I.

BSQUEDA DE CEPAS NATIVAS DE Lactobacillus spp CON POTENCIAL EN BIOCONSERVACIN DE ALIMENTOS

Maria Consuelo Vanegas1*, Aida Juliana Martnez2 y Lina Mara Gonzlez3
1,2,3

Laboratorio de Ecologa Microbiana y Alimentos, Universidad de los Andes, Bogot, Colombia. Direccin: Cra 1 #18A-70 Edificio J 209 *mvanegas@uniandes.edu.co

RESUMEN El objetivo de este estudio fue aislar e identificar cepas nativas de Lactobacillus sp. aisladas de alimentos, flora de nios recin nacidos y terneros por microbiologa clsica y PCR para evaluar su efecto inhibitorio contra Salmonella sp, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Algunas cepas presentaron actividad inhibitoria contra todos los microorganismos evaluados de las cuales fueron seleccionadas cuatro para evaluar sus extractos con catalasa, proteinasa K, temperatura y pH. Este estudio permiti identificar ocho cepas con amplio rango de inhibicin de patgenos, de las cuales una genera inhibicin por una sustancia de carcter proteico, lo que sugiere su potencial uso en bioconservacin. Palabras claves: bioconservacin, cepas nativas, Lactobacillus sp, flora en nios. I. INTRODUCCIN algunas cepas de Lactobacillus sp producen sustancias antimicrobianas como bacteriocinas que actan inhibiendo el crecimiento de bacterias que pueden ser patgenas. (Asahara, 2001; Mahoney, 2003) Se ha reportado que existe gran variabilidad de especies de Lactobacillus sp circulando en alimentos fermentados y como flora normal de animales y humanos. (Aquilanti, 2007; Zhong, 1998). Por sus propiedades fermentativas muchas especies de Lactobacillus sp son usadas como cultivos iniciadores en diversos alimentos. (Botes, 2007) Es as como llegan a colonizar el tracto gastrointestinal humano y animal favoreciendo la salud. (Biagi, 2007) Sin

Lactobacillus sp es uno de los gneros ms importantes perteneciente al grupo de bacterias cido lcticas (BAL) debido al especial uso que se le ha dado en la industria alimentaria tanto para desarrollar alimentos funcionales como en bioconservacin. Muchos reportes han indicado sus beneficios que van desde prevencin y control de enfermedades, incluyendo el balance de la flora intestinal y absorcin de nutrientes, (Heyman, 2000) hasta tratamientos para contrarrestar el efecto de microorganismos patgenos, produccin de enzimas anticancergenas y mecanismos de inmunoregulacin. (Cross, 2001; Strus, 2005). Por otro lado su uso en bioconservacin se debe a que

embargo esta colonizacin va cambiando a lo largo del tiempo y es beneficiada con factores tales como tipo de alimentacin y estado de salud del hospedero, por lo que es ms comn encontrar recuentos altos de estos microorganismos en nios recin nacidos y en terneros de poco tiempo de vida que an estn alimentndose con leche materna generando el mantenimiento de la flora benfica en el organismo. (Biagi, 2007; Lin, 2007) Algunos reportes indican que tambin hacen parte de la flora presente en el tracto urogenital femenino (Martin, 2005; Strus, 2005). En nuestro pas, dentro de los principales microorganismos involucrados en enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) se encuentran Staphylococcus aureus, Salmonella sp y Escherichia coli; y pesar de la falta de reportes debido a que no es de notificacin obligatoria, se sabe que tambin Listeria monocytogenes se halla con frecuencia en maquinaria y superficies en la industria alimentaria por su habilidad de producir Biopelculas. (Mahoney, 2003) El control de estos microorganismos en la industria de alimentos se realiza con la implementacin de Buenas Prcticas de Manufactura y sistemas de calidad que garantizan la inocuidad de los alimentos. Sin embargo con el objetivo de evitar que los alimentos en almacenamiento sean atacados por microorganismos que originan su descomposicin y/o que eventualmente pueden ser patgenos para el consumidor, se implementan tcnicas como el almacenamiento a bajas temperaturas y uso de aditivos qumicos. (Annimo, 2007)

