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Variao gentica e fenotPica

Relevncia da gentica de populaes, 20 Variao fenotpica em populaes naturais, 21 Variao contnua: a distribuio normal, 21 Mdia e varincia, 23 Teorema do limite central, 25 Variao mendeliana discreta, 27 Herana multifatorial, 29 Manuteno da variao gentica, 30 Gentica de populaes molecular, 32 Eletroforese, 33 Frequncias allicas e frequncias genotpicas, 35 Polimorfismo e heterozigosidade, 36 Polimorfismos de aloenzimas, 37 Inferncias a partir de polimorfismos de aloenzimas, 40 Polimorfismos em sequncias de Dna, 41 Enzimas de restrio, 41 Reao em cadeia da polimerase, 44 Polimorfismos de nucleotdeo nico, 48 Polimorfismos sinnimos e no sinnimos, 48 Stios segregantes e diferenas de nucleotdeos, 50 Utilidade dos polimorfismos genticos, 54
A cincia da gentica de populaes trata das Leis de Mendel e de outros princpios genticos no contexto de sua aplicao a populaes inteiras de organismos. Os organismos podem ser seres humanos, animais, plantas ou micrbios. As populaes podem ser naturais, agrcolas ou experimentais. O ambiente pode ser uma cidade, fazenda, campo ou floresta. O hbitat pode ser solo, gua ou ar. Devido a esse amplo espectro, a gentica de populaes atravessa muitos campos da biologia moderna. Um conhecimento funcional de gentica de populaes se tornou essencial em gentica, genmica, biologia evolutiva, biologia computacional, sistemtica, reproduo de plantas, criao de animais, ecologia, histria natural, gerenciamento florestal, horticultura, conservao e manejo de vida silvestre. Uma compreenso bsica da gentica de populaes tambm til em medicina, direito, biotecnologia, biologia molecular, biologia celular, sociologia e antropologia.
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daniel l. Hartl & andrew g. clark
A gentica de populaes tambm inclui o estudo de vrias foras que resultam em mudanas evolutivas nas espcies ao longo do tempo. Organismos individuais so caracterizados pelos seus gentipos, ou a sua constituio gentica, e pelos seus fentipos, ou as caractersticas que eles manifestam. Essa relao entre gentipo e fentipo frequentemente complexa, porque o fentipo pode depender de interaes de diferentes genes e tambm de efeitos do ambiente. Ao definir o arcabouo gentico dentro do qual a evoluo ocorre, os princpios de gentica de populaes so bsicos para que se tenha uma perspectiva evolutiva ampla sobre a biologia. De um ponto de vista experimental, a evoluo proporciona uma grande quantidade de hipteses testveis para todos os outros ramos da biologia. Muitos fatos estranhos em biologia se tornam compreensveis luz da evoluo: eles resultam da ancestralidade compartilhada entre os organismos e atestam quanto unidade da vida na Terra.
RElEVncia Da GEntica DE POPUlaES
As aplicaes prticas da gentica de populaes so muitas. Numerosas aplicaes, particularmente aquelas relevantes para os seres humanos, tambm possuem implicaes importantes em tica e polticas sociais. Entre as aplicaes da gentica de populaes na medicina, agricultura, conservao e pesquisa esto as seguintes:
n n
n n
n n n n n
aconselhamento gentico de pais e outros parentes de pacientes com doenas hereditrias; mapeamento gentico e identificao de genes de suscetibilidade a doenas em humanos, incluindo cncer de mama, cncer de clon, diabete e esquizofrenia; implicaes de levantamentos populacionais de portadores de genes de doenas, confidencialidade dos resultados e manuteno de seguros-sade; interpretao estatstica do significado da correspondncia entre tipos de DNA encontrados em um suspeito e em uma amostra de sangue ou smen da cena de um crime; desenho de estudos para amostrar e preservar o registro da variao gentica entre populaes humanas ao redor do mundo; melhoria no desempenho de animais domsticos e plantas cultivadas; organizao de programas de cruzamento para a conservao de espcies ameaadas em zoolgicos e refgios de vida silvestre; amostragem e preservao de germoplasma de plantas e animais potencialmente benficos que podem desaparecer da natureza em breve; interpretao de diferenas nas sequncias de nucleotdeos de genes ou sequncias de aminocidos de protenas entre membros da mesma espcie ou de espcies proximamente relacionadas; anlises de genes e genomas entre diversas espcies para determinar as suas relaes evolutivas e para testar hipteses sobre o processo evolutivo.
Princpios de gentica de populaes
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A variabilidade gentica nas populaes se tornou um tema de investigao cientfica no final do sculo XIX, mesmo antes da redescoberta do artigo de Mendel (1866) sobre a hereditariedade. O principal destaque no estudo de diferenas hereditrias nas populaes humanas foi Francis Galton (1822-1911). Galton foi um pioneiro na aplicao da estatstica na biologia. Ele utilizou mtodos estatsticos para estudar caractersticas fsicas como a cor dos olhos e padres de impresso digital, bem como caractersticas de comportamento como temperamento e habilidade musical. Galton esteve entre os primeiros a examinar relaes estatsticas entre as distribuies de caractersticas fenotpicas em geraes sucessivas. Ele considerado o fundador da biometria, a aplicao de estatstica a problemas biolgicos. Antes de 1900, o trabalho de Galton foi desenvolvido sem o conhecimento da teoria de hereditariedade proposta por Gregor Mendel (1822-1884).
VaRiaO FEnOtPica EM POPUlaES natURaiS
Galton e Mendel exemplificam abordagens opostas no estudo de caractersticas hereditrias. O ponto de partida de Mendel no estudo da gentica foi a variao discreta, na qual as diferenas fenotpicas entre os organismos podem ser atribudas a um pequeno nmero de classes claramente distintas, como ervilhas lisas versus ervilhas rugosas. O ponto de partida de Galton foi a variao contnua, na qual os fentipos dos organismos so medidos em uma escala quantitativa, como altura ou peso, e na qual os fentipos passam imperceptivelmente de uma categoria para a outra. Como material para o estudo da variao fenotpica, a escolha de Galton foi boa: a maioria das diferenas entre pessoas normais que so visveis a olho nu so diferenas em caractersticas contnuas altura, peso, cor de pele, cor de cabelo, caractersticas faciais, velocidade de corrida, tamanho do sapato e assim por diante. O mesmo verdadeiro para a variao fenotpica em outros organismos. Por outro lado, como material para o estudo da variao gentica, a escolha de Mendel foi boa (Hartl e Orel, 1992; Orel, 1996): o resultado da segregao revelado mais claramente em heredogramas incluindo caractersticas mendelianas discretas e simples. Segregao significa que as duas formas de um gene presentes em um indivduo, digamos A e a, se separam na formao das clulas reprodutivas, de forma que cada gameta recebe exatamente uma cpia de A ou a.
Variao contnua: a distribuio normal

No caso de caractersticas contnuas, no apenas os fentipos passam gradualmente de uma categoria a outra, mas tambm costuma haver dificuldades especficas para a realizao de anlises genticas. Os problemas so de dois tipos principais:
n
a maioria das caractersticas contnuas influenciada por pequenas diferenas na sequncia de DNA em dois ou mais genes, assim a segregao de
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diferenas em um gene em heredogramas mascarada pela segregao de diferenas em outros genes que afetam a caracterstica; a maioria das caractersticas contnuas influenciada por fatores ambientais e tambm por genes, assim a segregao gentica mascarada pelos efeitos ambientais.
Esses problemas no so intransponveis em organismos com uma densidade suficientemente alta de marcadores genticos distribudos pelo genoma (o conjunto de cromossomos), pois os marcadores genticos podem ser acompanhados em famlias juntamente com a caracterstica contnua de interesse. Organismos com mapas genticos suficientemente densos incluem os seres humanos, animais de laboratrio, muitos animais domesticados e plantas cultivadas. Na poca de Galton, no entanto, estudos de caractersticas contnuas com base na ligao de marcadores genticos ao longo do cromossomo eram desconhecidos. Por que, ento, Galton enfocou as caractersticas contnuas? A razo que elas possuem uma certa regularidade (uma previsibilidade estatstica) que lhes particular. Para muitas caractersticas contnuas, quando os fentipos so agrupados em intervalos adequados e organizados em um grfico de barras, a distribuio dos fentipos fica semelhante curva familiar, em forma de sino, conhecida como distribuio normal. Por exemplo, um grfico de barras gerado com os dados de Galton para a altura de 1.329 homens, arredondada para a polegada mais prxima, mostrado na Figura 1.1. A curva contnua a distribuio normal que melhor se encaixa nos dados. A equao da curva normal, mais adequadamente chamada de funo normal de densidade de probabilidade, :
( x )2 1 2 (1.1) f ( x ) = 1 e 2 2 f ( x ) = 2 e 2 2 onde x varia entre e , e onde = 3,14159 e e = 2,71828 so constantes. A localizao do pico da distribuio ao longo do eixo do x determinada pelo parmetro , que a mdia de valores fenotpicos. O grau em que os fentipos ( x )2
200 Nmero de homens 150 100 50 0 N = 1.329 x = 69,0 s = 2,5
0,125 0,1 0,075 0,05 0,025
<63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 >75 Altura (arredondada para a polegada mais prxima)
Figura 1.1 Distribuio da altura de 1.329 homens britnicos. (Dados de Galton, 1889.)
Ordenada da curva normal
0,15
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so agrupados ao redor da mdia determinado pelo parmetro 2, que a varincia da distribuio. Matematicamente, a varincia a mdia da diferena ao quadrado entre cada valor fenotpico e a mdia; isto , a mdia dos valores de (x )2. Como e 2 so estimados dos dados considerado a seguir.
Mdia e varincia
Os valores de e 2 so chamados de parmetros, o que significa que eles so constantes numricas fixas representando alguma caracterstica ou propriedade de uma populao, nesse caso, a mdia e a varincia, respectivamente. Embora eles sejam constantes, os seus valores so desconhecidos e, ento, devem ser estimados de uma amostra escolhida para representar a populao inteira. Para os dados de altura, a amostra tabulada na Tabela 1.1, na qual fi o nmero de homens cuja altura xi, arredondada para a polegada mais prxima. (O fato de que os homens mais baixos e os mais altos so agrupados nos extremos opostos da distribuio no faz diferena, porque esses homens representam apenas uma pequena proporo da amostra total.) Os produtos das multiplicaes fi xi e fi xi2 tambm so tabulados, assim como as suas respectivas somas. A mdia da distribuio estimada como a mdia da amostra, que convencionalmente representada por x (s vezes tambm por ^): x=
fx f
i i
(1.2)
Nesse exemplo, x = 91.639/1.329 = 68,95 polegadas. Tabela 1.1 Alturas de 1.329 homens
Intervalo de altura (i) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Totais
Fonte: Dados de Galton, 1889.
Faixa de altura (pol.) <63,5 63,564,5 64,565,5 65,566,5 66,567,5 67,568,5 68,569,5 69,570,5 70,571,5 71,572,5 72,573,5 73,574,5 >74,5
Polegada mais prxima (xi) 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75
Nmero de homens (fi ) 23 20 64 110 155 199 203 198 171 88 47 27 24 1.329 ( i)
fi xi 1.449 1.280 4.160 7.260 10.385 13.532 14.007 13.860 12.141 6.336 3.431 1.998 1.800 91.639
fi xi 2 91.287 81.920 270.400 479.160 695.795 920.176 966.483 970.200 862.011 456.192 250.463 147.852 135.000 6.326.939 (ixi2)
(ixi)
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Da mesma forma, a varincia 2 da distribuio estimada como a varincia da amostra, que convencionalmente representada por 2 (s vezes tambm por ^2): s2 =
f (x
i
x )2
fi
fx f
i i
2 i
( x )2
(1.3)
A expresso no centro vem diretamente da definio de varincia: a mdia dos desvios ao quadrado em relao mdia dos valores; para qualquer x valor de xi, (xi ) o seu desvio em relao mdia. A expresso direita aritmeticamente idntica, mas mais fcil de aplicar na prtica. No exemplo da Tabela 1.1, s2 = 6.326.939/1.329 (68,96)2 = 6,11. (Esse valor pode diferir levemente do seu prprio clculo de acordo com o nmero de dgitos significantes que voc utilizou antes de arredondar). Se o tamanho amostral pequeno (digamos, menor do que 50), ento uma estimativa um pouco melhor da varincia obtida ao multiplicar a expresso na Equao 1.3 por n/(n 1), onde n o tamanho total da amostra (nesse caso, 1.329). Intimamente relacionado com a varincia est o desvio-padro da distribuio, que a raiz quadrada da varincia. O desvio-padro uma quantidade natural a ser considerada de acordo com as unidades de medida. Na Tabela 1.1, por exemplo, cada medida expressa em polegadas. A mdia tambm expressa em polegadas. Entretanto, como a varincia a mdia de desvios ao quadrado, a varincia possui a unidade de polegadas ao quadrado, o que parece mais apropriado para uma medida de rea do que para altura. Quando se extrai a raiz quadrada da varincia, tem-se de volta a unidade de medida correta: nesse exemplo, polegadas. A estimativa do desvio-padro convencionalmente representada por s (s vezes, tambm, por ^) e calculada pela raiz quadrada da quantidade obtida na Equao 1.3. No exemplo da altura, s = 2,47 (o que talvez de novo difira levemente dos seus clculos em virtude de erro de arredondamento). A estimativa s do desvio-padro frequentemente chamada de erro-padro. Para uma distribuio normal, as propores 68%, 95% e 99,7% so as propores das observaes esperadas nos intervalos delimitados por 1, 2 ou 3 erros-padro em relao mdia, respectivamente. Estes emergem diretamente da Equao 1.1, porque a proporo de observaes ocorrendo em qualquer faixa especfica de x igual integral da Equao 1.1 atravs desta faixa de valores. Para a distribuio normal, a integral entre os limites igual a 0,6827, aquela entre 2 igual a 0,9545, e aquela entre 3 igual a 0,9973. Na anlise de dados, e s so utilizados no lugar de e . Por que utilizamos dois x smbolos para a mdia e dois para o desvio-padro? Porque existe uma diferena importante entre e e entre s e . Os smbolos e representam os valores x de mdia e desvio-padro na populao inteira. Os verdadeiros valores para esses parmetros so desconhecidos e podem ser apenas estimados a partir de amostras retiradas da populao. Os smbolos e s representam as estimativas x de e com base em uma amostra, e os diferentes smbolos so utilizados para enfatizar que as estimativas iro diferir de uma amostra para outra, de forma que e s so apenas aproximaes de e . x
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Casualmente, observa-se que a integral da distribuio normal entre os limites 4 igual a 0,9999; esse resultado mostra que menos de 1 em 10.000 observaes ocorre a mais do que quatro desvios-padro em relao mdia.
teorema do limite central

