doi: 10.5102/ucs.v10i2.

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Anticorpos catalticos e suas aplicaes em biotecnologia Catalytic antibodies and its applications in biotechnology

Resumo
Caractersticas peculiares como a alta especificidade dos anticorpos e o eficiente poder cataltico das enzimas tm despertado um grande interesse em grupos de pesquisa cientfica no que diz respeito a possveis reaes obtidas pela juno dessas duas molculas. O objetivo deste trabalho realizar uma reviso bibliogrfica sobre a constituio e obteno dos anticorpos catalticos e suas potenciais aplicaes em biotecnologia. A tecnologia de anticorpos catalticos j demonstrou a capacidade dessas molculas em mediar diversas reaes e vem abrindo relevantes possibilidades de aplicaes em reas industriais, agrcolas e biotecnolgicas. Aliada prtica mdica, os anticorpos catalticos so grande promessa para fins diagnsticos e teraputicos, desde a destruio de clulas cancergenas e microrganismos, at a elaborao de vacinas catalticas para as mais diversas finalidades, como a desintoxicao definitiva de pacientes com dependncia qumica. Palavras-chave: Catlise enzimtica. Enzima Anticorpos. Anticorpos catalticos. Imunoterapia. Biotecnologia.

Luciana Martins Macedo1 Paulo Roberto Martins Queiroz2

Abstract
Peculiar characteristics such as high specificity of the antibodies and efficient catalytic power of enzymes have attracted great interest in scientific research groups with regard to the possible reactions obtained by joining these two molecules. The aim of this study was a review of literature based on the constitution and obtaining catalytic antibodies and their potential applications in biotechnology. The catalytic antibody technology has already demonstrated the ability of these molecules to mediate various reactions and have opened significant opportunities for applications in industrial, agricultural, and biotechnology. Coupled with the medical practice are catalytic antibodies hold great promise for diagnostic and therapeutic purposes since the destruction of cancer cells and microorganisms, to the catalytic production of vaccines for many different purposes as the final detoxification of patients with chemical abuse. Keywords: Enzyme catalysis. Enzyme. Antibodies. Catalytic antibodies. Immunotherapy. Biotechnology.

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Graduada em Biomedicina UniCEUB. PhD em Biologia Animal. Universidade de Braslia UnB. Professor do curso de Biomedicina. UniCEUB. E-mail: pqsilva@uol.com.br

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1 Introduo
De todas as funes das protenas, a catlise provavelmente a mais importante. Na ausncia de catlise, a maioria das reaes nos sistemas biolgicos ocorreria de forma excessivamente lenta para fornecer produtos a um ritmo adequado para um organismo metabolizante (CAMPBELL; FARRELL, 2007). A capacidade cataltica a soma de fatores que resulta em uma diminuio da energia livre de ativao para a etapa determinante da velocidade da reao (JUSTO, 1998) e os catalisadores que desempenham essa funo nos sistemas biolgicos so protenas altamente especializadas denominadas enzimas. Possuem um extraordinrio poder cataltico, frequentemente maior que aquele dos catalisadores inorgnicos ou sintticos, um alto grau de especificidade para seus substratos, aumentam consideravelmente as reaes qumicas e funcionam em solues aquosas sob condies moderadas de temperatura e pH (LEHNINGER, 2006). Poucos catalisadores no biolgicos (que normalmente no so especficos para as reaes) possuem todas essas propriedades, por exemplo, ons e complexos de metais de transio, cidos e bases inorgnicas utilizados na indstria para o processo de fabricao de cidos e outros compostos qumicos (RAMALHO et al., 2007). Entretanto, a habilidade ilimitada de selecionar ou programar catalisadores especficos para qualquer
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O reconhecimento seletivo ocorre por meio de interaes fracas, sendo capazes de discriminar, com alta afinidade e seletividade especfica, um amplo espectro de molculas, naturais ou sintticas. Um complexo sistema de seleo, acoplado a eventos celulares subsequentes, tais como, mutaes somticas e afinidade de maturao, proporcionam um aumento de milhes de vezes de variantes estruturais, fornecendo inmeras molculas com especificidade molecular incomparvel e em uma escala de tempo de semanas (MALE et al., 1996). Basicamente, a diferena entre anticorpos e enzimas envolve a especificidade. As enzimas catalisam reaes por estabilizarem preferencialmente estados de transio, proporcionando diminuio da energia livre de ativao ao longo da coordenada de reao. Anticorpos so extremamente eficientes quanto capacidade de ligao, podendo exceder a de enzimas, mas o fazem ao estado fundamental de sua estrutura molecular, segundo a conjectura de Linus Pauling (1946), que props um estabelecimento conceitual quanto obteno de anticorpos catalticos. Isso levou William P. Jencks (1969) a sugerir que, se a complementaridade entre o stio ativo e o estado de transio contribui significativamente para a catlise enzimtica, deve ser possvel sintetizar uma enzima por meio da construo de um stio ativo. Uma maneira de fazer isso elaborar um anticorpo com um grupo de haptenos que se assemelhe ao estado de transio de uma determinada reao. O stio de combinao de tais anticorpos dever ser complementar ao estado de transio e deve provocar uma acelerao obrigando o substrato a se assemelhar ao estado de transio (JENCKS, 1969). Richard Lerner e Peter Schultz, que criaram os primeiros anticorpos catalticos, verificaram essa hiptese em 1986 e, desde ento, um grande nmero de abenzimas (termo designado para descrever hbridos anticorpo-enzima) foram gerados, sendo muitos deles com alta eficincia cataltica (JUSTO, 1998). Desde o reconhecimento do potencial dos anticorpos catalticos como ativadores de pr-frmacos (BAGSHAWE, 1987), vrios grupos tm isolado anticorpos com eficincia cataltica suficiente para a aplicao como agentes teraputicos na ativao de pr-drogas em produtos txicos, particularmente na terapia do cncer e outras doenas, inclusive virais como o HIV (PLANQUE et al., 2008), ou mesmo em processos de desintoxicao, como o proposto por Deng (2002), no qual foram gera-

