UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG ESCOLA DE QUMICA E ALIMENTOS - EQA CURSO DE ENGENHARIA BIOQUMICA

Andressa Maio Marina Amarante Thalles Trevisol

Determinao de acares redutores pelo mtodo espectrofotomtrico do 3,5 dinitrossaliclico (DNS)

Disciplina: Bioqumica I Professor: Jaqueline Garda Buffon

Rio Grande 2012 SUMRIO 1 INTRODUO.......................................................................................................................3 2 DESENVOLVIMENTO..........................................................................................................5 2.1 MATERIAL E MTODOS..............................................................................................5 2.1.1 MATERIAL...............................................................................................................5 2.1.2 MTODOS................................................................................................................5 2.1.2.1 PREPARAO DO 3,5 DINITROSSALICLICO............................................5 2.1.2.2 CURVA PADRO DA GLICOSE.....................................................................5 2.1.2.3 PREPARO DO MEIO FERMENTATIVO.........................................................6 2.1.2.4 DETERMINAO DE ACARES REDUTORES TOTAIS........................6 2.2 RESULTADOS E DISCUSSO......................................................................................7 2.2.1 RESULTADOS..........................................................................................................7 2.2.1.1 CURVA PADRO.............................................................................................7 2.2.1.2 DETERMINAO DE ACARES REDUTORES TOTAIS........................8 2.2.2 DISCUSSO...........................................................................................................11 2.2.2.1 Sacharomyces cerevisiae...................................................................................11 2.2.2.2 MTODO DE DNS..........................................................................................12 3 CONCLUSO.......................................................................................................................13 REFERNCIAS........................................................................................................................14

1 INTRODUO

Os carboidratos so as biomolculas mais abundantes na face da Terra. (LEHNINGER, 1995). Estas biomolculas so comumente conhecidas como acares, e juntamente com as protenas formam os principais constituintes dos organismos vivos. Sua oxidao a principal via metablica liberadora de energia em muitas clulas no fotossintticas. Estes compostos so poliidroxialdedos ou pollidroxicetonas, ou substncias que liberam esses compostos por hidrlise. (LEHNINGER, 1995). Os carboidratos podem ser classificados, segundo o seu tamanho, como monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. Os monossacardeos, ou acares simples, consistem de uma nica unidade de poliidroxialdedo ou cetona. O monossacardeo mais abundante na natureza a D-glicose, o acar com seis tomos de carbono na molcula. Os oligossacardeos consistem em cadeias curtas de unidades de monossacardeos unidas entre si por ligaes glicosdicas caractersticas. Os mais abundantes so os dissacardeos, com cadeias formadas por duas unidades de monossacardeo. Tpica dessa classe a sacarose, ou acar de cana, a qual consiste dois acares D-glicose e a D-frutose, cada uma com seis tomos de carbono unidos covalentemente entre si. Os polissacardeos consistem de longas cadeias contendo centenas ou milhares de monossacardeos. Alguns, como a celulose, ocorrem em cadeias lineares, enquanto outros, como o glicognio, tm cadeias ramificadas. Os polissacardeos mais abundantes so o amido e a celulose. Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves tais como os ons (Fe+) e o cprico (Cu+). O carbono do grupo carbonila oxidado a cido carboxlico. A glicose e outros acares capazes de reduzir os ons frricos e cpricos so chamados de acares redutores. (LENINGHER, 1995). Todos os monossacardeos so potencialmente redutores devido presena da carbonila, outros carboidratos precisam ser hidrolisados para se tornarem redutores. Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o mtodo do DNS. uma tcnica rpida e prtica na determinao destes acares, e tem grande aplicabilidade industrial. A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseiase na reduo, em meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (colorao amarela). O produto formado estvel, com colorao laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na

proporo estequiomtrica e mxima absoro da luz visvel no comprimento de onda de 546 nm. A anlise de acares redutores como glicose e frutose est constantemente sendo realizadas em laboratrios de Indstrias Alimentcias (SILVA et. al; 2003).

