GUIA DE TRABALHOS LABORATORIAIS

de

ENGENHARIA GENTICA

Mestrado em Engenharia Biolgica Mestrado em Engenharia Biomdica

(2011/2012)

Leonilde M. Moreira Cristina A. Viegas Arsnio Fialho Jorge H. Leito Isabel S-Correia

(rea de Cincias Biolgicas, IST)

ENGENHARIA GENTICA
(Mestrados em Eng Biolgica e Eng Biomdica) (2011/2012)

Aulas laboratoriais

AULA A1

TRABALHO TP1- Introduo de plasmdeos em bactrias por conjugao triparental e electrotransformao.

A2

TP2- Amplificao do gene pgmG (que codifica a protena bifuncional com actividades de fosfoglucomutase/fosfomanomutase) a partir do DNA cromossmico de Sphingomonas elodea, por recurso tcnica de PCR. Utilizao de ferramentas bioinformticas para anlise de sequncias de nucletidos e aminocidos.

A3 A4 A5

TP3- Hibridao de Southern utilizando sondas no radioactivas (1 parte). TP4- Hibridao de Southern utilizando sondas no radioactivas (2 parte). TP5- Mtodos moleculares de tipagem: aplicao a isolados clnicos de Burkholderia cepacia. Estudos de interaco protena-protena usando um sistema de dois hbridos para bactrias.

BIOSSNTESE DO EXOPOLISSACRIDO GELANO POR Sphingomonas elodea

O gelano um heteropolissacrido constitudo por uma unidade tetrassacardica repetitiva, apresentando, na sua forma nativa, substituintes acilo laterais (Fig. 1). (OAc)

6 3)--D-Glcp-(14)--D-GlcpA-(14)--D-Glcp-(14)--L-Rhap-(1 2 (OGl)
Figura 1- Estrutura nativa do gelano. Abreviaturas: D-Glc: D-glucose; D-GlcA, cido D-glucurnico; L-Rha, Lramnose; Oac: grupo acetilo; OGl: grupo glicerilo.

O gelano quando desacilado, capaz de formar gis rgidos e quebradios. Devido s suas propriedades gelificantes, tem uma vasta gama de aplicaes biotecnolgicas, nomeadamente nas indstrias alimentar e farmacutica. produzido, com elevado rendimento, pela espcie bacteriana Sphingomonas elodea (Fialho et al., 2008). Entre as vrias actividades enzimticas envolvidas na sntese dos precursores activados, a enzima fosfoglucomutase (PGM) desempenha um papel central, catalizando a interconverso de glucose 6-fosfato, um importante intermedirio glicoltico, a glucose 1fosfato, um intermedirio importante para a sntese de compostos de reserva e de polissacridos. O gene que codifica a actividade de fosfoglucomutase em S. elodea (pgmG) foi j clonado e sequenciado (Fig. 2), sabendo-se que codifica uma protena bifuncional de cerca de 50 kDa, com actividades de fosfoglucomutase e fosfomanomutase (catalisa a interconverso da manose 6-fosfato a manose 1-fosfato). A protena PgmG de S. elodea pertence famlia das fosfohexomutases, que contm trs domnios funcionais caractersticos [o centro activo, o local de ligao a ies metlicos (ex. Mg et al., 2000). Um outro gene essencial na biossntese de gelano denomina-se gelE. Este gene codifica para uma protena homloga a protenas com actividade de tirosina cinase e encontra3
2+

) e o local de ligao ao

substrato] altamente conservados quer em bactrias, quer em organismos superiores (Videira

se envolvido nos passos finais de polimerizao e excreo de gelano . Foi construdo um mutante de eliminao para este gene, tendo-se confirmado a ausncia da produo de gelano nesse mesmo mutante (Moreira et al. 2004). Um dos objectivos do presente trabalho laboratorial a introduo por electrotransformao de um plasmdeo recombinado contendo o gene gelE (pHA010-3) no mutante de Sphingomonas elodea GelE (SpLM21-4) por forma a avaliar a reposio do por fentipo mucoso desse mutante. A este processo denomina-se complementao homloga. Com o objectivo de demonstrar a complementao heterloga, vai-se introduzir conjugao triparental um plasmdeo recombinado contendo o gene pgmG numa estirpe mutante para a actividade de PGM de Pseudomonas aeruginosa e observar a reposio do fentipo mucoso devido produo de alginato. Em trabalhos posteriores r-se- obter um fragmento de DNA contendo o gene pgmG de S. elodea usando a tcnica de PCR. Esse fragmento de DNA ser posteriormente usado como sonda em experincias de hibridao de Southern. Finalmente proceder-se- a estudos de interaco protena-protena usando diversas protenas envolvidas na biossntese de gelano.

