ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ULTRAVIOLETAVISIBLE

La espectrofotometra de absorcin ultravioleta-visible (UV/V) se basa en la

absorcin de radiacin por la materia en el rango de longitudes de onda comprendido
entre el ultravioleta cercano y el infrarrojo cercano (180-1100 nm). Cuando una especie
qumica absorbe radiacin pasa a un estado excitado que posteriormente elimina ese
exceso de energa en forma de calor.

Fundamento de la absorcin
La distribucin espacial de los electrones de una molcula da lugar a los
diferentes niveles electrnicos de la misma. La diferencia de energa entre estos niveles
electrnicos es del orden de 1 eV. Cada nivel electrnico lleva asociado diferentes
niveles vibracionales cuyas diferencias de energa son del orden de 0,1 eV, y que son
debidos a las vibraciones interatmicas. A su vez, cada nivel vibracional contiene varios
niveles rotacionales debidos al movimiento de las molculas alrededor de su centro de
gravedad, si bien estos ltimos tienen poca importancia ya que la diferencia de energa
entre ellos es del orden de 0,01 eV.
La absorcin de radiacin cuya longitud de onda se encuentra en el ultravioleta
visible promueve la transferencia de electrones desde el estado electrnico fundamental
a estados electrnicos excitados, lo que conlleva transferencia entre niveles
vibracionales y rotacionales.
E = E
elect
+ E
vibrac
+E
rot

El primer trmino de la ecuacin es el ms importante, lo que permite clasificar
las especies absorbentes por el tipo de transiciones electrnicas que pueden tener lugar.
- Transiciones
*
. Son transferencias entre orbitales moleculares sigma
(enlazantes y antienlazantes) que implican energas relativamente grandes, de
forma que las bandas de absorcin se observan a longitudes de onda inferiores a
200 nm (UV lejano). Esta regin del espectro se denomina ultravioleta de vaco
debido a que los constituyentes del aire N
2
y O
2
absorben fuertemente a 160 y
200 nm, respectivamente. Los espectros en esta zona deben obtenerse en
condiciones de vaco.
- Transiciones n
*
. Se dan en especies qumicas saturadas que contienen
tomos con pares electrnicos en orbitales no enlazantes n. Esto sucede por
ejemplo en compuestos saturados que contienen heterotomos como oxgeno,

azufre y halgenos. Estas transiciones requieren menos energa que las
*
,
por lo que las bandas se presentan fundamentalmente en el ultravioleta lejano.
La intensidad de la absorcin suele ser pequea y las longitudes de onda de los
mximos de absorcin se desplazan hacia longitudes de onda menores al
aumentar la electronegatividad del heterotomo. La mayor parte de los
compuestos saturados que contienen oxgeno absorben a longitudes de onda
inferiores a 200 nm, de modo que el agua y los alcoholes pueden usarse como
disolventes en el ultravioleta prximo.
- Transiciones
*
. Estas transiciones entre orbitales moleculares (enlazantes
y antienlazantes) requieren la absorcin de energas que se encuentran entre el
ultravioleta lejano y prximo, proporcionando grandes intensidades.
- Transiciones n
*
. Se presentan en molculas compuestas por un heterotomo
portador de pares de electrones libres que pertenece a un sistema insaturado.
Requiere la absorcin de energas menores que las transiciones
*
, por lo que
aparecen en el ultravioleta prximo y en el visible.
- Bandas de transferencia de carga. Estas bandas se originan cuando se produce
una transferencia de electrones de un lugar a otro de la molcula. Como
consecuencia se origina un estado excitado resultado de un proceso de
oxidacin-reduccin interna. Estas bandas de absorcin presentan intensidades
muy altas, por lo que son posibles lmites de deteccin muy bajos.
- Bandas de campo ligando. Aparecen en iones y compuestos de metales de
transicin y son debidas a la diferencia de energa que se produce en los
orbitales d del in central al aproximarse los ligandos con los que forman
complejos en disolucin.