Galton ficou altamente impressionado com a observao de que muitos fenmenos naturais seguem a distribuio normal. Ele escreve:
No conheo quase nada que seja to capaz de impressionar a imaginao como a maravilhosa forma de ordem csmica expressa pela lei da frequncia de erro [a distribuio normal]. Quando uma grande amostra de elementos caticos tomada em mos e organizada na ordem da sua magnitude, esta inesperada e maravilhosa forma de regularidade prova ter estado latente todo o tempo. A lei teria sido personificada pelos gregos se eles a tivessem conhecido. Ela reina com serenidade e completa discrio em meio confuso mais extrema. Quanto maiores a massa e a anarquia aparente, mais perfeito o seu movimento. a lei suprema da falta de lgica.
realmente impressionante considerar que o acaso puro e cego a razo para essa inesperada e maravilhosa forma de regularidade. Esse princpio muito til na prtica tambm. Computadores modernos podem gerar nmeros aleatrios distribudos uniformemente de vrios modos. (Em um grupo de nmeros randmicos uniformemente distribudos, a amostragem de um nmero to provvel como a de qualquer outro.) Um modo comum de gerar uma nica amostra de uma distribuio normal gerar 12 nmeros aleatrios uniformemente distribudos em um computador e simplesmente adicion-los! A base terica da distribuio normal conhecida na teoria da probabilidade como o teorema do limite central. De uma maneira geral, o teorema do limite central postula que a soma de um grande nmero de quantidades randmicas e independentes sempre iro convergir para a distribuio normal. Para as nossas finalidades, independente neste contexto significa que a informao sobre qualquer uma das observaes no melhora a habilidade de prever qualquer outra observao. Um grande nmero de quantidades randmicas independentes aparentemente o que Galton quis dizer com uma grande amostra de elementos caticos. O teorema do limite central explica em parte porque muitas caractersticas apresentando variao contnua seguem a distribuio normal. A maioria das caractersticas contnuas so multifatoriais, o que significa que elas so influenciadas por muitos fatores, tipicamente vrios ou muitos genes atuando junto de fatores ambientais. Entre os seres humanos, por exemplo, as diferenas bvias entre pessoas normais no que diz respeito cor de cabelo, cor de olhos, cor de pele, estatura, peso e outras caractersticas similares no so normalmente determinadas por genes nicos. Elas resultam de efeitos combinados de vrios ou muitos genes e tambm de diversos efeitos ambientais atuando em conjunto como uma grande amostra de elementos
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caticos, que frequentemente produzem, como uma resultante geral, uma distribuio normal de fentipos. Deve ser enfatizado que o grande nmero de elementos randmicos especificado no teorema do limite central no precisa ser excessivo. Como exemplo, a Figura 1.2 um grfico de barras de 100 observaes, em que cada observao consiste na soma de nove nmeros randmicos consecutivos escolhidos, com igual probabilidade, de qualquer lugar na faixa (1, +1). Para a soma de nove nmeros randmicos nessa faixa, a mdia terica igual a 0, e o desvio-padro terico igual a 1,73; os valores da amostra foram = 0,12 x e s = 1,70. Expressos como uma diferena da mdia em mltiplos do desviopadro, o nmero de observaes aparece na parte superior de cada barra na Figura 1.2. Visto que os nmeros esperados so 2,5, 13,5, 68, 13,5 e 2,5, o encaixe em uma distribuio normal obviamente muito bom. Nesse exemplo, portanto, menos de 10 elementos caticos, quando somados, produziram essa inesperada e maravilhosa forma de regularidade.
70 60 Nmero de observaes 50 40 30 20 10 0 3 3 2 1 +1 +2 14 13 1 +3 69
Desvio em relao mdia ( SE)
Figura 1.2 Distribuio de 100 valores da soma de nove nmeros randmicos amostrados do intervalo (1, +1).
Questo 1.1 Em uma Exposio Internacional sobre Sade em Londres, em 1884, Galton montou um laboratrio antropomtrico que realizou dezenas de milhares de medidas cobrindo uma ampla faixa de caractersticas humanas. Entre essas caractersticas estava a fora de puxada, expressa como o nmero de libras que uma pessoa podia puxar com um brao contra uma fora de resistncia, utilizando um sistema que simulava uma queda de brao (Galton, 1889). Os dados de 519 homens com idade entre 23 e 26 anos se encaixaram nas seguintes categorias (o nmero entre parnteses o nmero de homens em cada categoria): 40-50 libras (10), 50-60 (42), 60-70 (140), 70-80 (168), 80-90 (113), 90-100 (22), 100-110 (24). Utilizando o ponto central de cada categoria como a fora de puxada de todos os homens nessa categoria, estime a mdia e o desvio-padro dessa fora. Assumindo que essa fora possui uma distribuio normal com parmetros iguais a essas estimativas, qual a proporo esperada de homens cuja fora de puxada excede 112 libras?
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resposta Os valores de xi so 45, 55, 65 e assim por diante. Ento, fi = 519, fixi = 38.675 e fixi2 = 2.963.375. Logo, x = 74,5 libras, s2 = 156,8 libras2 e s = 12,5 libras. (As respostas podem divergir levemente em vistude de diferenas de arredondamento). Uma fora de puxada de 112 libras est trs erros-padro acima da mdia; logo, esperase que uma proporo de somente (1 0,997)/2 = 0,0015 (aproximadamente um em 667) homens possua um fentipo que exceda esse valor.
Variao mendeliana discreta

A variao mendeliana discreta (tambm chamada de variao mendeliana simples) refere-se a diferenas fenotpicas que resultam da segregao de alelos de um nico gene. Os efeitos ambientais na caracterstica so to pequenos, em relao a diferenas hereditrias, que a transmisso dos alelos que determinam essa variao pode ser acompanhada diretamente em heredogramas. Um exemplo de variao mendeliana discreta a herana de colorao de flor vermelha, rosa ou marfim na planta boca-de-leo, Antirrhinum majus (Figura 1.3). As bocas-de-leo, assim como os seres humanos, so organismos diploides que possuem duas cpias de cada cromossomo, uma herdada de cada genitor. Qualquer gene, portanto, possui um par no seu cromossomo equivalente. Cada uma das possveis formas de um gene (que diferem na sua sequncia de DNA) chamada de um alelo desse gene. Quando os dois alelos em um indivduo so indistinguveis, o gentipo desse indivduo considerado homozigoto (II ou ii na Figura 1.3), e, quando eles so diferentes, o indivduo considerado heterozigoto (nesse exemplo, Ii). Esse exemplo excepcionalmente conveniente para estudos genticos devido ao fentipo intermedirio do heterozigoto. O resultado da segregao dos alelos I e i claramente manifestado na proporo de 1:2:1 de plantas com flores vermelhas, rosas ou marfim. Populaes naturais raramente possuem fentipos complexos discretos que segregam de um modo mendeliano simples, como exemplificado pela colorao da flor em boca-de-leo. Nas populaes humanas, por exemplo, embora a herana mendeliana simples realmente seja aplicvel a muitas doenas hereditrias, cada uma dessas enfermidades individualmente muito rara. Exemplos incluem a fibrose cstica, a fenilcetonria, a anemia falciforme e a hemofilia. Visto que a maioria da variao fenotpica entre indivduos normais em populaes naturais multifatorial, o padro de herana dessas caractersticas no mostra evidncia clara de segregao mendeliana e nada que se parea com qualquer uma das propores numricas simples que Mendel descobriu originalmente nos seus experimentos de cruzamento de ervilhas. A ausncia dessas propores causou uma grande controvrsia no incio dos anos 1900, imediatamente aps a redescoberta do artigo de Mendel. De um lado, estavam os discpulos de Galton, chamados de biomtricos, que menosprezaram a significncia da descoberta de Mendel, alegando que os fatores segregantes postulados por aquele autor no s eram irrelevantes para caractersticas con-
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I/I Homozigoto II Vermelho
i/i Homozigoto ii Marfim
I/i Heterozigoto Ii Rosa
Autofecundao
Gametas masculinos
1 2 1 4
I Ii Rosa
1 4
1 2
II Vermelho
1 2
Gametas femininos
Ii Rosa
1 2
1 4
ii Marfim
1 4
Figura 1.3 Herana mendeliana simples da colorao da flor em boca-de-leo (Antirrhinum majus). A barra (p. ex., I/I) separa alelos em diferentes cromossomos, e, quando no existe ambiguidade, pode ser omitida. As flores homozigotas II so vermelhas, as flores homozigotas ii so marfim e as flores heterozigotas Ii so rosa. A cor resulta da concentrao de um pigmento vermelho, uma antocianina, nas clulas das ptalas. O exemplo um clssico ao mostrar diretamente o resultado da segregao mendeliana no cruzamento Ii x Ii.
tnuas, como tambm eram inadequados para explicar as correlaes observadas em caractersticas entre parentes. Do outro lado, estavam os chamados mendelianos, que argumentavam que a segregao de mltiplos genes e sua
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interao poderia explicar caractersticas contnuas to bem quanto caracteres discretos. A disputa acirrada entre os biomtricos e os mendelianos continuou por quase 20 anos. As implicaes da herana multifatorial de caractersticas discretas foram o foco de um artigo de 1918 de autoria do estatstico Ronald Aymler Fischer (1890-1962) intitulado The correlation between relatives on the supposition of Mendelian inheritance. O tipo de modelo subjacente anlise de Fisher discutido a seguir.
HERana MUltiFatORial
Fisher examinou um modelo matemtico de herana multifatorial e deduziu as correlaes esperadas entre parentes. Ele mostrou que os tipos de dados disponveis para caractersticas contnuas no s eram compatveis com a herana mendeliana, mas tambm eram previstos por ela. O espectro do modelo de Fisher mostrado na Figura 1.4, que ilustra a variao gentica esperada entre os descendentes de um cruzamento entre gentipos que so heterozigotos para cada um de trs genes no ligados. (Genes so considerados no ligados quando sofrem segregao independente um do outro, como se eles estivessem em cromossomos diferentes.) Os alelos dos genes so representados por A/a, B/b e C/c, e a variao gentica resultante da segregao e combinao independente fica evidente pelos graus variados de sombreamento. Se assumimos uma caracterstica em que cada alelo maisculo adiciona uma unidade ao fentipo e que o alelo minsculo no possui nenhum efeito, ento o gentipo aa bb cc possui um fentipo de 0 e o gentipo AA BB CC possui um fentipo de 6. Assim, existem sete fentipos possveis (0-6) entre os descendentes. A distribuio dos fentipos pode ser observada no grfico de barras na Figura 1.5. A curva contnua representa a distribuio normal que se aproxima dos dados, a qual possui uma mdia de 3 e uma varincia de 1,5. Na Figura 1.4, assumimos que toda a variao no fentipo resulta de diferenas no gentipo. Se existissem tambm fatores ambientais aleatrios afetando a caracterstica, com um nmero maior de genes, ento as barras na Figura 1.5 se tornariam menos distintas e se aproximariam ainda mais da distribuio normal. O resultado o teorema do limite central em ao, produzindo a lei suprema da falta de lgica de Galton. O modelo de Fisher era muito mais complexo do que aquele apresentado na Figura 1.4, permitindo diferenas nos efeitos dos alelos, diferenas na frequncia dos alelos, vrios tipos de relao de dominncia e os efeitos de fatores ambientais aleatrios. O trabalho foi pioneiro ao demonstrar que a variao contnua poderia ser explicada por mltiplos fatores mendelianos interagindo entre si. O modelo de Fisher era complexo para a sua poca, e o artigo, de difcil compreenso. Mesmo agora, no est claro que papel prtico o artigo de Fisher desempenhou no trmino da controvrsia entre os biomtricos e os mendelianos. No parece que muitas pessoas o tenham lido. (Um brincalho disse que se trata de um artigo que voc no deve ler a no ser que j o tenha
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abc abc
ABC ABC
abc ABC 1 8 ABC aBC AbC ABc abC aBc Abc abc abc Abc aBc abC ABc AbC aBC ABC 1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
1 8
Figura 1.4 Resultado da segregao de trs pares independentes de alelos afetando a mesma caracterstica. Assume-se que cada alelo indicado por letra maiscula contribui em uma unidade para o fentipo. Os fentipos possuem uma faixa entre 0 e 6 e, no cruzamento entre heterozigotos triplos, so formados nas propores 1:6:15:20:15:6:1.
lido antes.) Por outro lado, ele o artigo fundamental que marcou a reconciliao das teorias de Galton e de Mendel.
ManUtEnO Da VaRiaO GEntica
Visto que a teoria de Darwin da evoluo por meio da seleo natural requer a presena de variao gentica entre indivduos, geneticistas de po-