Fialho AM, Moreira LM, Granja AT, Popescu AO, Hoffman K, S-Correia I. (2008). Occurrence, production and applications of gellan: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology.79:889-900. Moreira LM, Hoffmann K, Albano H, Becker A, Niehaus K, and S-Correia I. (2004). The gellan gum biosynthetic genes gelC and gelE encode two separate polypeptides homologous to the activator and the kinase domains of tyrosine autokinases. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 8:43-57. Videira, P. A., L. L. Cortes, A. M. Fialho, e I. S-Correia. 2000. Identification of the pgmG gene, encoding a bifunctional protein with phosphoglucomutase and phosphomannomutase activities, in the gellan gum-producing strain Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461. Applied and Environmental Microbiology. 66:2252-2258.

1 61 121 162 207 252 297

gacacgttgctgcgcggttgaggaccgtcctccgcacgtaacattttgccggcaactatg -35 ctgcagtgcaaaaattattaatctttccgtgcacggcgcgtcttgaaacttccattcgag -10 tcgcggaaga ggcacgcatc tttaccttcg ggagggcatg a RBS atgacgcaccgtttcgatccgacgtcgctgcgcgagtacgacatc M T H R F D P T S L R E Y D I cgcgggatcgtggggaagacgctgggcccggacgacgcccgtgcg R G I V G K T L G P D D A R A atcggccgcggcttcgcgacgctgctgcgccgcgccggcggccgc I G R G F A T L L R R A G G R cgggtggcggtgggccgcgatggccgcgtttcctcgccgatgctc

R V A V G R D G R V S S P M L 342 gaggccgcgctgatcgagggcctgaccgcgtcgggctgcgacgtg E A A L I E G L T A S G C D V 387 gtgcgcaccggcatgggccccacgccgatgctatattatgccgag V R T G M G P T P M L Y Y A E 432 gcaacgctggaggtggatggcggcatccagattaccggcagccat A T L E V D G G I Q I T G S H 477 aatccgggcaattacaatggcttcaagatggtgttccagcaccgc N P G N Y N G F K M V F Q H R 522 tcgttcttcggccaggacatccagacgctgggcaagatggcggcg S F F G Q D I Q T L G K M A A 567 gaaggcgactgggaagacggcgacggcaccgagaccgtgaccgat E G D W E D G D G T E T V T D 612 gccgacatcgaggacctctatgtcagccgtctgatcgcgggctat A D I E D L Y V S R L I A G Y 657 gccggcggcgcgtacaagatcggctgggacgcgggcaacggcgcc A G G A Y K I G W D A G N G A 702 gccggcccggtgatcgagaagctcgtcaagctgctgccgggtgag A G P V I E K L V K L L P G E 747 caccatacgctgttcaccgatgtggacggtaatttccccaatcat H H T L F T D V D G N F P N H 792 catcctgatcctaccgaggaaaagaacctcgccgatctgaagaag H P D P T E E K N L A D L K K 837 ctcgtcgcggagaagaacctcgatttcggtctcgctttcgatggc L V A E K N L D F G L A F D G 882 gacggcgatcggctgggcgcgatcgacggccagggccgggtggtg D G D R L G A I D G Q G R V V 927 tggggcgaccagctgctcgccatcctcgccgagccggtgctgcgc W G D Q L L A I L A E P V L R 972 atcgatccgggtgcgacgatcatcgccgacgtcaaggccagccag I D P G A T I I A D V K A S Q 1017 gcgctctacgaccggatcgccgaactgggcggcaagccggtgatg A L Y D R I A E L G G K P V M 1062 tggaagaccggccacagcctgatcaagaccaagatgaaggaaacc W K T G H S L I K T K M K E T 1107 ggcgcgccgctcgcgggcgagatgagcgggcacatcttcttcgcg G A P L A G E M S G H I F F A 1152 caggactattacggcttcgacgatgcccagtacgccgcgatccgc Q D Y Y G F D D A Q Y A A I R 1197 ctgatccaggcggtgcacgtgatcggcaagtcgctcacccagctc L I Q A V H V I G K S L T Q L 1242 aaggacgagatgccggcgatggtcaacacgccggagatgcgcttc K D E M P A M V N T P E M R F 1287 caggtcgacgagagccgcaagttcccggtcgtcgaggaagtgctc Q V D E S R K F P V V E E V L 1332 gaccgtctcgaggcggacggcgcccaggtcgaccgcaccgacggc D R L E A D G A Q V D R T D G 1377 gcgcgggtcaacaccgacgacggctggtggctgctgcgtgcgtcg A R V N T D D G W W L L R A S 1422 aacacccaggacgtgctcgtcgcgcgcgccgaggcgaaggaccag N T Q D V L V A R A E A K D Q 1467 gcgggtctcgatcgcctgatggcgcagatcgacgaccagttggcc A G L D R L M A Q I D D Q L A 1512 aagagcggcatcgtccgcggcgagcaggcggcgcattgaggtgcc K S G I V R G E Q A A H * aggggca Figura 2- Sequncia de nucletidos do gene pgmG de S. elodea e sequncia deduzida de aminocidos (cdigo de 1 letra). Encontram-se ainda indicadas as potenciais regies 35 e 10 do promotor e o local de ligao ao ribossoma (RBS).