Figura 1. Transiciones entre OM y zonas del espectro





Ecuacin de Lambert-Beer
Cuando un haz de radiacin monocromtica de una determinada longitud de
onda, atraviesa una capa de disolucin que contiene una especie absorbente, la
intensidad del haz incidente I
0
, se atena, disminuyendo hasta una intensidad I. La
transmitancia (T) se define como la fraccin de radiacin incidente que consigue
atravesar la muestra, de modo que la absorbancia A=-log T.
Para una capa de disolucin absorbente de espesor infinitamente pequeo (db),
la disminucin de la intensidad (dI), viene dada por dI=-kICdb donde k es una constante
de proporcionalidad y C es la concentracin de la especie absorbente. Integrando y
reagrupando se obtiene:
kCdb
I
dI
=
} }
=
b I
I
kCdb
I
dI
0
0
ln
|
|
.
|

\
|
= =
|
|
.
|

\
|
0 0
log 3 . 2
I
I
kCb
I
I

log
|
|
.
|

\
|
0
I
I
= -logT =A A=bC donde =
3 . 2
k
y b es el espesor de la muestra.
La expresin A=bC se denomina Ley de Lambert-Beer. La constante recibe el
nombre de absortividad molar, propiedad de la sustancia absorbente que depende de la
longitud de onda.
La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentracin nicamente se
cumple a concentraciones bajas. En la deduccin de la ley de Lambert-Beer no se ha
considerado que la absortividad vara con el ndice de refraccin, que a su vez depende
de la concentracin. En la prctica, para concentraciones inferiores a 10
-3
M el ndice de
refraccin es esencialmente constante. Sin embargo, existen otras desviaciones debidas
a causas instrumentales, qumicas o personales:
- Uso de radiacin monocromtica. La deduccin de la ley de Lambert-Beer se
realiza sobre la base de que la radiacin incidente es monocromtica, lo cual en
la prctica nunca se cumple en sentido estricto. Sin embargo, aunque la anchura
de la banda sea relativamente grande, si la diferencia en los valores de
absortividad son pequeos, el uso de un haz policromtico no implica
diferencias significativas respecto a uno monocromtico.
- Errores de lectura. Pequeos errores en la lectura de la transmitancia o de la
absorbancia pueden ocasionar grandes errores en la concentracin cuando se
opera en los extremos de la escala. Puede demostrarse que el mnimo error

relativo se obtiene para una transmitancia de 36.8%, lo que equivale a una
absorbancia de 0.434.
- Influencia del equilibrio. Cuando la sustancia problema forma parte de un
sistema en equilibrio con otras especies, el desplazamiento del equilibrio implica
una modificacin en la concentracin, y por tanto, en la absorbancia.
- Presencia de impurezas en los reactivos. Muchos mtodos espectroscpicos son
lo suficientemente sensibles como para detectar cantidades a nivel de trazas, por
lo que la presencia de impurezas absorbentes en los reactivos puede ocasionar
errores considerables. Por ello, en la prctica las medidas se llevan a cabo frente
a un blanco constituido por la propia clula, el disolvente y los reactivos.
- Interacciones entre especies absorbentes. Cuando en una disolucin existen
varias especies absorbentes, la ley de Lambert-Beer se cumple para cada una de
ellas, si todas actan independientemente. Sin embargo, la interaccin entre ellas
puede producir alteraciones en la posicin, forma y altura de las bandas de
absorcin.