20 64 15 64
31
6 64 1 64
Figura 1.5 Distribuio dos fentipos gerados no cruzamento ilustrado na Figura 1.4 e a distribuio normal que se aproxima dos dados. A curva normal possui uma mdia de 3 e uma varincia de 1,5.
pulaes tm se interessado neste assunto desde que o campo surgiu no incio dos anos 1900. As questes principais eram a magnitude das diferenas de gentipo entre indivduos e os processos pelos quais a variao gentica era mantida de uma gerao outra. Como os genes subjacentes a caractersticas multifatoriais no so revelados pela segregao em heredogramas, estudos iniciais de populaes estavam restritos a examinar casos especiais de variao discreta. Exemplos clssicos incluem a variao de cor ou padro dentro de populaes de flores, insetos ou caracis; variao em grupos sanguneos de humanos devido a diferenas em carboidratos antignicos presentes na superfcie das hemcias e reconhecidos por anticorpos proteicos do sistema imune; e variao em cromossomos de Drosophila causada por inverses que podiam ser detectadas estudando os cromossomos gigantes presentes nas glndulas salivares das larvas. Cada um desses exemplos gerou importantes concluses sobre processos evolutivos, mas todos eram to diferentes que nenhum pode ser generalizado. Cada sistema tambm apresentava um possvel vis devido a efeitos de diferenas no gentipo sobre o valor adaptativo relativo dos organismos. Dentro de suas limitaes, os resultados foram interpretados de maneira variada para dar apoio a um ou outro de dois modelos distintos propostos para explicar a abundncia e a manuteno da variao gentica. Um ponto de vista, chamado de hiptese clssica, afirmava que a variao gentica era incomum e era composta em grande parte por alelos mutantes deletrios mantidos na populao por um equilbrio entre mutaes deletrias recorrentes e seleo negativa. O outro modelo, chamado de hiptese do equilbrio, postulava que a variao gentica era abundante e mantida por seleo que favorecia ou os gentipos heterozigticos ou os gentipos raros. Na hiptese clssica, a maioria da variao gentica era ruim; na hiptese do equilbrio, era predominantemente boa. Cada lado cedeu algum espao para o outro a viso clssica admitindo a existncia de alguns casos de seleo balanceadora e a viso do equilbrio admitindo a existncia de mutaes deletrias. Nesse meio tempo, ambas as hipteses no se deram conta de outra alternativa importante a
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de que uma boa parte da variao gentica em populaes naturais possa ter pouco ou nenhum efeito significativo sobre o valor adaptativo do organismo, um modelo que mais tarde ficou conhecido como a teoria da neutralidade.
GEntica DE POPUlaES MOlEcUlaR
A hiptese clssica e a hiptese de equilbrio sentaram-se mesa se olhando de maneira pouco amistosa ao longo da maior parte das dcadas de 1950 e 1960. As diferenas no podiam ser resolvidas sem um mtodo livre de vis para estudar a variao gentica que pudesse ser amplamente aplicado a um grande nmero de genes em diversos organismos. Esse mtodo finalmente se tornou possvel com o estudo direto dos genes e de seus produtos utilizando tcnicas descritas nesta seo, mas ele veio com o preo de desconectar o gentipo do fentipo. Visto que os mecanismos de transcrio, processamento de RNA e traduo so relativamente livres de interaes gnicas e de efeitos ambientais, a correspondncia entre sequncias de DNA e alelos um para um: alelos diferentes possuem sequncias diferentes de DNA, independentemente de esses alelos afetarem ou no o fentipo. Da mesma forma, alelos que diferem na regio codificante da protena podem resultar em diferentes sequncias de aminocidos, independentemente do que a protena faz no metabolismo ou de como essa diferena na sequncia afeta o organismo. O estudo das molculas , portanto, um modo eficiente de detectar variao mendeliana simples e nisso se estabelece um paradoxo. Como bilogos evolutivos, os geneticistas de populaes esto interessados em fentipos observveis que esto provavelmente sujeitos seleo natural: morfologia, taxa de desenvolvimento, comportamento reprodutivo, idade de reproduo, longevidade e assim por diante (em resumo, os tipos de caractersticas que atraram Galton). Por outro lado, os estudos genticos so os mais facilmente desenvolvidos por meio da deteco de diferenas entre molculas resultantes de herana mendeliana simples. O paradoxo que as diferenas em molculas entre organismos saudveis no so normalmente relacionadas de qualquer maneira bvia a diferenas no fentipo. Assim, existe uma lacuna ao no se poder especificar exatamente que tipos de diferenas moleculares esto por trs do processo evolutivo. A ironia da situao similar quela descrita pelo fisiologista Albert Szent-Gyorgyi:
A minha prpria vida cientfica foi uma descida de dimenses altas para baixas, conduzidas pelo desejo de entender a vida. Fui de animais a clulas, de clulas a bactrias, de bactrias a molculas, de molculas a eltrons. A histria teve a sua ironia, porque molculas e eltrons no possuem vida. No meu caminho, a vida escapou entre os meus dedos.
O descompasso entre gentipo e fentipo resulta de interaes complexas entre genes e ambiente na determinao da fisiologia, do desenvolvimento e do comportamento. Na biologia evolutiva, a complexidade ainda maior porque o elemento-chave a habilidade relativa dos organismos de sobreviver e se reproduzir nos seus ambientes. No entanto, a desconexo entre diferen-
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as em molculas e adaptaes evolutivas no de modo algum inevitvel, permanente ou intransponvel. J est claro que o estudo da relao entre a variao gentica e a adaptao evolutiva deve ser priorizado na agenda da biologia evolutiva, e j existem muitos exemplos nos quais essas relaes j esto bem estabelecidas.
Eletroforese
Mtodos novos e melhores para o estudo de macromolculas so criados continuamente, sobretudo para DNA e protenas. Quase to rpido quanto eles aparecem, os geneticistas de populaes tm aplicado esses mtodos aos estudos de variao gentica em populaes naturais. Embora existam muitos desses procedimentos experimentais que diferem em uma gama de detalhes, a maioria dos mtodos se baseia em novas combinaes de uns poucos princpios simples. Um dos princpios mais aplicados ao estudo de macromolculas a eletroforese, na qual as macromolculas em soluo se movem em resposta a um campo eltrico (Smithies, 1954, 1995; Shaw, 1965; Lewontin e Hubby, 1966). A eletroforese pode ser utilizada para separar as molculas de protenas ou de cidos nucleicos. O material de apoio que segura as macromolculas geralmente um tipo de gel que pode estar na forma de uma prancha horizontal, ou comprimido verticalmente entre duas placas de vidro, ou em um cilindro contido entre as paredes de um tubo plstico ou de vidro. Lados opostos do gel fazem contato com uma soluo tampo e com eletrodos. Cada amostra do material contendo as macromolculas a serem separadas colocada em um dos lados da prancha ou do tubo, e uma corrente eltrica aplicada ao gel por vrias horas. As molculas nas amostras geralmente protenas ou cidos nucleicos so os alvos de maior interesse se movem atravs do gel em resposta ao campo eltrico. Molculas de tamanho e carga diferentes se movem em taxas diferentes. Molculas de DNA de fita dupla se movem primariamente em relao ao seu tamanho, enquanto as molculas de protena se movem primariamente em relao sua carga inica e tambm ao seu tamanho. Depois de terminada a eletroforese, as posies da molcula ou das molculas de interesse so reveladas por qualquer um de vrios procedimentos. Um conjunto tpico de laboratrio para eletroforese de protenas ilustrado na Figura 1.6. A eletroforese de protenas utilizada primariamente para estudar molculas de enzima, e a posio na qual uma enzima particular migra revelada ao mergulhar o gel em uma soluo contendo um substrato para a enzima juntamente a um corante que precipitado onde ocorre a reao catalisada pela enzima. Dessa forma, uma banda escura aparece no gel na posio da enzima. Se a enzima presente em uma amostra possui uma mudana de aminocido que resulta em uma diferena na carga inica total da molcula, ento a enzima apresentar uma alterao da mobilidade eletrofortica e ir se mover a uma taxa diferente. A mobilidade eletrofortica muda porque as enzimas de mesmo tamanho e forma se movem a uma taxa determinada em grande parte pela razo entre o nmero de aminocidos carregados positivamente (em
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daniel l. Hartl & andrew g. clark Bandas (visveis aps tratamento adequado)
Poos para amostras Gel
Soluo tampo Eletrodo
Direo do movimento
Fonte de energia
Figura 1.6 Um tipo de aparato de laboratrio para eletroforese. O procedimento amplamente utilizado para separar molculas de protena ou DNA. Em gis convencionais, fragmentos de DNA menores do que cerca de 20 kb (1 kb = 1.000 pares de bases nucleotdicas) migram aproximadamente em proporo ao logaritmo dos seus pesos moleculares.
especial lisina, arginina e histidina) e o nmero de aminocidos carregados negativamente (em especial o cido asprtico e o cido glutmico). A eletroforese pode, portanto, ser utilizada para detectar uma mutao que resulta em uma diferena na mobilidade eletrofortica da enzima que ela codifica. Um resultado possvel de um experimento de eletroforese ilustrado na Figura 1.7A, na qual todas as amostras mostram uma enzima com a mesma mobilidade eletrofortica. O resultado indica uma amostra monomrfica porque existe apenas um padro eletrofortico observado. Outro tipo de resultado mostrado na Figura 1.7B, na qual um polimorfismo observado nos
(A) Amostra monomrfica
(B) Amostra polimrfica
Figura 1.7 Monomorfismo e polimorfismo. (A) Gel hipottico mostrando monomorfismo de uma protena. Todas as amostras possuem uma enzima com a mesma mobilidade eletrofortica. (B) Gel hipottico mostrando polimorfismo de aloenzimas. Oito amostras so homozigotas para um alelo (F) que codifica uma enzima que migra rapidamente; duas amostras so homozigotas para um alelo diferente (S) que codifica uma enzima que migra vagarosamente; e seis amostras so heterozigotas (F/S) e, portanto, exibem bandas enzimticas correspondendo a ambos os alelos.
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tipos de padres eletroforticos. Quando bandas enzimticas polimrficas so observadas, testes genticos indicam tipicamente que organismos com apenas uma enzima que migra rpido so homozigotos para o alelo rpido (fast) (F/F) e aqueles com somente uma enzima que migra devagar so homozigotos para o alelo lento (slow) (S/S). Organismos com os dois tipos de bandas so heterozigotos para estes alelos (F/S). A herana mendeliana simples do polimorfismo indicada, por exemplo, pela observao de que cruzamentos entre dois 1 1 1 heterozigotos produzem em mdia descendentes de F/F, F/S e S/S. 4 2 4 Duas bandas enzimticas aparecem nos heterozigotos nas situaes em que a enzima ativa consiste em uma nica cadeia polipeptdica (em vez de duas ou mais cadeias polipeptdicas agrupadas juntas), porque os heterozigotos produzem uma cadeia polipeptdica diferente a partir de cada alelo.
Frequncias allicas e frequncias genotpicas

