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Instructor mada Como afecta temperatura y pH a las enzimas Bioqumica 1 MATERIALES Y UTILIDAD DE LOS MISMOS. - Patata.

En ella estn presentes las enzimas de catalasa cuya actividad queremos observar. Se escogi la patata por ser muy manipulable y accesible. - Bistur o cuchillo. Para cortar la patata. - Pinzas. Para agarrar los tubos de ensayo cuando haya que calentarlos. - Tubos de ensayo. Donde se llevan a cabo las posibles reacciones entre enzima y sustrato. Nos permiten manipular bien las muestras. - Gradillas para tubos. Para organizar los tubos. - Mechero. Para calentar las muestras cuando fue necesario, desnaturalizando la catalasa por aumento de temperatura. - HCl (cido clorhdrico) al 3,5% (dilucin 1:10 de la disolucin comercial HCl 35%). La disolucin se prepar en la clase anterior y con cuidado, aireando bien la zona. Es una de las sustancias que se supone deberan desnaturalizar la enzima en contacto con ella, debido al pH demasiado cido. - NaOH (1M). Sosa. Es otra de las sustancias que deberan alterar el funcionamiento de la enzima, esta vez debido a un pH demasiado bsico. - Vinagre. Es la tercera de las sustancias que deben desnaturalizar la enzima, tambin por pH cido, como el HCl. - Hielo. Para enfriar ciertas muestras y desnaturalizar la catalasa, esta vez por fro. - Agua oxigenada comercial (perxido de hidrgeno al 3%). Es el sustrato, que reaccionar con la enzima si sta no est desnaturalizada, y que no reaccionar en caso de que s lo est. La evidencia de la reaccin es que al realizarse se libera espuma o burbujas. 4 DESARROLLO DE LA PRCTICA. 1 - Preparacin de los materiales y las disoluciones y realizacin de un simulacro de la prctica para que resultara ms eficaz y rpido hacerla el da de la prctica en s. 2 - Organizacin y numeracin de muestras como sigue y por duplicado para confirmar los resultados y contemplar posibles discordancias entre muestras que deberan mostrar el mismo resultado. Cada grupo dispona de 12 tubos sealados de la A a la F y de la A a la F (los duplicados). Para precisar ms y hacer un anlisis ms completo de los resultados, a las pruebas de la A a la F se les retiraron los lquidos aadidos durante el proceso, y a las muestras de la A a la F no. 3 - Aadir reactivos a los tubos de ensayo. - A los tubos A y A se les aade un cubito de patata y 2ml de H2O2. - A los tubos B y B se les aade un cubito de patata y 2ml de vinagre. Hay que esperar al menos 5 minutos para que el vinagra surta efecto. - A los tubos C y C se les aade un cubito de patata y 2ml de la disolucin de HCl. Hay que esperar 5 minutos para que el HCl surta efecto. - A los tubos D y D se les aade un cubito de patata y 2 ml de la disolucin de NaOH. Hay que esperar 5 minutos para que el NaOH surta efecto. - A los tubos E y E se les aade un cubito de patata y 2ml de H2O. Hay que hervir ambas muestras durante 5

minutos. - A los tubos F y F se les aade un cubito de patata y 2ml de H2O. Hay que introducir los dos tubos en un entorno helado durante 10 minutos. - Tras haber esperado el tiempo necesario, se procede a retirar los lquidos que hemos aadido a los tubos B, C, D, E y F (y no al A, puesto que el lquido aadido era ya el sustrato). - Por ltimo se aaden 2ml de H2O2 a todos los tubos que an no lo tenan (todos menos el A y el A). - Observacin de resultados.
* Conviene usar instrumentos de laboratorio diferentes a la hora de aadir los diferentes lquidos o retirarlos, para evitar imperfecciones en los resultados. * En el paso 3 el orden de preparacin de los tubos es indiferente (incluso podra ser mejor empezar por preparar las muestras del hielo, que son las que ms tiempo de espera requieren. * Los cubitos de patata son de aproximadamente 0,5cm de lado y fueron preparados en la clase anterior.

5 OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS. TUBO TRATAMIENTO A A' B B' C C' D D' E E' F F' RESULTADO OBSERVADO EXPLICACIN

Patata + 2ml H2O2 Salen burbujas. Patata + 2ml H2O2 Salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. No salen burbujas. Apenas salen burbujas. Apenas salen burbujas.