TP1- INTRODUO DE PLASMDEOS RECOMBINADOS EM BACTRIAS

Pretende-se com este trabalho ilustrar e comparar dois mtodos de introduo de DNA recombinado em duas espcies Gram-negativas, S. elodea e P. aeruginosa e que so a electrotransformao e a conjugao triparental (Fialho et al., 1991; Monteiro et al., 1992). Por recurso tcnica de electrotransformao sero introduzidos no mutante SpLM21-4 de S. elodea um plasmdeo contendo o gene gelE (pHA010-3) ou o vector onde este gene foi clonado (plasmdeo pBBR1MCS) de forma o observar (ou no) a reposio do fentipo mucoso. Na conjugao triparental, ser utilizada a estirpe P. aeruginosa 8858, com o objectivo de observar a complementao, homloga ou heterloga, da mutao que as clulas desta estirpe possuem no gene que codifica a actividade de

fosfoglucomutase/fosfomanomutase. Essa complementao ser efectuada por introduo dos plasmdeos recombinados pNZ49 ou pLC100 (contm os genes algC ou pgmG de P. aeruginosa ou S. elodea, respectivamente) e clonados no vector de expresso pMMB66(HE). A complementao ser visualizada atravs da reposio do fentipo mucoso [capacidade para produzir o exopolissacrido alginato (May e Chakrabarty, 1994)] no referido mutante de P. aeruginosa 8858 (algC ).
-

Monteiro, G. A., A. M. Fialho, S. J. Ripley, e I. S-Correia. 1992. Electrotransformation of gellangum producing and non-producing Pseudomonas elodea strains. Journal of Applied Bacteriology 72:423-428. Fialho, A. M., G. A. Monteiro, e I. S-Correia. 1991. Conjugal transfer of recombinant plasmids into gellan-gum producing and non-producing variants of Pseudomonas elodea ATCC 31461. Letters of Applied Microbiology 12:85-87. May, T. B., e A. M. Chakrabarty. 1994. Pseudomonas aeruginosa: genes and enzymes of alginate synthesis. Trends in Microbiology. 2:151-157.

A. Electrotransformao de Sphingomonas elodea A electrotransformao tornou-se uma valiosssima tcnica de introduo de DNA quer em clulas eucariticas quer em bactrias, tendo vindo a possibilitar a transformao eficiente de espcies refractrias transformao pelo mtodo clssico (incubao com CaCl2 ou

outros caties tais como o Rb+, o K+, seguida de choque trmico). Nesta tcnica, as clulas a transformar so sujeitas, durante um curto espao de tempo, a um campo elctrico de elevada voltagem. Pensa-se que esta exposio tornar a membrana celular reversivelmente permevel a macromolculas permitindo assim a entrada, com elevada eficincia, de DNA plasmdico, mesmo o de elevado peso molecular. Enquanto que o campo elctrico usado na electrotransformao de clulas de mamferos e de protoplastos de plantas de normalmente 0,5 - 1 kV cm-1, o campo elctrico necessrio para a transformao de bactrias (dadas as suas dimenses diminutas) muito superior (em mdia entre 6 - 12,5 kV cm-1). Tal facto exigiu a introduo de algumas modificaes no equipamento usado para a