Enzimas que diferem na mobilidade eletrofortica como resultado de uma diferena allica em um nico gene so chamadas de aloenzimas. Portanto, a variao de aloenzimas em uma populao normalmente uma indicao de variao gentica mendeliana simples. Como veremos mais adiante neste captulo, a variao em aloenzimas comum em quase todas as populaes naturais estudadas por eletroforese, incluindo organismos como bactrias, plantas, Drosophila, camundongos e seres humanos. Para ilustrar como os dados de gentica de populao so analisados, considere uma populao que possui um polimorfismo de aloenzima com os alelos F e S em diferentes frequncias. Por frequncia allica, entendemos a proporo de todos os alelos do gene que so de um tipo especfico. Suponha que efetuamos a eletroforese da enzima em uma amostra de 400 membros de uma populao e encontramos 165 F/F, 190 F/S e 45 S/S (Aqui, utilizamos a barra para separar o smbolo de cada alelo; se no existe ambiguidade, a barra opcional). Nessa amostra, os nmeros observados dos alelos F e S so, portanto: F: 2 165 + 190 = 520 S: 190 + 2 45 = 280 Os fatores de 2 so includos para os gentipos homozigotos, pois cada gentipo FF possui dois alelos F, e cada gentipo SS possui dois alelos S. O nmero total de alelos na amostra igual a 2 400 = 800. Portanto, se p representa a frequncia do alelo F e q representa a frequncia do alelo S (com p + q = 1 porque esses so os nicos alelos do gene em questo), ento podemos estimar p e q da observao como: p: 520/800 = 0,650 q: 280/800 = 0,350
^ ^
Para propores como essas, os erros-padro das frequncias allicas estimadas so dados por ( pq / n), onde n o nmero de alelos
^ ^
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na amostra. Nesse caso, o erro-padro de ^ (e tambm o de ^) igual a p q (0, 650 0, 350 / 800) = 0, 0169. Note que, se os alelos F e S estiverem combinados de maneira aleatria (com independncia) em gentipos, as frequncias esperadas de trs gentipos podem ser calculadas por multiplicao como p2 FF, 2pq FS e q2 SS. Portanto, assumindo uma combinao randmica em gentipos, os nmeros esperados dos trs gentipos so: FF: (0,35)2 400 = 169 FS: 2 0,65 0,35 400 = 182 SS: (0,35)2 400 = 49 Ento, os nmeros observados nessa populao hipottica so muito parecidos com aqueles esperados em uma combinao randmica de alelos. As propores p2, 2pq e q2 para os trs gentipos quando dois alelos so combinados aleatoriamente constituem o princpio de Hardy-Weinberg, que um dos princpios bsicos de gentica de populaes. O princpio de Hardy-Weinberg discutido em detalhes no Captulo 2.
Questo 1.2 Suponha que uma amostra aleatria de 400 indivduos de uma populao diferente inclua 185 gentipos F/F, 150 F/S e 65 S/S. Estime a frequncia allica p de F e q de S. Assumindo combinaes aleatrias de alelos nos gentipos, que nmeros dos trs gentipos so esperados? Os dados observados correspondem s expectativas?
resposta Em um total de 800 alelos, o nmero observado de alelos F 2 185 + 150 = 520 e de alelos S ^ 150 + 2 65 = 280. Portanto, ^ = 520/800 = 0,65 e q = 280/800 = 0,35. Observe que as frequnp cias allicas estimadas so as mesmas do exemplo anterior, mesmo os nmeros dos gentipos observados sendo diferentes. Com combinaes aleatrias de alelos nos gentipos, os nmeros esperados so novamente 169 F/F, 182 F/S e 49 S/S. Em comparao com os nmeros observados, parecem existir muitos gentipos homozigotos e muito poucos gentipos heterozigotos. Um mtodo estatstico para decidir se a aderncia ou no satisfatria ser discutido no Captulo 2.
Polimorfismo e heterozigosidade
O polimorfismo de um gene em uma amostra usualmente de interesse apenas se ele indicar o polimorfismo do gene na populao como um todo. Em uma populao, um gene polimrfico um gene para o qual a maioria dos
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alelos comuns possui uma frequncia de menos de 0,95. Em termos prticos, para um gene com dois alelos, essa definio sugere que uma amostra aleatria possuindo apenas 11 indivduos de uma populao com frequncia de gentipos de Hardy-Weinberg (p2, 2pq e q2) incluiria pelo menos um gentipo heterozigoto, porque 2 0,05 0,95 11 = 1. As frequncias observadas de gentipos heterozigotos para os genes codificadores de enzima variam amplamente, mas em geral esto ao redor de 15% em invertebrados e 7% em vertebrados (Figura 1.8). O corte em 0,95 arbitrrio, mas serve para focar a ateno naqueles genes em que a variao allica comum. Em qualquer populao grande, alelos raros so observados para praticamente todos os genes. Um alelo considerado raro se a sua frequncia menor do que 0,005; em humanos, entre uma e duas pessoas em mil so heterozigotas para alelos raros de qualquer gene. Muitos alelos raros so deletrios e so provavelmente mantidos na populao por mutaes recorrentes. A definio de polimorfismo uma tentativa de focar em genes que possuem alelos com frequncias muito altas para serem explicadas apenas por mutaes recorrentes para alelos deletrios. Com a definio de polimorfismo de 0,95 dada acima, e se os alelos so combinados aleatoriamente em gentipos, ento aproximadamente 10% de uma populao com frequncias de Hardy-Weinberg heterozigota para a maioria dos alelos comuns, pois 2 0,95 0,05 = 0,095 10%.
Polimorfismos de aloenzimas
A Figura 1.8 resume os resultados de amostragens eletroforticas de 14 a 71 genes (a maioria ao redor de 20) em populaes de 243 espcies. Cada ponto na figura mostra o tipo de organismo estudado e o nmero de espcies examinadas. O eixo com a legenda Polimorfismo refere-se proporo estimada de genes que so polimrficos pelo critrio 0,95. O eixo com a legenda Heterozigosidade refere-se mdia de heterozigosidade em cada grupo. A mdia de heterozigosidade a proporo estimada de genes heterozigotos em um organismo mdio; ela estimada como a proporo de gentipos heterozigotos para cada gene dividido por todos os genes. Por exemplo, os dados dos europeus incluem uma populao inglesa na qual 10 genes de enzima foram examinados (Harris, 1966). Desses 10 genes, trs eram polimrficos, dos quais a proporo estimada de genes polimrficos no genoma 3/10 = 0,30. A proporo observada de gentipos heterozigotos para cada um dos trs genes polimrficos foi 0,509 (para a fosfatase cida dos glbulos vermelhos), 0,385 (para a fosfoglucomutase) e 0,095 (para a adenilato-quinase); a mdia de heterozigosidade nessa amostra levando em conta que a heterozigosidade observada dos sete genes adicionais foi 0 , portanto, (0,509 + 0,385 + 0,095 + 7 0)/10 = 0,099. Uma amostragem eletrofortica mais ampla de 104 genes de uma amostra incluindo todas as principais raas humanas apresentou estimativas de polimorfismo de 0,32 e heterozigosidade de 0,06 (Harris et al., 1977). As barras verticais e horizontais no ponto correspondente a Drosophila indicam o tamanho do erro-padro estimado. As barras indicam os limites de
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0,60 0,55 0,50 0,45 Polimorfismo 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0
Insetos (23) (excluindo Drosophila) Invertebrados (27) (excluindo insetos) Humanos (europeus, 71 lcus) Rpteis (17) Aves (7) Drosophila (43) Todos os invertebrados (93) Anfbios (13) Plantas (15) Todos os vertebrados (135) Peixes (51)
Mamferos (46) 0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Heterozigosidade
Figura 1.8 Nveis estimados de heterozigosidade e proporo de genes polimrficos derivados de estudos de aloenzimas em vrios grupos de plantas e animais. A curva demonstra a relao teoricamente esperada sob a suposio duvidosa de que toda a variao de aloenzima seletivamente neutra. O nmero de espcies estudadas mostrado entre parnteses ao lado de cada ponto. Os quadrados mostram mdias para plantas, invertebrados e vertebrados. As barras que cruzam o ponto de Drosophila indicam o erro-padro no qual aproximadamente 68% das espcies devem estar. Outros grupos possuem similarmente grandes erros-padro. (Dados de Nevo, 1978.)
polimorfismo e heterozigosidade dentro dos quais aproximadamente 68% das espcies so esperadas a se encontrar. Entre as espcies de Drosophila, aproximadamente 68% possui uma proporo de genes polimrficos na faixa entre 0,30 e 0,56 e uma mdia de heterozigosidade na faixa entre 0,09 e 0,19. Se essas barras fossem colocadas em cada ponto, os seus tamanhos seriam comparveis com aqueles de Drosophila, indicando uma variabilidade substancial no polimorfismo e na heterozigosidade entre as espcies e dentro dos grupos. A Figura 1.8 indica uma relao positiva entre a quantidade de polimorfismo e o grau de heterozigosidade. Esta relao a esperada, pois quanto maior a frao de genes polimrficos em uma populao, mais genes so esperados serem heterozigotos em mdia. Considere uma populao idealizada na qual cada nova mutao codifica uma protena cuja mobilidade eletrofortica distinta de todas as outras presentes na populao e na qual cada novo alelo mutante seletivamente neutro (ou seja, possui efeitos desprezveis na sobrevivncia e na reproduo). Devido a mutaes recorrentes, os alelos em uma populao se modificam ao longo do tempo, com alguns sendo perdidos e outros se tornando polimrficos. Nessas condies, e restringindo nossa ateno a genes autossmicos em espcies diploides, a proporo esperada de lcus polimrficos P dada por ln[1P] = ln(0,05) 3 (1.4)
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(Kimura e Ohta, 1971), onde = 4N o produto do tamanho da populao (N) e da taxa de mutao () por gene e por gerao. (O smbolo ln refere-se ao logaritmo na base e). O valor 0.05 surge da definio de polimorfismo na qual a frequncia do alelo mais comum menor do que 0,95, pois 0,05 = 1 0,95. De acordo com as mesmas suposies, a magnitude esperada de heterozigosidade (H) pode ser igual a (1.5) H= 1+ (Kimura & Crow, 1964). Consequentemente, para genes em uma populao ideal sofrendo sucessivas mutaes neutras, a relao esperada entre a heterozigosidade e o polimorfismo pode ser obtida eliminando entre as Equaes 1.4 e 1.5, com o resultado de ln[1 P ] = 3 H 1 H (1.6)
Essa a relao mostrada pela curva na Figura 1.8. A mdia geral de polimorfismo na Figura 1.8 0,26 0,15, e a mdia de heterozigosidade 0,07 0,05. Os vertebrados possuem a menor mdia de variao gentica entre os grupos da Figura 1.8, as plantas vm a seguir, e os invertebrados possuem a maior mdia de variao. Drosophila o grupo de organismos com maior variabilidade gentica estudado at agora, e os mamferos, o menos varivel. Os seres humanos so tpicos de grandes mamferos. Uma concluso bvia que pode ser tirada da Figura 1.8 que os polimorfismos de aloenzimas esto amplamente presentes entre organismos superiores. A variao gentica ainda mais prevalente entre alguns procariotos. Por exemplo, isolados naturais da bactria Escherichia coli do intestino de mamferos exibem nveis de polimorfismos genticos 2 a 3 vezes mais altos do que os vertebrados (Selander et al., 1987). Embora os polimorfismos genticos estejam difundidos, eles no so universais. Por exemplo, as duas maiores subespcies de guepardo Acinonyx jubatus so praticamente monomrficas (OBrien et al., 1987). Uma amostragem de 49 enzimas entre 30 animais da subespcie do leste africano (A. j. raineyi) resultou em somente dois genes polimrficos e em estimativas de polimorfismo de 0,04 e de heterozigosidade de 0,01; entre 98 animais da espcie sul-africana (A. j. jubatus), a estimativa de polimorfismo foi de 0,02 e de heterozigosidade de 0,0004. O resultado mais impressionante foi a no rejeio de um enxerto de pele entre guepardos de populaes no relacionadas da subespcie sul-africana. A no rejeio de enxerto significa que a populao de guepardos monomrfica para os principais locos de histocompatibilidade que iniciam a rejeio de enxertos, lcus que so altamente polimrficos em outros mamferos. Aparentemente, os guepardos, que eram distribudos mundialmente no passado, mas que agora totalizam menos de 20.000 animais, sofreram pelo menos duas constries severas no nmero populacional, resultando na perda da maioria da sua variabilidade gentica.
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inferncias a partir de polimorfismos de aloenzimas

