'y a que 2 valeurs pour ce traitement, la statistiqu alcule est le U de Mann-Whitney

5.4.2.3.3 Discussion
e c

a Figure
5.4-4 dtaille les plot box des comtes du traitement "Contrle 1" (Olive tail moment), pour
lequel une diffrence significative est dmontre, et compare les 3 lectrophorses.
La comparaison de ces rsultats avec les Figures 5.4-2 et 5.4-3 montre que, lorsque les
tests mettent en vidence des diffrences significatives entre lectrophorses, celles-ci
apparaissent cependant ngligeables par rapport aux diffrences entre traitements. L
283
Figure 5.4-4 : Comparaison des lectrophorses pour le traitement "Contrle 1" (Olive tail
moment) (100 comtes mesures sur 2 lames)
re Le graphique est prsent avec en ordonne (i) la mme chelle que la Figu
5.4-3 et (ii) une chelle agrandie.
40
3
Electrophorse 1 Electrophorse 2 Electrophorse 3
O
l
i
v
e

T
a
t
0
10
30
Electrophorse 1 Electrophorse 2 Electrophorse 3
n
t
0

i
l

M
o
m
e
n
20
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
1
2
En agrandissant l'chelle, la diffrence significative entre lectrophorses (p = 0.0002)
apparat clairement; la plupart des co l'lectrophorse 1 sont en effet suprieures
celles des 2 autres lectrophorses, prsentant donc un rang suprieur. La plus grande
dispersion de l'lectrophorse 1 et le no important de comtes (N = 300) jouent
probablement un rle dans la signification du test.
Nos essais d'estimation de la reproductibilit intralectrophor s de Mann-Whitney
pour chaque paire de lames duplicata) se sont heurts au mme cueil, savoir la mise en
vidence de atistiquement significatives mais insignifiantes sur le plan
biologique.
5.4.2.3.4 Co
mtes de
mbre
se (test
diffrences st
nclusions
Les conclusions suivantes peuvent tre tires :
l'hypothse de mmes dispersion et distribution, bien que non rdhibitoire, pose un
problme certain pour la comparaison entre chantillons traits et contrles;
l
interaction; une diffrence statistiquement significative (ou une absence de diffrence)
tements tudis, mais aussi du paramtre mesur (tail DNA ou Olive
vement
ent inutile,
car peu susceptible d'apporter une information supplmentaire.
a comparaison des sries d'lectrophorse par le test de Kruskal-Wallis montre une
dpend des trai
tail moment);
quand une diffrence inter-lectrophorses est mise en vidence, elle est objecti
ngligeable par rapport la diffrence entre traitements;
si le test parvient mettre en vidence des diffrences aussi ngligeables, son
application dans la comparaison des diffrents traitements s'avre pratiquem
284
5.4.2.4 Extraction de statistiques significatives
opos par (Lovell et al., 1999), nous avons alors considr comme unit de
e traitement et non plus la comte,
Comme pr
comparaison l rduisant chaque srie de mesures de
comtes une statistique reprsentative de l'chantillon mesur, lui-mme reprsentatif de la
population de comtes du traitement examin.
Un examen des rsultats prsents jusqu'ici montre qu'un stress se traduit par une
augmentation de la mdiane et de la dispersion des mesures; la mdiane (quantile 0.5) et le
percentile 75 (p75, quantile 0.75) seront donc extraits pour reprsenter chaque chantillon de
comtes. Ces 2 valeurs permettent une image globale de l'chantillon car elles ne sont que peu
sensibles aux valeurs extrmes
77
(Lovell et al., 1999).
Pour cette tude de reproductibilit, chaque lame individuelle a d'abord t traite comme
l'un ;
r

mes) qui seront traits comme des points
de
nt
50
nt donc se trouver rsumes en 27 paramtres statistiques (9 traitements x 3
ont traits comme des points de mesure individuels.
5.4 es de confiance
it lmentaire permettant d'valuer la reproductibilit intra-lectrophorse (intra-essai)
chaque lame a en effet subi le mme traitement et la mme lectrophorse mais diffre de pa
sa position alatoire dans le bac d'lectrophorse. Les 2700 comtes (9 traitements x 3
lectrophorses x 2 lames x 50 comtes) se trouvent donc rsumes en 54 paramtres
statistiques (9 traitements x 3 lectrophorses x 2 la
mesure individuels.
Nous avons galement vrifi si le traitement des donnes pouvait s'effectuer en coupla
les lames duplicata. Les 2700 comtes (9 traitements x 3 lectrophorses x 2 lames x
comtes) vo
lectrophorses) qui ser
.2.4.1 Calcul des quantiles et de leurs intervall
p*
me
q re X
p

df t
positio
me

Soit un chantillon ordonn de X
n
valeurs indpendantes dont on dsire dterminer le
uantile et son intervalle de confiance (0 p* 1); ce quantile p* est le nomb
ini el que la proportion p* des valeurs de l'chantillon soit infrieure ou gale X
p
. La
n P du p* quantile X
p
est dtermine comme suit :
* p . ) 1 n ( +
100
P=

n'est pas un nombre entier, X
p
est interpol entre les 2 va Si P leurs dont les positions sont
immd

iatement infrieure et suprieure P (Aczel, 1993).

i n'est pas le cas d'autres percentiles tests, notamment le p5 et le p95; le p25
77
Ce qu n'a permis de tirer aucune
conclusion et a donc t abandonn.
285
Pour n > 20, les positions de l'intervalle de confiance r* et s* sont calcules, partir d'une
approximation base sur le thorme central limite (Conover, 1999) :

*) p 1 ( . * p . n . z * p . n * r ) 2 / ( + =

*) p 1 ( . * p . n . z * p . n * s ) 2 / 1 ( + =

La valeur du quantile normal z est calcule partir de la fonction de distribution cumulative
normale inverse (qui convertit la probabilit normale p en valeur normale z) et le niveau de
confiance est 1 . En gnral, r* et s* ne sont pas des nombres entiers et sont
systmatiquement arrondis aux entiers suprieurs, r et s (Conover, 1999).
5.4.2.4.2 Traitement des rsultats
Intuitivement, lorsque le nombre de donnes est suffisamment grand, les quartiles obtenus
sur un chantillon devraient tre une approximation raisonnablement correcte des quart
la population et leur distribution devrait s'approcher de la normale. Cette intuition est
d'ailleurs renforce par la mthode applique au calcul de leurs intervalles de confiance,
lorsque n est suprieur
iles de
20 (approximation base sur le thorme central limite, 5.4.2.4.1).
es

d'estimer
l'incertitude associe aux diffrentes sources de variabilit (Lovell et al., 1999).
Aprs extraction des statistiques reprsentatives des chantillons, celles-ci ont donc t
compares par une analyse de variance 2 facteurs alatoires, lectrophorse et traitement, en
considrant la lame de microscope comme unit lmentaire de rptition . Les variances ont
alors t rparties comme dcrit au 3.3.4.2.2.3 pour calculer les CV% intra-srie et de
variation totale. En cas de rejet de l'hypothse nulle d'galit des moyennes, un test post-hoc
(tests t multiples avec correction de Bonferroni) a t ralis pour mettre en vidence les
diffrences entre chantillons. Ces tests ont t raliss l'aide du logiciel Systat 7.1.
Cette hypothse de normalit a par ailleurs t vrifie sur des mdianes et percentiles 75
extraits de lames ralises et mesures par 3 oprateurs, et ce pour des cellules non stress
(Contrle) et stresses (UVA) (Tableau 5.4-5). Les mthodes drives du modle linaire
gnral, notamment l'analyse de variance, sont donc applicables permettant
78

78
Comme dit prcdemment, l'chantillon LUM de la 3
me
lectrophorse a t perdu; afin de rtablir la balance
de l'tude, ncessaire pour raliser une ANOVA 2 niveaux, un chantillon LUM identique a t ralis sur une
4
me
lectrophorse et introduit dans les rsultats. Cet artifice nous semble plus correct que de driver
mathmatiquement une valeur, tel que prconis par certains auteurs {(Shearer, 1973) in (Zar, 1996)}.
286
Tableau 5.4-5 : Caractre gaussien des distributions des mdianes et percentiles 75 extraits
d'chantillons de cellules stresses et non stresses (50
rsultats obtenus au cours de 5 lectrophorses par 3 o
comtes par lame;
prateurs diffrents;
Cellules P388D1).


Tail DNA Olive tail moment
Traitement Mdiane Percentile 75 Mdiane Percentile 75
Contrle 5.575 8.535 0.645 1.105
5.620 9.868 0.63 1.385
4.375 6.363 0.515 0.685
5.415 7.440 0.515 0.7175
4.665 7.058 0.465 0.7625
4.020 6.948 0.43 0.7125
1.528 0.515 1.13
W 0.8516 0.8760 0.8692 0.8852
3.875 1
7.910 14.885 0.9 1.41
7.390 15.420 0.835 1.465
11.070 17.553 1.110 2.075
Shapiro-Wilk
p = 0.0607
gaussien
p = 0.1173
gaussien
p = 0.0977
gaussien
p = 0.1496
gaussien


Tail DNA Olive tail moment
Traitement Mdiane Percentile 75 Mdiane Percentile 75
UVA 25.780 43.920 3.9 9.2975
25.605 47.563 3.62 10.4375
24.175 43.563 4.13 9.02
29.100 51.878 5.29 10.92
20.140 38.625 2.585 7.0475
24.440 49.430 3.53 11.1025
18.710 23.478 2.53 3.095
20.515 27.325 2.68 3.645
W
Shapiro-Wilk
0.9431
p = 0.6417
gaussien
0.8888
p = 0.2283
gaussien
0.9090
p = 0.3467
gaussien
0.8506
p = 0.0966
gaussien


287
5.4.2.4.3 Rsu
hantillons.
ltats : Statistiques reprsentatives des diffrents chantillons
Les Tableaux 5.4-6 et 5.4-7 prsentent respectivement les mdianes et les p75 des tail
DNA mesurs sur les diffrents c Les Tableaux 5.4-8 et 5.4-9 prsentent
spectivement les mdianes et les p75 des Olive tail moment mesurs sur les diffrents
chantillons.

Tableau 5.4-6
re
: Mdianes des distributions de comt urs inte s de confiance
95 % NA; 9 traitements 3 lec orses; s; 50 comtes par
lame; Cellules P388D1)

diane d NA
es et le rvalle
(tail D ; troph 2 lame
M u Tail D
Traitement Lame
e Electrop Electrophorse 3 Electrophors 1 horse 2
rl 58
-
38
5.4)
62 2

rl 37
-
3
5.97)
82
(
00
7 - 7.24)
5.91 A
- 4.9
.13
- (5
A .77
(3 -
7.31
.28 - 9.84)
23
- 7.56)
99
- 8.42)
.7
- 42.26)
B .61 18

A 23.6
-
67
- 13.68)
B .12 00
- - 37.21)
B
(26.18 - 14)
7.12
51 - 30.42)
cont e 1 A 5.
(3.77 6.24)
4.
(3.90 -
4.67
(3.63 - 5.83)
B 5.
(4.35 - 7.19)
5.4
(3.32 - 6.74)
4.02
(3.25 - 5.14)
cont e 2 A 7.
(6.57 8.36)
5.1
(3.63 -
4.48
(3.59 - 5.54)
B 5.
5.29 - 8.05)
5.
(4.4
4.11
(3.05 - 5.74)
-ala

5.25
(3.78 6.51) ( 7 - 8.35)
5.60
(4.14 - 6.62)
B 5
(3.99 6.75)
6.46
.37 - 8.74)
6.31
(4.88 - 7.79)
Lum 5
.70 6.79) (6
6.57
(3.50 8.35)
B 6.
(5.06
6.
(4.86
6.68
(3.73 12.27)
UVA A 25 8
(21.17 38.78)
29.10
(22.08 -
20.14
(14.02 - 26.7)
25
(19.60 - 35.14)
24.
(21.50 - 30.26)
24.44
(19.79 - 29.08)
-ala + lum 30 6
(21.18 25.79)
9.
(8.35
16.27
(13.16 - 19.32)
23
(18.57 - 28.52)
18.
(14.07 - 24.06)
18.28
(15.79 - 20.39)
-ala + lum 60 A 27.40
(21.17 33.74)
33.50
(31.60
26.31
(22.22 - 32.37)
30.93
38.
2
(22.
29.71
(20.73 - 41.58)
-ala + UVA 30 A 48.42
(42.63 - 53.98)
50.25
(44.17 - 55.1)
42.52
(38.42 - 46.67)

B 51.23
(48.14 - 56.4)
47.30
(38.23 - 53.19)
45.90
(40.04 - 51.36)
-ala + UVA 60 A 60.11
(55.62 - 63.53)
64.43
(58.99 - 68.38)
60.30
(52.30 - 69.39)
B 57.63
(55.57 - 65.25)
63.31
(58.81 - 67.79)
58.81
(54.33 - 67.0)
288

Tableau 5.4-7 : Percentiles 75 des distributions de comtes et leurs intervalles de confiance

p75 du Tail DNA
95 % (tail DNA; 9 traitements; 3 lectrophorses; 2 lames; 50 comtes par
lame; Cellules P388D1)

Traitement Lame
Electrophorse 1 Electrophorse 2 Electrophorse 3
contrle 1 A 8.54
(6.24 - 10.14)
6.36
(5.40 - 9.11)
7.06
(5.83 - 9.18)
B 9.87
(7.19 - 13.81)
7.44
(6.74 - 8.79)
6.95
(5.14 - 8.98)
contrle 2 A 9.92
(8.36 - 11.97)
6.92
(5.54 - 8.70)
6.51
(5.97 - 12.94)
9.82
5 - 11.5
8.36
8.56
4 - 10.1
9.80
7.31
74 - 7.74
9.04
1 - 10.3 5 - 12.8 2 - 11.8
8.19
5 - 12.1
8.05
10.19
4 - 12.0
11.82
10.03
9 - 12.2
11.80
9 - 11.3 4 - 16.8 5 - 16..3
10.87
6 - 15.0
43.92
10.19
2 - 14.7
51.88
17.18
78 - 52. 26 - 66.
38.63
70 - 76.
47.56
14 - 62.
30.38
43.56
26 - 55.
16.95
49.43
08 - 65.
23.46
79 - 37 68 - 24. 32 - 27.
35.695
.52 - 45.8
39.41
27.350
.06 - 35.3
42.92
25.115
.39 - 32.0
37.47
.74 - 43.1 .21 - 58.3 .37 - 49.4
43.31
.14 - 50.6
62.26
36.86
42 - 42.
63.82
46.46
.58 - 52.4
55.12
.98 - 88.9 .10 - 66.6 .67 - 62.6
60.17
6.4 - 64.6
68.38
62.08
.19 - 65.2
72.45
57.36
.36 - 65.0
83.68
.53 - 76.5 .38 - 77.8 .39 - 87.9
68.44
.25 - 71.5
72.06
.79 - 77.2
86.73
.00 - 89.1
B
(8.0 3) (7.2 9) (5. )
-ala

A
(6.5 7) (8.3 0) (6.6 8)
B
(6.7 7)

(8.7 6)

(7.7 9)
Lum A
(6.7 5)

(9.8 7)