electrotransformao de bactrias, de modo a permitir o uso dessas grandes voltagens sem riscos quer para o equipamento quer para o operador. A electrotransformao uma tcnica de introduo de DNA muito eficiente, rpida, reprodutvel e de fcil execuo. Permite o uso, com idntica eficincia de transformao, quer de clulas frescas (usadas logo aps centrifugao e suspensas no tampo de electrotransformao, por exemplo 10 % (v/v) glicerol) quer aps congelao (em tampo de electrotransformao) e armazenamento a - 70 C, durante vrios mses. A eficincia de electrotransformao (n de transformantes / g DNA) e a frequncia de electrotransformao (n de transformantes / n de clulas viveis aps electrotransformao) dependem de vrias condies experimentais (fase da curva de crescimento em que as clulas so recolhidas, concentrao das clulas e composio do tampo usados para a electrotransformao, bem como variveis associadas ao aparelho de electroporao, tais como - intensidade do campo elctrico e durao do pulso, o qual, por sua vez, depende do valor da resistncia introduzida em paralelo com a resistncia da amostra, etc). Depende ainda da dimenso do DNA a introduzir e da estirpe hospedeira a transformar (nomeadamente do seu sistema de modificao - restrio). Neste trabalho, proceder-se- introduo em clulas de S. elodea gelE do vector de clonagem pBBR1MCS (4,7 kb) e do plasmdeo recombinado pHA010-3 (contendo o gene gelE de S. elodea e de dimenso 5,4 kb) (Anexo III).

TCNICA:

I- Preparao de clulas competentes para electrotransformao

1.

Inocular, uma colnia da estirpe SpLM21-4 ( gelE), em 20 ml de LB. Crescer durante a noite a 30 C com agitao constante.

2.

Adicionar o pr-inculo a 750 mL de LB (DO inicial 0,05), e crescer at uma densidade ptica, determinada a 640 nm, de 1,2 0,1 (12 horas), a qual corresponde a uma fase avanada do crescimento exponencial.

3. 4.

Transferir a cultura para tubos de centrifuga; arrefecer em gelo durante 15 minutos. Centrifugar a cultura durante 15 minutos a 5.000 rpm, a 4C (Beckman J2 - 21 ; rotor JA 10).

5.

Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 mL de H2O desionizada fria.

6. 7.

Repetir 4. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 mL de H2O desionizada fria.

8. 9.

Repetir 4. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 mL de uma soluo fria (em gelo) de 10 % de glicerol (v/v).

10.

Centrifugar a cultura durante 10 minutos a 5.000 rpm, a 4C (Beckman J2 - 21 ; rotor JA 10).

11. 12. 13. 10.

Ressuspender o sedimento em 20 ml glicerol 10 % (v/v) frio. Repetir 10. Ressuspender o sedimento em 10 ml de glicerol 10%(v/v) frio. Dividir a suspenso celular em aliquotas (500 L) e conservar a -70 C.

Nota: Este procedimento no ser efectuado na aula. As clulas sero fornecidas j preparadas.

II- Electrotransformao

1.

As clulas a electrotransformar, aps descongelamento lento, devero ser mantidas em gelo. As cuvettes para electrotransformao (0,2 cm) devero tambm ser previamente arrefecidas (colocadas a -20 C durante a noite).

2.

Ligar o aparelho de electroporao ("Gene Pulser" da "BioRad" equipado com um "Pulser controler"). Acertar a voltagem para 2,5 kV, o condensador para 25 F e a resistncia para 400 .

3.

Adicionar s clulas electrocompetentes 2-5 l de uma soluo de DNA plasmdico em H2O (cerca de 350 ng). Usar solues dos plasmdeos pBBR1MCS, e pHA010-3. Agitar a suspenso, com a ponta da pipeta, tendo o cuidado de no deixar formar bolhas de ar.

4.

Transferir a mistura para a cuvette evitando a formao de bolhas de ar, e coloc-la na cmara de electrotransformao.

5. 6. 7.