A generalidade de estimativas de polimorfismos com base em eletroforese , de algum modo, incerta (Lewontin, 1974b, 1991). A quantidade de polimorfismo pode ser subestimada, porque a eletroforese no detecta substituies de aminocidos. Por exemplo, em um estudo de 14 protenas de mioglobinas de vrias espcies, incluindo cetceos (baleias, golfinhos e toninhas), no mximo 8 puderam ser distinguidas por eletroforese convencional; no entanto, 13 puderam ser distinguidas quando o pH do tampo de eletroforese foi modificado (McLellan e Inouye, 1986). Algumas substituies de aminocidos podem ser detectadas, pois elas deixam a enzima sensvel a altas temperaturas; um teste de sensibilidade para a temperatura aumentou o nmero de alelos identificados do gene que codifica a xantina-desidrogenase em Drosophila pseudoobscura de 6 para 37 e aumentou a estimativa mdia de heterozigosidade de 0,44 para 0,73 (Singh et al., 1976). Por outro lado, embora tcnicas mais elaboradas revelem alelos adicionais de genes reconhecidamente polimrficos, aumentando assim as estimativas de heterozigosidade, genes classificados como monomrficos por eletroforese de rotina tendem a permanecer monomrficos, fazendo com que as estimativas de polimorfismo permaneam mais ou menos as mesmas. Amostragens eletroforticas podem tambm superestimar a quantidade de polimorfismos, pois as enzimas tipicamente amostradas so aquelas encontradas em concentraes relativamente altas nos tecidos ou fluidos corporais (enzimas do Grupo I) e frequentemente no possuem a especificidade para um substrato alta como as enzimas envolvidas em processos metablicos centrais (enzimas do Grupo II). Por exemplo, entre 10 enzimas do Grupo I e 11 enzimas do Grupo II em Drosophila, as estimativas de polimorfismo e heterozigosidade foram 0,70 e 0,24 para o primeiro grupo e 0,27 e 0,04 para o segundo grupo (Gillespie e Langley, 1974). Em resumo, a eletroforese de protenas um mtodo conveniente para a deteco de polimorfismos, mas difcil extrapolar resultados de amostragens eletroforticas para o genoma inteiro, porque as enzimas talvez no sejam representativas. Os altos nveis de polimorfismo observados para aloenzimas imediatamente pem em dvida a hiptese clssica. Essa hiptese postula que a variao gentica consiste amplamente em alelos altamente deletrios que so mantidos por mutao recorrente. A hiptese clssica prev que os polimorfismos de aloenzimas devem ser raros, enquanto a Figura 1.8 indica que eles so comuns. Alm dessas estimativas de magnitude de polimorfismo e heterozigosidade, outros dados tambm colocam em dvida a hiptese alternativa do equilbrio. A hiptese do equilbrio postula que a variao gentica deve ser comum porque mantida tanto pela seleo que favorece os gentipos heterozigotos quanto pela seleo que favorece os gentipos raros. Esse tipo de seleo prev fortes efeitos altamente deletrios de endocruzamento (cruzamento entre parentes prximos), mas os efeitos de endocruzamento observados de fato so relativamente brandos. O aparente ajuste entre os dados da Figura 1.8 e a curva terica de neutralidade da Equao 1.6 pode ser visto como um apoio para a teoria da neutralidade, mas os dados escondem vrias complicaes. Alguns genes individuais
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demonstram muita heterozigosidade para o seu nvel de polimorfismo, enquanto outros genes apresentam muito pouca heterozigosidade. Anlises mais refinadas de sequncias de DNA de alelos de genes individuais utilizando mtodos estatsticos discutidos nos Captulos 4 e 7 mostram que a Figura 1.8 apresenta um desenho pintado com um pincel muito largo. Entre os diversos lcus representados, em alguns, a maioria dos alelos polimrficos parece ser levemente deletria, em outros, os polimorfismos parecem ser mantidos por alguma forma de seleo, e ainda outros no mostram um desvio claro dos padres esperados, sendo os alelos polimrficos seletivamente neutros ou quase neutros.
POliMORFiSMOS EM SEqUnciaS DE Dna
A eletroforese tambm um dos carros-chefe para o estudo da variao gentica em sequncias de DNA, porque as molculas de DNA so carregadas negativamente e, portanto, iro se mover em um campo eltrico. Embora os procedimentos-padro de purificao de DNA em geral separem aleatoriamente as molculas de DNA de fita dupla em fragmentos de aproximadamente 50 kb (1 kb = 1.000 pares de nucleotdeos), vrios mtodos podem ser utilizados para produzir fragmentos de tamanhos especficos.
Enzimas de restrio
Os fragmentos de DNA de um tamanho especfico podem ser produzidos por meio de qualquer enzima de uma classe chamada de enzimas de restrio, que cortam o DNA de fita dupla onde exista uma sequncia curta, particular de nucleotdeo chamada de stio de enzima de restrio. Visto que esses locais de corte so altamente especficos, o tamanho de qualquer fragmento de DNA produzido determinado pela distncia entre stios de restrio adjacentes. Exemplos de enzimas de restrio e de seus stios adjacentes so apresentados na Figura 1.9, onde os cortes so feitos nas posies das setas. Por exemplo, a enzima AluI corta nos stios da sequncia de quatro nucleotdeos 5-AGCT-3, e a EcoRI corta no stio de seis sequncias de nucleotdeo 5-GAATTC-3. A sequncia de nucleotdeos de somente uma fita de DNA precisa ser especificada, pois, no DNA de fita dupla, o nucelotdeo A pareia com o T, e o nucleotdeo G pareia com o C. Os smbolos 5 e 3 so utilizados para indicar a polaridade (da esquerda para a direita) das fitas. No DNA de fita dupla, cada fita possui uma polaridade oposta outra, desse modo a sequncia 5-GAATTC-3 pareada com a sequncia 3-CTTAAG-5. Como ilustrado na Figura 1.9, a maioria das enzimas de restrio utilizadas em estudos populacionais possui stios de restrio compostos de 4 ou 6 nucleotdeos. Devido ocorrncia de stios de clivagem especficos, a digesto do DNA genmico com uma enzima de restrio gera um conjunto de fragmentos de diferentes tamanhos, de acordo com as distncias entre stios de restrio adjacentes. Esses fragmentos so separados por tamanho por meio da eletroforese, e qualquer fragmento de interesse identificado como ilustrado na
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daniel l. Hartl & andrew g. clark Enzima de restrio AluI Stio de restrio 5 AGCT3 3 TCGA5
HahI
5 GCGC3 3 CGCG5
HaeIII
5 GGCC3 3 CGCG5
EcoRI
5 GAATTC3 3 CTTAAG5
BamHI
5 GGATCC3 3 CCTAGG5
XhoI
5 CTCGAG3 3 GAGCTC5
Figura 1.9 Enzimas de restrio cortam as molculas de DNA em stios especficos de sequncias de nucleotdeos curtas. Mais de 500 enzimas de restrio diferentes esto disponveis comercialmente. Elas so as ferramentas essenciais na anlise de DNA e na clonagem de genes. O stio de clivagem em cada fita de DNA indicado pelas setas.
Figura 1.10. Visto que os nucleotdeos das fitas complementares podem parear uns com os outros, um pedao de fita simples de DNA pode parear com a regio complementar de uma fita em uma molcula de fita dupla, desde que as fitas da molcula de fita dupla sejam primeiro separadas quimicamente ou por calor. O pequeno pedao de um DNA de fita nica geralmente chamado de sonda. Uma sonda pode apresentar um tamanho que varia entre 24 e
(A) Marcao Sonda (B) Sonda pareada com a sequncia complementar (A T, G C)
Fragmento de DNA de fita dupla
Fitas separadas
Figura 1.10 As sondas de cidos nucleicos baseiam-se no princpio de que fitas individuais com sequncias de nucleotdeos complementares e de tamanho adequado podem formar molculas de fita dupla estveis. (A) Uma sonda que possui exatamente a mesma sequncia de nucleotdeo (regio em preto) que uma das fitas da molcula de DNA de fita dupla. (B) Se as fitas de DNA so separadas e so colocadas juntas novamente, na presena de um excesso de sondas, a fita complementar ir sofrer hibridao preferencial com a sonda do que com o seu parceiro original.
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milhares de nucleotdeos e geralmente marcada para emitir fluorescncia, luz visvel ou sofrer perda de radioatividade. A marcao pode ser aderida a uma extremidade da molcula como demonstrado na Figura 1.10A, ou pode ser incorporada em nucleotdeos individuais ao longo da sonda. Uma sonda curta como a mostrada na Figura 1.10 no funcionaria porque o pareamento de regies muito curtas facilmente quebrado por movimento trmico. O diagrama, no entanto, ser suficiente para mostrar que uma sonda de DNA (ou RNA) de tamanho adequado ir hibridizar com a sua sequncia complementar (ou quase complementar) em qualquer fita de DNA (ou RNA). Como demonstrado pelo sombreamento na Figura 1.10B, em geral uma sonda ir parear com somente uma fita ao longo de um pedao de DNA de fita dupla, porque a sequncia-base na mesma regio da outra fita idntica e, portanto, no estar apta a parear com a sequncia na sonda. A hibridizao de um fragmento de restrio com uma sonda o princpio bsico do procedimento de Southern blot ilustrado na Figura 1.11. Os fragmentos de restrio de DNA que foram separados por eletroforese so mantidos em fita nica quando colocados em uma soluo de hidrxido de sdio e depois marcados em um filtro de nilon ou celulose onde sofrero um tratamento qumico para se ligarem a esse filtro (Figura 1.11A). O filtro ento banhado com uma soluo de DNA com sondas marcadas (parte B). A soluo esfria, a sonda de pedaos de DNA forma molculas de fita dupla com as suas sequncias complementares no filtro, e uma lavagem cuidadosa retira toda a sonda de DNA que no foi pareada. O filtro colocado entre filmes fotogrficos onde a emisso de luz ou a desintegrao radioativa da sonda adicionada resulta em bandas visveis (parte C). As diferenas genticas resultantes da presena ou da ausncia de stios de restrio podem ser identificadas porque elas modificam o comprimento caracterstico dos fragmentos de restrio. Um exemplo ilustrado na Figura 1.12.
Gel
Filtro
Fragmentos de restrio de DNA (A) Marcao
(B) Filtro de hibridizao com sondas radioativas ou que emitem luz. (Bandas pretas no so visveis neste estgio.)
(C) Filme fotogrfico exposto ao filtro. Bandas pretas aparecem no filme.
Figura 1.11 Procedimento de Southern blot. (A) Os fragmentos de DNA separados por eletroforese so transferidos e aderidos quimicamente a um filtro. (B) O filtro misturado com sondas marcadas de DNA que hibridizam e se aderem a molculas homlogas de DNA no filtro. (C) Depois de uma lavagem, o filtro exposto a um filme fotogrfico que desenvolve bandas pretas causadas pela emisso de luz ou radiao das sondas.
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daniel l. Hartl & andrew g. clark Stios de restrio AA Aa aa
DNA em cromossomos homlogos
Sonda de DNA
Bandas de DNA
Figura 1.12 Polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrio (RFLPs) resultam da presena ou da ausncia de stios particulares de restrio no DNA. Nesse exemplo, a molcula de DNA designada A possui trs stios de restrio, e a protena chamada de a possui quatro. Os gentipos AA, Aa e aa produzem um padro de bandas diferente em um Southern blot utilizando a sonda de DNA indicada.
A parte superior de cada desenho mostra a localizao dos stios de restrio nas molculas de DNA em um gentipo diploide. A molcula tipo a possui um stio de restrio adicional que no est presente na molcula tipo A. A parte de baixo da figura demonstra que, com uma sonda de DNA adequada, os trs gentipos podem ser distinguidos pelo seu padro de fragmentos de restrio. Uma diferena no tamanho de um fragmento de restrio encontrado segregando em populaes naturais chamado de polimorfismo de tamanho de fragmento de restrio, ou RFLP. Visto que os RFLPs so abundantes nos genomas da maioria dos organismos, eles tm sido utilizados para estudar a variao gentica nas sequncias de DNA em populaes naturais.
Reao em cadeia da polimerase