(8.3 0)
B
(7.5 4) (8.4 2) (12.27 39.25)
UVA A
(38. 29) (42. 49) (26. 77)
B
(35. 23) (30. 56) (29. 09)
-ala + lum 30 A
(25. .16) (13. 82) (19. 46)
B
(28 3) (24 1) (20 4)
-ala + lum 60 A
(33 4) (37 6) (32 0)
B
(38 8) (30. 08) (41 2)
-ala + UVA 30 A
(53 7) (55 6) (46 5)
B
(5 ) (53 6) (51 4)
-ala + UVA 60 A
(63 2) (68 4) (69 4)
B
(65 7) (67 7) (67 2)



289
Tableau 5.4-8 : Mdianes des distributions de comtes et leurs intervalles de confiance

95 % (Olive tail moment; 9 traitements; 3 lectrophorses; 2 lames; 50
comtes par lame; Cellules P388D1)

Mdiane du Olive tail moment
Traitement Lame
Electrophorse 1 Electrophorse 3 Electrophorse 2
0.65
48 - 0.8
0.52
38 - 0.5
0.47
39 - 0.6
0.630
53 - 0.8
1.12
0.515
40 - 0.5
0.56
0.430
33 - 0.5
0.49
83 - 1.3 42 - 0.6 42 - 0.5
0.84
69 - 1.1
0.57
0.56
51 - 0.7
0.67
0.48
36 - 0.5
0.68
39 - 0.6 50 - 0.7 53 - 0.8
0.58
48 - 0.7
0.59
0.69
.61 - 0.90
1.01
0.68
.50 - 0.87
0.53
40 - 0.8 .64 - 1.13 .39 - 0.61
0.62
.51 - 0.85
3.90
0.69
.49 - 0.89
5.29
0.68
.40 - 0.96
2.59
.89 - 5.80 .14 - 8.09 .78 - 3.53
3.62
.04 - 6.16
4.37
4.13
.58 - 5.71
1.50
3.53
.55 - 4.70
2.57
.76 - 4.86 .09 - 2.39 .01 - 3.58
4.49
.47 - 5.87
4.83
4.39
.95 - 5.08
6.51
2.89
2.22 - 3.51
4.42
.42 - 5.29 .00 - 7.13 .10 - 5.68
5.93
.31 - 6.63
9.70
4.17
.52 - 4.90
10.300
5.65
.25 - 7.29
7.870
56 - 11.0 99 - 11.5 .80 - 8.59
10.59
87 - 11.9
11.29
9.46
87 - 10.7
13.36
8.95
24 - 10.2
12.24
.57 -14.9 .73 -15.1
.56 -13.1
12.87
.70 -14.4
12.02
.73 -13.5
contrle 1 A
(0. 0) (0. 7) (0. 3)
B
(0. 8) (0. 9) (0. 4)
contrle 2 A
(0. 2) (0. 5) (0. 9)
B
(0. 2) (0. 1) (0. 8)
-ala

A
(0. 8) (0. 7) (0. 6)
B
(0. 4) (0 ) (0 )
Lum A
(0. 0) (0 ) (0 )
B
(0 ) (0 ) (0 )
UVA A
(2 ) (3 ) (1 )
B
(3 ) (3 ) (2 )
-ala + lum 30 A
(3 ) (1 ) (2 )
B
(3 ) (2 ) ( )
-ala + lum 60 A
(3 ) (6 ) (4 )
B
(5 ) (3 ) (3 )
-ala + UVA 30 A
(8. 4) (8. 5) (6 )
B
(9. 6) (7. 3) (7. 7)
-ala + UVA 60 A
(10.31 -12.38) (12 0) (9 5)
B 11.58
(10 9) (11 7) (10 8)



290
Tableau 5.4-9 : Percentiles 75 des distributions de comtes et leurs intervalles de confianc
95 % (Olive tail moment; 9 traitements; 3 lectrophorses; 2 lames; 50
comtes par lame; Cellules P388D1)
e


p75 du Olive tail moment
Electrophorse 1 Electrophorse 2 Electrophorse 3
contrle 1
(0. 5 (0.
0.76
(0.63 - 0.94)
A 1.11
80 - 1.2 )
0.69
57 - 1.04)
.88 - 1.82) .59 - 0.92) .54 - 0.93)
contr A 1.46
32 - 1.7 )
0.72
65 - 1.17)
0.71
9 - 0.89)
12 - 1.9 ) 71 - 1.02) 8 - 0.89)
68 - 1.0 ) 77 - 1.43) 6 - 1.44)
B 0.93
74 - 1.4 )
1.06
90 - 1.49)
1.01
7 - 1.37)
80 - 1.1 ) 13 - 1.78) 1 10.2 )
B 1.00
85 - 1.7 )
1.22

0 - 13.12) 9 - 15.42) 3 - 17.20)
0.438
6 - 14.48)
9.020
1 - 11.83)
1.103
0 - 17.23)
-ala + lum 3 A 6.830
86 - 8.0 )
2.975
39 - 4.16)
.228
8 - 4.93)
7.51
87 - 9.4 )
6.38
08 - 8.76)
4.48
1 - 6.63)
-ala + lum 6 A 6.60
29 - 7.4 )
8.28
3 -11.6 )
7.04
8 - 8.32)
B 8.09
3 -10.0 )
6.27
90 - 7.33)
8.58
9 -10.5 )
-ala + UVA 3 A 13.04
04 - 19.66)
13.02
.55 - 15.10)
10.53
59 - 12.51)
13.69
.96 - 15.32)
13.45
73 - 13.98)
1.44
7 - 14.78)
-ala + UVA 6 A 15.94
.90 -18.5 )
17.19
.15 -19.53)
B 13.72
.19 -14.3 )
15.00
.47 -16.6 )
16.07
.58 -19.2 )
Traitement Lame
B 1.39
(0
0.72
(0
0.71
(0
le 2
(1. 5 (0. (0.5
B 1.40
(1. 0
0.81
(0.
0.74
(0.5
-ala

A 0.83
(0. 1
0.94
(0.
1.03
(0.8

(0. 1 (0. (0.8
Lum A 0.93
(0. 2
1.41
(1.
0.88
(0.6 3

(0. 7
1.07
(0.89 - 1.39) (0.96 6.48)
UVA A 9.30
(5.8
10.92
(8.0
7.05
(3.5
B 1
(6.1 (5.7
1
(4.7
0
(4. 7 (2.
4
(3.5
B
(5. 0 (5. (3.5
0
(5. 4 (7.1 7 (5.6

(6.6 5 (4. (7.2 5
0
(11. (11 (8.
B
(11 (10.
1
(10.2
0 13.77
(12.38 -16.73) (14 5 (15

(13 9 (14 4 (13 6


291
5.4.2.4.4 Rsultats : Comparaison des lectrophorses et des traitements
x 5.4-10 et 5.4-11 prsentent les rsult Les Tableau ats de l'analyse de variance et des tests t
ost-hoc pour, respectivement, les mdianes et les p75 des tail DNA mesurs sur les diffrents
chantillons. Les Tableaux 5.4-12 et 5.4-13 prsentent r les Olive tail
moments.
5.4.2.4.5 Conclusions
p
les mmes rsultats pou
e (tail D e tail es
mtres sta
p > 0.05). s les cas, ents
nts
ier cas pa de tail DN
oment (T .4-12). Un vergence
s dan l
nts (mdi et p75, 1 tail DNA
ent X le se. Cette i pourrait
e simplement ci des s s tail
ntale
de la queue, co omne. A c u, l'tude st
r plots (Figures 5.4-2 et 5.4-3).
Le traitement r un va
tale; il ne p
e de
qu'tre de l'inform
hique des d ons. Par ex es plot boxe

Quels que soient les paramtres de comt NA ou Oliv moment) ou l
para tistiques (mdiane ou percentile 75) envisags, l'tude ANOVA (Tableaux
5.4-10 5.4-13) dmontre une diffrence statistiquement significative (***) entre traitements
et pas de diffrence entre lectrophorses ( Dans tou les traitem
contrle 1, contrle 2, -ala et lum 30 ne peuvent tre distingus entre-eux.
Tous les autres traiteme diffrent des contrles et diffrent entre eux, l'exception des
paires de traitements (UVA et -ala + lum 60) et (UVA et -ala + lum 30) qui peuvent tre
occasionnellement assimiles, dans le prem r les p75 A (Tableau 5.4-11),
dans l'autre par les mdianes de Olive tail m ableau 5 e telle di
entre les paramtres ne pose pas de problme s e cas prsent, ces comparaisons purement
anecdotiques ne nous intressant pas.
Bien que la reproductibilit totale des statistiques des tail DNA (mdiane et p75, 10 %,)
soit meilleure que pour les Olive tail mome ane, 18 % 5 %), les
mettent en vidence une interaction traitem ctrophor nteraction
tr due la pr sion suprieure tatistiques de DNA ou indiquer que ce
paramtre dpend plus fortement de l'lectrophorse, donc des conditions exprime s. Le
Olive tail moment, le produit du tail DNA par la distance entre les centres de masses de la tte
et rrige absolument ce phn e nivea atistique permet de
confirme l'impression gnrale dgage par les graphiques box
statistique envisag, trs efficace pour rsume ste ensembl
donnes, perd cependant une bonne partie ation to eut donc
complmentaire d'une reprsentation grap istributi emple, l s
des distributions des donnes montrent que, mme si la reproductibilit des mdianes et p75
des tail DNA apparat meilleure, les mesures tail DNA sont plus disperses que les tail
moments; la correction introduite dans le Olive tail moment rduit sensiblement cette
dispersion.
292
Tableau 5.4-10 : Mdianes des Tail DNA
Rsultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements;

Source de Somme des
rrs
Carr moyen F
Probabilit
du F observ
Signification Variance CV %
3 lectrophorses; 2 lames; 50 comtes par lame; Cellules P388D1)
et tests post-hoc (matrice des probabilits; comparaisons par paires)


variation
ddl
ca
Tra 63.48 itement 8 19796.132 2474.517 254.919 < 0.001 *** 205.40
Electroph. 2 39.216 19.608 2.020 0.165 NS 1.10
T X E 16 155.313 9.707 2.341 0.025 * 1.85
Rsidu 27 111.971 4.147 4.15 9.0
4.65
6.03
2

CV % intra-srie (inter-lames) = 9.0 %
CV % total = 10.2 %

Comparaisons post-hoc : tests t, correction de Bonferroni; les diffrences statistiquement

Contrle
1
Contrle
2
UVA -ala -ala + -ala + -ala + -ala + Lum 30
significatives (p < 0.05) sont soulignes
lum 30 lum 60 UVA 30 UVA 60
Contrle 1 1.000
UVA < 0.001

< 0.001 1.000
-ala 1.000 1.000 < 0.001 1.000
-ala +
lum 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
-ala +
lum 60
< 0.001 < 0.001 0.040 < 0.001 < 0.001 1.000
UVA 30
-ala +
UVA 60
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
Contrle 2 1.000 1.000
-ala + < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
Lum 30 1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000



L'tude des mdianes des distributions de tail DNA montre qu'il y a une diffrence significative entre
traitements, pas de diffrence entre lectrophorses et une interaction traitement X lectrophorse
significative (*).
A l'inverse des traitements contrle 1, contrle 2, -ala et lum 30 qui ne peuvent tre distingus, tous
autres traitements diffrent des contrles et diffrent entre eux.
les

293
Tableau 5.4-11 : Percentiles 75 des Tail DN
Rsultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements;
3 lectrophorses; 2 lames; 50 comtes par lame; Cellules P388D1)
et tests post-hoc (matrice des probabilits; comparaisons par paires)
A


Source de
ddl
Somme des
Carr moyen F
Probabilit
d
Signification Variance CV %

variation carrs u F observ
< 0.001
10.732 5.366 0.157 0.856 NS -3.2 ------
T X E 16 546.775 34.173 3.411 0.002 ** 8.05 8.94
Rsidu 27 270.468 10.017 10.02 9.98
Traitement 8 30312.305 3789.038 110.877 *** 312.91 55.75
Electroph. 2

CV % intra-srie (inter-lames) = 10 %

Comparaisons post-hoc
CV % total = 10 %
: tests t, correction de Bonferroni; les diffrences statistiquement

Contrle
1
Contrle UVA -ala -ala + -ala + -ala + -ala + Lum 30
significatives (p < 0.05) sont soulignes
2 lum 30 lum 60 UVA 30 UVA 60

Contrle 2 1.000 1.000
< 0.001 < 0.001 1.000
-ala 1.000 1.000 < 0.001 1.000
-ala +
lum 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
-ala +
lum 60
-ala +
UVA 30
-ala +
UVA 60
Lum 30
Contrle 1 1.000
UVA

< 0.001 < 0.001 0.533 < 0.001 < 0.001 1.000

< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000

< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000


L'tude des percentiles 75 des distributions de tail DNA montre qu'il y a une diffrence significative entre
ntrle 1, contrle 2, -ala et lum 30 ne peuvent tre distingus. Tous les autres traitements
t
traitements, pas de diffrence entre lectrophorses et une interaction traitement X lectrophorse
significative (**).
Les traitements co
diffrent des contrles et diffrent entre eux, l'exception des traitements UVA et -ala + lum 60 qui son
identiques.
294
Tableau 5.4-12 : Mdianes des Olive tail mome
Rsultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements;
3 lectrophorses; 2 lames; 50 comtes par lame; Cellules P388D1)
et tests post-hoc (matrice des probabilits; comparaisons par paires)
nts


Source de
d
Somme des
Carr
Pro
du
observ
nificat Varian CV %

variation
dl
carrs
moyen F
babilit
F Sig ion ce
Traitement 8 869.585 108.698 177.587 < 0.001 *** 9.01 73.62
Electroph. 2 3.314 1.657 2.707 0.097 NS 0.12 8.36
T X E 16 9.793 0.612 1.486 0.177 NS 0.07 6.34
Rsidu 27 11.118 0.412 0.41 15.74

ter-lames) = 15.7 %
CV % total = 17.8 %
omparaisons post-hoc
CV % intra-srie (in

C : tests t, correction de Bonferroni; les diffrences statistiquement
significatives (p < 0.05) sont soulignes
C
1
Contrle
2
UVA -ala -ala +
lum 30
-ala +
lum 60
-ala +
UVA 30
-ala +
UVA 60
Lum 30

ontrle
-ala
-ala +
lum 30
< 0.001
Contrle 1 1.000
Contrle 2 1.000 1.000
UVA < 0.001 < 0.001 1.000
1.000 1.000 < 0.001 1.000




< 0.001 < 0.001 1.000
< 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
-ala +
UVA 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
-ala +
UVA 60
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000

L'tude des mdianes des distributions de Olive tail moment montre qu'il y a une diffrence significat
entre traitements, pa
ive
s de diffrence entre lectrophorses et pas d'interaction traitement X lectrophorse.
Les traitements contrle 1, contrle 2, -ala et lum 30 ne peuvent tre distingus. Tous les autres traitements
diffrent des contrles et diffrent entre eux, l'exception des traitements UVA et -ala + lum 30 qui sont
identiques.
1.000
-ala +
lum 60
0.027
< 0.001
< 0.001
Lum 30 1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
295
Tableau 5.4-13 : Percentiles 75 des Olive tail mome
Rsultats de l'analyse de variance 2 facteurs (9 traitements;
3 lectrophorses; 2 lames; 50 comtes par lame; Cellules P388D1)
et tests post-hoc (matrice des probabilits; comparaisons par paires)
nt
n F
lit
obs
ti ance V %