transformao qumica desejada, a partir de qualquer reagente qumico, ainda no foi alcanada. O desenho racional de catalisadores especficos ainda um problema difcil, mas uma soluo em estudo utiliza a diversidade do sistema imune para produzir uma nova classe de enzimas: os anticorpos catalticos. Sua habilidade em selecionar um dentre 10 possveis anticorpos que se ligam virtualmente a qualquer molcula de interesse faz do sistema imune uma fonte atrativa de catalisadores especficos (JUSTO, 1998). Os anticorpos so protenas de estruturas simples, apresentando quatro cadeias peptdicas compostas por duas cadeias leves (VL), idnticas, constitudas de polipeptdios com cerca de 25 kDa de massa molecular e de duas cadeias pesadas (VH), idnticas, com polipeptdios maiores de massa molecular de 50 kDa ou mais. So geradas pelo sistema imune para reconhecer substncias estranhas denominadas antgenos e iniciar o processo de neutralizao ou destruio desses agentes (GOLDSBY et al., 2002).
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dos abenzimas que clivam a molcula de cocana em ttulos especficos, eliminando o efeito txico da droga. A tecnologia de anticorpos catalticos j mostrou ser capaz de mediar mais de 100 reaes diferentes em estudos de diversos laboratrios, e essa nova abordagem abre uma gama de possibilidades nas reas industriais, qumicas, biotecnolgicas, agrcolas e mdicas, e sua utilizao em ciclos de produo, depender unicamente da assimilao criativa de ideias em bioqumica de protenas, imunologia, biotecnologia e biologia molecular, campos de intensa atuao para o profissional biomdico (JUSTO, 1998; BIOLOGICAL, 2006; WEISS et al., 2006). A partir do exposto, o objetivo deste trabalho foi realizar uma reviso bibliogrfica a respeito da natureza dos anticorpos catalticos e seus potenciais de aplicao biotecnolgica.

A molcula de imunoglobulina o modelo perfeito para a gerao de novas funes de biocatlise. Todos os anticorpos tm capacidade cataltica intrnseca, ou seja, a soma dos fatores que resulta em uma diminuio da energia livre de ativao para a etapa determinante da velocidade da reao. Sendo assim, o alcance da catlise por anticorpos bastante amplo e razovel assumir que qualquer reao qumica, para a qual um anlogo do estado de transio possa ser sintetizado, no caso, um hapteno, ir apresentar um anticorpo com alguma atividade cataltica (JUSTO, 1998; WJCIK; KONONOWICZ, 2008). Essa abordagem auxilia tambm na compreenso dos mecanismos envolvidos, e ainda no totalmente elucidados, na catlise enzimtica. A maior parte da investigao original nesse campo foi inspirada pelo conceito geral de complementaridade introduzido para as cincias da vida por Fischer, em 1894. Esse princpio clssico detinha as interaes complementares como fora motriz de uma variedade de

2 Anticorpos catalticos
Uma das tendncias mais intrigantes em bioqumica do sculo XX foi a criao de funes catalticas e de um novo desenho de biocatalisadores baseados na molcula de imunoglobulina. A concepo artificial de diversas atividades catalticas de abenzimas parecia ser um evento revolucionrio que gerou novos cruzamentos entre a qumica, a bioqumica, a imunologia, a biologia molecular, a patologia e a biotecnologia. Atualmente, o significativo avano na engenharia de anticorpos e tecnologia de expresso promoveu uma considervel expanso das aplicaes mdicas com imunoglobulinas e est oferecendo por meio de anticorpos catalticos uma oportunidade nica para torna-se uma fonte promissora de alta preciso de vacinas catalticas (ZIGMAN; ELMQUIST, 2006; ZORRILLA et al., 2006; POPKOV et al., 2009). Simultaneamente a isso, a descoberta de abenzimas naturais no contexto de doenas autoimunes tem revelado funes benficas durante a patogenicidade dessas doenas (BELOGUROV JR. et al., 2009a). Aplicaes recentes de anticorpos catalticos com significado clnico incluem converso da cocana em substncia no psicoativa, degradao da nicotina, ativao de pr-frmacos contra tumores, inibio da infectividade do HIV e a destruio dos agregados de -amilide implicados na doena de Alzheimer (HANSON, 2005).