A reao em cadeia da polimerase (PCR) resulta na amplificao de fragmentos especficos de DNA. A PCR de grande utilidade em gentica de populaes, tanto para a produo de uma sonda de DNA quanto para a determinao direta da quantidade de sequncias de nucleotdeos presentes nas populaes naturais. O mtodo resumido na Figura 1.13. A sequncia de DNA original a ser amplificada mostrada em preto, e as novas fitas de DNA sintetizadas so mostradas em cinza. Os pequenos crculos representam sequncias curtas de DNA de fitas simples (oligonucleotdeos) quimicamente sintetizadas que so complementares em sequncia s extremidades da regio a ser amplificada. Os oligonucleotdeos so chamados de primers porque eles pareiam com as fitas complementares nas extremidades da sequncia a ser amplificada e so utilizados como iniciadores para o alongamento da cadeia pela DNA-polimerase. Os oligonucleotdeos iniciadores possuem um tamanho tpico de 20 a 30 nucleotdeos. O DNA a ser utilizado como modelo em uma
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DNA dupla fita a ser amplificado
n-simo ciclo 2n cpias Primeiro ciclo Oligonucleotdeos iniciadores Segundo ciclo
Terceiro ciclo
Figura 1.13 A reao em cadeia da polimerase (PCR). Pequenos oligonucleotdeos iniciadores so utilizados como primers para iniciar a replicao de DNA de lados opostos de uma fita dupla de DNA a ser amplificada. Depois de cada rodada de replicao, o DNA aquecido para a separao das fitas e ento esfriado para permitir o anelamento dos novos primers. Rodadas repetidas de replicao resultam em um aumento exponencial no nmero de molculas-alvo.
reao de PCR primeiro misturado com ambos os primers e com a DNA-polimerase termoestvel em uma soluo tampo. A amplificao da PCR ocorre em ciclos. No primeiro ciclo, o DNA aquecido para a separao das fitas e depois esfriado na presena de um grande excesso de primers de oligonucleotdeos. O alongamento dos primers produz molculas de fita dupla. O segundo ciclo da PCR semelhante ao primeiro, mas, depois do segundo ciclo, existem quatro cpias de cada molcula original. O ciclo repetido por 20 a 30 vezes, cada uma resultando no dobro do nmero de molculas. O resultado terico de n rodadas de amplificao 2n cpias de cada molcula-molde originalmente presente. Na prtica, a reao no ocorre com eficincia perfeita, e a eficincia varia em virtude da cintica de hibridizao dos primers e das tendncias do modelo em formar estruturas complexas dobradas. A amplificao por PCR muito til para gerar grandes quantidades de uma sequncia de DNA especfica. A principal limitao da tcnica que as sequncias de DNA nas extremidades da regio a ser amplificada devem ser conhecidas de modo que os oligonucleotdeos possam ser sintetizados. Existem muitas aplicaes nas quais esse requerimento obedecido. Em gentica de populaes, por exemplo, a PCR pode ser utilizada para amplificar diferentes alelos presentes em populaes naturais. Com a PCR, a necessidade em saber as sequncias nas extremidades dos fragmentos a serem amplificados (para poder sintetizar os oligonucleotdeos iniciadores) pode parecer uma limitao sria, mas mesmo essa dificuldade pode ser contornada com um mtodo eficaz para o estudo de polimorfismo conhecido como polimorfismo de tamanho de fragmento amplificado
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(AFLP). O mtodo resumido na Figura 1.14. O primeiro passo (parte A) a digesto do DNA genmico com uma enzima de restrio; esse exemplo utiliza a enzima EcoRI, cujo stio de restrio 5-GAATTC-3, e as estrelas representam as posies de dois stios de restrio adjacentes. (O tamanho do fragmento de DNA entre os stios, relativo ao tamanho dos prprios stios, no mostrado em escala.) A digesto gera um grande nmero de fragmentos de restrio flanqueados em cada lado pela parte remanescente do stio de EcoRI. A digesto de EcoRI resulta em um pedao 5 pendurado em cada extremidade, com a sequncia 5-AATT (Figura 1.9). Esses pedaos pendurados so compridos o suficiente para que, em baixas temperaturas, eles possam parear com os pedaos pendurados 3 complementares de adaptadores especiais (Figura 1.14B), que so aderidos ao fragmento de restrio utilizando a enzima DNA-ligase. Os fragmentos resultantes (C) esto prontos para a amplificao
Stio da EcoRI (A) Clivagem Stio da EcoRI
(B) Adaptador Ligao do adaptador Primer (C) Primer PCR (D) Adaptador
(D) Fragmento de EcoRI amplificado
Figura 1.14 Polimorfismos de tamanho de fragmento amplificado (AFLPs) utilizam primers adaptadores para amplificar fragmentos de restrio produzidos com uma enzima de restrio particular, nesse caso a EcoRI. (A) Parte da molcula de DNA em um cromossomo mostrando as posies dos dois stios de restrio da EcoRI. (B) Depois da digesto com a enzima de restrio, o fragmento misturado com os adaptadores de fita dupla que possuem pedaos pendurados de fita simples complementares aos pedaos pendurados de fita simples produzidos pela enzima de restrio, e ento os adaptadores hibridizados so ligados ao fragmento de restrio utilizando uma enzima. (C) Primers que so complementares s sequncias dos adaptadores so ento utilizados para amplificar o fragmento de restrio por meio da reao em cadeia da polimerase. (D) Muitas cpias do fragmento de restrio so produzidas. Geralmente, o DNA de um nico indivduo produz muitos fragmentos amplificados diferentes, e qualquer fragmento que pode ser amplificado de algum indivduo e no de outro um AFLP.
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Questo 1.3 A PCR foi utilizada para amplificar cinco alelos (designado ae) do gene Rh3 que codifica uma protena sensvel luz no olho de Drosophila simulans, uma espcie de mosca-das-frutas bem prxima a D. melanogaster. Os fragmentos de DNA resultantes foram sequenciados (Ayala et al., 1993). Os dados mostram os nucleotdeos presentes em cada um dos 16 stios de nucleotdeo polimrficos encontrados nos primeiros 500 stios DA regio do gene codificadora de aminocidos; os restantes 484 stios de nucleotdeo eram monomrficos nessa amostra. Qualquer stio de nucleotdeo que um exato mltiplo de trs est na terceira posio de um cdon. Nessa regio do gene: a) que proporo de stios de nucleotdeo polimrficos est na terceira posio dos cdons? O que voc pode inferir dessa observao? b) que proporo de stios de nucleotdeo polimrfica? c) por que o erro-padro binomial ( pq / n) no apropriado para a estimativa na parte (b)?
^^
Stio de nucleotdeo em um gene alelo a b c d e 132 142 162 192 198 201 207 240 246 351 354 372 375 405 417 483 T T C C C C C T T T T C C C C A T C C C C A C C C C C C C T T C C C C C T T T T C C C T T T C T C T C T T T T G G T G G G G G A G T T C C C T T T T C A T A T A
resposta (a) Entre os 16 stios polimrficos, somente o stio 142 no exatamente mltiplo de trs, ento 15 = 94% dos stios polimrficos esto na terceira posio do cdon. A inferncia que muitos 16 polimorfismos de nucleotdeos so silenciosos, ou seja, eles no alteram a sequncia de aminocido do polipeptdeo. (De fato, todos os 16 so polimorfismos silenciosos, incluindo a mudana C g T no 142, que altera o cdon de CUA g UUA, ambos codificando para leucina.) (b) Um total 16 de = 3,2% de stios de nucleotdeos so polimrficos nessa regio do gene. (c) O erro-padro 500 binomial no apropriado nesse caso, pois os nucleotdeos em um gene no so amostras independentes; eles so geneticamente ligados.
por meio de PCR utilizando primers que so complementares aos adaptadores. Observe que o mesmo adaptador ligado a cada extremidade, e, assim, uma nica sequncia de primer ir anelar a ambas as extremidades e promover a amplificao. Existe, no entanto, uma gama de escolhas relativa sequncia do primer. Um primer que combina com os adaptadores com perfeio ir amplificar todos os fragmentos, mas isso frequentemente resulta em muitos fragmentos amplificados que no so bem separados em um gel. Visto que um primer de PCR deve combinar perfeitamente com a extremidade 3 para ser alongado, nucleotdeos adicionados extremidade 3 reduzem o nmero de fragmentos amplificados. Esses primers iro amplificar somente aqueles fragmentos que, ao acaso, possuem um nucleotdeo complementar especfico imediatamente adjacente ao stio EcoRI.
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Polimorfismos de nucleotdeo nico

O ltimo nvel para o estudo de polimorfismos genticos aquele da prpria sequncia de DNA, e a menor unidade do polimorfismo o polimorfismo de nucleotdeo nico ou SNP. Diz-se que um SNP est presente em um stio particular de nucleotdeo se as molculas de DNA na populao frequentemente diferem na identidade do par de nucleotdeos que ocupa o stio. Considere, por exemplo, um stio de nucleotdeo em uma fita de DNA codificadora de protena. Algumas molculas de DNA na populao podem possuir um nucleotdeo T (timidina) nesse stio, enquanto outras molculas de DNA na mesma populao podem possuir um nucleotdeo C (citosina) nesse mesmo stio. Essa diferena constitui um SNP O SNP define dois alelos para os quais . podem existir trs gentipos entre indivduos em uma populao, chamados de homozigotos com T no stio correspondente em ambos cromossomos homlogos, homozigotos com C no stio correspondente em ambos cromossomos homlogos ou heterozigotos com T em um cromossomo e C no cromossomo homlogo. A palavra alelo est entre aspas porque o SNP no precisa estar em uma sequncia codificadora ou em um gene. Acredita-se que o genoma humano possua ao menos 10 milhes de SNPs, ou um a cada 300 pares de bases. Mais de 4 milhes de SNPs foram identificados, nos quais os alelos alternativos so relativamente comuns, e a densidade entre esses de aproximadamente um stio de SNP a cada 1.000 a 3.000 pares de base em um DNA codificador de protena, e aproximadamente um stio de SNP a cada 500 a 1.000 pares de bases no DNA no codificador. Como os SNPs so utilizados nos estudos de gentica de populaes humanas discutido no Captulo 10.
Polimorfismos sinnimos e no sinnimos

Uma limitao inevitvel da eletroforese de protenas que ela s pode detectar aqueles polimorfismos de nucleotdeos em uma sequncia codificadora que resultem em um aminocido sendo trocado por outro na protena. (De fato, ela s consegue detectar uma parte que altera a carga da protena sob condies de eletroforese.) Os polimorfismos de nucleotdeos que resultam em trocas de aminocidos so conhecidos como polimorfismos no sinnimos. Existe tambm uma grande classe de polimorfismos sinnimos que esto presentes em regies codificadoras, mas que no resultam em troca de aminocidos. Esses so bem comuns, pois o cdigo gentico permite muitas substituies sinnimas de nucleotdeos. Por exemplo, os cdons TTA, TTG, CTT, CTC, CTA e CTG codificam para o aminocido leucina, e os cdons CGU, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG codificam para o aminocido arginina. (Somente 2 de 20 aminocidos no cdigo gentico no possuem cdons sinnimos.) Muitos polimorfismos tambm esto presentes em regies no codificadoras do genoma, como nas regies a montante (5) de uma sequncia codificadora, a regio a jusante (3) da sequncia codificadora ou em ntrons que interrompem a sequncia codificadora. Polimorfismos sinnimos e no codificadores podem afetar sutilmente o organismo, e os polimorfismos podem ento ser
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afetados por apenas seleo natural; os alelos polimrficos so sinnimos ou no codificadores no sentido de que todos eles codificam para a mesma sequncia de aminocidos. Um exemplo de polimorfismo sinnimo extensivo em Drosophila ilustrado na Figura 1.15 para alelos do gene codificador da lcool-desidrogenase. Esse gene possui um polimorfismo eletrofortico que disseminado nas populaes naturais com dois alelos predominantes, lento (Adh-S) e rpido
97 85 65 109 36 22 31 64 45 109 53 56 50 19 24 9 41 3 1 113 90 25 104 72 32 34 108 84 7 16 44 66 20 68 14 61 40 30
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83 47 112 27 17 11 63 13
5 96
94
103 110
15
29
82 48 21 4
67
98 100 101
77 91 8
58 78 73 79 62 33 23 42 76 106 99
55
87 89 37 71 35 10 52 51 38 46 12 57
28 95 2 111
Figura 1.15 Hapltipos dos alelos na regio Adh de Drosophila melanogaster da costa leste da Amrica do Norte. Cada linha na rede conecta dois hapltipos que diferem por uma nica diferena molecular. Alm disso, 20 hapltipos diferindo por mais de uma mudana daqueles da rede no so mostrados. Os quadrados indicam o alelo Adh-F, e os crculos, o alelo Adh-S. (De acordo com Berry e Kreitman, 1993.)
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(Adh-F). A diferena molecular que o cdon para o aminocido nmero 193 no Adh-S AAG (lisina), enquanto no Adh-F ACG (treonina). As enzimas no diferem somente na mobilidade eletrofortica. O produto do alelo rpido possui uma maior atividade enzimtica e tambm sintetizado em maior quantidade do que aquele do alelo lento. Os dados na Figura 1.15 so derivados de estudos da regio Adh de 1.533 moscas isoladas de 25 populaes no leste da Amrica do Norte (Berry e Kreitman, 1993). Um total de 193 hapltipos foram identificados. Um hapltipo uma combinao nica de estados allicos de marcadores genticos presentes ao longo de um nico cromossomo. Quanto menor a recombinao gnica existente em uma regio do genoma, ou mais forte a seleo, maior a diferenciao dos hapltipos. Os exemplos extremos so o DNA mitocondrial, o DNA de cloroplastos e o cromossomo Y, nos quais a recombinao normalmente no ocorre. (Veja o Captulo 4 para uma discusso da evoluo do DNA mitocondrial e do DNA do cloroplasto.) Na Figura 1.15, os hapltipos indicados por quadrados so Adh-F, e aqueles indicados por crculos so Adh-S. O nmero dentro de cada smbolo relativo abundncia de hapltipos (1 sendo o mais frequente, 2 o prximo mais frequente e assim por diante). Uma linha reta conectando os dois hapltipos indica que eles diferem por uma nica mudana de nucleotdeo. A Figura 1.15 inclui 93 hapltipos relacionados a pelo menos um outro por uma nica mudana; os outros 20 hapltipos observados no estudo incluem mudanas adicionais. O ponto principal do exemplo do Adh que populaes naturais possuem uma grande abundncia de diferentes tipos de variao de sequncias de nucleotdeos que no afetam a sequncia de aminocidos.
Stios segregantes e diferenas de nucleotdeos