Source de
variation
ddl
Somme des
carrs
Carr moye
Probabi
du F erv
Significa on Vari C
16 1.62 1.9 0.0
Rsidu 27 22.97 0.85
Traitement 8 1471.901 183.988 113.009 < 0.001 *** 15.20 64.69
Electroph. 2 1.456 0.728 0.447 0.647 NS -0.10 ------
T X E 26.049 8 13 66 NS 0.26 8.45
5 1 0.85 15.31

CV % intra-srie (inter-lames) = 15.3 %
CV % total = 15.3 %

Comparaisons post-hoc : tests t, correction de Bonferroni; les diffrences statistiquement

Contrle Contrle UVA -ala -ala + -ala + -ala + -ala + Lum 30
significatives (p < 0.05) sont soulignes
1 2 lum 30 lum 60 UVA 30 UVA 60
Contrle 2 1.000 1.000
UVA < 0.001 < 0.001 1.000
-ala 1.000 1.000 < 0.001 1.000
lum 30
< 0.001
-ala + < 0.001
lum 60
-ala +
Contrle 1 1.000
-ala + < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
< 0.001 0.014 < 0.001 0.021 1.000
UVA 30
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
-ala +

< 0.001
UVA 60
Lum 30

L'tude des percentiles 75 des distributions de Olive tail moment montre qu'il y a une diffrence
significative entre traitements, pas de diffrence entre lectrophorses et pas d'interaction traitement X
lectrophorse.
A l'inverse des traitements contrle 1, contrle 2, -ala et lum 30 qui ne peuvent tre distingus, tous les
autres traitements diffrent des contrles et diffrent entre eux.
< 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.001 1.000
1.000 1.000 < 0.001 1.000 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 1.000
296
5.4.2.5 Discussion
aramtre comte considrer fait toujours l'objet d'un dbat actif entr
thode et aucun consensus ne semble se dgager (Tice et al., 2000).
Le choix du p e les
utilisateurs de la m Nous
vons donc tudi 2 paramtres souvent employs, le tail DNA et une expression du moment
e queue; pour ce dernier, nous avons choisi le Olive tail moment
79
qui, au contraire du tail
m sique
80
, e tivem luenc par l'estimation exacte de la longueur de
queue, un paramtre trs difficile r. Une recommandation gn e cons
mesurer de 50 100 comtes sur 2 ou 3 lames (Lovell et al., 1999; Tice et al., 2000) ce qui
fo pide nt une somme de donnes considrables.
Le traitement statistique de ces donnes a t relativement peu tudi et nombre d'auteurs
div e tes, certains
reco e t t ou une analyse de variance, soit aprs test du caractre
gaussien des distributions (Belpaeme et al., 1998; De Boek et al., 2000), soit aprs
8),
it sans tenir compte du c d'autres procdent des
tests non-paramtriques, Mann-Whitney (Anderson et al., 1997; Lehmann et al., 1998) ou
Kolmogorov-Smirnov (Belpaeme et al., 1998; Moretti et a ) c ns, et
Wa n et al., 97; De Boek et al., 2000) pour plus de 2 chantillons. Le
test de Kolmogorov-Smirnov a galement t appliqu sur les donnes pooles de plusieurs
chantillons qvi l., 1 don des nombres impressionnants de rplicata, ce
qui peut sr n r l e ue.
Une valuation visuelle du % de cellules prsentant une queue peut tre suivie d'une
araison par un test (Miyamae et al., 1997b), un test cependant trs sensible de petites
diffrences entre chantillons (Lovell et al., 1999).
dispe es s re p isa n icient de
ion", com le r nt end va an cart talon
ijayalaxmi et al., 1992). Cette valeur qui caractrise la distribution est cependant trs
sen
s de modlisation ont galement t appliques. Chaque chantillon de
com
donc de comparer les distances entre les 2 moyennes (Olive et Durand, 1992). La distribution

a
d
oment clas st rela ent peu inf
mesure ral iste
urnit ra me
ur nt simplement un tes
transformation logarithmique (Betti et al., 1994; Churg et al., 1995; Wojewodzka et al., 199
aractre non-gaussien (Holz et al., 1995 so );
l., 1998 hantillo
Kruskal- llis (Anderso 19
erg nt quant la mthode employe. Pour comparer les chantillons de com
pour 2
(Berg st et a 998), c sur
ieuseme e s
d re t
t fauss 'analy statistiq
comp
La rsion mesu peut reflte l 'u
r l'
ar l'uti tion d "coeff
dispers dfini me apport e re l't ue des leurs ( ge) et
(V
sible un petit nombre de valeurs extrmes (Lovell et al., 1999).
Des technique
tes a pu tre ajust une somme de 2 distributions normales, permettant d'estimer et

79
Produit du tail DNA et de la distance sparant les centres de masse de la tte et de la queue
80
Produit du tail DNA et du tail length
297
des mom ue a galement pu tre modlise comme une distribution , une fonction
u e

it de

cellules prsentent en effet un
pou
ents de que
n seul paramtre (n, le "nombre de degrs de libert") qui permet donc de caractriser et d
comparer les chantillons (Bauer et al., 1998). La fonction prsente cependant une
singularit pour les valeurs faibles du paramtre (n < 2), empchant de caractriser les
chantillons de cellules contrles (Bock et al., 1998).
Parmi toutes ces mthodes et philosophies de test statistique, aucune ne fait encore l'objet
d'un consensus (Tice et al., 2000). Les discussions rcentes montrent cependant que l'un
comparaison ne devrait pas tre la cellule, mais le traitement (Lovell et al., 1999; Tice et al.,
2000). Les comparaisons portant sur de grands nombres de
voir discriminant lev, mettant trop facilement en vidence un effet.
5.4.2.6 Conclusions quant au traitement statistique des donnes comtes
Aucune tude systmatique des traitements statistiques de donnes comtes n'tant enc
publie, il nous a sembl important de dfinir les conditions d'utilisation de cette m
nouvellement introduite dans le laboratoire. Cette tude originale des diffrentes possibilits
de reprsentation des donnes et de traitement statistique nous mne aux conclusions
suivantes :
1. la reprsentation en box plots est un moyen efficace de comparer visuellement l
amplitudes et surtout les distributions des dgts occasionns, sans le biais visuel
des histogrammes tridimensionnels;
2. les distributions de comtes ne prsentent pratiquement jamais un caractre
gaussien;
ore
thode
es
ique;
en vidence des diffrences
le;
es peut tre limite par

3. les distributions ne peuvent tre normalises par une transformation logarithm
4. la comparaison des chantillons de comtes par un test non-paramtrique
(Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney) met
objectivement peu importantes et n'apporte donc aucun renseignement uti
5. la rduction aux statistiques non-paramtriques reprsentatives permet une
comparaison des chantillons par analyse de variances;
6. la perte d'information
81
due cette rduction aux statistiqu
l'utilisation de 2 statistiques (mdiane et percentile 75);
7. il n'y a pas de diffrence significative entre lectrophorses;

81
Notamment quant la dispersion des mesures
298
8. les 2 paramtres de comtes tudis, tail DNA et Olive tail moment, permettent
d'arriver des conclusions similaires et il n'y a pas de diffrence flagrante entre
eux.

Pour la suite de ce travail qui consistera principalement en analyses de tendance, nous
avo

NA (% d'ADN dans
r une
e,
e la
"forme" des comtes. La mesure de ce paramtre est aussi fiable que celle du

2. uplicata afin d'en extraire les paramtres
ui, considres individuellement, nous ont permis d'estimer la
3. rver une

5.4.2.7 Conclusions quant l'effet photodynamique des porphyrines
ns donc dcid :
1. de ne plus considrer les 2 paramtres comtes pour chaque exprience et de
prsenter les rsultats :
sous la forme de tail DNA pour les essais de dtection de lsions spcifiques
l'aide d'endonuclases de rparation (Section 5.5); le tail D
la queue) nous semble en effet le paramtre naturel pour estime
augmentation de la quantit d'ADN migrant aprs fragmentation enzymatique;
sous la forme de Olive tail moment pour les autres expriences; ce paramtr
qui localise d'une certaine faon le gros de l'ADN dplac sous l'action du
champ lectrique, nous semble en effet un bon moyen de tenir compte d
tail DNA ( 5.3.1.5); elle prsente l'avantage de dpendre moins des conditions
exprimentales et de prsenter une dispersion plus rduite.
de coupler les lames de microscope d
statistiques reprsentatifs de 100 comtes et non plus de 2 x 50; ces lames
duplicata q
reproductibilit intra-lectrophorse ne sont en effet pas des chantillons
indpendants;
de considrer les 2 statistiques, mdiane et percentile 75, afin de conse
ide de la dispersion des mesures.

L'analyse de variance sur les paramtres extraits des distributions de comtes dmontre
que ni la lumire blanche, ni l'acide -aminolvulinique n'induisent des cassures de chanes en
quantit e blanche aprs
induction des porphyrines exerce un effet significatif.
Les UVA induisent des cassures de chanes et cet effet est largement potentialis aprs
induction des porphyrines.
suprieure aux contrle. Par contre, une irradiation par la lumir
299
5.4.3 Analyse de tendance
Les rponses au traitement photodynamique ont t mesures en fonction de la dose de
lumire, en prsence et en absence de -ala; les traitements raliss sont dcrits dans le
Tableau 5.4-14. Chaque traitement (100 comtes mesures sur 2 lames) a t rpliqu au
cou
4.2). Au fur et mesure de leur prparation, les lames de microscope sont
disposes alatoirement dans les cuves contenant la solution de lyse et maintenues 4C;
chaque cuve est assigne un run d'lectrophorse excut endans les 2 jours.


Tableau 5.4-14
rs d'expriences indpendantes ralises de la mme manire que pour l'tude de
reproductibilit ( 5.
: Traitements raliss dans le cadre de l'tude d'analyse de tendance
(Cellules P388D1)


Nom donn aux
chantillons
Traitement
contrle aucun (ni -ala, ni irradiation )
-ala 300 M 3 h + 30 min 4C sans irradiation
irradiation lumire visible, 4C, 5 min (3.6 J/cm)
irradiation lumire visible, 4C, 15 min (10.7 J/cm)
-ala
lum 5
lum 10 irradiation lumire visible, 4C, 10 min (7.1 J/cm)
lum 15
lum 30 irradiation lumire visible, 4C, 30 min (21.4 J/cm)
UVA 5 irradiation UVA, 4C, 5 min (0.09 J/cm)
UVA 10 irradiation UVA, 4C, 10 min (0.19 J/cm)
UVA 15 irradiation UVA, 4C, 15 min (0.28 J/cm)
UVA 30 irradiation UVA, 4C, 30 min (0.56 J/cm)
-ala + lum 5 -ala 300 M 3 h + irradiation lumire visible, 4C, 5 min (3.6 J/cm)
-al
-ala + l diation lumire visible, 4C, 15 min (10.7 J/cm)
-ala + lum 30 -ala 300 M 3 h + irradiation lumire visible, 4C, 30 min (21.4 J/cm)
/cm)
-ala + UVA 10 -ala 300 M 3 h + irradiation UVA, 4C, 10 min (0.19 J/cm)
a + lum 10 -ala 300 M 3 h + irradiation lumire visible, 4C, 10 min (7.1 J/cm)
um 15 -ala 300 M 3 h + irra
-ala + UVA 5 -ala 300 M 3 h + irradiation UVA, 4C, 5 min (0.09 J
-ala + UVA 15 -ala 300 M 3 h + irradiation UVA, 4C, 15 min (0.28 J/cm)
-ala + UVA 30 -ala 300 M 3 h + irradiation UVA, 4C, 30 min (0.56 J/cm)

300
5.4.3.1 Rsultats
Les Figures 5.4-5 et 5.4-6 montrent les box plots de l'ensemble des rsultats pour,
respectivement, les traitements lumire blanche et UVA. Le Tableau 5.4-15 prsente les
mdianes et p75 des Olive tail moments mesurs pour tous les traitements.
5.4.3.2 Courbes dose-rponse


Les courbes de tendance "dose de lumire - rponse (statistique reprsentative de la
distribution des Olive tail moments)", en absence et en prsence de -ala et pour les
traitements lumire blanche et UVA, ont t tablies pour les mdianes (Figure 5.4-7) et les
percentiles 75 (Figure 5.4-8).
301
Figure 5.4-5 : Lumire blanche : Rsultats de l'ensemble des expriences (Cellules P388D1)


Contrle
ala
Lum 5 min
Lum 10 min
Lum 15 min
Lum 30 min
Lum 5 min
Lum 10 min
Olive Tail Moment
0 10 20 30 40
Lum 30 min
Lum 15 min
-ala
300 M
3 h
+


Les rsultats, prsents traitement par traitement en fonction de la dose de lumire, correspondent
10 traitements (dcrits au Tableau 5.4-14) raliss en duplicata (expriences indpendantes); 100
comtes mesures sur 2 lames.

302
Figure 5.4-6 : UVA : Rsultats de l'ensemble des expriences (Cellules P388D1).


Contrle
ala
UVA 5 min
UVA 10 min
UVA 15 min
UVA 30 min
UVA 5 min
UVA 10 min
UVA 15 min
UVA 30 min
Olive Tail Moment
0 10 20 30 40

-ala
300 M
3 h
+

Les rsultats, prsents traitement par traitement en fonction de la dose de lumire, correspondent
10 traitements (dcrits au Tableau 5.4-14) raliss en duplicata (expriences indpendantes); 100
comtes mesures sur 2 lames.