Desferir a corrente elctrica. Retirar a cuvette e adicionar, imediatamente, 2 ml de meio LB suspenso. Incubar, com agitao, a 30C durante 2 horas [crescimento das clulas em meio no selectivo, durante o tempo correspondente a cerca de uma gerao, de modo a permitir a sntese de protenas codificadas pelos genes relacionados com as marcas selectivas associadas ao plasmdeo (por exemplo de resistncia a antibiticos)].

8.

Plaquear (aps diluio apropriada em soluo salina) a suspenso celular em placas de meio S contendo 25 mg/l de cloranfenicol (LB+Cm) para a seleco de transformantes.

9.

Plaquear a mesma suspenso, diluda de 10-4 a 10-7, em meio S, para a determinao do n de clulas viveis totais.

10. 11.

Incubar, durante 3 dias, a 30 C, para crescimento dos electrotransformantes. Calcular a eficincia (n de transformantes / g de DNA) e a frequncia da electrotransformao (n de transformantes/n de clulas viveis aps

electrotransformao) para cada um dos plasmdeos, nas condies ensaiadas. Observar ainda se houve ou no reposio do fentipo mucoso.

B- Transferncia de DNA recombinado de Escherichia coli para Pseudomonas aeruginosa por conjugao triparental

A transferncia de DNA plasmdico por conjugao pressupe contacto fsico entre as clulas, dadora e receptora. H plasmdeos que, embora no sendo autotransmissveis, so mobilizveis (como o caso dos plasmdeos pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49, usados neste trabalho). Isto quer dizer que no apresentam genes (tra), envolvidos no processo de transferncia (responsveis por exemplo pela sntese do pilus sexual e de outras estruturas de superfcie que permitem o contacto fsico entre as duas clulas envolvidas) mas que apresentam os genes (mob) que codificam para funes envolvidas na sua mobilizao entre clulas. Neste caso, necessrio recorrer a um plasmdeo "ajudante" que, por ser conjugativo, vem mediar a transferncia de plasmdeos mobilizveis por conjugao. Neste trabalho, usarse- o plasmdeo pRK2013 (plasmdeo conjugativo) em E. coli HB101, que ser uma terceira estirpe (a estirpe ajudante) a qual participar num processo de acasalamento que envolver assim as 3 estirpes (dadora, receptora e ajudante). Estas sero para tal colocadas em contacto sobre um filtro que retm bactrias (porosidade = 0, 45 m). O sistema descrito geralmente utilizado para introduzir plasmdeos mobilizveis em espcies que no so transformveis com uma eficincia razovel, ou que so mesmo refractrias transformao clssica, no sendo possvel proceder sua electrotransformao. Os plasmdeos usados neste trabalho (pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49) tm uma vasta gama de hospedeiros entre as bactrias Gram-negativas podendo assim replicar quer em E.

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coli , a clula dadora, quer em P. aeruginosa, que neste trabalho funciona como clula receptora.

TCNICA : 1. Inocular e incubar, durante a noite, a 37 C e com agitao vigorosa, em meio LB contendo o antibitico indicado pela marca selectiva do plasmdeo (Anexo I, Tabelas I e II), as seguintes bactrias: a ) Escherichia coli HB101/ pRK2013 b) Pseudomonas aeruginosa 8858 c) Escherichia coli HB101/pMMB66(HE) d) Escherichia coli HB101/pLC100 e) Escherichia coli HB101/pNZ49 - O plasmdeo conjugativo pRK2013 contm a marca de resistncia a canamicina (Km) pelo que se dever adicionar 50 mg/l deste antibitico ao meio de cultura. Os plasmdeos pMMB66(HE), pLC100 e pNZ49 (anexo III) conferem resistncia ampicilina, pelo que este antibitico dever ser adicionado ao meio de cultura (Anexo II. B.). 1. Lavar as clulas com soluo salina (NaCl 0,9%(v/v)) para eliminar restos dos antibiticos. 2 Para mobilizar os plasmdeos pMMB66(HE), pLC100 ou pNZ49 para dentro de clulas de P. aeruginosa 8858, proceder s seguintes misturas (A a C), de 3 culturas num tubo eppendorf:

P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)

E. coli HB101/pRK2013 (0,1 ml) E. coli DH1 / pMMB66(HE) (0,2 ml)

11

P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)

P. aeruginosa 8858 (0,5 ml)

E. coli HB101 / pRK2013 (0,1 ml) E. coli DH1 / pLC100 (0,2 ml)

C E. coli HB101/pRK2013 (0,1 ml)