Las bacteriocinas comprenden un gran grupo de protenas o ppticos que son producidas por varios microorganismos. Sin embargo las que provienen de bacterias cido lcticas han sido estudiadas de modo especial en los ltimos aos debido a su potencial aplicacin en la industria de alimentos como biopreservantes. (Arbogast, 1975). La mayora de las bacteriocinas producidas por BAL son aisladas de alimentos fermentados y estos microorganismos se han usado en la industria de alimentos por aos. (Stern, 1973) Muchos autores han reportado diferentes bacteriocinas producidas por en Lactobacillus sp, en las que se incluyen plantaricina C, W, C19, 423 (van Reenen, 1998) entre muchas otras, con un rango de inhibicin de microorganismos que est relacionado con un mismo nicho ecolgico. (Silva, 1987) Actualmente, la tendencia por el consumo de alimentos funcionales hace que muchas empresas se interesen por introducir en sus alimentos cepas de Lactobacillus spp por sus caractersticas probiticas y en bioconservacin. (Gmez-Trevio, 2001; Martn, 2007). Pases como Japn, Estados Unidos y algunos de la Unin Europea identifican y caracterizan cepas de bacterias cido lcticas con el objetivo de introducirlas en el mercado de alimentos. (Cai, 1998) Sin embargo en Sur Amrica el consumo de estos productos es reciente y los primeros probiticos son importados desde Europa en yogurt, leches fermentadas, quesos, frmulas infantiles, bebidas de jugos, entre otros. (Martn, 2007) Para la identificacin de Lactobacillus sp se emplea microbiologa clsica y

tcnicas moleculares. Las tcnicas clsicas incluyen coloracin de Gram, actividad de catalasa y oxidasa, movilidad, crecimiento en agar Man Rogosa y Sharp (MRS), utilizacin de azcares por kits comerciales o pruebas independientes de laboratorio. (Castillo, 2007) En cuanto a la caracterizacin de Lactobacillus spp por tcnicas moleculares, la mayora de estudios sugieren PCR para bsqueda de algunas especies de Lactobacillus spp y slo algunos autores reportan esta tcnica para caracterizar este microorganismo a nivel de gnero (Aquilanti, 2007). Lo ltimo es importante debido a que son muchas las especies de Lactobacillus spp reportadas con potenciales efectos benficos en la industria de alimentos, lo que hace que desarrollar tcnicas moleculares que permitan la caracterizacin de todo el gnero de Lactobacillus spp y no slo de una o algunas especies en particular sea de mayor utilidad. En Colombia, pocos estudios han reportado especies de Lactobacillus sp productoras de sustancias inhibitorias, (Leon P, 2006) sin embargo no se ha estudiado cepas que provengan de flora normal de humanos y animales por tcnicas moleculares. Lo anterior sugiere que el aislamiento y la caracterizacin de cepas de Lactobacillus sp provenientes de dichas fuentes con potencial en bioconservacin, pueden ser una herramienta importante para la industria de alimentos colombiana al poder utilizar cepas nativas en conservacin de alimentos que permitan sustituir, al menos parcialmente, el uso de aditivos qumicos para asegurar que el alimento est exento de microorganismos patgenos o que se

encuentran dentro de los rangos permitidos por la legislacin nacional. Estudios en esta rea permitirn que la industria de alimentos se vea favorecida al disponer de cepas nativas tiles en bioconservacin. El objetivo de este estudio fue aislar e identificar cepas nativas de Lactobacillus sp. provenientes de alimentos, flora normal de nios recin nacidos y terneros utilizando microbiologa clsica y PCR (Reaccin en cadena de la Polimerasa) y evaluar su efecto inhibitorio contra las principales bacterias causantes de ETAs en nuestro pas. II. MATERIALES Y MTODOS.

2.1 Aislamiento y Mantenimiento de Cepas. 60 muestras de diferentes alimentos artesanales, vegetales, heces de nios recin nacidos (Donadas por el Laboratorio de Bioimagen con la colaboracin de SaludCoop) y terneros del departamento de Cundinamarca, fueron utilizadas para el aislamiento de Lactobacillus sp. Se realiz siembra directa en agar Man Rogosa y Sharp (MRS) por 72 horas a 30 C. Se seleccionaron las cepas que presentaron morfologa tpica tanto al microscopio como en medio de cultivo y pruebas de oxidasa y catalasa. Las cepas fueron almacenadas a -70 C en glicerol para los dems anlisis. 2.2 Identificacin por PCR Todas las cepas seleccionadas fueron caracterizadas por PCR con el protocolo reportado por Dubernet y col en 2002. (Dubernet, Desmasures, Gueguen, 2002)