303
Tableau 5.4-15 : Mdianes et percentiles 75 des distributions de comtes et leurs intervalles
de confiance 95 %; Olive tail moment; 10 traitements raliss en duplicata
(expriences indpendantes); 100 comtes mesures sur 2 lames; Cellules
P388D1 (Traitements dcrits dans le Tableau 5.4-14)


Mdiane du Olive tail moment p75 du Olive tail moment
Traitement
Exprience 1 Exprience 2 Exprience 1 Exprience 2
contrle 0.46
(0.29 - 0.61)
1.66
(1.27 1.96)
0.89
(0.70 1.20)
2.64
(2.12 3.58)
-ala 0.39
(0.23 - 0.52)
1.75
(1.33 2.06)
0.81
(0.61 - 0.97)
3.39
(2.49 3.99)
lum 5 0.55
(0.42 - 0.69)
0.48
(0.33 0.57)
1.10
(0.85 - 5.55)
0.76
(0.69 - 0.97)
lum 10 0.56
(0.46 - 0.64)
0.45
(0.38 - 0.57)
0.85
(0.72 1.00)
0.95
(0.65 1.27)
lum 15 0.94
(0.64 1.29)
0.31
(0.20 - 0.45)
1.85
(1.47 2.11)
0.67
(0.52 - 0.89)
lum 30 0.61
(0.53 - 0.80)
0.81
(0.65 - 0.98)
0.94
(0.86 1.20)
1.25
(1.06 1.58)
-ala + lum 5 1.02
(0.88 1.24)
0.50
(0.41 - 0.69)
1.55
(1.40 2.01)
1.09
(0.89 1.17)
-ala + lum 10 1.06
(0.91 1.38)
0.90
(0.69 1.23)
1.96
(1.54 2.23)
1.70
(1.43 2.20)
-ala + lum 15 2.82
(1.94 3.78)
1.62
(1.44 1.85)
6.85
((5.30 8.55)
2.65
(2.24 3.20)
-ala + lum 30 4.39
(3.92 4.86)
2.43
(1.64 3.23)
6.85
(5.87 8.08)
4.83
(4.16 6.09)
UVA 5 0.53
(0.36 - 0.63)
0.72
(0.51 - 0.90)
0.92
(0.72 2.03)
1.34
(1.12 1.51)
UVA 10 0.99
(0.79 1.14)
2.38
(1.98 2.95)
2.10
(1.52 2.89)
4.24
(3.45 - 5.33)
UVA 15 1.34
(1.16 1.72)
3.99
(3.04 4.84)
2.20
(1.83 2.77)
6.33
(5.29 7.72)
UVA 30 3.71
(3.04 - 5.57)
4.22
(3.58 - 5.94)
9.89
(8.15 12.57)
9.70
(7.53 12.76)
-ala + UVA 5 1.76
(1.49 2.39)
1.02
(0.85 1.43)
4.12
(2.70 - 5.11)
2.01
(1.54 2.29)
-ala + UVA 10 2.69
(1.96 3.55)
5.22
(4.62 6.21)
4.87
(3.99 6.49)
8.26
(7.34 - 9.23)
-ala + UVA 15 5.08
(4.50 - 5.62)
5.56
(4.23 7.12)
7.23
(6.06 7.66)
9.04
(8.05 10.65)
-ala + UVA 30 10.53
(9.45 11.06)
9.78
(8.87 10.73)
13.38
(11.96 14.93)
13.43
(11.73 14.09)

304
Figure 5.4-7 : Mdianes de la distribution des Olive tail moments en fonction de la dose de
ire (Cellules P388D1)
face de chaque droite sont indiqus le coefficient de dtermination et la probabilit du test
r l'existence d'une pente significative. Les traitements sont
lum
En
pou dcrits dans le Tableau 5.4-14
(** 1; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05)
Sans incubation a ique
*, p < 0.00

vec l'acide -aminolvulin
30
'irradia
Lumire blan
Va

Aprs incubation a 'acide -aminolvulinique

vec l tion d )
O
l
i
a
i
l
umire b
UVa

R = 0.665
()
R = 0.02
(NS)
0.634
(pas d'induction de porphyrines)
0
4
8
12
16
0 10 20
Temps d tion (min)
O
l
i
v
e

t
a
i
l

m
o
m
e
n
t
che
U
(induc e porphyrines
0
4
8
12
16
0 10 20 30
Temps d'irradiation (min)
v
e

t

m
o
m
e
n
t
L lanche
R = 0.906
()
R =
()
305
Figure 5.4-8 : Percentiles 75 de la distribution des Olive tail moments en fonction de la dose
de lumire (Cellules P388D1
En face de chaque droite sont indiqus le coefficient de dtermination et la probabilit du test
pour l'existence d'une pente significative. Les traitements sont dcrits dans le Tableau 5.4-14
(***, p < 0.001; **, p < 0.01; *, p < 0.05; NS, p > 0.05)

)

Sans incubation avec l'acide -aminolvulinique (pas d'induction de porphyrines)
0
4
8
12
16
0 10 20 30
Temps d'irradiation (min)
O
l
i
v
e

t
a
i
l

m
o
m
e
n
t
Lumire blanche
UVa


Aprs incubation avec l'acide -aminolvulinique (induction de porphyrines)
0
4
8
12
16
0 10 20 30
Temps d'irradiation (min)
O
l
i
v
e

t
a
i
l

m
o
m
e
n
t
Lumire blanche
UVa
R = 0.911
()
R = 0.538
()


R = 0.829
()
= 0.041
(NS)
R
306
Le Tableau 5.4-16 compare les pentes des droites de rgression obtenues en prsence et en
la (correspondant aux Figures 5.4-7 et 5.4-8 prsentes ci-avant).

absence de -a

Tableau 5.4-16 : Comparaison des pentes des droites de rgression obtenues avec et sans

(0.05; 16)


Mdiane Percentile 75
induction des porphyrines
t = 2.112
Lumire blanche
(n = 10)
Sans induction
des porphyrines
Aprs induction
des porphyrines
Sans induction
des porphyrines
Aprs induction
des porphyrines
R 0.020 0.634 0.041 0.538
b - 0.005 0.090 - 0.011 0.153
sb 0.013 0.024 0.019 0.050
p du test pour l'existence
d'une pente significative
0.659
NS
0.006
**
0.575
NS
0.016
*
Comparaison des pentes
(a)
Comparaison des pentes
(a)

t calcul 3.48 3.07
p 0.003
**


0.007
**

UVA
(n = 10)
Sans induction
des porphyrines
Aprs induction
des porphyrines
Sans induction
des porphyrines
Aprs induction
des porphyrines
R 0.665 0.906 0.829 911 0.
b 0.111 0.317 0.290 0.388
sb 3
p du test pour l'existence
d'une pente significative
0.004
**
< 0.001
***
< 0.001
***
< 0.001
***

Comparaison des pentes Comparaison des pentes
0.028 0.028 0.047 0.04
t calcul 5.202 1.538
p < 0.001
***


0.143
NS


(a)
Note : dans le cas prsent, ce test est redondant; en effet, les sont statistiquement non diffrentes de 0
pour l'irradiation sans induction des porphyrines.


5.4.3.3 Discussion
pentes

La lumire blanche seule ne prsente aucun effet significatif et il n'y aucune relation entre
la dose de lumire et la fragmentation de l'ADN (R = 0.02 ou 0.041 suivant le quantile
envisag; les tests pour l'existence d'une pente sont largement non significatifs). Aprs
induction des porphyrines, l'analyse de tendance dmontre un effet significatif dose-
dpendant.
307
La lampe UVA induit par elle-mme des cassures de chane de manire dose-dpendante;
aprs induction des porphyrines, l'tude des mdianes dmontre une augmentation de pente
significative, donc un effet photodynamique se traduisant par une fragmentation accrue de
istiquement significative, certainement en raison d'une
lus grande variabilit des mesures. Ce paramtre statistique est en effet plus sensible que la
diane aux valeurs extrme
e des box p de s l'interprtation des donnes, car il
toute une part d'in du ucti u
graphiques (Figures 5.4-5 et 5.4-6), un certain nombre de valeurs extrmes peuvent en effet
server, de manire appar nt erratique certains chan (notamme r des
in et UVA 5 et 10 min). D'a s notre exprience ultrieure, ces valeurs
proviennent de la manipulation; une remise en suspension trop vigoureuse des cellules avant
l'tape d'incorporation dans l'agar induit des cassures de chanes dans l'ADN, ce qui augmente
variabilit intra-chantillon
Conclusions q an de
l'ADN. La mme tendance s'observe dans l'tude des percentiles 75; mais, dans ce cas,
l'augmentation de pente n'est pas stat
p
m s.
Le graphiqu
prsente
lots est une ai
formation per
prcieuse dan
e lors de la rd on aux statistiq es. Sur ces
s'ob emme pour tillons nt pou
chantillons LUM 5 m pr
la .
5.4.3.4 u t l'analyse tendance
L'analyse de tendance sur les paramtres statistiques met en vidence un effet dose-
pendant et parvient des r s similaires ceux de l'tude de ductibilit
lyse ANOVA prsente c t ( 5.4.2.4). Elle permet de distinguer une absence d'effet
blanche ffet pos -ala + lu nche,
UVA). So application ose cependa t le oxicit et
t pas tre toujours v e pouvoir onter en dose.
4.3.5 Conclusions quant hotodynamique des porp e
d sultat repro par
ana i-avan
gnotoxique (lumire ) d'un e itif (UVA, mire bla -ala +
n certaines molcules p n problme de la cytot
il ne doi ident d m
5. l'effet p hyrin s
'une pente significative pour la lumire blanche aprs induction des porphyrines indique sans
ur les UVA, la pente devient plus importante aprs -ala ce qui indique
galement un effet photodynamique; l'augmentation de pente, statistiquement significative
pour la mdiane, est une tendance nette pour les percentiles 75.
Les coefficients de dtermination sont relativement loigns de l'unit, mais il convient de
ne pas oublier que ces rgressions portent sur des quantiles qui ne sont que des reflets trs
imparfaits des distributions relles.
L'effet photodynamique est galement dmontr par l'analyse de tendance. L'apparition
d
conteste un effet. Po
308
5.5 PHOTOOXYDATION DE L'ADN PAR LES PORPHYRINES
INDUITES : UTILISATION D'ENDONUCLEASES SPECIFIQUES.
L'utilisation d'endonuclases bactriennes spcifiques de certaines lsions devrait
permettre de dterminer si (i) l'essai comte parvient aux mmes conclusions que les tudes
chromatographiques (Chapitre 4) quant l'induction de purines oxydes par le traitement
photodynamique; et (ii) si l'effet de fragmentation observ avec la lampe UV est d
l'induction (donc la rparation) de dimres par la fraction UVB prsente dans le
rayonnement.
Aprs l'tape de lyse, les nuclodes sont traits in situ dans le gel d'agarose par l'enzyme
tudie, 37C; les lsions spcifiques excises se traduisent par une fragmentation
additionnelle, donc par une migration accrue de l'ADN.
5.5.1 Les endonuclases utilises
Les 3 endonuclases bactriennes spcifiques employes au cours de ce travail
proviennent de vecteurs plasmidiques exprims dans des souches bactriennes (Epe et Hegler,
s dcrits dans le Tableau 5.5-1.

1994; Angelis et al., 1999). Elles reconnaissent les site
Tableau 5.5-1 : Endonuclases de rparation utilises au cours de ce travail
Enzyme Spectre de reconnaissance
Bases modifies Site abasique (site AP) dont le
dsoxyribose est

non modifi oxyd en 1' oxyd en 4'
Formamidopyrimidine 8-oxodG et formamidopyrimidine
glycosylase (FPG)
(EC 3.2.2.23)
5-OH-cytosine, 5-OH-uracile, acide
-uridoisobutyrique et acide -R-OH-
-uridoisobutyrique
(Endo III)
82


OH-6-hydrothymine, 5,6-dihydrouracile,
alloxane, 5-OH-6-hydrouracile, uracile
glycol, 5-OH-cytosine, 5-OH-uracile,
acide -uridoisobutyrique et acide -R-
OH--uridoisobutyrique
-
T4 endonuclase V dimres de pyrimidines
+
-
+
Endonuclase III thymine glycols, 5,6-dihydrothymine, 5- + +
(T4
82
+
-
+
)

D'aprs (Epe et Hegler, 1994; Laval et al., 1998)


82
Pas de numro EC
309
La FPG est globalement spcifique des purines oxydes mais elle peut galement exciser
certaines pyrimidines; l'Endo III a une spcificit large envers les pyrimidines oxydes,
excisant les pyrimidines noyau satur, ouvert ou fragment; la T4 endonuclase V reconnat
les dommages UV-induits directs.
Ces enzymes ont en fait une activit glycosylasique et AP endonuclasique combine;
elles liminent la lsion et incisent le squelette ADN au site AP gnr (Epe et Hegler, 1994).
Les sites AP sont donc galement substrats de ces enzymes.
ole 5.5.2 Protoc
t entre la source UVA et les
oute trace d'UVB (cf 2.3.2.4.4)

Tab
Afin de pouvoir mettre en vidence une augmentation de la fraction d'ADN migrante, des
conditions qui fragmentent relativement peu l'ADN ont t tudies (Tableau 5.5-2).
Certaines expriences ont t ralises en interposan
chantillons un filtre qui permet liminer t
leau 5.5-2 : Traitements raliss dans le cadre de l'tude avec endonuclases
(Cellules P388D1)
Nom donn aux Traitement
chantillons
(a)
contrle aucun (ni -ala, ni irradiation )
-ala -ala 300 M 3 h + 30 min 4C sans irradiation
0 irradiation lumire visibl
lum 20 mire visible, 4C, 20 min (14.2
UVA 10 irradiation UVA, 4C, 10 min (0.19 J/cm
ya UV34, 4C, in
umire visible, 4C, 10 min (7.1 J/cm)
-ala + lum 20 rradiation lumire visible, 4C, 20 min (14.2 J/cm)
, 4C, 10 .19 J/cm
V filtr sous filtre Hoya UV34, 4C, 11 min
lum 1 e, 4C, 10 min (7.1 J/cm)
irradiation lu J/cm)
)
UVA filtr
-ala + lum 10
irradiation UVA sous filtre Ho
-ala 300 M 3 h + irradiation l
-ala 300 M 3 h + i
11 m
-ala + UVA 10
-ala + U
-ala 300 M 3 h + irradiation UVA
-ala 300 M 3 h + irradiation UVA
min (0 )
ux de rsultats et Figures, le nom de l'enzy
au nom de l'chantillon; par
des cellules -ala (300 M 3 h), irrad 0.1

(a)
Dans les Tablea me utilise pour rvler un type de lsions
peut tre accol exemple : "-ala + UVA 10 + FPG" signifie "traitement
par iation UVA (4C, 10 min, 9 J/cm) et rvlation des lsions
par digestion des nuclodes par l'enzyme FPG (formamidopyrimidine glycosylase) avant
lectrophorse"

310
5.5.3 ines et pyrimidines oxyd Pur es
5.5.3.1 Rsultats
Les graphes box plots des Figures 5.5-1 et 5.5-2 (3 expriences indpendantes ralises
endans 3 mois) comparent l'augmentation de fragmentation due l'action des endonuclases
FPG et Endo III, et ce pour diffrentes conditions exprimentales. Les Figures 5.5-3 et 5.5-4
rsument ces donnes en prsentant les mdianes de tail DNA mesures. Pour plus de
lisibilit, chaque figure reprend les donnes obtenues sans l'utilisation d'endonuclases.
compare les augmentations des mdianes de tail DNA dues l'effet
photodynamique des porphyrines; les mdianes de Olive tail moment sont galement
prsentes.

Tab
Le Tableau 5.5-3
leau 5.5-3 : Diffrences de mdianes entranes par l'induction de porphyrines av
irradiations lumire blanche et UVA
ant les
Les rsultats correspondent 3 expriences indpendantes ralises sur 3 mois; 100 comtes
mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2).
Tail DNA VA Irradiation lumire blanche Irradiation U
Trai
endo
A 10
Diffrence due
l'effet
photodynamique
lum 20

-ala +
lum 20
Diffrence due
l'effet
photodynamique
tement
nuclase
UV
-ala +
UVA 10
de digestion
matique
27.7 + 13.1 4.3
34.6 + 16.8 23.2
41.5 + 23.8 12.4
28.8 + 12.6 17.7
26.5 + 13.5 7.0
e tail
ent
Irradiation UVA Irradiation lumire bl
ment

-ala +
Diffrence due
-ala +
Diffrenc
Pas
enzy
17.7
19.6
14.6

30.4
37.9
+ 12.7
+ 18.3
14.8
11.4


18.8
26.3
14.1
+ 4.0
+ 14.9
+ 9.8
Digestion FPG 17.8
36.2
17.7

56.4 + 20.2 20.8


29.1
36.0
22.1
+ 5.9
+ 15.2
+ 9.7
Digestion Endo
III
16.2
24.9
13.0

34.0 + 9.1 17.8

24.8
21.2
14.7
+ 7.1
+ 3.4
+ 7.7


Oliv
mom
anche
Traite
endonuclase
UVA 10
UVA 10
l'effet
photodynamique
lum 20
lum 20
e due
l'effet
photodynamique
Pas de
enzymati
digestion
que
1.0
4.0
1.6




2.7
7.5
4.7

+ 1.7
+ 3.5
+ 3.1
1.5
1.2
0.6


3.9
4.8
2.3
+ 2.4
+ 3.6
+ 1.7
FPG 2.3 Digestion
6.9
2.2



6.5
10.5
8.3
+ 4.2
+ 3.6
+ 6.1
3.1
3.6
1.5


5.3
6.9
3.8
+ 2.2
+ 3.3
+ 2.3
Digestion Endo
III
2.1
3.6
1.3



5.6
5.9
4.2
+ 3.5
+ 2.3
+ 2.9
2.5
2.2
0.7


4.5
4.4
1.6
+ 2.0
+ 2.2
+ 0.9

311
Figure 5.5-1 : Comparaison de la fragmentation mesure avant et aprs action de la FPG
(excision des purines oxydes)
sultats, prsents traitement par traitement, correspondent 3 expriences indpendantes
ralises sur 3 mois; 100 comtes mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2).