Influencia del entorno sobre los espectros de absorcin
Los grupos funcionales responsables de la absorcin en las regiones ultravioleta
y visible se denominan grupos cromforos. Aquellas agrupaciones atmicas que por s
mismas no comunican color a la molcula, pero son capaces de reforzar la accin de un
cromforo, se denominan auxcromos. Si un auxcromo y un cromforo se encuentran
en la misma molcula, la absorcin del cromforo se desplaza hacia longitudes de onda
mayores (desplazamiento batocrmico) a la vez que se produce un incremento en la
intensidad de la absorcin (efecto hipercrmico).
El disolvente tambin puede variar la posicin, altura y forma de las bandas. Al
aumentar la polaridad del disolvente, se produce un desplazamiento hacia longitudes de
onda menores (desplazamiento hipsocrmico) de las bandas n
*,
y un desplazamiento
batocrmico de las bandas
*
. Esto es debido a que el estado excitado es ms polar
que el estado fundamental, por lo que la presencia de un disolvente polar tiende a
estabilizar el estado excitado. En el caso de las transiciones n
*
se produce adems un
aumento de la solvatacin del par de electrones no enlazados, lo cual rebaja la energa
del orbital no enlazante en mayor medida de lo que disminuye la energa del orbital
antienlazante.


Aplicaciones
En principio, cualquier especie qumica que absorba radiacin electromagntica
en las regiones ultravioleta y visible es susceptible de poder ser determinada por
tcnicas espectrofotomtricas. El mayor campo de aplicacin se encuentra en el anlisis
cuantitativo siendo la espectrofotometra una de las tcnicas ms usadas.
Anlisis cualitativo.
Los espectros de absorcin ultravioleta-visible son, en general, poco tiles con
fines cualitativos debido a la anchura de las bandas. La identificacin de un compuesto
requiere la comparacin emprica de los detalles del espectro de la muestra problema
con el espectro del compuesto puro. El estudio de espectros de un elevado nmero de
molculas ha permitido establecer correlaciones entre estructuras qumicas y posicin
de los mximos de absorcin. Las ms conocidas son las reglas establecidas por
Woodward, Fieser y Scout, referidas a compuestos carbonlicos, dienos o esteroides.
Anlisis cuantitativo.
La absorcin de radiacin luminosa en las regiones ultravioleta y visible
presenta multitud de aplicaciones en anlisis cuantitativo. No es necesario que el
compuesto a analizar absorba directamente radiacin si se puede transformar en un
derivado que posea un cromforo. Mediante este mecanismo es posible analizar tambin
una gran variedad de especies qumicas cuya absorcin es inicialmente muy dbil o bien
se encuentran en una parte del espectro en la que coexisten otras absorciones que
interfieren. Con este fin, la medida de absorbancia est precedida de una transformacin
qumica que debe ser especfica, total, rpida, reproducible y conducir a un derivado
estable en disolucin.
Para el anlisis de un analito individual se comienza por el establecimiento de
una curva de calibrado A=f(C), a partir de disoluciones de concentraciones conocidas
del analito, sometidas al mismo tratamiento que la muestra. Esta curva, frecuentemente
ajustada a una lnea recta para disoluciones diluidas, permite deducir la concentracin.