processos biolgicos como replicao gentica, catlise enzimtica, interao ligante-receptor e reconhecimento de antgeno-anticorpo. Entretanto, apesar dos princpios gerais de catlise enzimtica j formulados h algum tempo, o verdadeiro sucesso nessa rea veio ao final dos anos 80, no qual, para a gerao de estruturas catalticas, anlogos do estado de transio de reaes enzimticas (BELOGUROV JR. et al., 2009b). Aps os estudos em anticorpos catalticos configurados por Pauling (1946) e Jencks (1969) sobre a complementaridade entre stio ativo e anlogos do estado de transio de uma catlise enzimtica, o potencial bioqumico do sistema imune foi demonstrado por Schultz e Lerner em 1986, por meio da gerao de anticorpos monoclonais com atividade cataltica (tcnica do hibridoma) induzida por anlogos do estado de transio fosfato e fosfonato para a hidrlise de carbonatos e steres respectivamente (JUSTO, 1998). Em princpio, o mecanismo de catlise dos anticorpos consiste em romper ou transformar o antgeno em molculas que o organismo possa eliminar facilmente. Toda reao pode chegar a ocorrer em velocidade e concentrao infinitamente grande, embora haja algumas cuja velocidade to pequena, que se considera impossvel que ocorram. Todavia, as abenzimas possuem a capacidade de facilitar reaes que no ocorreriam naturalUniversitas: Cincias da Sade, Braslia, v. 10, n. 2, p. 137-148, jul./dez. 2012 139

estveis foram usados como antgenos em imunizaes

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mente. Isso concede aos anticorpos catalticos seu carter inovador, ao menos teoricamente, de catalisar reaes sobre molculas que no so reconhecidas por nenhuma enzima (RAJCHENBERG, 2009). Anticorpos catalticos so descritos e obtidos em quantidade como anticorpos monoclonais, por meio de tcnicas clssicas conhecidas como tcnica do hibridoma, a qual envolve tipicamente quatro etapas: (1) imunizao do camundongo com o conjugado hapteno-protena carreadora; (2) gerao de clones hbridos, imortalizados por meio da fuso de clulas esplnicas e clulas de mieloma provenientes de roedores; (3) seleo de clones individuais para ligao especfica do anticorpo ao hapteno; e (4) seleo dos anticorpos exibindo a atividade cataltica desejada. Dentre as diferentes metodologias que tm sido descritas para a seleo direta de sobrenadantes hbridos com funo cataltica, destaca-se pela simplicidade, sensibilidade e viabilidade, a primeira delas, denominada catELISA (imunoensaio enzimtico colorimtrico para determinao quantitativa de cloranfenicol acetiltransferase - cat), que se baseia no uso de substratos imobilizados para imunodeteco do produto final de uma reao catalisada (TAWFIK et al., 1993). Com o advento da tecnologia de hibridoma, tornou-se possvel gerar stios ligantes de anticorpos catalticos homogneos com alta afinidade que reconhecem um grande nmero de ligantes estruturalmente diferentes. Esses novos anticorpos, predominantemente baseados em estratgias desenvolvidas pela engenharia de protenas, possuem seletividade bem superior e exibem atividade cataltica (LIMA; ANGNES, 1999). 2.1 Gerao de anticorpos com grupos catalticos em seus stios combinantes A complementaridade de um anticorpo a um hapteno (molcula de baixa massa molecular que pode atuar como um antgeno, mas no induz, ela prpria, formao de anticorpos seno conjugada a uma protena carreadora) foi explorada para a gerao de stios combinantes. Na produo de abenzimas, o desenho do hapteno fundamental, pois ele deve ser quimicamente estvel ao mesmo tempo em que deve mimetizar as propriedades estruturais do estado de transio da reao catalisada (RAO; WOOTLA, 2007). Recentemente, uma das ferramentas empregadas para o design de haptenos so mtodos de projetos computacionais utilizados primei-

ramente com o objetivo de formar o desenho de novas enzimas para a elaborao de biocatalisadores, e que vem se estendendo para a criao de diversas outras molculas de interesse biomdico e industrial (RTHLISBERGER et al., 2008). Outra importante ferramenta empregada a introduo direta de grupos funcionais catalticos nos stios combinantes dos anticorpos por meio de modificao qumica direta. Uma vez que uma determinada capacidade cataltica tenha sido obtida, a modificao qumica dirigida, utilizando-se diferentes ligantes, pode ser empregada para incorporar grupos catalticos adicionais ou cofatores (JUSTO, 1998). George Schultz e seu grupo de pesquisa (1986) demonstraram que a configurao efetiva do hapteno deve aproximar-se da geometria do estado de transio, incorporando a sua funo especfica no qual resultar em um alojamento propcio dos resduos de aminocidos catalticos necessrios no stio combinante, uma vez que sua estrutura e funcionalidade iro definir a topologia dos stios combinantes do anticorpo selecionado do repertrio imune (NEVINSKY et al., 2002). Com isso, esses stios tornam-se complementares ao estado de transio de determinada reao por intermdio da mutagnese stio-dirigida. Uma srie de experimentos de mutagnese stio-dirigida foi realizada para investigar o papel individual de aminocidos de stios ativos de enzimas, que resultam em substituio, supresso ou adio de um determinado resduo em uma regio funcional (recombinao V(D) J) e de tcnicas de DNA recombinante. Essa tcnica vem sendo aplicada tambm para aumentar a capacidade cataltica dos stios combinantes de anticorpos (JUSTO, 1998; ZHENG et al., 2004). 2.2 Anticorpos catalticos e o anlogo do estado de transio Anticorpos direcionados para um anlogo do estado de transio podem ser mais especficos para a estabilizao do estado de transio de uma reao que um grupo de substratos. Por esse motivo, anticorpos obtidos para catlise so preparados para muitos tipos de reaes, utilizando sua diversidade e especificidade. Isso se d por meio de ensaios experimentais nos quais so injetados em camundongos haptenos conjugados a uma protena carreadora que mimetizam esses anlogos provocando a produo de anticorpos especficos para tal reao. Se o