Les r
Les mesures sans l'action d'une endonuclase sont identiques celles de la Figure 5.5-2.

A. Sans action d'une endonuclase
100
C
o
n
e
l

1
0
+

1
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
V

1
0

U
V
A

1
T
a
i
l

D
0
2
60
N
A
80
0
40
Exprie
Exprience 1
nce 2
Exprience 3
t
r

l
a
l
a
u
m
l
u
m

2
0

l
u
m
0
a
l
a

A
a
l
a

+
0
B. Apr ion d a FP



s act e l G

l
e
a
l
a 0
l
u
m

2

1
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
A

1
0
U
V
A

1
0
T
a
i
l

D
N
A
0
20
60
80
100


C
o
n
t
l
u
m

1
0
a
l
a

+

l
u
m
U
V
a
l
a

+

40


Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3
312
Figure 5.5-2 : Comparaison de la fragmentation mesure avant et aprs action de l'Endo II
(excision des pyrimidines oxyd
Les rsultats, prsents traitement par traitement, correspondent 3 expriences indpendantes
ralises sur 3 mois; 100 comtes mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2)).
Les mesures sans l'action d'une endonuclase sont identiques celles de la Figure 5.5-1.
I
es)

A. Sans action d'une endonuclase
C
o
n
t
r

l
e
a
l
a
l
u
m

1
0
l
u
m

2
0
a
l
a

+

l
u
m

1
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
V
A

1
0
a
l
a

+

U
V
A

1
0
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3


I


B. Aprs action de l'Endo II
C
o
n
t
r

l
e
a
l
a
l
u
m

1
0
l
u
m

2
0
a
l
a

+

l
u
m

1
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
V
A

1
0
a
l
a

+

U
V
A

1
0
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100


Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3
313
Figure 5.5-3 : Comparaison des mdianes mesure avant et aprs action de la FPG
(excision des purines oxydes)
Les rsultats correspondent 3 expriences indpendantes ralises sur 3 mois; 100 comtes
mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2).
Les mesures sans l'action d'une endonuclase sont identiques celles de la Figure 5.5-4.

A. Sans action d'une endonuclase
0
20
40
60
a
l
a
l
u
m
2
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
V
A

1
0
a
l
a

+

U
V
A

1
0
T
a
i
l

D
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A
Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3



C
o
n
t
r

l
e


B. Aprs action de la FPG
0
20
40
60
a
l
a
l
u
m
2
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
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1
0
a
l
a

+

U
V


A

1
0
T
a
i
l

D
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A
Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3


C
o
n
t
r

l
e

314
Figure 5.5-4 : Comparaison des mdianes mesure avant et aprs action de l'Endo II
(excision des pyrimidines oxyd
Les rsultats correspondent 3 expriences indpendantes ralises sur 3 mois; 100 comtes
mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2).
Les mesures sans l'action d'une endonuclase sont identiques celles de la Figure 5.5-3.
I
es)

A. Sans action d'une endonuclase
0
20
40
60
a
l
a
l
u
m
2
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
V
A

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0
a
l
a

+

U
V
A

1
0
T
a
i
l

D
N
A
Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3



C
o
n
t
r

l
e



I B. Aprs action de l'Endo II
0
20
40
60
a
l
a
l
u
m
2
0
a
l
a

+

l
u
m

2
0
U
V
A

1
0
a
l
a

+

U
V
A

1
0
T
a
i
l

D
N
A
Exprience 1
Exprience 2
Exprience 3



C
o
n
t
r

l
e

315
5.5.3.2 Discussion
ulations avec les endonuclases de restriction nous semblent nettement plus
'essai comte classique et apparaissent moins reproductibles. De plus, la
Les manip
dlicates que l
lourdeur de manipulation et surtout les faibles quantits d'enzymes dont nous disposions ne
nous ont pas permis de rpter les essais. Remarquons que les rsultats enregistrs au cours de
l'exprience 2 sont systmatiquement plus levs que dans les autres essais. Il n'y a pas
d'explication vidente cette observation.
La dispersion des mesures, relativement importante, empche toute comparaison
statistique, mais nous pouvons cependant tenter de retirer quelques tendances importantes de
nos essais :
les UVA par eux-mmes n'induiraient que peu de sites sensibles la FPG et pas de
sites Endo III;
le traitement photodynamique UVA ne semble pas induire de pyrimidines oxydes
(pas d'effet de l'Endo III), il y a une tendance nette la formation de purines oxydes
(augmentation des mdianes et de la dispersion des distributions par excision FPG);
cet effet se manifeste de manire moindre lorsque la fragmentation "bruit de fond" est
trs importante (Exprience 2);
le traitement photodynamique lumire visible montre une tendance moins nette que les
UVA l'apparition de purines oxydes (augmentation de la dispersion des mesures par
ible sur la mdiane).
5.5.4 Photoproduits dimres
excision FPG mais effet fa

5.5.4.1 Rsultats
Les graphes box plots de la Figure 5.5-5 (2 chantillons indpendants) comparent
l'augmentation de fragmentation due l'action de la T4 endonuclase V, et ce pour diffrentes
conditions exprimentales.
Une exprience a galement t ralise aprs filtration de la fraction UVB de la lampe
employe dans ce travail (Filtre Hoya UV-34 qui absorbe toutes les longueurs d'onde
infrieures 320 nm, prsente une transmission de 50 % 340 nm et de 80 90 % au-dessus
de 360 nm; cf Figure 2.3-8); les rsultats sont prsents la Figure 5.5-6.

316
Figure 5.5-5 : Comparaison de la fragmentation mesure avant et aprs action de la
T4 endonuclase V (excision des dimres de pyrimidines)
ts; Les rsultats, prsents traitement par traitement, correspondent 2 chantillons indpendan
100 comtes mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2).

A. Sans action d'une endonuclase
80
100
t
T
D
40
a
i
l

N
A
60
20
C
o
n
r

l
e
a
l
a
l
u
m

2
0

+

l
u
m

2
0
U
V
A

1
0
+

U
V
A

1
0
0
Ech


Echantillon 1
antillon 2
a
l
a
a
l
a




B. Aprs action de la T4 endonuclase V
100
C
o
n
t
60
80
T
a
i
l

D
N
A
40
r

l
e
a
l
a
m

2
0
m

2
0
A

1
0
A

1
0
0
20
Ech


antillon 1
Echantillon 2
l
u
a
l
a

+

l
u
U
V
a
l
a

+

U
V



317
Figure 5.5-6 : Effet de la filtration des UVB sur les fragmentations mesures avec le
diffrentes endonuclases
100 comtes mesures sur 2 lames (traitements dcrits au Tableau 5.5-2).
s

C
o
n
t
r

l
e
C
o
n
t
r

l
e

E
n
d
o

I
I
I
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U
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+

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I
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V
A

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l
t
r


+

F
P
G
U
V
A

F
i
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t
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a

+


U
V
A

F
i
l
t
r

a
l
a

+

U
V
A

F
i
l
t
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+

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d
o

I
I
I
a
l
a

+

U
V
A

F
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l
t
r


+

F
P
G
a
l
a

+

U
V
A

F
i
l
t
r


+

T
4
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100


5.5.4.2 Discussion
Une forte augmentation de la fragmentation par la T4 endonuclase V est observe aprs
irradiation UV, que ce soit avant ou aprs induction des porphyrines (Figure 5.5-5).
L'irradiation avec les tubes Clo utiliss dans ce travail, typiques, rappelons-le, des salons de
bronzage, gnre donc des quantits apprciables de dimres bipyrimidiques. L'exprience
avec les UVB filtrs (Figure 5.5-6) montre que la plus grande partie de ces dimres sont
forms par la fraction d'UVB contenue dans le rayonnement de la lampe (rapport UVB/UVA,
1.2 %). En effet, aprs filtration des UVB, l'endonuclase T4 gnre sensiblement moins de
fragmentation additionnelle. Ces tracs montrent un effet net de la FPG, rvlant l'induction
de purines oxydes aprs induction des porphyrines et UVA; l'effet de l'Endo III aprs ce
traitement photodynamique est beaucoup plus important que dans les autres expriences mais
il est difficile de tirer une conclusion partir de l'ensemble des donnes. Rappelons que nous
n'avons pas eu l'occasion de rpter ces essais ( 5.5.3.2).


318
5.6 DISCUSSION : LA LUMIERE ET L'ESSAI COMETE
e ce travail, qui visait mettre en vidence un effet photodyna Au cours d mique des
porphyrines endognes ainsi qu'une mthode de traitement statistique des donnes obtenues
dans l'essai comte, nous avons relev diffrentes observations qui mritent d'tre mises en
perspective par rapport aux donnes publies.
5.6.1 Formation de cassures de chanes par une irradiation lumineuse
5.6.1.1 Energie ncessaire pour induire une lsion l'ADN
Une irradiation laser 308 nm a permis d'estimer que moins de 4 x 10
5
photons UVB par
cellule sont requis pour induire une lsion dans l'ADN dtectable par essai comte
83
, ce qui

Figure 5.6-1 : Energie ncessaire pour induire une lsion dtectable par essai comte
dans une cellule en fonction de la longueur d'onde.


(de With et Greulich, 1995)

correspondrait, compte tenu de la portion d'UVB dans la lumire solaire, une exposition
0.5 ms au soleil (de With et al., 1994). De la mme manire, les quantits d'nergie
ncessaires pour induire une lsion l'ADN en fonction de la longueur d'onde ont t
estimes (Figure 5.6-1) (de With et Greulich, 1995). Dans le graphique obtenu, la
modification de pente observe vers 340 nm correspond la transition entre les effets de ty
UVC (effets directs) et les effets de type UVA (effets indirects mdis par des
photosensibilisants) (de With et Greulich, 1995) (cf 1.3.4.2.7). Les doses de lumire
de
pe

83
Cassures simple-brin et double-brin, sites alcali-labiles
319
ncessaires pour observer un effet augmentent donc considrablement avec la longueur
d'onde, de manire logiquement inverse l'nergie du rayonnement.
5.6.1.2 Origine des cassures de chane induites par la lumire
Les comtes induites par les radiations ionisantes et certains gnotoxiques sont une
consquence des cassures provenant de l'attaque directe de l'ADN. Les comtes induites par
les UV (A, B et C) rsulteraient par contre en grande partie des incisions transitoires
effectu
2000). E
es par les mcanismes de rparation au niveau des photoproduits (Rnger et al.,
n effet, les quantits d'ADN migrant augmentent jusqu' environ 2.5 h aprs
l'ex
,
l'utilisation d'inhibiteurs des ADN polymrases (l'aphidicoline et l'ara-C
84
, inhibiteurs
notamment de la polymrase ) mne l'accumulation
position aux UV pour ensuite rgresser, au fur et mesure de l'achvement de la
rparation, ce qui prend de 4 h 24 h suivant les lignes cellulaires et les auteurs; d'autre part
des cassures de chanes, la rparation
s'arrtant l'tape d'incision (Speit et Hartmann, 1995; Bock et al., 1998; Rnger et al., 2000).
La rpartition de ces effets de fragmentation entre les diffrentes bandes UV est complexe
et controverse
85
(Rnger et al., 2000). Les UV peuvent en effet produire un mlange de
lsions qui sont rpares par 2 voies principales
87
, le NER et le BER. Ces mcanismes
distincts contribuent donc aux incisions dtectes dans l'essai comte, leurs parts relatives
dpendant des longueurs d'onde impliques
86
.
Remarquons que l'effet d'accroissement de cassures de chanes au cours du temps n'est pas
observ aprs irradiation des cellules de patients prsentant un dfaut gntique dans le
mcanisme de rparation NER
87
(groupes de complmentation A G de xeroderma
pigmentosum et trichothiodystrophie); cette particularit a t propose comme moyen de
diagnostic (Green et al., 1992), notamment prna
es rsultats de notre tude montrent un effet de fragmentation statistiquement significatif
; de fait,
res,
tal (Alapetite et al., 1997).
L
de l'irradiation UV mais aucun effet pour l'irradiation lumire blanche. L'effet des UV
pourrait tre d soit aux UVA, soit la fraction d'UVB contaminant le rayonnement
nous avons montr que la lampe utilise induisait une proportion leve de dgts dim
typiques des UVB.

84
1--D-arabinofuranosyl cytosine
85
font qu'embrouiller la situation en employant des sources aux spectres compltement fausss (lampe "UV
Certains travaux supposs clairer la contribution respective de chaque bande UV (Lehmann et al., 1998) ne
B"
mettant un spectre continu intense de 270 390 nm et lampe "UVA" mettant de 300 plus de 400 nm).
86
Un spectre d'action pour les cassures simple-brins est prsent au 5.6.2.2 qui suit
87
Malgr un certain recouvrement de fonctions, le NER (nucleotide excision repair) s'adresse particulirement
aux adduits encombrants (dimres); le BER (base excision repair) concernerait plutt les adduits de taille faible
(bases oxydes) (cf section 1.1.5)
320
Remarquons cependant que, pour les dgts induits par les UVA, une rparation
incomplte 80 min aprs irradiation s'observe aussi bien 4C qu' 37C (Bock et al., 1998).
L'induc eurs du NER (aphidicoline
par
s cette
nous
incision
tion de cassures de chanes a pu tre exalte par les inhibit
exemple), mais pas ceux du BER (mthoxyamine) ce qui indique que le premier
mcanisme pourrait jouer un rle important dans la rparation des dgts UVA (Bock et al.,
1998) alors que l'induction des dimres bipyrimidiques ne joue qu'un rle mineur dan
bande de longueurs d'onde (Rnger et al., 2000).
Il apparat donc que mme des conditions de travail basse temprature, telles que
les avons appliques (< 4C), sont susceptibles d'induire des cassures de chanes par
enzymatique, au cours soit de l'irradiation, soit des manipulations subsquentes
(centrifugations, lavage des cellules, coule du gel).
5.6.2 Dgts oxydatifs, dimres de pyrimidine et irradiation lumineuse
Les essais avec les endonuclases spcifiques sont fort dlicats, particulirement au
niveau de l'tude mene. En effet, nous essayons de diffrencier les migrations d'ADN
correspondant une triple fragmentation due l'irradiation lumineuse, l'effet
photodynamique et l'action de l'enzyme; chacune de ces tapes tant entache de sa propre
variabilit, la distinction non quivoque d'un effet dpend de son importance .
Grce ces endonuclases, nous avons cependant pu montrer que, sans induction de
porphyrines, l'irradiation par notre lampe UVA induit peu de sites sensibles la FPG, quasi
pas de sites Endo III (Tableau 5.5-3, Figures 5.5-1 et 5.5-4), mais une quantit importante de
lsions bipyrimidiques (Figure 5.5-5). Par contre, l'irradiation en lumire visible induit des
bases oxydes (purines et
88
pyrimidines) mais pas de dimres bipyrimidiques.
Ces observations sont tout fait cohrentes avec le spectre d'action tabli par lution
alcaline (Kielbassa et al., 1997) pour l'induction de cassures de chanes, de lsions dimres et
de purines oxydes (Figure 5.6-2). Ce spectre indique que les quantits de cassures simple-
brins, de sites FPG et de sites T4 diminuent en parallle entre 290 et ~ 315 nm. Les sites T4
continuent diminuer de manire exponentielle aux longueurs d'onde suprieures et restent
dtectables jusqu' environ 380 nm. Le nombre de modification sensibles la FPG prsente
un minimum vers 340 nm et monte vers un maximum entre 400 et 450 nm. Les cassures
simple-brins sont dtectables toutes les longueur d'onde et sont moins importantes que les
sites FPG dans la zone visible.

