Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia de Alimentos

RELATRIO DE TA514 BIOQUMICA DE ALIMENTOS

DETERMINAO DA CONCENTRAO DE GLICOSE EM LEITE INTEGRAL E DE BAIO TEOR DELACTOSE PELO MTODO DE GLICOSE OXIDASE E SIMOGYI-NELSON

Professor Responsvel: Gabriela Alves Macedo

Grupo 11 Alunos: Henrique Osamu Ikuta Roger Kenny Miyamoto Kayano Viviane Coelho Teruel RA: 102605 074361 065045 Campinas, 1 de junho de 2012

1. Introduo A lactose est presente em diversos tipos de leite, e todos os mamferos, inclusive o ser humano, quando nascem em condies normais esto aptos a digerir este aca. No entanto, 75% da populao mundial sofrem de intolerncia lactose. Para que possa ser assimilada pelo organismo necessrio que a lactose seja hidrolisada em galactose e glicose no intestino delgado, pela ao da enzima lactase, tambm chamada de -galactosidase. A ausncia dessa enzima na mucosa intestinal implica na no absoro e utilizao do acar. A ocorrncia de uma variao ontogentica determina maior prevalncia de deficincia da lactase em certos grupos tnicos, principalmente negros e amarelos. Estudos realizados em diferentes partes do mundo demonstram que a intolerncia lactose apresenta alta prevalncia mundial, variando em relao ao grupo tnico, podendo chegar a 100% em algumas regies da frica, e menos de 1% na Dinamarca. H uma teoria que preconiza que a persistncia da lactase no adulto um trao adaptativo da evoluo do homem. No Brasil, a miscigenao, associada s condies precrias de higiene, com constante contaminao do tubo digestivo, originam baixa atividade da lactase nas crianas. Para a quebra da lactose, dois mtodos tm sido utilizados: a hidrlise cida (homognea ou heterognea) e a hidrlise enzimtica (enzimas na forma livre, imobilizadas em suportes ou recuperadas). A hidrlise cida requer condies de operao extremamente rigorosas, como elevadas temperaturas e pH cido, formando diversos subprodutos que devero ser purificados. A hidrlise enzimtica ocorre em condies mais brandas, tanto de temperatura como pH, mas requer a utilizao de uma etapa posterior para a separao dos produtos formados. A hidrlise enzimtica da lactose um processo complexo que envolve uma grande quantidade de reaes seqenciais, formando sacardeos como produtos intermedirios. Durante a reao, outros acares, alm da glicose e galactose, so formados, dependendo da origem da -galactosidase utilizada. A -galactosidase pode ser extrada de diversas fontes como: animais, fungos, bactrias, leveduras e vegetais, como broto de alfafa, pssego e rosas selvagens. Porm, nem todas as lactases podem ser utilizadas. Enzimas extradas de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae e Saccharomyces sp (lactis ou fragilis) so consideradas seguras, devido ao histrico de suas aplicaes e aos numerosos estudos realizados.

A importncia industrial da -galactosidase est na sua aplicao na indstria de laticnios. Esta enzima hidrolisa a lactose, em seus monossacardeos glicose e galactose, obtendo assim, alimentos com baixos teores de lactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lcteos, ideais para consumidores intolerantes lactose. A intolerncia lactose definida como uma sndrome clnica de desconforto intestinal, tambm conhecida como Deficincia de Lactase do Adulto e ocorre devido aos baixos nveis (ou ausncia) de atividade da enzima -galactosidase no aparelho digestivo, conseqncia de uma deficincia congnita desta enzima ou de uma diminuio gradativa de sua atividade com o avano da idade, causando sintomas como diarria cida e gasosa, fortes dores abdominais e inchaos. O mtodo da Glicose-Oxidase (GOD) fundamenta-se na ao da enzima glicose-oxidase catalisando a oxidao da glicose formando cido glicurnico e gua oxigenada. Esta sofre ao da enzima peroxidase, que proporciona a reao da 4aminoantipirina e o fenol, presentes no reagente de cor, formando um cromgeno vermelho que, por seguir a Lei de Lambert-Beer, pode ter a absorbncia determinada em 510 nm. um mtodo de extrema preciso e praticidade (ocorre a 37C), sendo os reagentes pouco txicos, a exceo do fenol. As principais aplicaes da glicose-oxidase so: - proteo de alimentos: como antioxidante, pela remoo de O2 em refrigerantes, vinhos, molhos, alimentos desidratados e enlatados em geral. - para remoo da glicose de ovos antes da desidratao (secagem) de forma a impedir o escurecimento e desenvolvimento de sabor desagradvel. - misturada com a catalase, aumenta a estabilidade de alimentos marinhos (o cido glicnico formado diminui o pH e inibe o crescimento de microorganismos e, tambm utilizada no tratamento de invlucros para alimentos, impedindo a sua deteriorao oxidativa). - estabilizante em soluo de cido ascrbico e vitamina B12. O mtodo de Somogyi Nelson baseia-se na propriedade que alguns acares apresentam em reduzir o Cu+2 (on Cprico) em Cu+1 (on Cuproso) e tambm na reao de Molibdatos, sob certas condies, com arseniatos, silicatos, entre outros, para formar complexos heteropolares que aps reduo controlada fornece o composto azul de molibdnio que poder ser mensurado colorimetricamente em espectrofotmetros.