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hapteno desenhado um verdadeiro anlogo do atual estado de transio de uma reao, a taxa da velocidade de uma reao pode ser prevista a partir da razo entre a afinidade para com o substrato e a afinidade com o anlogo de transio (TANAKA, 2002; WILEY, 2002). A estabilizao do estado de transio fundamental no mecanismo de catlise e ser este processo que proporcionar ao anticorpo maior eficincia em sua funo cataltica. Uma interessante verso do anlogo do estado de transio a abordagem do anti-idiotipo estudado por Alan Friboulet e seus colaboradores (1995), em que ratos foram imunizados com uma enzima, a fim de produzir um anticorpo monoclonal (denominado como Ab1) com o stio de ligao de um antgeno estruturalmente complementar ao stio ativo de uma enzima. Anticorpos monoclonais (Ab2) especficos para o stio de ligao do antgeno de Ab1 so ento posteriormente gerados. Alguns desses Ab2 tero uma imagem estrutural do stio ativo da enzima e iro mimetizar as funes catalticas da enzima. Essa proposta inicial permitiu a produo de anticorpos dotados com esterase, amidase e atividades serino proteases, por utilizao da acetilcolina esterase, -lactamase e sublisina como imungenos, respectivamente (RAO; WOOTLA, 2007). Grande nfase tem sido dada compreenso das caractersticas estruturais e mecansticas da catlise por anticorpos com o objetivo de obteno futura de anlogos do estado de transio que forneam anticorpos mais efetivos, melhorando assim a atividade da primeira gerao de anticorpos catalticos (STEWART et al., 1994; JUSTO, 1998). 2.3 Uso de anticorpos com efeitos entrpicos A entropia, segundo as leis da termodinmica, um estado de equilbrio geralmente definido como uma medida da quantidade de desordem de um sistema. Muita desordem implica em elevada entropia, ao passo que a ordem implica em baixa entropia. O efeito entrpico em um processo de catlise enzimtica diminui a energia de ativao e gera estabilizao do estado de transio. Logo, o aumento da velocidade por efeitos entrpicos frequentemente considerado um importante mecanismo cataltico (ARANTES, 2008). A utilizao da energia de ligao para orientar uma molcula de substrato em uma conformao reativa ou trazer duas molculas, em conjunto e na orientao correta

para a reao, representa uma forma eficaz de compensar as perdas de entropia que podem acompanhar uma transformao bioqumica (CAMPBELL, 1993). Enzimas tm sido frequentemente descritas como armadilha entrpica ou sequestradores de entropia. Porquanto, os anticorpos devem ser capazes, eficientemente, de catalisarem reaes com desfavorveis entropias de ativao agindo assim, como sequestradores de entropia, catalisam reaes unimoleculares, bem como reaes bimoleculares. Um exemplo do uso de anticorpos catalticos para atuarem como armadilhas entrpicas envolve um anticorpo catalisador de reao bimolecular de Diels-Alder (BLACKBURN; DATTA; PARTRIDGE, 1996; RAO; WOOTLA, 2007). Biomolculas, tais como os anticorpos catalticos, representam uma classe de catalisadores que tm apresentado promissores resultados em reaes de Diels-Alder entre um dieno e um alqueno para a formao de um ciclohexeno com alta seletividade. Nessas reaes, a cicloadio procede em uma nica etapa, sem intermedirios, por um nico estado de transio; mas, nesse estado de transio, pode haver a formao de duas ligaes covalentes com uma diferena temporal entre as duas. Por conseguinte, o produto principal de qualquer cicloadio apresenta quimiosseletividade, regiosseletividade e estereosseletividade (BROCKSOM et al., 2010). Existem trs classes de molculas que demonstraram habilidade cataltica em transformaes de Diels-Alder: abenzimas (anticorpos catalticos), ribozimas (RNA catalticos) e enzimas encontradas em vias biossintticas. Donald Hilvert e colaboradores (1989) relataram pela primeira vez um anticorpo cataltico Diels-Alder, seguido de perto por um relatrio de Peter Schultz e pesquisadores em 1990. Duas diferentes estratgias foram utilizadas desses ensaios iniciais para criar um hapteno que elucidasse o anticorpo cataltico. Em ambos os casos, triagem dos anticorpos isolados com base em sua capacidade de vincular o hapteno resultou em um anticorpo com atividade cataltica nas transformaes de Diels-Alder direcionadas (JUNGBAUER, 2002). Anticorpos que catalisam tais processos ampliam o alcance dos biocatalisadores, atualmente conhecidos, oferecendo novas oportunidades para a sntese orgnica como, por exemplo, para a ativao de pr-frmacos in vivo, uma vez que no ocorrem interferncias de enUniversitas: Cincias da Sade, Braslia, v. 10, n. 2, p. 137-148, jul./dez. 2012 141

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zimas, o que poderia ocorrer naturalmente. Entretanto, sofrem tantas limitaes quanto outras abenzimas como: baixa eficincia cataltica, alto custo e tempo para gerao de anticorpos e seus substratos especficos. Contudo, a caracterstica que adquirem de alta seletividade da qual reduzem a elevada energia do estado de transio e redirecionam o curso de uma reao para a formao de produtos que normalmente seriam desfavorveis, valiosa.