88
Par exemple, l'effet de la T4 endonuclase V est si flagrant que les sites T4 spcifiques sont dtects sans
aucune ambigut.
321

Figure 5.6-2 : Induction de lsions l'ADN en fonction de la longueur d'onde
Cellules d'ovaire de cobaye AS52. Donnes obtenues par lution alcaline avec utilisation d'un
monochromateur et de filtres de bandes de longueur d'ondes
U lsions reconnues par la T4 endonuclase V (dimres de pyrimidine)
cassures simple-brins (single-strand breaks)

lsions reconnues par la FPG (purines oxydes)


(Kielbassa et al., 1997)

5.6.3 Essai comte et bronzage artificiel
L'essai comte coupl la T4 endonuclase V et l'Endo III a dj dmontr l'induction
de dgts mutagnes par exposition des lampes de bronzage et au soleil (fibroblastes
humains MRC-5 irradis sur de la glace, directement dans la couche d'agarose des lames de
microscope) (Woollons et al., 1997). Une des lampes tudies par ces auteurs est la Philips
"Clo Performance" 1000 W-R, une des lampes les plus employes dans les salons de
bronzage . Dans ce modle, les lsions prdominantes sont les dimres bipyrimidiques; les
cassures de chane et les sites Endo III reprsentent seulement 1.0 et 3.3 % de la
fragmentation rvle par excision des dimres.
Dans notre modle (cellules P388D1 irradies dans le milieu de culture), nous confirmons
la forte induction de dimres par l'irradiation avec une lampe similaire celle employe par
Woollons et al; en effet, le spectre d'mission de notre lampe "Clo Compact" est quasi
89

89
Un historique complet de l'volution des techniques de bronzage artificiel est prsent par (Diffey, 1999); il y
apparat que les lampes de marque Clo sont aujourd'hui les lampes les plus utilises, remplaant les lampes
trs faible teneur en UVB (0.05 % UVB) introduites vers 1985 et tombes en dsutude.
322
identique celui de la Philips "Clo Performance", si ce n'est pour la teneur en UVB du
la "Compact") rvons une proportion plus
importante de sure
Remarquons que le soleil induit des profils de dommages comparables. Aprs 1 min
d'exposition (fibroblastes humains MRC-5 irradis dans la couche d'agarose), les cassures
brutes et les pyrimidines oxydes reprsentent 8.5 et 2.6 % de la fragmentation due aux
dimres (Woollons et al., 1997). Sur une autre ligne (leucmie murine L1210, irradiation
dans le PBS, dtection par la mthode d'lution alcaline), une exposition solaire de 4 min
induit un taux lev de dimres ainsi que des sites sensibles la FPG (15 % de la
fragmentation due aux dimres), mais quasi pas de sites Endo III (0.02 %) ni de cassures de
chanes brutes (Pflaum et al., 1998).
5.6.4 Essai comte et effet photodynamique des porphyrines
rayonnement (les rapports UVB/UVA sont de 0.7 % pour la "Performance" et de 1.2 % pour
(Philips, 2000). Par rapport cette tude, nous obse
cas s de chanes
90
.

5.6.4.1 Essai comte et porphyrines exognes
L'essai comte a dj t employ pour estimer l'effet gnotoxique de la thrapie
photodynamique base de porphyrines exognes (driv d'hmatoporphyrine, HpD), et d'une
chlorine
91
, la meta-(ttrahydroxyphnyl)-chlorine (m-TH
Un effet photodynamique intense a t observ pour le HpD immdiatement aprs
traitem K562), les cassures de chanes tant
ent
un
lsion
PC).
ent (ligne de leucmie mylode humaine
irement rpares en 4 h. Sur le mme modle, aucun effet n'a pu tre mis en vidence
pour la m-THPC (McNair et al., 1997). Par contre, sur des cellules de gliome murin C6,
traitement photodynamique avec la mTHPC induit une fragmentation intense de l'ADN,
rpare significativement aprs 4 h et compltement aprs 24 h (Rousset et al., 2000). Un
autre essai sur une ligne tablie partir d'un carcinome spino-cellulaire n'a mis aucune
en vidence avec la m-THPC, mais les auteurs n'ont tudi la fragmentation que 24 h aprs
irradiation, soit aprs la phase de rparation (Yow et al., 2000).

90
L'tude avec la "Clo Performance" (Woollons et al., 1997) minimise l'expression des incisions de rparation.
L'irradiation sur les lames de microscope rduit sensiblement le temps entre les tapes d'irradiation et de lyse; la
puissance des lampes employes (100 W/m) permet galement des irradiations trs courtes (0.5 1 min). La
couche d'agarose peut cependant absorber une certaine partie des rayonnements et dcaler le spectre vers les
longueurs d'onde suprieures (Rnger et al., 2000)
91
Les cycles chlorines sont des porphyrines portant une double-liaison sature
323
5.6.4.2 Essai comte et porphyrines endognes
D'autres auteurs ont galement remarqu un effet de fragmentation de l'ADN aprs -ala
(i) en prsence de lumire visible (ligne de leucmie murine L1210) par lution alcaline
(Pflaum et al., 1998); et (ii) tout rcemment
92
, en prsence d'UVA (ligne de lymphoblastes
humains), par essai comte en milieu faiblement alcalin (Rnger et al., 2000). Remarquons
que ce dernier auteur n'a tir aucune consquence de ses observations.
L'tude de Pflaum et al montre que la lumire blanche (1 6 J/cm) n'exerce un effet
cytotoxique et gnotoxique (induction de cassures de chanes et de micronoyaux) qu'aprs
induction des porphyrines; l'effet photodynamique augmente les proportions de cassures de
chanes brutes d'un facteur 15 et de sites sensibles la FPG d'un facteur 4; l'induction de sites
FPG montre une courbe de saturation avec la dose de lumire. Alors que l'acide ascorbique
(pigeur de
1
O
2
) inhibe sensiblement cet effet photodynamique, l'o-phnanthroline
(compl s) ne prsentent
aucun effet quant l'induction des cassures de chanes et sites FPG (Pflaum et al., 1998).
L'tude de Rnger et al montre que les UVA
93
(0.25 1 J/cm) et non les UVB
94
(3
10 es

ment d la fraction UVA-
vis us
exant du fer), l'-tocophrol et le -carotne (antioxydants lipidique
mJ/cm) sont responsables des cassures de chanes photoinduites par les porphyrin
endognes (Rnger et al., 2000). Nos essais avec le filtre UV34 (Figure 5.5-6) dmontrent que
l'effet photodynamique observ avec notre lampe est effective
ible. En dpit de la largeur des bandes de longueur d'onde utilises par cet auteur, no
arrivons donc des conclusions similaires.
5.7 CONCLUSIONS
5.7.1 L'essai comte
Dans leurs publications, les pionniers et les premiers utilisateurs de l'essai comte font
montre de nombreux loges envers la mthode. Il s'agirait d'une technique sensible, fiable,
flexible, facile, exigeant peu de cellules par test, de cot peu lev et, surtout, rapide (Tice et
al., 2000). Ces louanges ont apparemment convaincu de nombreux exprimentateurs car la
popularit de la technique ne fait que crotre.
Aprs tous les essais dcrits ci-avant, la "sensibilit" et la "fiabilit" de la mthode nous
semblent correctes. Les mesures sont reproductibles entre les lectrophorses et les

92
Note: cette publication est postrieure notre prsentation d'une partie des rsultats de ce chapitre (Duez et al.,
1999, 2000a)
93
320 440 nm avec 97% de l'nergie suprieure 340 nm
94
275 365 nm, avec un maximum 315 nm et un rapport UVB:UVA d'environ 2
324
oprateu t" et "non-effet". Il manque cependant
sin
t
test programm, les
pos
95
probablement d'amliorer notre technique (travaux en cours).
La "rapidit" dpend de ce dont l'exprimentateur se contente. Quelques lames mesures
visuellement ou l'aide d'un systme d'acquisition d'images et compares par un test non-
paramtrique ne demandent effectivement pas trop de temps. Nous avons cependant montr
dans ce travail qu'une tude statistique considrant le traitement et non la comte comme unit
de base permet la mise en vidence non ambigu d'un effet. Une telle tude exige cependant
de rpter soit une srie d'essais, soit une srie de doses et/ou de temps d'exposition, ce qui
allon 'exprimentation.
omte possde de nombreux atouts et son potentiel est important.
Rappelons cependant qu'il s'agit d'une technique relativement rcente. L'enthousiasme des
dbuts laisse prsent place des recherches qui devront permettre (i) de dterminer la valeur
prdictive de l'essai comte pour le positionner clairement parmi les autres tests de
mutagnicit; et (ii) d'automatiser la mesure des comtes afin d'allger la dtermination
visuelle ou assiste par ordinateur, tape limitative de la mthode.

rs; il est possible de distinguer entre "effe
gulirement de recul pour estimer le pouvoir prdictif de ce test quant la gnotoxicit.
Situation qui devrait tre remdie assez vite par l'augmentation du nombre de composs
tests et le dveloppement de validations croises avec d'autres tests de gnotoxicit (Rojas e
al., 1999).
La "flexibilit" est un avantage certain. Cependant, en fonction du
sibilits de l'essai comte sont telles que le nombre de lames envisageables pour
circonscrire une exprience donne peut devenir rdhibitoire
La "facilit" est une notion relative. Il nous semble quant nous que l'essai comte
requiert pas mal d'habilet manuelle dans un environnement fort peu clair La mesure
assiste par ordinateur, seul dans l'obscurit pendant de nombreuses heures, exige doigt,
calme, patience et endurance. L'utilisation d'endonuclases de rparation apparat
particulirement dlicate. Notre participation au projet europen ESCODD mentionn ci-
avant va nous permettre de comparer la mthode FPG avec d'autres laboratoires et
ge considrablement l
En conclusion, l'essai c

95
Les paramtres suivants peuvent notamment tre envisags : lectrophorse 3 pH, variations sur les temps de
dnaturation et d'lectrophorse, rvlation par diffrents fluorophores, utilisation d'une srie d'endonuclases
pour rvler des lsions spcifiques, tude de doses de toxiques (et de lumire) avec diffrentes combinaisons de
temps d'exposition, mesures de cintiques de rparation, recherche d'effet cross-linker, etc
325
5.7.2 Effet photodynamique des porphyrines endognes
Les 2 tudes comtes menes dans notre travail permettent de dmontrer un effet
photodynamique des porphyrines endognes envers l'ADN, aussi bien en prsence de lum
visible que d'UVA; le traitement photodynamique UVA induit galement des purines
oxydes, co
ire
nfirmant l'induction de 8-oxodG mesure par CLHP (Chapitre 4).

ponsable de l'effet bronzant
rec
x

thodes
s inconvnients non
ng
La fraction UVA-visible de la lampe que nous avons utilise est responsable de l'effet
photodynamique observ, alors que la faible fraction UVB induit de fortes quantits de
dimres cyclobutanes; l'excision de ceux-ci est probablement res
herch avec ce type de lampes.
Les rsultats de l'essai comte viennent renforcer nos conclusions prcdentes quant au
consquences possibles de cet effet photodynamique. Celles-ci sont largement discutes et
dveloppes dans les section 4.4 et 4.5 de ce travail.
Rappelons qu'il n'y a pas l'heure actuelle de corrlation entre les taux de 8-oxodG
mesurs par CLHP et par essai comte coupl la FPG (Gedik et al., 1998). Les m
sont en effet extrmement diffrentes et prsentent chacune de
ligeables (Tableau 5.7-1) qui rendent la comparaison difficile. La meilleure sensibilit des
mthodes LC-MS-MS et une tendance continue rduire les oxydations artfactuelles
devraient cependant permettre d'entrevoir une concordance entre les 2 mthodes au moins
quant l'estimation des taux de base en 8-oxodG dans l'ADN nuclaire (ESCODD, 2001).

Tableau 5.7-1 : Problmes associs la dtermination de la 8-oxodG par mthodes
chromatographiques et par es

sai comte
Mthodes chromatographiques (CLHP) Essai comte coupl l'endonuclase FPG
Oxydation artfactuelle possible en cours
digestion enzymatique
Manque de sensibilit pour les taux de base
La spcificit de l'enzyme n'est pas absolue
Problme de la calibration qui peut tre :
base sur la mesure en gradient de sucrose du
nombre de cassures induites par une irradiat
base sur la teneur en 8-oxodG dtermine par
chromatographie (Pou
Problme des lsions groupes
de lyse cellulaire, d'extraction et de
ion
(Gedik et al., 1998)
get et al., 1999)
qui s'enregistrent comme
une seule cassure




326
6. Rsultats et Discussion :

Essai "comte"et photoactivation
des porphyrines endognes -
Application une ligne
umain de mlanome h
327
6.1 INDUCTION DES PORPHYRINES ENDOGENES
Comme pour les cellules P388D1, les porphyrines endognes ont t induites par
incubation des cellules de mlanome HBL avec l'acide -aminolvulinique; la synthse
effective de porphyrines a t contrle par spectroscopie et microscopie de fluorescence.
6.1.1 Spectroscopie de fluorescence
6.1.1.1 Fluorescence intracellulaire
La prsence de mlanine a empch de relever les spectres de fluorescence sur le lysat
brut obtenu par sonication des cellules dans le PBS. Les spectres ont donc t relevs en
milieu HClO
4
1 M : mthanol (1 : 1, v/v).
Le maximum d'excitation se situe 408 nm et les maxima d'mission 604 et 664 nm
(Figure 6.1-1), ce qui est en accord avec les caractristiques spectrales de la PPIX (Gomer et
al., 1985; Qu ous avons
galement pu relever sur cellules P388D1 ( 4.1.2).
Il y a donc bien production de PPIX, mais l luorescence induite dans les cellules de
mlan
6.1.1.2 Flu
intanilla-Vega et al., 1995; Dietel et al., 1996; Bech et al., 1997) que n
a f
ome est beaucoup plus faible que dans le cas des cellules P388D1.
orescence extracellulaire
fluorescence suprieure celle du tmoin n'a t dtecte dans le milieu
it par relev spectroscopique direct ou aprs extraction par le m
ol (1 : 1, v/v). Cette diffrence avec les observations su
une moindre production de porphyrines intracellulaires
Aucune de
culture, que ce so lange
HClO
4
1 M : mthan r cellules P388D1
peut s'expliquer par mais aussi par une
densit cellulaire nettement infrieure.
328
Figure 6.1-1 : Spectroscopie de fluorescence intracellulaire
(1 : 1, v/v)
650 mV; 5 nm/s

Spectres d'mission : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm
Mesures dans le mlange HClO
4
aqueux 1 M : mthanol
Spectre d'excitation : bande passante excitation, 4 nm; bande passante mission, 4 nm

Spectres d'mission - HBL
excitation = 406 nm
0 850
S
i
0.1
0.05
g
n
a
l
Blanc
d-ala 300 M (3 h)
Blanc
-ala 1 mM (3 h)
0
550 600 650 700 750 80
(nm)

Spectres d'excitation - HBL
mission = 604 nm
0
300 350 400 450 500 550 600
(nm)
a
0.1
0.05
S
i
g
n
l
d-ala 300 M (3 h) -ala 1 mM (3 h)
Blanc Blanc







329
6.1.2 Cintique d'induction de la fluorescence intracellulaire
e de fluorescence, mesure sur 5 heures d'incubation avec 1 mM de -ala La cintiqu ,
montre une synthse croissante de PPIX (Figure 6.1-2).