La reaccin tuvo lugar en un volumen final de 50 ul que contena: 25 ul del Kit PCR Master Mix (Roche), 5 ul de cada Primer, 5 ul de ADN y 10 ul de agua libre de nucleasas. Con el siguiente ciclo para la amplificacin: 95 C por 5 minutos, 30 ciclos de 94 C por 1 minuto, 42 C por 1 minuto, 68 C por 1 minuto y 68 C por 7 minutos Despus de la amplificacin los productos fueron visualizados por electroforsis en gel de agarosa al 2% y observados en el transiluminador. Para la validacin de la tcnica se utiliz la cepa control de Lactobacillus plantarum donada por el Instituto Ziel de Alemania y como control negativo Listeria monocytogenes. (Dubernet, 2002. et al.) 2.3 Evaluacin de antimicrobiana la actividad

inhibicin alrededor de las cepas de Lactobacillus sp. III. RESULTADOS Y DISCUSIN Se identificaron 56 cepas de Lactobacillus spp (36 aisladas de alimentos, 5 de terneros y 15 de nios recin nacidos) por microbiologa clsica mediante morfologa tpica en agar MRS y en lmina, catalasa (-) oxidasa (-) y por biologa molecular mediante PCR con el mtodo antes descrito. Se evalu el espectro de inhibicin contra cepas de bacterias patgenas tanto Gram positivas como Gram negativas. De las 34 cepas de Lactobacillus sp aisladas de alimentos: 9 mostraron actividad inhibitoria contra Listeria monocytogenes, 5 mostraron actividad inhibitoria contra Salmonella Enteritidies, 25 mostraron actividad inhibitoria contra S. aureus y E. coli y 28 actividad inhibitoria contra L ivanovii. As mismo de las 19 cepas provenientes de nios recin nacidos y de terneros 10 mostraron actividad inhibitoria contra L. monocytogenes, 7 mostraron actividad inhibitoria contra Salmonella Enteritidies, 10 actividad inhibitoria contra S aureus, 12 de ellas actividad inhibitoria contra E. coli y 8 actividad inhibitoria contra L. ivanovii. Del total de cepas evaluadas tanto de alimentos como de flora normal de nios y terneros 8 cepas (14.28%) mostraron actividad inhibitoria contra los cinco microorganismos indicadores evaluados (5 cepas de alimentos, 2 de nios recin nacidos y 1 de ternero) lo que indica un potencial en bioconservacin de alimentos. 12 cepas (21.42%) 10 aisladas de alimentos y 2 aisladas de nios recin nacidos mostraron actividad inhibitoria

Se evalu el efecto de inhibicin de todas las cepas aisladas contra los siguientes microorganismos indicadores: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Salmonella sp. Staphylococcus aureus y Escherichia coli. La prueba se realiz en un medio slido utilizando el mtodo de botn (Lewus, 1991). Cada cepa de Lactobacillus sp se inocul en caldo MRS a 30 C por 18 horas. En una caja de petri se coloc aproximadamente 10 mL de Plate Count Agar (SPC), se dej secar y se coloc por gotas (aproximadamente 2 L) cultivos de cada cepa de Lactobacillus sp. Despus fueron incubadas a temperatura ambiente durante 8 h. Posteriormente 9 mL del mismo medio se colocaron con 10 L del microorganismo indicador (107 ufc/mL). Las cajas se incubaron a la temperatura ptima de crecimiento de los indicadores durante 18 h. El efecto antibacteriano se detect por la presencia de halos de

contra cuatro de cinco microorganismos indicadores evaluados. 15 cepas (26.78%) 8 aisladas de alimentos y 7 de nios y terneros mostraron actividad inhibitoria tanto para L. monocytogenes como para L. ivanovii. Sin embargo del total de cepas que inhiban el crecimiento de Listeria monocytogenes el 26.66% (1 cepa aislada de alimentos y 3 aisladas de nios y terneros) no inhiban el crecimiento de L ivanovii. Del total de cepas utilizadas en el estudio, cuatro (LAC111 y LAC096 provenientes de alimentos, LAC134 proveniente del nio recin nacido y LAC150 de flora de ternero) fueron seleccionadas debido a que presentaron un amplio rango de inhibicin con respecto a los microorganismos indicadores evaluados. El 78.87% de las cepas identificadas como Lactobacillus sp por tcnicas tradicionales de microbiologa tambin lo fueron por PCR, mientras que el 21.12% fueron identificadas en este gnero por microbiologa tradicional pero no por PCR. Segn lo reportado por otros autores las secuencias de los primeras utilizadas en este estudio permiten caracterizar Lactobacillus sp mediante la regin terminal del 16S rRNA que amplifican una regin conservada para la mayora de especies de Lactobacillus sp. Por lo cual se sugiere que las 15 cepas que no amplificaron en la PCR no pertenecen al gnero Lactobacillus sp pero debido a sus caractersticas morfolgicas se sugiere que pertenecen al grupo de bacterias cido-lcticas posiblemente al gnero Carnobacterium sp. El uso de estos primer basados en la amplificacin de una secuencia 16S especifica para Lactobacillus sp tambin