Os acares redutores da amostra em questo, aquecidos em meio alcalino, transformam-se em Enodiis que reduzem o on Cprico presente no reativo de Somogyi, a on Cuproso. O xido Cuproso (Cu2O), assim formado, reduz o composto Arsnio-Molibdico para xido de Molibdnio de colorao azul cuja intensidade de cor proporcional a quantidade de acares redutores existentes na amostra. O objetivo desse estudo foi determinar a concentrao de glicose em leite com baixo teor e lactose e em leite integral, pelo mtodo de glicose oxidase e SimogyiNelson. 2. Procedimento 2.1 Materiais Amostra de leite integral Amostra de leite com baixo teor de lactose tratado com -galactosidase Soluo de HCl 0,6mol/l Soluo de NaOH 0,6mol/l Reagente de glicose oxidase Reagente de Simogyi-Nelson I e II Tubos de ensaio Pipetas Agua destilada Banho Maria Banho de gelo Espectrofotmetro 2.2 Mtodo Determinao da glicose pelo mtodo da glicose oxidase Aps o preparo das amostras de leite, as amostras de leite integral (amostra 1) e leite com baixo teor de lactose (amostra 2) foram diludas com gua destilada na proporo de 1:5 nos tubos marcados como G1 e G2, respectivamente para cada amostra.

Em trs tubos limpos foram pipetados 2ml de reagente de glicose oxidase, marcados como G1, G2 e tubo branco. Aps a transferncia dos 2ml, as amostras foram incubadas em banho maria 37C por 10min. Aps os 10min, das amostras G1 e G2 diludas (preparadas na primeira etapa), foram retirados 20ml e adicionados aos tubos G1 e G2 dentro do banho e mais 20ml de gua destilada no tubo branco. Os trs tubos permaneceram no banho por mas 10min. O espectrofotmetro foi calibrado a 505nm utilizando-se o tubo branco e as absorbncias das amostras foram medidas em seguida. Com a medida das absorbncias, a concentrao de glicose em 100ml de leite integral e 100ml de leite com baixo teor de lactose, foi calculada. Determinao de glicose atravs do mtodo de Simogyi-Nelson Aps as amostras de leite integral e leite com baixo teor de lactose terem sido tratadas, as mesmas foram diludas nas concentraes de 1:50 e 1:100 em 4 tubos marcados como A1(1:50), A1(1:100),A2(1:50) e A2(1:100). Cinco tubos de ensaio foram marcados com as quatro indicaes acima e mais o tubo branco e receberam 0,5ml da amostra respectiva e mais 1ml de reagente SNI. Os tubos foram agitados, tampados e colocados em banho maria em ebulio por 6min. Os tubos foram retirados do banho e colocados em banho de gelo at a temperatura ambiente, quando foi adicionado 1ml de reagente SNII. Os tubos foram agitados e deixados em repouso por 5min, quando ento foi adicionado 10ml de gua destilada e misturados por inverso. O espectrofotometro foi calibrado com o tubo branco a 540nm, e as absorbncias dos outros tubos medidas a seguir. Com os valores da absorbncia e a curva padro da glicose a concentrao de acares redutores em 100ml de leite com baixo teor de lactose e 100ml de leite integral foi obtida. 3. Resultados e Discusso 3.1 Glicose Oxidase A concentrao de glicose foi calculada de acordo com o clculo para o mtodo glicose oxidase. Primeiramente, calcula-se a concentrao de glicose em cada uma das amostras:

1 mg de glicose/mL X

0,290 Abs

Em seguida, so realizadas as converses multiplicando-se o resultado (x) por 5 e 2, em que o x representa a concentrao de glicose em mg por mL de amostra. Para o x, podemos estabelecer a seguinte expresso:

Na determinao da concentrao de glicose em gramas por 100 mL de leite, chamemo-la de y e seja dada pela seguinte expresso:

Os dados obtidos foram colocados na seguinte tabela: Tabela 1 - Determinao de glicose pelo mtodo de glicose oxidase em amostras de leite integral e leite com baixo teor de lactose Tubo G1-(1:5) (Amostra 1-preparada com leite integral, diluda 1:5) G2-(1:5) (Amostra 2-preparada com leite com baixo teor de lactose, diluda 1:5) Padro de glicose (100 mg/100mL) 0,290 1 mg de glicose/mL 0,298 10,276 41,103 0,021 0,724 2,897 Abs 505 nm mg de glicose/mL de amostra g de glicose/100 mL de leite

Pela tabela acima, foi verificado que a amostra com leite de baixo teor de lactose apresentou maior concentrao de glicose do que a amostra preparada com leite integral. Esse resultado era de se esperar, j que no leite integral h maior quantidade de lactose. Alm da lactose presente na amostra de leite com baixo teor de lactose ter sido quebrada em glicose e galactose, o que aumentou o teor de glicose.

3.2 Somogyi-Nelson A medida da absorbncia foi realizada no espectrofotmetro FEMTO III e sua curva padro dada pelo seguinte grfico:

0.9 Absorbncia - 540 nm 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 y = 1.9035x + 0.031 R = 0.9833 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Concentrao de Glicose (mg/mL)

Grfico 1 Absorbncia do FEMTO III por concentrao de glicose A partir do Grfico 1 e das medidas realizadas no espectrofotmetro, as concentraes do acar redutor pde ser determinado. Para isso, foi feito uma srie de clculos, como apresentado abaixo. Considerando as diluies feitas durante o experimento (25 mL de amostra em 50 mL de soluo) e as diluies posteriores (1:50 e 1:100), multiplicou-se os valores das diluies 1:50 por 100 e por 200 para as diluies 1:100. Em seguida, converteu-se a concentrao que estava em mg/mL para g/mL, dividindo-se por 1000. Em seguida, multiplicou-se por 100 para se obter a concentrao em g/ 100 mL de leite.

Tabela 2 - Determinao acares redutores em amostras de leite integral e leite com baixo teor de lactose

mg de acares Tubo Abs 540 nm redutores/mL de amostra diluda

mg de acares redutores/mL de amostra

g de acares redutores/100 mL de leite

AR-1 (1:50) (Amostra 1 diluda 1:50) 0,158 0,067 6,672 0,667

AR-1 (1:100) (Amostra 1 diluda 1:100) 0,060 0,015 3,047 0,305

AR-2 (1:50) (Amostra 2 diluda 1:50) 0,166 0,071 7,092 0,709

AR-2 (1:100) (Amostra 1 diluda 1:100) 0,084 0,028 5,569 0,557

Foi observado que as amostras cuja diluio era de 1:50 apresentaram maior concentrao de acares redutores do que aquelas cuja diluio era de 1:100. Segue abaixo o grfico plotado a partir da concentrao de acares redutores obtidos por meio de clculos versus absorbncia.

0.080 0.070

Absorbncia

0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0 0.05 0.1 0.15 0.2

Concentrao de acar (mg/mL)

Grfico 2 Absorbncia (540 nm) x Concentrao de acar (mg/mL) Pelo Grfico 2, foi observado que quanto maior a absorbncia, maior foi a concentrao de acares redutores nas amostras, o que era o resultado esperado.