Dados de sequncia de DNA possuem mais informao sobre variao gentica do que eletroforese de protenas, pois os polimorfismos de nucleotdeos so detectados mesmo que eles sejam polimorfismos sinnimos ou que estejam em uma regio do DNA no codificadora e tambm porque cada nucleotdeo em um grupo de sequncias alinhadas pode ser considerado individualmente. (As sequncias so consideradas alinhadas se a subunidade correspondente em cada sequncia, nesse caso nucleotdeos, deriva da subunidade correspondente na sequncia ancestral.) Por analogia com estimativas de polimorfismos de protenas, a variao gentica nas sequncias de DNA convenientemente observada em relao ao nmero de stios de nucleotdeos que so polimrficos em uma amostra de sequncias e tambm de acordo com o nmero de stios de nucleotdeos que so heterozigotos. Em um grupo de sequncias alinhadas, o nmero de stios segregantes (stios de nucleotdeos que so polimrficos na amostra) simbolizado por S e definido como
S = Nmero de stios de nucleotdeos que diferem entre as sequncias alinhadas
(1.7)
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O anlogo da heterozigosidade para a sequncia de DNA o nmero de nucleotdeos que diferem em qualquer par de sequncias alinhadas. Essas so as diferenas de nucleotdeos, e iremos utilizar para simbolizar o nmero mdio de diferenas de nucleotdeos para cada comparao par a par possvel entre as sequncias alinhadas. Para n sequncias, existem n(n 1)/2 comparaes par a par possveis. O valor de para qualquer amostra , portanto, definido como Nmero total de diferenas de nucleotdeos = Nmero total de comparaes par a par (1.8)
As estimativas de S e possuem uma varincia em virtude da amostragem aleatria e tambm da histria da populao, que sero consideradas no Captulo 4. Para relacionar S e com parmetros bsicos que afetam a variao gentica, como = 4N, onde novamente N o tamanho de uma populao idealizada, e , a taxa de mutao, necessrio um modelo de como as sequncias de DNA evoluem. Um dos modelos mais simples o modelo de stios infinitos, no qual se assume que as sequncias consistem em um nmero muito grande (infinito) de stios de nucleotdeos sem recombinao, no qual cada substituio de nucleotdeo ocorre em um stio diferente e seletivamente neutra. Depois de um tempo longo o suficiente, a populao eventualmente alcana um equilbrio no qual S e so constantes, mas as sequncias individuais esto se modificando lentamente em virtude de mutaes recorrentes e perdas aleatrias. Nesse equilbrio, pode ser observado que os valores esperados de S (Watterson, 1975) e (Kimura, 1968) para uma amostra de n sequncias so dados por 1 1 1 1 E( S) = 1 + + + + ... 2 3 4 n 1 E( ) = (1.9) (1.10)
Essas expresses sero derivadas e discutidas mais tarde neste livro, mas as introduzimos agora para mostrar como elas ajudam a unir algumas medidas bsicas da variabilidade da sequncia de DNA. Os valores da soma dos recprocos na Equao 1.9 so dados para pequenos valores de n na Tabela 1.2. Para valores de n maiores do que 20, a soma dos recprocos igual a aproximadamente 0,577 ln (n 1) (Nei, 1987). importante enfatizar que, nas Equaes 1.9 e 1.10, enquanto = 4N, o valor de corresponde a taxas de mutao na sequncia inteira. Em outras palavras, igual taxa mdia de mutao por nucleotdeo multiplicada pelo nmero de nucleotdeos em cada sequncia que est sendo comparada. Em um estado de equilbrio no modelo de stios infinitos, d uma estimativa de (veja Equao 1.10), e S d outra estimativa por meio da Equao 1.9 como 1 1 1 1 = S / 1 + + + + ... + (1.11) 2 3 4 n 1
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Testar a igualdade entre essas duas estimativas um dos vrios modos de detectar desvios do equilbrio no modelo de stios infinitos (Tajima, 1989). Por exemplo, certos tipos de seleo (ou crescimento populacional recente) resultam em um excesso de alelos raros, e assim a estimativa de da Equao 1.10 ser menor do que aquela da Equao 1.11. Da mesma forma, outros tipos de seleo (ou um decrscimo recente no tamanho da populao) resultam em muito poucos alelos raros, e, nesse caso, a estimativa de da Equao 1.10 ser maior do que da Equao 1.11. Esses e outros testes para desvio da neutralidade seletiva so discutidos em detalhes no Captulo 4. Os dados na Questo 1.3 so tpicos e podem ser utilizados para exemplificar os clculos. L, consideramos n = 5 sequncias, cada uma com 500 nucleotdeos, e encontramos que o nmero observado de stios segregantes era S = 16. Assim, a estimativa de da Equao 1.10 1 1 1 = 16 / 1 + + + = 7, 68 2 3 4 (1.12)
O nmero mdio de diferenas de nucleotdeos o nmero mdio de diferenas de nucleotdeos entre todos os pares de sequncias possveis na amostra. Para os dados na Questo 1.3, a amostra de 5 sequncias permite (5 4)/2 = 10 comparaes par a par possveis. As comparaes par a par podem ser consideradas para cada nucleotdeo por vez. Para o stios polimrficos no Problema 1.3, o nmero de diferenas par a par totaliza 6 (= 2 3) para seis stios (stios 132, 142, 246, 351, 405 e 483), totaliza 4 (= 1 4) para nove stios (stios 162, 198, 201, 207, 240, 354, 372, 375 e 417) e totaliza 7 para um stio (stio 192). Entre os 484 nucleotdeos monomrficos na Questo 1.3, o nmero de diferenas par a par 0. O nmero mdio de diferenas par a par por comparao par a par , portanto, (6 6) + (4 9) + (7 1) + (0 484 ) = = 7, 90 10 (1.13)
Para os dados na Questo 1.3, portanto, a estimativa de = 7,68 (Equao 1.12, com base no S na Equao 1.11) similar ao = 7,90 (Equao 1.13, com base em na Equao 1.10). A concordncia muito boa, mas, por outro lado, o nmero amostral muito pequeno. Nesse tipo de comparao, os valores de S e dependem do comprimento das sequncias que esto sendo analisadas, e esse tamanho ir diferir de gene para gene e de um estudo para o outro. O modo como os efeitos dos comprimentos diferentes de sequncias podem ser removidos examinado no Captulo 4. Estimativas de stios segregantes e diferenas de nucleotdeos podem tambm ser observadas com dados de stio de restrio na forma de polimorfismos de tamanho de fragmento de restrio (RFLPs). O modo mais simples analisar cada stio de restrio. Para cada stio de restrio monomrfico considerada a identificao de seis nucleotdeos monomrficos adjacentes (ou quatro nuleotdeos monomrficos se a enzima possui um stio de restrio de quatro bases). Para cada stio de restrio, so identificados cinco nucleotdeos
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Tabela 1.2 Soma dos recprocos