permitira diferenciar entre especies. (Cocolin, 2000) Por lo anterior se propone la utilizacin de estos primer en estudios posteriores para la caracterizacin a nivel de especie de los Lactobacillus sp identificados en este trabajo mediante electroforsis de gradiente denaturante como DGGE o TGGE debido a que las secuencias que amplifican permiten esta identificacin. Acorde con lo reportado por otros autores (D. Hill, 2005) del total de muestras de nios recin nacidos el 100% contena cepas de Lactobacillus sp. Al igual que lo sugerido por otros autores (Benkerroum, 2002) E coli, L. ivanovii y S. aureus fueron microorganismos sensibles en un alto porcentaje (66.03, 67.92 y 69.81% respectivamente). Los dems microorganismos indicadores evaluados mostraron tambin ser sensibles a Lactobacillus sp pero en porcentajes ms bajos. Conforme con lo reportado por Ramrez et al., (Socorro Ramrez, 2005) se obtuvo un porcentaje bajo de Lactobacillus sp con actividad antimicrobiana frente a L monocytogenes. En este estudio es mucho mayor el porcentaje de cepas que mostraron actividad inhibitoria contra L. monocytogenes que las reportadas por Ramrez et al., sin embargo el porcentaje fue ms el ms bajo (35.84%) en comparacin con los dems microorganismos indicadores evaluados. La evidencia de algunas cepas que inhiban a L. monocytoegenes pero no L. ivanovii afirma lo reportado por muchos autores que sugieren que las bacteriocinas tienen bajos espectros de inhibicin al actuar contra unas especies de Listeria y contra otras no. (Luchansky, 1992) Sin embargo tendiendo en cuenta que se encontraron cepas con actividad

para los cinco microorganismos indicadores se puede decir tambin que otras sustancias inhibitorias muestran rangos ms amplios de inhibicin. (Elotmani, 2002) De las ocho cepas que inhibieron todos los microorganismos indicadores evaluados en este estudio se seleccionaron cuatro para evaluar sus extractos. Las ocho cepas que presentaron inhibicin de todos los microorganismos evaluados, pudieron generar el efecto inhibitorio por factores asociados a la produccin de perxido de hidrgeno o pH de los extractos. Por este motivo se seleccionaron cuatro cepas que presentaron los mejores resultados (mayores halos de inhibicin) De los cuatro extractos purificados mediante tratamiento con catalasa, proteinasa K, temperatura de 90 C, temperatura de 120 C y pH 6.5, el extracto de la cepa LAC134 de flora normal de nio recin nacido, mostr inhibicin contra Listeria monocytogenes y Listera ivanovii. Las pruebas sugieren que la sustancia es de carcter protico debido que despus del tratamiento con catalasa y con el pH ajustado a 6.5 se obtuvo una inhibicin de los dos microorganismos que se mencionaron anteriormente. A 90 C se obtuvo halo de inhibicin mientras que a 120 C lo que indica que la sustancia bactericida es estable a 90 C. Despus del tratamiento de Proteinasa K se sugiere que la inhibicin fue dada por la accin de una sustancia de carcter proteico debido a que no hubo halo de inhibicin. IV. CONCLUSIONES Este estudio permiti crear una coleccin de cepas de Lactobacillus sp

aisladas de alimentos, nios recin nacidos y terneros, caracterizadas tanto por microbiologa tradicional como por PCR da inicio a nuevas investigaciones en el tema de Probiticos y bioconservacin. La tcnica de la PCR para la identificacin a nivel de gnero de Lactobacillus sp puede ser empleada como una herramienta adicional a la microbiologa clsica para la caracterizacin de las cepas en el laboratorio. Se sugiere continuar esta investigacin en la caracterizacin a nivel de especie de los Lactobacillus sp mediante electroforsis de gradiente denaturante como DGGE o TGGE. Los resultados muestran que el 92.45% de las muestras analizadas contenan Lactobacillus sp capaces de inhibir microorganismos patgenos logrndose as la compilacin de un grupo de cepas que pueden ser usadas en la industria de alimentos colombiana para bioconservacion de alimentos por su actividad contra microorganismos patgenos o deterioradores. Este estudio permiti hallar ocho cepas nativas de Lactobacillus spp. con actividad antimicrobiana frente a los cinco microorganismos evaluados que son de inters en la salud pblica en nuestro pas. Adicionalmente permiti identificar un extracto de carcter protico proveniente de una cepa de orgen humano que inhibe Listeria monocytogenes y Listera ivanovii sugieren su uso potencial en bioconservacin.

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