E. coli DH1 / pNZ49 (0,2 ml)

4. Centrifugar 1 min, ressuspender as clulas no lquido que fica no eppendorf e aplicar sobre um filtro estril colocado num placa de LB slido. Incubar a 30C entre 6 a 18 h. 5. Ressuspender as clulas que cresceram sobre a membrana em 1 ml de uma soluo estril de cloreto de sdio (0,9% p/v) (soluo salina) contida em tubo de ensaio, mediante forte agitao (vrtex). 6. No caso de P. aeruginosa 8858 (misturas A, B e C) plaquear em placas de meio PIA (anexo II) suplementado com 500 mg/l de carbenicilina, a suspenso celular obtida em 5. aps diluio dessa mesma suspenso de 10-1 a 10-3 em soluo salina estril. Plaquear ainda (aps diluio entre 10 e 10
-4 -7

em soluo salina) a mesma suspenso celular em

placas de meio PIA para determinao do nmero de clulas viveis. Nota: Dado que E. coli no cresce em meio PIA e que P. aeruginosa naturalmente resistente a ampicilina, as placas de PIA contendo carbenicilina visam seleccionar os transconjugantes de P. aeruginosa 8858 que contm os plasmdeos pMMB66(HE), pLC100 ou pNZ49. 7. Incubar, durante 2 a 3 dias, a 30 C, para crescimento dos transconjugantes. 8. Calcular a frequncia de conjugao (n de transconjugantes/n de clulas viveis aps conjugao) para cada plasmdeo, nas condies ensaiadas. 9. Registar, no caso dos tranconjugantes de P. aeruginosa 8858, a reposio do fentipo

mucoso produtor do exopolissacrido alginato, resultante da ocorrncia de complementao homloga (pNZ49) ou heterloga (pLC100).

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Anexo I

TABELA I - ESTIRPES BACTERIANAS

Estirpe S. elodea SpLM21-4 P. aeruginosa 8858 E. coli HB101

Fentipo / Gentipo Gelano-; gelEAlginato , algC F-, hsdR , hsdM , recA

TABELA II - PLASMDEOS

Plasmdeo pHA010-3 pBBR1MCS pMMB66HE pLC100 pNZ49 pRK2013 Anexo II

Hospedeiro E. coli HB101 E. coli HB10 E. coli HB101 E. coli HB101

Descrio gene gelE, Cmr vector, Cmr vector, Apr gene pgmG, Apr gene algC, Apr Kmr, tra+

A- Meios de cultura Os meios de cultura so esterilizados em autoclave (15 minutos,120 C). Meios lquidos Meio LB (pH 7,5) lquido NaCl 5 g Peptona (Difco) Extracto de levedura (Difco) (g/l) 10 g 5g

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Meios slidos Os meios slidos usados so idnticos aos meios lquidos aos quais se adicionou 20 g de agar por litro. O meio PIA uma formulao comercial, sendo apenas necessrio juntar 45 g de PIA, 20 ml de glicerol, perfazer o volume a 1 litro e esterilizar. Meio S (pH 7,4) ( g / l) Na2HPO4 KH2PO4 K2SO4 NaCl MgSO4.7H2O Hidrolisado de caseina (Difco) Extracto de levedura (Difco) Glucose * CaCl2.2H2O * * FeSO4.7H2O * * 10 g 3g 1g 1g 0,2 g 1g 1g 20 g 0,01 g 0,001 g

* A glucose (tal como os outros acares) esterilizada sempre em separado ** Solues concentradas (10x) de CaCl2 e FeSO4 so esterilizadas, individualmente, e em separado dos outros componentes do meio.

B. Antibiticos
Meio slido (mg/l) Meio lquido (mg/l)

Ampicilina Canamicina Carbenicilina Cloranfenicol

150 100 500 25

75 50 -

Os meios selectivos so preparados por adio de solues concentradas dos antibiticos (esterilizados por filtrao) de modo a se obterem as concentraes acima indicadas. A concentrao de antibitico a usar para a preparao dos meios lquidos ser metade da concentrao usada em meio slido.

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Anexo III Mapas de restrio dos plasmdeos pMMB66(HE), pLC100, pNZ49 e pHA010-3.

-gal

KpnI

HindIII

gelE 702 pb

Plac
pBBR1MCS
4,7 kb CmR

pHA010-3 (gelE)

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