cidos nucleicos tm sido isolados do soro de pacientes com lpus eritematoso sistmico, artrite reumatide e esclerose mltipla (RAO; WOOTLA, 2007). Embora sejam encontrados preferencialmente no repertrio imunolgico de indivduos com doena autoimune, os anticorpos catalticos tambm ocorrem naturalmente em indivduos saudveis. Devido ausncia de fatores de imunizao evidente, a hiptese que sugere a existncia de abenzimas em hgidos, sem distrbios do estado imunitrio, no suscitou muito interesse por um longo tempo. Durante o primeiro ms, aps o nascimento, o sistema imunolgico de recm-nascidos e crianas pequenas ainda no completamente formado, sendo assim, a partir do conhecimento que anticorpos do leite da me cobrem as superfcies mucosas do recm-nascido conferindo a eles mecanismos de proteo contra diversos agentes patolgicos, foram investigadas as propriedades catalticas dos anticorpos no leite humano (NEVINSKY, 2000). IgG possuindo atividade DNAse e IgA com protena quinase foram isolados a partir do leite de parturientes saudveis (WJCIK; KONONOWICZ, 2008). Em geral, visto que pode haver um aumento da quantidade de anticorpos catalticos naturais durante a gravidez (principalmente em gestantes com infeco viral ou reaes alrgicas), doenas autoimunes ou inflamatrias, tem-se sugerido que abenzimas possam participar na manuteno da homeostase do organismo e na defesa dele contra infeces. Isso tem gerado um significativo interesse no estudo desses catalisadores altamente especficos, abrindo diversas possibilidades de aplicao dos anticorpos catalticos para estratgias teraputicas in vivo nas reas mdica, alm da utilizao em campo biotecnolgico, qumico e agrcola (WANG, 2001).

3 Ocorrncia natural de anticorpos catalticos

A descoberta de anticorpos catalticos naturais ocorreu empiricamente por mensurao de uma transformao qumica de vrios antgenos, na presena de preparados de anticorpos monoclonais e policlonais. Anticorpos com funes proteolticas e outras atividades catalticas foram observados em sangue e secrees, mucosas de humanos e animais experimentais. Todavia, esses resultados foram vistos, inicialmente, com certo ceticismo. Porm, agora percebe-se que anticorpos com atividade cataltica especfica so possveis por meio da combinao de reao natural e no covalente de regies de epitopo recombinantes com o centro da reao do estado de transio (HANSON, 2005; PAUL et al., 2006). Esse mecanismo elucida como anticorpos catalticos so gerados espontaneamente pelo sistema imunolgico sem
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que haja imunizao prvia. Catalisadores tm sido identificados por vrios grupos, dentre os quais pacientes com as mais diversas doenas autoimunes, descritos como sendo positivos para autoanticorpos catalticos. Doenas autoimunes esto associadas a um aumento da produo de diferentes tipos de abenzimas direcionadas contra uma variedade de autoantgenos (PONOMARENKO et al., 2002). O primeiro exemplo da atuao de autoanticorpos com poder cataltico ativo na etiologia de uma doena vem de estudos desenvolvidos por Lacroix-Desmazes e colaboradores (2005), os quais observaram que 50% dos pacientes com hemofilia A, que recebiam terapia com Fator VIII em substituio ao Fator VIII endgeno deficiente, desenvolveram uma classe de IgGs anti-Fator VIII que hidrolizam esse fator. Anticorpos proteolticos especficos para tireoglobulina e protrombina foram relatados em pacientes com doena de Hashimoto e mieloma mltiplo, respectivamente, assim como anticorpos que realizam hidrlise de

4 Aplicaes
4.1 HIV Uma interessante aplicao da atuao antimicrobiana dos anticorpos catalticos est em seu emprego para a realizao da clivagem de uma sequncia especfica de peptdeos ou carboidratos associados ao revestimento viral ou bacteriano, assim como tambm foram desenvolvidas abenzimas que catalisam a destruio especfica de genes virais. A infeco com o vrus da imunodeficincia humana 1 (HIV), agente etiolgico da sndrome da imunode-

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ficincia adquirida (AIDS) caracterizado por depleo de clulas T CD4+, hiperglobulinemia e hiperplasia de clulas B. As principais clulas hospedeiras so as clulas T e macrfagos. A ligao da glicoprotena capsidial gp120 aos receptores CD4 e correceptores de quimiocina (principalmente CCR5 e CXCR4) o primeiro passo para a infeco pelo HIV, sendo a gp120 responsvel pela induo da morte de clulas T CD4. A incapacidade do sistema imune adaptativo em responder a infeco deriva da variabilidade estrutural do envelope viral (HANSON, 2005). A gp120 composta por cinco regies constantes (C) e cinco regies altamente variveis (V). A maioria das respostas adaptativas dirigida contra epitopos imunodominantes do domnio V, os quais sofrem rpidas mutaes. Clulas T citotxicas e respostas adaptativas de neutralizao por Igs somente oferecem proteo transitria, induzindo assim incapacidade de desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o HIV. Em contrapartida, foram identificados em humanos no infectados, anticorpos catalticos naturais que reconhecem resduos especficos do stio superantignico (SAg) da gp120 e catalisam a hidrlise dessa ligao peptdica por um mecanismo proteoltico codificado por genes da regio varivel (V) da imunoglobulina e expressos em elevado nveis por IgM e IgA, mas pouco por IgG. Essas classes foram encontradas na saliva desses indivduos, nos quais foi observado tambm que IgAs provenientes da mucosa so altamente catalticos e neutralizantes do HIV, sugerindo que eles constituem a primeira linha de defesa contra o vrus (PLANQUE et al., 2008a; NIERI et al., 2009). A inativao do vrus por anticorpos proteolticos ocorre por meio da imunizao com anlogos eletroflicos, covalentemente reativos, da gp120. Esses anlogos geram anticorpos com reatividade nucleoflica reforada e alta especificidade. A adio desses anticorpos catalticos (IgM/IgA) aceleram a hidrlise da gp120 e neutralizam o HIV em cultura de tecidos (PAUL et al., 2009). Conforme Planque e seus colaboradores (2008), a descoberta estrutural dos anlogos sintticos dos resduos peptdicos vinculados aos SAgs ser til para revelar a conformao neutralizante relevante do peptdeo, o que implicar na elaborao de vacinas peptdicas de acordo com a correta conformao, aumentando assim a probabilidade de induo de imunoglobulinas de proteo. Vias de diferenciao de clulas B que favorecem o desenvolvimento adaptativo de anticorpos com atividade ca-