Instrumentacin
El equipo utilizado para realizar espectros de absorcin es un espectrofotmetro.
Los componentes bsicos son: una fuente de radiacin, un sistema que permita
seleccionar una banda estrecha de longitudes de onda, una cubeta o recipiente que
contenga la muestra, un detector, y un sistema de tratamiento y lectura de la seal.
Las fuentes de radiacin deben ser continuas en una amplia zona del espectro,
de intensidad elevada y constante con la longitud de onda. En la zona del visible la
fuente ms utilizada es la lmpara de filamento de volframio, basada en la emisin de
radiacin por efecto de la temperatura. Por debajo de 350 nm su potencia es inadecuada
por lo que se utilizan fuentes de descarga formadas por una ampolla que contiene dos
electrodos en el seno de un gas (H
2
, D
2
, Ar, Xe). Los electrodos aplican una descarga
elctrica que excita las partculas de gas, de modo que cuando stas vuelven al estado
fundamental lo hacen emitiendo luz ultravioleta.
Los filtros y monocromadores son sistemas que seleccionan un haz de radiacin
con un estrecho rango de longitudes de onda. Existen filtros de absorcin, basados en la
absorcin selectiva de ciertos rangos de longitudes de onda, y filtros de interferencia,
que mediante reflexiones de la radiacin en un dielctrico transparente recubierto en
ambas caras por un material reflectante, refuerzan unas longitudes de onda mientras que
las otras sufren interferencias destructivas. Los filtros de absorcin se usan en la regin
del visible y los de interferencia en las regiones ultravioleta y visible. Los
monocromadores se caracterizan por producir un haz de gran pureza espectral y por
variar la longitud de onda de la radiacin de forma continua y en un amplio intervalo.
Los componentes bsicos de un monocromador son, una rendija de entrada, que
selecciona un haz de radiacin policromtica entrante, un elemento dispersante -prisma
o red-, que dispersa la radiacin en sus longitudes de onda individuales, y una rendija de
salida, que asla la banda espectral deseada.
Los detectores son transductores que convierten la radiacin electromagntica en
un corriente o voltaje que posteriormente es amplificada y cuantificada. As, los
fototubos, basan su funcionamiento en el efecto fotoelctrico. Los electrones que emiten
ciertos materiales cuando reciben el impacto de fotones de determinadas longitudes de
onda, generan una diferencia de potencial proporcional a la cantidad de fotones recibida.
Los fotomultiplicadores son una combinacin de un fototubo y una cadena interna
multiplicadora de electrones. Los fotodiodos, consisten en una unin semiconductora.
Cuando un fotn impacta en el diodo, los electrones llegan hasta la banda de

conduccin, donde actan como portadores de carga. De esta forma la corriente
generada es proporcional a la intensidad incidente.
El trmino colormetro, se utiliza cuando se trabaja en la regin del visible con
filtros para seleccionar la longitud de onda. El trmino espectrofotmetro se reserva
para equipos que pueden trabajar en las regiones ultravioleta y visible, y estn dotados
de monocromadores en lugar de filtros.
Existen espectrofotmetros de simple haz y de doble haz. Los instrumentos de
simple haz son aquellos en los que la radiacin sigue una nica trayectoria entre la
fuente y el detector. En el caso de que slo se disponga de una celda, en primer lugar se
realiza la medicin con el blanco y despus con la muestra problema. En los
instrumentos de doble haz, la radiacin proveniente de la fuente es dividida en dos
haces mediante un sistema de espejos. Uno de ellos se dirige a la celda de referencia que
contiene el blanco, y el otro hacia la celda que contiene la muestra. Los equipos de
doble haz tienen la ventaja de que cualquier variacin en la intensidad de la fuente,
eficiencia de la red, sensibilidad del detector, etc., afecta simultneamente a los dos
haces, por lo que la relacin entre sus intensidades permanece constante.

Figura 2. Esquema de un espectrofotmetro de haz simple y doble
Celdas
Estn diseadas para contener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo
de luz de longitudde onda determinada por el monocromador.
Las celdas o cubetas se fabrican de vidrio, si se requieren efectuar estudios en el rango
de los 340 a los 1 000 nm y de slice, si el anlisis est en el rango comprendido entre
los 220 y los 340 nm. Tambin hay celdas en materiales plsticos como estireno
o poliestireno. El portador de muestras lo disean los fabricantes de acuerdo al tipo de
espectrofotmetro y de muestra a analizar, por ello se encuentran portadores de muestra
con microceldas, aunque tambin tubos de ensayo y otras variantes como las celdas de
flujo continuo. Una casa comercial con una amplia gama de cubetas es Hellma. Sin

embargo para usos menos complicados se pueden conseguir precios ms asequibles en
aquellas cubetas de uso comn.