Figure 6.1-2
d
: HBL + -ala : Cintique d'apparition de la fluorescence intracellulaire (PPIX).
Mesures dans le mlange HClO aqueux 1 M : mthanol (1 : 1, v/v)
4
0
0.05
0.1
0.15
0 1 2 3 4 5
Temps d'incubation (h)
S
i
g
n
a
l

/

m
g

p
r
o
t

i
n
e
s


Les points reprsentent les rsultats obtenus dans 2 expriences indpendantes; la courbe rejoint les
moyennes des valeurs exprimentales.
650 mV; acquisition de 1 point/s pendant 20 s; excitation, 406 nm (bande passante, 4 nm); mission,
604 nm (bande passante, 8 nm).

6.1.3 Microscopie de fluorescence
La Figure 6.1-3 montre une image en microscopie de fluorescence de cellules HBL
incubes pendant 3 h avec 1 mM de -ala. La fluorescence apparat rpartie de manire
diffuse dans l'ensemble du cytosol; l'intensit faible de la fluorescence combine un
bleaching rapide ne permettent pas d'observation fine ni de distinguer le noyau cellulaire
comme c'tait le cas pour les cellules P388D1 (cf Figure 4.1-8).
our cette ligne cellulaire, une observation microscopique n'a pas rvl de fluorescence
intense, dtectable sans l'assistance d'une camra, jusqu' 24 h aprs mise en contact avec
l'acide -aminolvulinique.
P
330
Figure 6.1-3 : Image obtenue en microscopie de fluorescence. Cellules HBL incubes en


prsence de -ala (1 mM, 3 h).


t,
respectivement, 425 20 nm, 460 nm et 590 nm (long pass); un filtre de densit neutre (Zeiss, 0.06) est
et a
t combine de manire informatique avec l'image acquise en lumire visible pour dlimiter les contours
Objectif 25 X immersion; les longueurs d'onde d'excitation, du miroir dichroque et d'mission son
incorpor sur le trajet optique d'excitation. L'image de fluorescence a ncessit un temps de pose de 3 s
cellulaires. Les niveaux de gris proviennent de l'image visible, les niveaux de rouge de l'image de
fluorescence.



331
6.1.4 Conclusion
L'incubation des cellules HBL avec l'acide -aminolvulinique induit l'apparition d'une
fluorescence intracellulaire croissant jusqu'au moins 5 h d'incubation; aucune excrtion d'une
espce fluorescente n'a pu tre dtecte.
Les donnes spectrales, obtenues en milieu HClO
4
: mthanol, sont en accord avec celles
publies pour la protoporphyrine IX, suggrant que le traitement appliqu induit bien le
compos intracellulaire attendu. Les taux de ce compos apparaissent nettement infrieurs
ceux produits par les cellules P388D1; les niveaux atteints, exprims par mg de protines,
sont infrieurs d'environ un facteur 10 et une incubation de dure plus longue (24 h) ne
permet pas d'atteindre des taux de porphyrines dtectables visuellement.
6.2 CYTOTOXICITE DU TRAITEMENT PHOTODYNAMIQUE
Les courbes de survie ont t tablies pour l'effet ltal de diffrentes doses de -ala
combines avec des rayons UVA (filtrs par le filtre Hoya UV34) et visibles, et ce dans les
conditions suivantes : 3 h de chargement en -ala et 30 min d'irradiation 4C (soit
560 mJ/cm pour la lampe UVA et 21.4 J/cm pour la lampe visible) (Figure 6.2-1). Compte
tenu de la dispersion exprimentale, il n'y a pas d'effet ltal du traitement photodynamique
jusqu'au moins 3 mM en -ala, ce qui est matrialis sur les graphiques par une droite
reprsentant 100 % de vie.
Pour les UVA, la rptition de cette exprience avec 1 h d'irradiation (1.12 J/cm) a fourni
des rsultats tout fait similaires.
Nous pouvons donc conclure que la photoactivation des porphyrines endognes, telle que
ralise dans nos conditions exprimentales, n'est pas cytotoxique.

332
Figure 6.2-1 : Cytotoxicit de l'acide -aminolvulinique combin avec des radiations UVA
es

et visibl
Irradiation UVA
100%
10 100 1000 10000
e
s
0%
Concentration en -ala (M)


Irradiation visible Irradiation Visible
50%
%

c
l
l
u
l
e
s

v
i
v
a
n
t
e
0%
50%
10 100 1000 10000
Concentration en -ala (M)
%

c
e
l
l
u
l
e
s

v

100%
i
v
a
n
t
e
s
Cellules HBL incubes en prsence de -ala (3 h) et irradies (4C; UVA 30 min, soit 560 mJ/cm;
lumire visible 30 min, soit 21.4 J/cm). Les points reprsentent 2 expriences en octoplicat
(les points et reprsentent, respectivement, les expriences 1 et 2).
Irradiation UVA (Filtre Hoya UV34)
333
6.3 RESULTATS DE L'ESSAI COMETE
.3.1 Mise en vidence d'un effet gnotoxique de rfrence 6
Le procd de dcollage des cellules de mlanome des botes de culture a t valid et
n'induit pas de cassures de chanes dans l'ADN (Section 2.3.6.2.2). Il a t vrifi que cette
mthode permet de mettre en vidence l'effet gnotoxique bien connu de l'EMS
(thylmthanesulfonate, cf 5.3.2.2) (Figure 6.3-1).

Figure 6.3-1 : Evolution du Tail DNA et du Olive tail moment en fonction de la dose
d'thylmthanesulfonate (cellules HBL; temps de contact, 3 h; 100 comtes
mesures sur 2 lames; dnaturation et lectrophorse pH > 13).
Contrle EMS 2 mM (3 heures)
T
a
i
l

D
N
A
0
20
40
60
80
100
Contrle EMS 2 mM (3 heures)
O
l
i
v
e

T
a
i
l

M
o
m
e
n
t
0
5
10
15
20

6.3.2 Photooxydation de l'ADN par les porphyrines induites : Analyse de
tendance
En raison de la faible induction de porphyrines et de la filtration des rayonnements par la
mlanine, cette tude n'a t ralise que pour les UVA; ceux-ci ont en effet montr sur
cellules P388D1 un effet beaucoup plus intense que la lumire visible, que ce soit en termes
de formation de 8-oxodG (Section 4) ou de fragmentation de l'ADN (Section 5). Pour essayer
d'augmenter la sensibilit de dtection des cassures de chanes induites par le traitement
photodynamique, la fraction UVB a t limine du rayonnement l'aide du filtre Hoya
UV34.
Les rponses au traitement photodynamique UVA ont t mesures en fonction de la dose
de lumire, en prsence et en absence de -ala; les traitements raliss sont dcrits dans le
Tableau 6.3-1. Chaque traitement (100 comtes mesures sur 2 lames) a t rpliqu au cours
d'expriences indpendantes. Au fur et mesure de leur prparation, les lames de microscope
sont dispo
chaque cu
ses alatoirement dans les cuves contenant la solution de lyse et maintenues 4C;
ve est assigne un run d'lectrophorse excut endans les 2 jours.
334
Tableau 6.3-1 : Traitements raliss dans le cadre de l'tude d'analyse de tendance
(Cellules HBL)

Nom donn aux Traitement
chantillons
contrle aucun (ni -ala, ni irradiation )
-ala -ala 1 mM 3 h + 30 min 4C sans irradiation
UVA 5 irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 5 min
UVA 10 irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 10 min
UVA 30
-ala + UVA min
-ala + UVA 10 -ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 10 min
-ala + UVA 15 -ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 15 min
-ala + UVA 30 -ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 30 min
UVA 15 irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 15 min
irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 30 min
5 -ala 1 mM 3 h + irradiation UVA, 4C sous filtre Hoya UV34, 5

6.3.2.1 Rsultats
La Figure 6.3-2 montre les box plots de l'ensemble des rsultats; le Tableau 6.3-2 prsente
les mdianes et p75 des Olive tail moments mesurs pour tous les traitements.
6.3.2.2 Courbes dose-rponse
Les courbes de tendance "dose de lumire - rponse (statistique reprsentative de la
ur
les mdianes et les percentiles 75 (Figure 6.3-3).
6.3
distribution des Olive tail moments)", en absence et en prsence de -ala, ont t tablies po
.2.3 Discussion
L'irradiation UVA a tendance induire une fragmentation de l'ADN, mais il n'y a pas de
relation significative entre la dose de lumire et la migration de l'ADN. En effet, la filtration
de la fraction UVB, la fois par la mlanine et par le filtre Hoya UV34, induit probablement
peu de dimres bipyrimidiques et donc peu d'excisions de rparation.
Aprs induction des porphyrines, l'irradiation UVA induit sensiblement plus de
fragmentation, ce qui se marque par l'apparition d'une relation significative (p < 0.05) entre la
dose de lumire et la mdiane de l'Olive tail moment. Comme prcdemment avec les cellules
P388D1 ( 5.4.3.2), le percentile 75 marque une tendance nette un accroissement avec la
dose de lumire mais cette tendance n'est pas significative au seuil 0.05.
335
Figure 6.3-2 : UVA filtrs (Rsultats de deux expriences; Cellules HBL)




Olive tail Moment
Les rsultats, prsents traitement par traitement en fonction de la dose de lumire
(traitements dcrits au Tableau 6.3-1), sont raliss au cours de 2 expriences indpendantes
100 comtes mesures sur 2 lames.
UVA 5 min
min
min
UVA 5 min
VA 10 min
UVA 15 min
min

UVA 30
U
UVA 30
la
M
h

-a
300
3
+
UVA 15
UVA 10 min
ala 1 mM
Contrle
0 2 4 6 8 10 12 14

336
Tableau 6.3-2 : Mdianes et percentiles 75 des distributions de comtes et leurs intervalles de
confiance 95 %; Olive tail moment; traitements raliss en duplicata
(expriences indpendantes); 100 comtes mesures sur 2 lames.
Cellules HBL (Traitements dcrits dans le Tableau 6.3-1)


Mdiane du Olive tail moment p75 du Olive tail moment
Traitement
Exprience 1 Exprience 2 Exprience 1 Exprience 2
contrle 1.26
(1.13 - 1.55)
0.60
(0.46 - 0.76)
1.99
(1.71 - 2.44)
0.98
(0.85 - 1.29)
-ala 1.00
(0.78 - 1.17)
0.86
(0.72 - 1.03)
1.69
(1.49 - 2.34)
1.96
(1.28 - 2.32)
UVA 5 1.08
(0.78 - 1.28)
1.29
(1 - 1.66)
2.15
(1.56 - 2.61)
2.03
(1.85 - 2.83)
UVA 10 1.64
(1.27 - 1.93)
0.81
(0.53 - 1.13)
2.25
(2.09 - 2.47)
1.49
(1.27 - 1.75)
UVA 15 1.25
(1.07 - 1.56)
1.36
(1.12 - 1.73)
2.15
(1.79 - 2.39)
2.13
(1.88 - 2.39)
UVA 30 1.27
(1 - 1.54) ----
2.37
(2.06 - 2.76) ----
-ala + UVA 5 1.23
(0.8 - 1.57)
2.22
(1.96 - 2.52)
2.10
(1.96 - 2.46)
3.63
(2.98 - 4.07)
-ala + UVA 10 0.92
(0.83 - 1.24)
1.69
(1.29 - 2.01)
1.66
(1.48 - 2.24)
2.67
(2.4 - 3.16)
-ala + UVA 15 1.71
(1.23 - 2.09)
2.19
(1.88 - 2.48)
2.68
(2.31 - 3.03)
3.22
(2.65 - 3.49)
-ala + UVA 30 2.29
(1.88 - 2.53) ----
3.22
(2.64 - 3.83) ----


337
Figure 6.3-3 : Mdianes et percentiles 75 de la distribution des Olive tail moments en fonction
e la dose de lumire (Cellules HBL)
n face de chaque droite sont indiqus le coefficient de dtermination et la proba
our l'existence d'une pente significative. Les traitements sont
d
E bilit du test
p rits dans le Tableau 6.3-1
(* > 0.05)
dc
, p < 0.05; NS, p

Mdianes
0
1
2
10 20
Temps d'irradiation (min)
O
l
i
v
e

t
a
i
l

m
o
m
e
n
t
UVA
Inductio phyrines + UVA

3
0 30
n de por
8
R = 0.452
( )
R = 0.30
(NS)
Percentiles 75
0
1
2
3
4
0 10 20 30
Temps d'irradiation (min)
O
l
i
v
e

t
a
i
l

m
o
m
e
n
t
UVA
Induction de porphyrines + UVA

R = 0.285
(NS)
R = 0.391
(NS)
338
6.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS
s rsultats prsents dans ce chapitre doivent tre considrs comme Bien que le
prliminaires, la photoactivation de faibles quantits de porphyrines
endognes induit bien un stress oxydatif au niveau de l'ADN. Nous avons galement tent de
mettre en vidence des lsions sensibles aux endonuclases FPG, endo III et T4; cependant,
une importante variabilit exprimentale ne nous a pas permis de conclure quant l 'induction
de ces lsions. Cette tude mrite certainement d'tre conduite plus avant (modification des
conditions d'induction des porphyrines et d'irradiation, rduction du temps entre irradiation et
lyse, modification des rapports eumlanine/phaeomlanine,).
Quelques publications en rapport avec nos observations sont discutes dans les
paragraphes qui viennent.
6.4.1 Mlanocytes et cassures de chanes UV-induites
nous avons montr que

Un dosage immunochimique, ralis l'aide d'un anticorps spcifique des lsions simple-
brin (ssb), a montr que, dans des mlanocytes humains, les UVA et les UVB
96
induisent
respectivement
97
0.07 et 1.9 ssb/10
10
Da par kJ/m (Wenczl et al., 1997).
En fonction du phnotype de peau, les UVA ont un effet plus ou moins important. Les
mmes auteurs ont en effet montr que les mlanocytes provenant d'un individu de phototype
VI (peau trs fonce) prsentent une bien plus forte sensibilit aux UVA (1.18 ssb/10
10
Da par
kJ/m) que ceux provenant d'un individu de phototype I (0.04 ssb/10
10
Da par kJ/m) alors que
leurs teneurs en mlanine sont nettement plus leves (10 fois plus de mlanine totale et 7 fois
plus de phaeomlanine). Les mlanocytes d'un individu de phototype I (peau trs claire)
98

voient leur sensibilit augmenter d'un facteur 3 aprs induction de la mlanine par incubation
avec de la L-tyrosine (Wenczl et al., 1998). D'aprs ces publications, il n'est cependant pas
clair si l'auteur a irradi des mlanines en formation (pendant l'activation de la mlanogense)
ou des mlanines prformes. L'effet observ pourrait donc tre d l'irradiation
d'intermdiares indoliques et quinoniques.