n 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
a Nota:
(1/i)a 1,000 1,500 1,833 2,083 2,283 2,450 2,593 2,718 2,829 2,929
n 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
(1/i) 3,020 3,103 3,180 3,252 3,318 3,381 3,440 3,495 3,548 3,598
(1/i) vai de i = 1 a i = n 1.
monomrficos e um nucleotdeo segregado (ou trs stios monomrficos e um stio segregante, se a enzima possuir um stio de restrio de quatro bases). Em outras palavras, cada polimorfismo no stio de restrio considerado ser resultante da segregao de uma diferena nica de nucleotdeo no stio de restrio. Comparaes par a par para estimar so tambm desenvolvidas nessa premissa. A razo ilustrada no seguinte problema.
Questo 1.4 A variao em stios de restrio foi estudada na regio do gene da lcool-desidrogenase (Adh) em uma populao de D. melanogaster descendente de animais capturados em um mercado de frutas holands em Groningen (Cross e Birley, 1986). A regio possua um total de 23 stios para cinco enzimas de restrio, cada uma possuindo um stio de restrio de seis bases. Um total de 16 stios foram cortados de todas as moscas da amostra. A tabela abaixo documenta a presena (+) ou ausncia () de cada um dos sete stios polimrficos em uma amostra de 10 cromossomos. Assumindo que somente um nucleotdeo alterado para cada stio de restrio que perdido, estime o valor de com base no nmero de stios S nos nucleotdeos segregantes e no nmero mdio de diferenas de nucleotdeos . Essas estimativas parecem ser iguais para esses dados? BamHi + + Hindiii + + + + + + Psti + Xhoi + + + + + + + + Psti + Ecori + + + + + + + + + Ecori + + + + + + +
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resposta Considere primeiro os stios segregantes. Os 16 stios monomrficos de restrio identificam 16 x 6 = 96 stios de nucleotdeos monomrficos, enquanto os 7 stios polimrficos de restrio identificam 7 x 5 = 35 stios de nucleotdeos monomrficos e 7 x 1 stios polimrficos (segregantes), assumindo que somente um nucleotdeo alterado para cada stio de restrio que perdido e que todas as molculas de DNA que no possuem um stio de restrio particular apresentam o mesmo hapltipo de nucleotdeos neste stio. Em conjunto, existem 138 stios de nucleotdeos analisados, dos quais S = 7 so stios segregantes. Visto que n = 10, o denominador na Equao 1.11 fica igual a 2,829 (da Tabela 1.2). A estimativa de com base em S , portanto, = 7/2,829 = 2,47. Para a estimativa de , existem (10 x 9)/2 = 45 comparaes pareadas, e um stio de restrio com i mais e (10 i) menos significa que o stio segregante de nucleotdeos resulta em i x (10 i) diferenas par a par. Portanto, o nmero total de diferenas para cada um dos stios de restrio, da direita para a esquerda, igual a 16, 24, 9, 16, 9, 9 e 21, respectivamente, totalizando 104. Portanto, a estimativa de = 104/45 = 2,31, o que tambm a estimativa de com base em . As estimativas de = 2,47 e = 2,31 esto em muito boa concordncia. No entanto, o tamanho amostral muito pequeno para generalizar essa concluso.
UtiliDaDE DOS POliMORFiSMOS GEnticOS
A variabilidade gentica natural apresenta muitas utilidades, no importando se estudada por meio de aloenzimas ou sequncias de nucleotdeos. A variao gentica propicia um conjunto de marcadores prprios para o estudo gentico de organismos nos seus hbitats nativos, incluindo organismos para os quais a domesticao ou o crescimento em laboratrio no podem ser realizados ou para os quais a manipulao gentica impossvel. Os polimorfismos genticos so teis na investigao das relaes genticas entre subpopulaes de uma espcie. O princpio de que os alelos so compartilhados entre subpopulaes em virtude de migrao, sendo, portanto a similaridade na frequncia de alelos entre as subpopulaes utilizada para estimar a taxa de migrao (veja Captulo 6). Dentro das subpopulaes, os alelos so compartilhados em virtude da ancestralidade em comum. Por exemplo, o povo Ainu do norte do Japo possui muitas caractersticas semelhantes a caucasoides, incluindo traos faciais, pele clara e pelos no corpo, entretanto os seus polimorfismos genticos mostram claramente que eles so mais relacionados a outros grupos mongis (Watanabe et al., 1975). Entre os alelos mais informativos, o povo Ainu possui o alelo D (Chi) da protena transferrina e o alelo Dia do grupo sanguneo Diego, sendo os dois praticamente restritos a populaes mongis. Por outro lado, o povo Ainu no possui muitos alelos que sejam polimrficos nos caucasoides.
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De um ponto de vista prtico, os polimorfismos genticos so teis em populaes humanas como marcadores genticos que podem estar geneticamente ligados a genes deletrios que causam doenas (veja Captulo 10). Em pessoas relacionadas com uma histria familiar de doenas, os marcadores genticos podem ser utilizados para determinar quais membros da famlia provavelmente carregam o gene deletrio. Os marcadores tambm podem ser utilizados em diagnsticos precoces de pessoas que provavelmente possam ser afetadas. Os RFLPs e outros tipos de polimorfismos de DNA que so relacionados a genes de doenas tambm demonstraram a sua utilidade como sondas para a identificao de clones de DNA contendo os genes imperfeitos. Os marcadores genticos prximos habilitam a identificao dos genes imperfeitos e de suas funes, servindo assim como primeiro passo na busca de tratamentos efetivos. Os marcadores de DNA com um grande nmero de alelos de frequncia moderada so particularmente teis em gentica de populaes. Na maioria dos organismos, muitas regies do genoma possuem alelos mltiplos consistindo em sequncias curtas de bases repetidas uma aps a outra. Podem resultar alelos mltiplos, porque o nmero de cpias da sequncia repetida talvez seja diferente de um cromossomo para o outro. Os gentipos so ainda mais variveis porque cada gentipo carrega dois alelos. Uma das aplicaes prticas desses polimorfismos est no DNA fingerprinting, em que os alelos no DNA de um suspeito so comparados com os de uma amostra da cena do crime. O exame de um nmero suficiente dessas regies altamente variveis proporciona uma base para distinguir uma pessoa da outra, pois duas pessoas (exceto gmeos idnticos) no possuem o mesmo gentipo. A variabilidade gentica desse tipo utilizada na determinao de paternidade e tambm em investigaes criminais. O DNA fingerprinting tambm tem sido aplicado a estudos de sistemas de acasalamento naturais em plantas e animais, pois, com um grande nmero e alta especificidade de tipos de DNA, os parentes prximos podem ser detectados em populaes. Em estudos de comportamento, a tipagem de DNA pode determinar se os organismos que apresentam atos altrusticos mtuos so geneticamente relacionados. Outros tipos de polimorfismos tambm podem ser informativos sobre sistemas de acasalamento. Por exemplo, as frequncias observadas de gentipos podem ser utilizadas para estimar a quantidade de autofertilizao em populaes de plantas monoicas ou animais hermafroditas. Do ponto de vista da biologia evolutiva, as sequncias de genes e padres de polimorfismos podem ser utilizados para fazer inferncias sobre a histria e os processos evolutivos. Existe de fato um projeto internacional chamado de Projeto de Cdigo de Barras de DNA (DNA barcoding) que possui o objetivo de catalogar sequncias nicas de DNA que podem ser utilizadas para identificar espcies de qualquer organismo por meio de um banco de dados que
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seria constantemente expandido. As sequncias de macromolculas possuem um registro da sua histria evolutiva. Os organismos com uma ancestralidade compartilhada geralmente possuem sequncias de genes similares. Da mesma forma, similaridades na sequncia podem ser consideradas como uma medida de ancestralidade compartilhada. Como um ndice de ancestralidade compartilhada, a similaridade em sequncias proporciona um meio de inferncia da relao ancestral entre um grupo de organismos (filogenia molecular, discutida no Captulo 7). As taxas e os padres de mudana na sequncia dentro e entre espcies relacionadas tambm possuem um registro do trabalho de foras evolutivas. A gentica de populaes evoluiu de um campo relativamente pobre em dados para um campo relativamente rico em dados, e numerosos mtodos novos de anlise de dados e de teste de hipteses tm sido desenvolvidos.
RESUMO
2 3 4
5 6
7 8
Galton estudou principalmente caractersticas contnuas, incluindo altura e peso, que so medidas em uma escala quantitativa, enquanto Mendel estudou a variao discreta, incluindo ervilhas lisas e rugosas resultantes da segregao de alelos de um nico gene. Em populaes naturais, a maioria das caractersticas contnuas so multifatoriais, significando que elas so determinadas por efeitos combinados de mltiplos fatores genticos e ambientais. As caractersticas multifatoriais requerem mtodos especiais para estudar as suas bases genticas, enquanto a variao mendeliana simples a regra para os genes e seus produtos. Para uma caracterstica mendeliana simples controlada por dois alelos em uma populao que possui cruzamentos ao acaso, existe uma relao simples esperada entre as frequncias de alelos (p, q) e as frequncias genotpicas (p2, 2pq, q2). Os polimorfismos de protenas so frequentes na maioria das populaes naturais, e muitos alelos para protenas variantes so comuns. A ampla ocorrncia de polimorfismos pe em dvida a teoria clssica da variao gentica, a qual postulava que a maioria da variao gentica ocorria em virtude de alelos raros e deletrios mantidos por mutao recorrente. Outros tipos de dados tambm pem em dvida a hiptese do equilbrio, a qual postulava que a maioria dos polimorfismos era mantida em virtude de uma maior adaptao do gentipo heterozigoto. Nem o modelo clssico nem o do equilbrio considerou que muitos polimorfismos podem no apresentar efeito na habilidade do organismo de crescer e se reproduzir (a teoria da neutralidade). O ltimo nvel da variao gentica consiste em diferenas na sequncia de nucleotdeos de DNA em posies correspondentes nos cromossomos de diferentes indivduos. O genoma humano, consistindo em aproximadamente 3 bilhes de pares de nucleotdeos, possui aproximadamente 10 milhes de polimorfismos de nucleotdeo nico.
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Muitos polimorfismos de nucleotdeo nico ocorrem em partes do genoma que no codificam protenas. Em regies codificadoras de protenas, polimorfismos no sinnimos mudam a sequncia do aminocido, enquanto polimorfismos sinnimos no mudam a sequncia do aminocido. 10 A variao de nucleotdeos em um grupo de sequncias de DNA alinhadas pode ser quantificada de acordo com o nmero de stios de nucleotdeos segregantes e com o nmero mdio de diferenas entre um par de sequncias observadas ao acaso. A comparao dessas medidas um dos muitos modos de inferir sobre as foras evolutivas histricas que tm atuado sobre um gene. 11 Os polimorfismos genticos so importantes em quase todos os aspectos da biologia moderna, incluindo a gentica humana, a biologia celular e molecular, o cruzamento de plantas e animais e o manejo e a conservao de vida silvestre. As aplicaes a populaes humanas vo desde a identificao de fatores de risco para doenas complexas at a implicao de culpa em casos criminais por meio de DNA fingerprinting.
tEStE SEU cOnHEciMEntO
A tabela a seguir representa valores fenotpicos medidos em cada membro de uma amostra aleatria de 100 indivduos. Estime a mdia, a varincia e o desvio-padro da populao da qual a amostra foi retirada. 82 102 106 91 99 87 120 120 106 106 80 112 116 114 96 101 86 101 75 73 106 105 127 81 109 113 90 104 100 88 102 97 140 128 71 117 67 97 82 142 82 125 117 73 90 97 88 72 98 89 94 96 94 130 95 80 87 106 126 96 74 89 130 95 107 139 120 113 103 12 123 105 82 94 92 108 124 88 118 95 96 111 79 98 112 107 112 120 120 99 110 97 80 109 110 103 107 99 104 79
Assumindo que a amostra na Questo 1 foi retirada de uma distribuio normal, quantos indivduos na amostra devero ter um valor fenotpico que exceda a mdia, mais um desvio-padro? Que nmero de indivduos na amostra devero ter um valor fenotpico menor do que a mdia, menos um desvio-padro? Como essas previses so comparadas com as observaes? Assumindo que a amostra na Questo 1 foi retirada de uma distribuio normal, que nmero de indivduos na amostra esperado possuir um valor fenotpico que exceda a mdia, mais dois desvios-padro? Que nmero de indivduos na amostra so esperados possuir um valor fenotpico menor do que a mdia, menos dois desvios-padro? Como essas previses so comparadas com as observaes?
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Um modo tpico de utilizar um computador para gerar nmeros aleatrios distribudos normalmente escolher 12 nmeros aleatrios e som-los. Depois de fazer uma escala da soma por meio de uma constante que dependa da mdia e da varincia da distribuio uniforme, o resultado representa uma amostra de uma distribuio normal. Por que essa metodologia funciona? Uma afirmativa do teorema do limite central que a soma de variveis aleatrias independentes e distribudas identicamente possui uma distribuio normal limitante. Se as variveis aleatrias que so adicionadas no so independentes, mas exibem uma correlao positiva em retiradas sucessivas, como voc esperaria que a soma desviasse da distribuio normal prevista pelo teorema do limite central? A eletroforese de protenas aplicada utilizando amostra de sangue de um camundongo de tipo selvagem para um gene com dois alelos, cujo produto ir correr rpido ou devagar no gel. Entre 100 fmeas, 64 possuem somente a banda rpida, 4 possuem somente a banda devagar e 32 possuem as bandas rpida e devagar. Entre 100 machos, no entanto, 80 possuem somente a banda rpida e 20 possuem somente a banda devagar, sem gentipos heterozigotos aparentes. Que modo de herana poderia explicar a ausncia de machos heterozigotos? Muitas protenas existem em uma forma ativa somente como dmeros, com unidades mantidas unidas por pontes de hidrognio ou pontes covalentes de cistena. Se uma enzima ativa somente como um dmero, ento, em uma populao com dois alelos codificando as formas migratrias rpida e devagar da protena, que tipo de padro de bandas voc esperaria de um tecido proveniente de um gentipo heterozigoto? O diagrama mostra o resultado de uma eletroforese de amostras de tecidos de 240 gansos canadenses, Branta canadensis, marcadas para a enzima aldedo-oxidase. As amostras foram colocadas em depresses (poos) mostrados na parte de cima do gel, e com a eletroforese as protenas migraram na direo inferior. Os nmeros representam o nmero de indivduos na amostra que possui cada padro de bandas. Estime as frequncias dos alelos rpidos e devagar e calcule as frequncias esperadas dos gentipos assumindo as propores de Hardy-Weinberg. Os resultados observados parecem estar de acordo com os valores esperados? 26 98 116
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O diagrama de gel a seguir resume os resultados de eletroforese de 99 indivduos de uma populao da planta Phlox cuspidata. Essa populao parece estar nas propores de Hardy-Weinberg? 33 33 33
10 Um gene com dois alelos em uma populao possui as frequncias genotpicas P, Q e R para os gentipos AA, Aa e aa, respectivamente. Mostre que, se a populao est nas propores de Hardy-Weinberg, a relao esperada entre as frequncias genotpicas PR = Q2/4. 11 Como muitas cpias de um fragmento de DNA devem se apresentar depois de 30 rodadas de PCR, assumindo eficincia perfeita? 12 Quatro sequncias de um fragmento de DNA de 1.200 pb proveniente de um gene geraram as seguintes contagens de diferenas par a par: 4, 7, 5, 3, 6, 5. Qual a estimativa do nmero de diferenas par a par para essa amostra? 13 As sequncias de nucleotdeos mostradas aqui so um grupo completo de nucleotdeos polimrficos encontrados em uma regio de 5 kb em uma amostra de seis cromossomos do milho, Zea mays. Os nucleotdeos polimrficos no so adjacentes como mostrado aqui, mas distribudos nos 5 kb. Qual o nmero de stios segregantes S e qual o nmero mdio de diferenas par a par entre essas sequncias? Estime de S e . Tais estimativas parecem ser consistentes? Se esses resultados fossem encontrados em uma amostra maior, o que isso sugeriria sobre as foras seletivas atuando na sequncia de polimorfismos? gcctt actat accac gtcat gcttt accat tatgg taagg tgtcg tgtgg tatga catga cctgt cttgt cccgt tcctc ccttt ccttt atgag ttgat acgcg ttgag ataag attaat
14 Em aplicaes forenses de gentica, se o DNA fingerprint amostrado de uma cena de crime e o do suspeito no so correspondentes, a confiana na concluso muito maior do que se os DNA fingerprints so correspondentes. Que concluso poderia ser retirada dessa afirmativa e por que haveria confiana nessa concluso?

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Variao gentica e fenotPica

daniel l. Hartl & andrew g. clark

RElEVncia Da GEntica DE POPUlaES

Princpios de gentica de populaes

Variao contnua: a distribuio normal

daniel l. Hartl & andrew g. clark

200 Nmero de homens 150 100 50 0 N = 1.329 x = 69,0 s = 2,5

0,125 0,1 0,075 0,05 0,025

<63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 >75 Altura (arredondada para a polegada mais prxima)

Ordenada da curva normal

Princpios de gentica de populaes

Polegada mais prxima (xi) 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Princpios de gentica de populaes

teorema do limite central

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Desvio em relao mdia ( SE)

Princpios de gentica de populaes

Variao mendeliana discreta

daniel l. Hartl & andrew g. clark

I/I Homozigoto II Vermelho

i/i Homozigoto ii Marfim

I/i Heterozigoto Ii Rosa

Princpios de gentica de populaes

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Princpios de gentica de populaes

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Princpios de gentica de populaes

Poos para amostras Gel

Soluo tampo Eletrodo

(B) Amostra polimrfica

Princpios de gentica de populaes

Frequncias allicas e frequncias genotpicas

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Princpios de gentica de populaes

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Mamferos (46) 0,04

Princpios de gentica de populaes

daniel l. Hartl & andrew g. clark

inferncias a partir de polimorfismos de aloenzimas

Princpios de gentica de populaes

Fragmento de DNA de fita dupla

Princpios de gentica de populaes

Fragmentos de restrio de DNA (A) Marcao

(C) Filme fotogrfico exposto ao filtro. Bandas pretas aparecem no filme.

daniel l. Hartl & andrew g. clark Stios de restrio AA Aa aa

DNA em cromossomos homlogos

Reao em cadeia da polimerase

Princpios de gentica de populaes

DNA dupla fita a ser amplificado

n-simo ciclo 2n cpias Primeiro ciclo Oligonucleotdeos iniciadores Segundo ciclo

daniel l. Hartl & andrew g. clark

(D) Fragmento de EcoRI amplificado

Princpios de gentica de populaes

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Polimorfismos de nucleotdeo nico

Polimorfismos sinnimos e no sinnimos

Princpios de gentica de populaes

97 85 65 109 36 22 31 64 45 109 53 56 50 19 24 9 41 3 1 113 90 25 104 72 32 34 108 84 7 16 44 66 20 68 14 61 40 30

daniel l. Hartl & andrew g. clark

Stios segregantes e diferenas de nucleotdeos

Princpios de gentica de populaes

daniel l. Hartl & andrew g. clark