taltica so praticamente desconhecidas. Sua elucidao ajudar a projetar uma vacina que ser capaz de induzir anticorpos neutralizantes para o vrus. 4.2 Doena de Alzheimer Aproximadamente 26 milhes de pessoas tm a doena de Alzheimer (DA) em todo o mundo. A acumulao de agregados peptdeos -amilides no crebro tem sido proposta como um fator causal dessa doena (HANSON, 2005). As alteraes cerebrais caractersticas da DA so as placas senis e os emaranhados neurofibrilares. As placas senis resultam do metabolismo anormal da protena precursora do amiloide, conduzindo formao de agregados do peptdeo -amiloide (FORLENZA, 2005). Ainda no existe uma terapia verdadeiramente eficaz para o tratamento da DA, entretanto, vrios estudos que utilizam imunoterapia com abenzimas para a reduo de agregados -amilides esto em desenvolvimento. Taguchi e pesquisadores (2008) identificaram IgMs e fragmentos de imunoglobulinas recombinantes que hidrolisam -amilides. IgM e IgG especficos para a clivagem de -amiloides foram identificados em pessoas idosas, presumindo-se aqui, uma benfica resposta autoimune (NIERI et al., 2009). Esses autoanticorpos cataltiem pacientes que apresentam DA. As IgGs so propostas para reduzir a deposio de -amilides no crebro por meio de sua ligao com esses peptdeos e podem restringi-los a uma conformao no agregada no crebro. Essa abordagem baseada na expresso de atividade proteoltica especfica dos anticorpos catalticos isolados por intermdio de processos de seleo de adaptao imunolgicos. Ensaios com a administrao de um pool da IgG como terapia para a DA esto em curso, e anticorpos gerados por imunizao com peptdeos -amiloides e seus anlogos esto sendo reportados para proteo contra um declnio cognitivo em modelos animais da DA. Tendo em conta o desenvolvimento natural de anticorpos catalticos anti--amiloides, bibliotecas de recursos humanos so fontes promissoras de homogeneidade de imunoglobulinas proteolticas (RANGAN et al., 2003). Em vistas dessas consideraes, pode-se supor que anticorpos catalticos anti--amiloide encontrados
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cos esto presentes tanto em indivduos saudveis quanto

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em humanos idosos podem cumprir uma funo protetora contra os efeitos txicos do peptdeo. Um contra-argumento a possibilidade desse anticorpo de induzir uma reao inflamatria. Entretanto, um grupo de pesquisa defende que anticorpos catalticos podem limpar os agregados do peptdeo -amiloide do crebro sem o auxlio da liberao de mediadores inflamatrios devido a no formao de um complexo estvel desses anticorpos com o peptdeo. Assim, a funo de catalisador pode diminuir a possibilidade de efeitos inflamatrios oriundos da presena de anticorpos (LUE; WALKER, 2002; PAUL et al., 2005). Em vista das vantagens de sua funo cataltica, autoanticorpos IgM e IgG, isolados do repertrio de humanos, so objetos de considerao em seu desenvolvimento como agentes imunoteraputicos para a doena de Alzheimer. 4.3 Cocana A cocana um poderoso estimulante e viciante, cujo abuso ainda um desafio sade pblica, alm de sempre estabelecer uma crise social. Atualmente no existe um tratamento farmacolgico eficaz para a desintoxicao da cocana. Algumas estratgias que esto em desenvolvimento atuam nos receptores de dopamina molculas de clulas cerebrais que so estimuladas durante o uso de cocana, causando, dentre outros efeitos, uma de suas caractersticas clnicas, o seu potencial de abuso. Todavia, medicamentos destinados ao bloqueio da estimulao nos receptores de dopamina, esto associados a efeitos colaterais adversos como perturbaes das funes motoras e tratamentos alternativos esto sendo estudados com intuito de eliminar, ou ao menos minimizar esses efeitos (DENG, 2002). Pesquisadores esto investigando maneiras de neutralizar a droga no sangue, reduzindo a quantidade disponvel para a absoro no crebro. Ao atacar a cocana diretamente, essa abordagem poderia tambm auxiliar a reverter alguns dos efeitos txicos da cocana, tais como a reduo do fluxo sanguneo e o fornecimento de oxignio para o crebro (BOWERSOX, 1995). O cerne do problema decorre do fato que a cocana em si um bloqueador, e anlogos da droga podem desloc-lo de seu stio de ligao, ainda como a cocana faria, como um bloco funcional. As dificuldades inerentes