Solucionando problemas
Problema1. Aparece error al conectar el instrumento.
Cada fabricante tiene en su manual de instrucciones una serie de errores
clasificados, pero los problemas ms frecuentes son:
- Se ha conectado el aparato con una celda olvidada dentro. Se ha de
apagar el aparato, sacar la celda y volver a conectar.
- No se ha cerrado la puerta del portador de celdas al conectar el aparato.
Se ha de apagar el aparato, sacar la celda y volver a conectar.
- La lmpara muestra signos de desgaste. Se ha de cambiar la lmpara.
Estos tres problemas se producen porque cada vez que el aparato se conecta,
mide la intensidad que emite la lmpara y la que recibe el detector, que han de ser
iguales y determinadas. Si hay una celda dentro, o se pierde intensidad por la puerta
abierta o la lmpara ya no emite la intensidad que debe aparece un error.
Para cambiar las lmpara de wolframio, hay que tener una de repuesto. Conviene
tener lmparas de repuesto de cada colormetro, para lo cual hay que saber qu tipo de
lmpara necesitamos. Lo primero es saber los voltios y los watios que suelen ir
estampados sobre la lmpara. Si se pide la lmpara adecuada a la casa comercial del
aparato el precio ser aproximadamente el triple de lo que vale. Existen casas
comerciales como rs Amidata que venden componentes elctricos y electrnicos por
internet. Slo con introducir los voltios y los watios aparecen las lmparas de esas
caractersticas. Adems cada lmpara lleva escrito sobre ella un cdigo que describe la
lmpara fsicamente, as podemos conseguir lmparas idnticas a las que lleva el
aparato. Para cambiar la lmpara se desconecta el aparato de la corriente se abre la
portezuela, se agarra la lmpara lo ms cerca posible de los bornes y se estira. Algunos
fabricantes sellan la lmpara al portalmpras para que el cambio de lmpara sea caro
(hay que sustituir las dos piezas) y difcil. En estos casos se puede sacar el
portalmparas, quitar el sello y colocar una lmpara nueva.
Para colocar la lmpara nueva se evitar tocarla con los dedos para lo cual un
trozo de papel es suficiente.
En el caso de espectrofotmetros UV-visible, tenemos dos lmparas, y
normalmente el instrumento dispone de algn apartado en su software que indica el

tiempo de vida que le resta. Las de tungsteno se cambian como la de los colormetros,
pero el cambio de la lmpara UV es ms complicado sobre todo por el precio,
(aproximadamente 600 euros). La mejor opcin es comprar la lmpara, tenerla de
repuesto y esperar una visita del tcnico para que la cambie. La pgina web de la casa
comercial Heraeus Noblelight te indica el tipo de lmpara que necesitas con slo
introducir la marca y modelo del aparato. Dado que el precio de las lmparas UV es tan
alto, algunos de estos aparatos tienen la opcin de encenderla o no. Si vamos a medir
toda una sesin en el visible, la lmpara UV es innecesaria por lo que podemos tenerla
apagada y ahorrar tiempo de vida del elemento. Cuando un aparato se retira como
obsoleto o porque no tiene arreglo, es buena idea conservar las lmparas, seguro que en
la Universidad existe en algn lugar un instrumento similar que puede aprovecharlas

Problema2. La absorbancia o transmitancia no ofrece un valor estable cuando
debera darlo.
Muchas veces el problema no es el instrumento, si no la muestra. Si la muestra
no es una disolucin, pongamos que hay burbujas, cosas flotando, el haz de luz
incidente puede atravesarlas o no por lo que la medida no ser constante. Algunos
instrumentos disponen de un dispositivo para evitar que la muestra se caliente si est
mucho tiempo en el portaceldas evitando que incida sobre ellas el haz de luz incidente.

Problema3. El aparato simplemente no se enciende.
En este caso lo ms habitual es que se haya fundido el fusible. Al igual que con
las lmparas para el visible estos elementos son muy baratos, un euro o dos, por lo que
se puede disponer de alguno de recambio. El fusible suele venir localizado cerca del
interruptor de encendido y apagado junto al cable elctrico de alimentacin. Para
conseguir fusibles de repuesto hay que mirar su amperaje y fsico y buscarlo en casa
comerciales como las anteriormente nombradas. El cambio se fusible se realizar con el
aparato desconectado de la corriente.