* En los tubos F y F la desnaturalizacin debera haber sido ms radical, pero quiz el tiempo al que se sometieron las muestras al fro no fue suficiente. Pudo haberse dado la renaturalizacin de la catalasa. Sera mejor aadir el H2O2 lo antes posible despus de quitar los muestras F y F del hielo, para que no haya tiempo de renaturalizacin.

6 ACTIVIDADES.
* Analiza esta explicacin de los resultados y explica si puede ser vlida (coherente con los resultados de tus experimentos).

1 El vinagre, el HCl y el NaOH afectan al agua oxigenada, impidiendo que la catalasa pueda catalizar su

transformacin en agua y oxgeno. No afectan a la catalasa. Falso. En las muestras B, C, D, E y F hemos retirado los lquidos antes de aadir el H2O2. En estas muestras los lquidos desnaturalizantes nunca han estado en contacto con la enzima y an as la reaccin ha ocurrido. Por ello se deduce que el vinagre, el HCl y el NaOH s que afectan a la enzima y no al H2O2. 2 En los tubos B, C, D y E la muestra est ms diluida que en A y por eso no se observa reaccin. Falso. La razn no es el nivel de dilucin, sino el hecho de que los lquidos aadidos (o el calor) han desnaturalizado la catalasa. Por eso no se observa reaccin. 3 El tubo A es el nico en el cual la patata no ha estado 5min hasta que hemos aadido el agua oxigenada, por eso es el nico en el que hay reaccin (quizs la catalasa se ha estropeado en esos 5 minutos en los tubos B, C, D, E y F y por eso no funciona). Falso. La enzima se ha estropeado (desnaturalizado), pero no porque tenga que echarse nada ms poner la patata, sino por la accin de los cidos y las variaciones de temperatura. * Explica qu haras para descartar cada una de las tres hiptesis anteriores. Y hazlo. Para descartar la 1: eliminar lquidos antes de echar el H2O2 (como ya hicimos). Para descartar la 2: eliminar los lquidos supone tambin disminuir el grado de dilucin, y an as la reaccin sigue sin ocurrir, lo que prueba que la hiptesis no es correcta. Para descartar la 3: se puede esperar 5 minutos para echar el H2O2 en las pruebas A y A, y veremos que la reaccin seguir ocurriendo. * Anota los resultados. Cul es la conclusin? Ya he anotado los resultados y conclusiones en la tabla. * Compara lo que ocurre cuando el tubo E (hervido) y el tubo F (hielo) vuelven poco a poco a temperatura ambiente. Intenta explicar qu ocurre en cada caso. En ambos casos (sobre todo se nota con las muestras del hielo) la reaccin empieza a ocurrir tras esperar un poco, porque la enzima no se ha desnaturalizado irreversiblemente y va recuperando su actividad progresivamente. * Qu ocurre al cabo de un tiempo en los tubos B, C y D? Qu explicaciones se te ocurren? Cmo podras decidir cul de esas hiptesis es la correcta? En esas muestras, nosotros sobresaturamos por error a la patata echando todos los cidos y bases juntos. No observ que pasara nada en ninguno de estos tubos, quiz por esta sobresaturacin. Probablemente debera haber sucedido una renaturalizacin progresiva, como en los casos anteriores.

* Los cidos (o la base) empleados son inhibidores de la enzima? Explica tu respuesta. S, lo son, ya que (segn la definicin) son sustancias que disminuyen o anulan la actividad de una enzima. * Si representamos grficamente la actividad enzimtica frente a la temperatura obtenemos una grfica de este tipo:

Interpreta la grfica en funcin de lo que has aprendido. En la grfica se puede observar cmo la actividad enzimtica aumenta con la temperatura hasta un determinado punto de temperatura ptima de actuacin de esa enzima. La temperatura, al elevarse ms, acaba provocando la disminucin de la actividad de la enzima hasta la desnaturalizacin. * En alguna ocasin habas observado el desprendimiento de burbujas al aadir agua oxigenada? S, al aplicar H2O2 a una herida. Cul crees que es la razn de ese desprendimiento? La enzima catalasa, presente no slo en las patatas, sino tambin en otros seres vivos como nosotros ha catalizado el H2O2, que es perjudicial para nosotros. De este modo, dos molculas de H2O2 se catalizan en 2 molculas de H2O y un O molecular (O2), que son sustancias no perjudiciales. Si no ocurriera esto tendramos problemas de envejecimiento celular excesivo o incluso tumores.