de se formular um mecanismo de inibio para esse bloqueador levaram Deng e pesquisadores (2002) a abordarem uma alternativa baseada em um bloqueio perifrico em vez de central. Independentemente do caminho pelo qual uma droga que vicia entra no organismo, ela deve passar pelo sangue para o crebro. As principais ferramentas de neutralizao da cocana investigadas so anticorpos catalticos, projetados para se ligarem cocana na corrente sangunea e cliv-la em seus componentes nanoativos, imitando o metabolismo natural da droga no organismo, porm em uma velocidade muito maior (LANDRY et al., 1993). A cocana degradada na circulao antes de atingir o sistema nervoso central e exercer seus efeitos txicos. Na tcnica empregada, foram sintetizados haptenos anlogos do estado de transio da hidrlise da cocana em camundongos imunizados; esses hibridomas foram preparados e, a partir deles, desenvolveram os primeiros anticorpos catalticos anticocana com a capacidade de degrad-la sem a gerao de produtos txicos (MCKENZIE et al., 2007). Com essa abordagem, criou-se a possibilidade de desenvolvimento de vacinas contra a cocana e outras drogas como nicotina (DICKERSON, 2004), anfetamina e o crack, que j vm sendo testadas desde 1996. Pesquisadores desse experimento afirmam que a vacina reduz o uso da droga elevando os nveis de anticorpos contra a cocana, o que a deixa inativa antes de atingir o sistema nervoso central e produzir seus efeitos txicos. Os efeitos da vacina, no entanto, no persistiram por mais de dois meses, o que sugere doses de reforo que mantenham adequados os nveis sricos de anticorpos (GUTIERREZ, 2007). Todos esses resultados indicam o potencial imunoteraputico dos anticorpos catalticos anticocana e outras substncias entorpecentes, no tratamento de dependncia txica e superdosagem aguda (overdose) em pacientes viciados. 4.4 Outras aplicaes teraputicas Anticorpos catalticos foram relatados por serem muito eficazes em retardar o desenvolvimento da neurodegenerao. Isso est associado esclerose mltipla, por meio da ao de degradao stio-especfica de uma rede neural de antgeno na qualidade de epitopo de autoanticorpos catalticos baseados em abenzimas naturais para

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protena bsica de mielina (MBP) (PONOMARENKO et al., 2006). Embora inicialmente percebidos com potencial nocivo, anticorpos catalticos foram propostos para participarem na remoo de resduos metablicos e proteo contra infeces generalizadas, conhecidas como sepse. Aqui foram desenvolvidos pela presena no plasma de IgGs dotadas de semelhana com a estrutura da protease-serina com atividade hidroltica. As variaes das taxas de IgGs catalisadoras foram observadas em maior quantidade em pacientes com sepse grave do que em doadores saudveis, indicando que associado a alteraes nos nveis plasmticos de IgG hidroltica (LACROIX-DESMAZES et al., 2005). 4.5 Estudo de anticorpos catalticos para aplicao industrial Durante muito tempo a catlise biolgica vem sendo estudada pela indstria qumica e, embora catalisadores biolgicos estejam sendo empregados por dcadas em algumas reas da indstria como alimentos, detergentes e produtos farmacuticos, o domnio do mecanismo cataltico ainda no est totalmente elucidado, tornando tal rea cada vez mais extensa para pesquisas (OLIVEIRA; MANTOVANI, 2009). Novos sistemas catalticos esto sendo identificados e produzidos proporcionando significativos benefcios como: baixo consumo de gua, reduo da temperatura de funcionamento, maior seletividade do produto, recuperao de resduos agrcolas e industriais remunerada, alm do desenvolvimento de catalisadores de menor custo (BIOLOGICAL, 2006). Anticorpos com atividades catalticas vm sendo estudados h vrios anos, no entanto, mesmo sendo revelados como promissores materiais catalticos, sua aplicao na indstria ainda no foi definida. Tem-se visto um aumento recente de interesse acadmico por esses materiais, e sua adaptao para aplicaes industriais especficas pode fornecer importantes benefcios financeiros e ambientais. O grupo do Dr. Donald Hilvert (2006) tem desenhado por sntese qumica, haptenos associados a molculas proticas capazes de induzir em camundongos uma resposta imune de anticorpos catalticos, com objetivo de aplicao desses anticorpos na sntese de produtos industriais, como exemplo, para produo de polmeros biodegradveis.

Uma vasta gama de transformaes qumicas pode ser gerada por anticorpos catalticos por meio de reaes de transferncia de prtons redox, reaes de enanciosseletividade, ster-hidrlise, amida-hidrlise, clivagem foto-induo, dimerizao foto-induo, descarboxilao, formao de ligao com amida, formao de ligao amida bimolecular ou mesmo reao de Diels-Alder (ALI et al., 2009; CAMPBELL, 1993). A tecnologia de anticorpos catalticos para emprego industrial ainda est em fase inicial, mas j aparece como fonte promissora para indstria, sendo que novas pesquisas envolvendo reas de bioinformtica qumica esto fornecendo relevantes contribuies para o seu desenvolvimento (BIOLOGICAL, 2006).