96
Les dbits de fluence appliqus sont 7 mW/cm (UVA ) et 0.6 mW/cm (UVB)
97
Le gnome humain comprend ~ 3 x 10
9
paires de bases, ce qui correspond ~ 1.9 x 10
12
daltons (Sambrook et
al., 1989)
98
Dans cette exprience, ces cellules apparaissent capables de fabriquer de l'eumlanine; il s'agirait donc plus
vraisemblablement d'un individu de phototype II.
339
La sensibilit des mlanocytes humains aux UVA a t confirme par essai comte; une
exp qui crot
hnomnes de rparation
pen n
oz et al., 1996; Wenczl et al., 1997; Wenczl et al., 1998; Marrot et
al., 1999), soit empaquetes dans de l'agarose (Marrot et al., 1999); les dbits de fluence sont
souven ysiologiques"
100
en des
tem
osition une fluence de 7 J/cm (15 min)
99
induit une fragmentation apprciable
en fonction de la teneur en mlanine. Il semble que le risque de dgt l'ADN augmente
lorsque la pigmentation commence se dvelopper, c'est--dire en dbut de bronzage (Marrot
et al., 1999).
L'essai comte a galement t appliqu aux dommages induits par les UVB; une
irradiation de 5 20 mJ/cm (dbit de fluence, 0.5 mW/cm) induit des cassures de chanes
dose-dpendantes dans les mlanocytes (Noz et al., 1996).
Les protocoles appliqus par tous ces auteurs minimisent les p
dant et aprs l'exposition la lumire. Les cellules sont irradies sur glace, soit e
suspension dans le PBS (N
t extrmement levs, permettant d'administrer des doses "ph
ps trs courts, par exemple 40 s pour 20 mJ/cm d'UVB (Noz et al., 1996).
Il faut galement remarquer que les phnomnes de rparation sont toujours prsents,
mme basse temprature (Bock et al., 1998). De plus, l'extrapolation aux conditions
phy
6.4.2 Effet pro-oxydant des mlanines ?
siologiques des phnomnes observs des dbits de fluence levs n'est pas forcment
valable, des diffrences majeures pouvant se marquer en fonction du dbit de la dose de
lumire (Pflaum et al., 1998). Enfin, les mlanocytes en suspension sont dans des conditions
tout fait particulires, pas vraiment reprsentatives de leurs conditions physiologiques.
Les mlanines, d'excellents filtres envers les longueurs d'onde solaires les plus
dangereuses, sont galement des pigeurs de radicaux libres fort efficace (Rozanowska et al
1999). Il semble donc paradoxal que la prsence de mlanine puisse jouer un rle de
photosensibilisant ( 6.4.1). Le statut redox du mlanocyte apparat en fait fort com
pourrait en partie rguler la synthse de m

.,
plexe et
lanine, notamment la balance entre eu- et
phaeomlanine (del Marmol et al., 1996).

99
Pour comparaison, rappelons que la fluence applique dans notre tude est de 250 mJ/cm (mesure sur la
lampe UVA non filtre; dbit de fluence total, 0.31 mW/cm pendant 13.5 min)
100
Comparables celles reues lors d'une exposition solaire typique
340
L'effet photo-oxydant observ dans ces diffrentes tudes a t attribu soit aux
mlanines, soit aux intermdiaires de leur synthse qui sont eux-mmes de puissants pro-
oxydants :
un stress oxydatif constitutif a pu tre mis en vidence dans les mlanomes mais aussi
dans les mlanocytes de patients atteints de mlanome (Picardo et al., 1996).
t un
'eumlanine et transforme la
le
l'ADN (Kipp
une tude in vitro sur liposomes a montr que les 2 types de mlanines exercen
effet antioxydant envers la peroxydation lipidique induite par les UVB et UVA;
cependant, la complexation du fer inhibe l'effet de l
phaeomlanine en un prooxydant (Krol et Liebler, 1998).
la rpartition des mlanines et de leur synthse dans les mlanosomes joue un r
protecteur. Mais certains intermdiaires, comme par exemple l'acide 5,6-
dihydroxyindole-2-carboxylique, peuvent s'chapper de l'organelle et de la cellule; il a
notamment t dmontr par essai comte que des kratinocytes irradis en prsence
de cet acide subissaient un stress photo-oxydant capable d'endommager
et Young, 1999).
6.4.3 Mlanome et porphyrines
Peu d'tudes ont port sur l'induction de porphyrines et la thrapie photodynamique d
mlanomes; en effet, la mlanine, filtre de densit neutre, ne fait pas de ces tumeurs une cible
optimale de ce mode thrapeutique (Dougherty et al., 1998). Le dveloppement de
es

photosensibilisants activables dans l'infrarouge devrait cependant lever cette limitation
ion des
tans
eurs
rphyrines induit une inhibition de croissance
significative, mais pas de rmission complte (Abels et al., 1997).
Le contenu en porphyrines de cellules de mlanome B16, traites in vitro par l'acide -
aminolvulinique en prsence de dimthylsulfoxyde et d'allylisopropyl-actamide, augmente

(Andreoni et al., 1991; Busetti et al., 1999).
Aprs injection intra-veineuse d'acide -aminolvulinique, la cintique d'apparit
porphyrines a t dtermine chez des hamsters portant un mlanome amlanotique. Des taux
6 fois plus levs de PPIX
101
ont t mesurs dans la tumeur par rapport aux tissus cu
voisins. Cette diffrence s'expliquerait par une forte vascularisation de la tumeur, mais aussi
par la permabilit de ses vaisseaux (Fritsch et al., 1997). Le phototraitement des tum
(635 nm; 100 J/cm) aprs induction des po

101
La PPIX reprsente 83 % du total des porphyrines induites; la coproporphyrine et des porphyrines hautement
carboxyles ont t galement mises en vidence par CLHP.
341
d'u en l'effet
de benzoporphyrine monoacide A, inject en intraveineuse chez des souris
portant
rapport crose
tumora
absorp r-
irradiat l.,
1999).
6.4.4 Conclusions
n facteur 2700. La photosensibilisation des cellules traites est effective, rsultant
ltal d'une irradiation lumineuse (Schoenfeld et al., 1994).
Le driv
un mlanome pigment B16, s'accumule dans la tumeur endans les 3 h (mais avec un
tumeur/peau saine de seulement 1.6); sa photoactivation 690 nm induit la n
le avec un dlai de reprise de croissance. Cet effet important, observ malgr la forte
tion de cette bande de longueur d'ondes par la mlanine, est potentialis par une p
ion 1064 nm qui entrane la destruction slective des mlanosomes (Busetti et a

L'e
reste co
incerta
possibl de capture de radicaux libres par les polymres soient satures.
Par contre, l'effet que nous observons avec de faibles taux de porphyrines induites et des
us une lampe de bronzage typique, une distance et
un
4.4.2.
ouvons en effet conclure que les cellules de
mlanome, et donc probablement les mlanocytes, sont capables de synthtiser la PPIX in
vivo. Il apparat galement que la photoactivation d'un driv porphyrique, mme par des
longueurs d'onde fortement absorbes par la mlanine, peut rsulter en un effet
tait
tti et
l'induction des mlanomes.
ffet pro-oxydant ventuel des mlanines, plus particulirement de la phaeomlanine,
ntrovers et son impact ventuel dans l'induction de mlanome est largement
in. Comme cet effet est dmontr des dbits de fluence importants, il nous semble
e que les capacits
dbits de fluence communs (exposition so
temps d'exposition naturels) semble plus proche des conditions physiologiques. En
fonction de la localisation intracellulaire de la PPIX, les radicaux libres induits par la lumire
qui a pu passer le filtre mlanique pourraient ne pas tre pigs par la mlanine des
mlanosomes et exercer un effet gnotoxique suivant un des mcanismes discuts au
Des tudes prsentes au 6.4.2, nous p
photodynamique apprciable.
Si notre hypothse base sur la photoactivation des porphyrines endognes ( 4.4.3.1)
correcte, la potentialisation de cet effet par les radiations infrarouges thermoactives (Buse
al., 1999) pourrait s'avrer fondamentale dans la problmatique de


342
7. Conclusions gnrales
343
7.1 PROPOS DU TRAVAIL
Ce travail aborde la problmatique des dommages photo-oxydatifs l'ADN par la mesure
d'un biomarqueur sensible, la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine (8-oxodG), et par
l'estimation des cassures simple-brin, double-brins et sites alcali-labiles.
L'tude de la photo-oxydation de l'ADN aprs induction des porphyrines endognes
permet de proposer un mcanisme possible d'initiation de la cancrogense par les fractions
UVA et visible de la lumire solaire.
7.2 VALIDATION DES METHODES ANALYTIQUES
7.2.1 La mthode de dosage de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-dsoxyguanosine
Les performances de la mthode chromatographique de dosage de la 8-oxodG (CLHP
avec dtection ampromtrique et UV) ont t tudies travers une validation analytique
complte qui nous a permis de rpondre certaines questions rcurrentes dans la littrature.
Il s'agit, notre connaissance, de la premire validation formelle publie pour un
biomarqueur du stress oxydatif.
Les critres ogique ont
t valids, sa ibilit, les
limites de dtection et de quantification, la robustesse et la conservation des chantillons
diffrents points de la procdure. Aprs une tude statistique de l'ensemble de ces critres,
nous sommes arriv aux conclusions suivantes :
la mthode de dosage de la 8-oxodG, bien qu'extrmement dlicate
de qualit aujourd'hui prconiss pour les dosages en milieu biol
voir la spcificit, la linarit, l'exactitude, la rptabilit, la sens
, fournit des
donnes cohrentes qui permettent de dtecter de manire fiable une augmentation
de ce biomarqueur dans l'ADN cellulaire;
la digestion enzymatique de l'ADN telle qu'applique au cours du dosage n'est pas
entrave par les modifications induites par un stress oxydatif svre;
l'expression des taux de 8-oxodG relativement la base normale, la 2'-
dsoxyguanosine, influence positivement la rptabilit et la sensibilit du dosage;
la gnration artefactuelle de l'analyte en cours de manipulation peut tre
contrle.
7.2.2 L'essai comte
Nous avons galement valu les performances de la mthode choisie pour la mesure de la
fragmentation de l'ADN, une technique de micro-lectrophorse applique des cellules
344
individuelles. Les critres de qualit, adapts la nature semi-quantitative de l'essai comte en
rer que :
t
gure satisfaisantes, nous avons propos et test une
appr nent en effet rarement
compte de la distribution des donnes, qui n'est manifestement pas gaussienne, et considrent
milieu alcalin, nous permettent d'assu
les mesures sont fiables et reproductibles entre lectrophorses et oprateurs;
la technique, telle qu'adapte au laboratoire, nous permet bien de mettre en
vidence des effets gnotoxiques connus.

Aprs avoir montr que les mthodes statistiques habituellement appliques au traitemen
des donnes de l'essai comte ne sont
oche statistique simple et pratique. Les traitements classiques tien
le plus souvent la cellule et non le traitement comme unit de comparaison. Diffrentes
exp
re
7.3
riences nous ont montr que les traitements peuvent tre compars de manire valable
via la mdiane des distributions de comtes; cette statistique reprsentative permet de mett
en vidence un effet gnotoxique, aussi bien par comparaison d'chantillons rpliqus que
par une analyse de tendance.
EFFET PHOTODYNAMIQUE DES PORPHYRINES ENDOGENES
Aprs induction de la synthse des porphyrines endognes par l'acide -aminolvuliniqu
(-ala) dans 2 modles cellulaires, la synthse effective de protoporphyrine IX a t mise en
vidence par spectroscopie de fluorescence.
Nous avons montr pour la premire fois que
e

la photo-activation par les UVA (lampe
typique de c es
-ala-induit
En effet ation lumineuse des porphyrines
induites gn
diffrents p is, savoir la
concentratio es
porphyrines
intracellula e la
concentrati , mais de la dose de lumire.
A la fois sur les cellules P388D1 et sur des cellules de mlanome humain HBL, la photo-
induites provoque une fragmentation significative de l'ADN, reflet
des
elles employes dans les salons de bronzage) et la lumire visible des porphyrin
es prsente des effets pro-oxydants au niveau de l'ADN cellulaire.
, sur une leucmie murine P388D1, l'irradi
re une augmentation significative de la 8-oxodG dans l'ADN cellulaire; les
aramtres impliqus dans cet effet photodynamique ont t approfond
n et le temps de chargement en -ala, la dose de lumire et l'influence d
intracellulaires et excrtes dans le milieu de culture. Seules les porphyrines
ires participent l'effet photodynamique observ; celui-ci ne dpend pas d
on en -ala
oxydation des porphyrines
cassures de chanes et des sites alcali-labiles produits, soit directement, soit par les
345
mcanismes de rparation cellulaire. Une production de purines oxydes et de dimres
bipyrimidiques est galement observe pour le traitement photodynamique UV au niveau des
cellules P38
utilise.
Les hyp utes; ceux-ci pourraient tre directs
(photognration de radicaux libres proximit de l'ADN) ou transmis au matriel gntique
par
7.4 CONCLUSIONS
8D1; les dimres sont principalement dus la faible fraction UVB de la lampe
othses quant aux effets observs sont disc
une raction en chane de type peroxydation lipidique.
Il est aujourd'hui admis que les UVA exerceraient leur effet mutagne principalement par
l'entremise de radicaux libres, ce qui suppose la prsence de photosensibilisants endogn
qui ne sont toujours pas identifis avec certitude.
Les rsultats obtenus au cours de ce travail indiquent une implication possible des
porphyrines endognes dans la carcinognicit solaire, mais aussi dans des effets secondair
ventuels des applications md

es
es
icales de thrapie et de diagnostic photodynamique.
Cet effet photo-oxydant est galement mis en vidence dans des cellules de mlanome
En

bserv. La potentialisation possible de cet effet
par
humain pour de faibles taux de porphyrines induites et une lampe de bronzage typique.
fonction de la localisation intracellulaire de la PPIX, les radicaux libres induits par la
lumire qui a pu passer le filtre mlanique pourraient ne pas tre pigs par la mlanine des
mlanosomes et exercer l'effet gnotoxique o
les radiations infrarouges pourrait s'avrer fondamentale dans la problmatique de
l'induction des mlanomes.
346
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