5 Dificuldades para obteno e aplicao de anticorpos catalticos

Os benefcios em torno da produo e aplicaes de anticorpos catalticos nas diversas reas cientficas so incontestveis. Todavia, inmeras questes essenciais relacionadas com problemas fundamentais da biocatlise e potencial utilizao de abenzimas, inclusive no que diz respeito sua aplicao in vivo, ainda tm respostas vagas e uma lista de questes em constante expanso (BELOGUROV JR et al.; 2009). Melhorias no mtodo de concepo do hapteno e estratgias de imunizao podem levar a um aumento da atividade cataltica de anticorpos e ampliar a utilizao dessas molculas em abordagens teraputicas in vivo. O desenho de um hapteno capaz de gerar estabilidade reao um dos pontos crticos para produo de anticorpos e, por ainda no estar to bem elucidado, considerado um dos principais fatores para a ineficiente atividade cataltica das abenzimas sintticas, em comparao a funcionalidade de catlise enzimtica. A velocidade cataltica (turnorver) das abenzimas ainda menor que a de enzimas convencionais (RAO; WOOTLA, 2007). Ao mesmo tempo, srias limitaes intrnsecas s abenzimas, como a questo da velocidade cataltica, explicam as limitaes existentes para a utilizao dos anticorpos catalticos na prtica clnica. Abenzimas adaptadas no foram capazes de imitar o sofisticado mecanismo de enzimas altamente evoludas. Isso pode ser eventualmente melhorado pelo adequado desenho do hapteno (JUSTO, 1998).
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A obteno por imunizao reativa com um anlogo do estado de transio realizada em camundongos por definio ineficiente. Isso porque tal tcnica seleciona as clulas B de acordo com a capacidade da superfcie da imunoglobulina se ligar ao anlogo, e no da atividade cataltica da superfcie dela. difcil prever a estrutura do anlogo do estado de transio, assim como isol-lo devido extrema instabilidade do verdadeiro estado de transio; isso tambm justifica o porqu de no poder us-los como haptenos (ALI et al., 2009). Outra ponderao importante com relao utilizao de abenzimas, principalmente como imunoterpicos, diz respeito s doenas associadas produo de abenzimas naturais. Durante muito tempo, os anticorpos catalticos foram excludos das pesquisas teraputicas devido sua provvel atuao na patognese de vrias doenas autoimunes. Paciente com doenas autoimune so frequentemente positivos para autoanticorpos catalticos antgeno-especficos. Em alguns casos, como a hemofilia A, o papel patognico dos anticorpos catalticos foi bem documentado. Isso deu incio a uma extensa pesquisa para inibidores de peptdeos abenzimas induzidores da doena que poderiam ser usados com finalidade teraputica. No entanto, esses fatores no foram razoveis para considerar as abenzimas naturais como agressores (BELOGUROV JR et al. 2009).
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6 Consideraes finais
Os anticorpos catalticos (abenzimas), independentemente do possvel campo de sua utilizao, tm criado uma nova rea de investigao despertando assim, um grande interesse em diversos setores de pesquisas cientficas biotecnolgicas, biomdicas e de prtica clnica. Muitas descobertas fundamentais sobre biocatlise so baseadas em estudos de abenzimas sendo que, seu potencial de aplicao na medicina prtica, na indstria e na biotecnologia, tem apresentado valiosos resultados, sobretudo no que diz respeito produo de eficazes ferramentas diagnsticas e teraputicas como: eliminao de clulas neoplsicas, elaborao de catalisadores adequados para imunizao passiva de doenas graves e imunizao reativa nos quadros de vacinao profiltica, dentre outras. Entretanto, alguns problemas vm sendo apontados quanto produo desses anticorpos catalticos no que tange conservao da alta seletividade dessas molculas, aliada eficincia cataltica das enzimas definidas nesse caso, por um adequado desenho do hapteno. A obteno dessas molculas em larga escala e o custo da tcnica tambm tm sido pontos ponderveis a serem discutidos. Contudo, esses resultados tm questionado um dos principais dogmas da imunologia que molculas de anticorpos apenas desempenham um papel de reconhecimento e ligao a antgenos especficos. Todavia, as conquistas obtidas pelo emprego de anticorpos catalticos, alguns iniciando a fase clnica, tm se tornado um marco no desenvolvimento da imunologia e da bioqumica moderna, alm de ser atualmente um dos principais alvos de pesquisa em biotecnologia.

O uso de abenzimas geradas pela condio da doena autoimune pode provocar tambm inmeras dificuldades, sendo uma das mais complicadas, a extrao desses anticorpos de um vasto repertrio ainda no conhecido de transformaes mediadas por abenzimas e a luta permanente com contaminaes por enzimas (PONOMARENKO et al., 2002). O pice dessa abordagem foi a tentativa de conduzir as abenzimas para todas as reaes possveis e, paralelamente, buscar o isolamento de um anticorpo cataltico natural para todos os antgenos possveis. Em ambos os casos, as metas ainda no foram realizadas. Como alternativa, abenzimas foram selecionadas a partir de anti-idiotipos denominados de segunda ordem, pertencentes ao repertrio, isolados contra o stio ativo da enzima correspondente (JENCKS, 1969). Nessa abordagem, a busca por abenzimas foi baseada na anlise das propriedades catalticas dos anticorpos e seleo dos melhores anticorpos de ligao.

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