2 DESENVOLVIMENTO 2.1 MATERIAL E MTODOS 2.1.1 MATERIAL

HCl 2 M; NaOH 2 M; Soluo padro de glicose 1 mg/mL; Soluo de sacarose;

Cepa de Saccharomyces cereviase;

3,5 dinitrossaliclico preparado conforme procedimento abaixo; gua destilada; Trtaro de sdio e potssio; Fenol;

Banho; Espectofotmetro. 2.1.2 MTODOS 2.1.2.1 PREPARAO DO 3,5 DINITROSSALICLICO Soluo A: 13,5 g de NaOH em 300 mL de gua destilada; Soluo B: 8,8 g de DNS; 225 g de tartarato de sdio e potssio em 800 mL de gua destilada (adicionar o DNS em 400 mL e o trtaro e o resto da gua em seguida); Soluo C: misturar as solues A e B; Soluo D: 2,2 g de NaOH, 10 g de fenol em 100 mL de gua destilada. Misturar as solues. 2.1.2.2 CURVA PADRO DA GLICOSE Numerar 7 tubos de ensaio em duplicata e proceder de acordo com a tabela 1.

Tubo de ensaio Glicose (mL) gua (mL) Branco 0,0 3,0 1 0,5 2,5 2 1,0 2,0 3 1,5 1,5 4 2,0 1,0 5 2,5 0,5 6 3,0 0,0 Tabela 1. Procedimento para execuo da curva padro da glicose Adicionar 1 mL do reagente de 3,5 DNS. Deixar 5 minutos em banho Maria em 100C e logo em seguida esfriar em banho de gelo. Adicionar 6 mL de gua destilada e realizar leitura a 546 nm em espectrofotmetro.

2.1.2.3 PREPARO DO MEIO FERMENTATIVO Em 50 mL de soluo de sacarose 5% estril, adicionar 0,1 g de levedura. Realizar a amostragem (2 mL) no tempo zero de fermentao, no momento da adio da levedura, e a cada 30 min para quantificao de acares redutores no meio.

2.1.2.4 DETERMINAO DE ACARES REDUTORES TOTAIS Numerar 4 tubos de ensaio em duplicata (A, B, C e D). Tomar 1 mL das diferentes amostras de carboidratos e proceder de acordo com a tabela 2 para cada amostra. Tubo Amostra gua (mL) A (branco ) B 0,5 0,5 1,0 0 1,0 1,0 5 C 1,0 0,5 1,0 10 1,0 1,0 5 D 1,5 0,5 1,0 15 1,0 1,0 5 Tabela 2. Procedimento para execuo da determinao de amostras. 5 5 5 5 5 5 0,0 (mL) 1,0 HCl (mL) 1,0 Banho NaOH 100C (min) 0 (mL) 1,0 DNS (mL) 1,0 Banho Banho 100C (min) 5 gelo (min) 5 H2O (mL) 5

2.2 RESULTADOS E DISCUSSO 2.2.1 RESULTADOS 2.2.1.1 CURVA PADRO Concludo o procedimento de determinao da curva padro, foi feita a leitura da transmitncia a 546nm em espectrofotmetro. Utilizando a seguinte equao, a transmitncia dos tubos pode ser transformada em absorvncia:

TUBO TRANSMITNCIA 1 69,0 / 71,0 2 44,4 / 41,3 3 26,7 / 27,2 4 18,2 / 19,3 5 13,4 / 11,9 6 10,4 / 10,3 Tabela 3. Transmitncia e absorvncia dos tubos

ABSORVNCIA 0,154 0,368 0,569 0,726 0,898 0,984

A concentrao de carboidratos em cada tubo pode ser calculada a partir do volume adicionado de glicose. So feitas as seguintes relaes para cada tubo: 1 mg X 1mL 0,5mL x = 0,5mg

0,5mg/10mL (volume total do tubo) = 0,05 (concentrao de carboidratos no tubo 1) TUBO V (mL) glicose [ ] carboidratos (mg/mL) Br 0 0 1 0,5 0,05 2 1,0 0,1 3 1,5 0,15 4 2,0 0,2 5 2,5 0,25 6 3,0 0,3 Tabela 4. Volume de glicose adicionada e concentrao dos carboidratos Deste modo, com os valores de concentrao de carboidratos e de absorvncia encontrados em cada um dos tubos, possvel construir a curva padro:

[carboidratos] 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

ABS 0 0,154 0,368 0,569 0,726 0,898 0,984

Figura 1. Curva padro de glicose

2.2.1.2 DETERMINAO DE ACARES REDUTORES TOTAIS A amostragem dos tempos 0 e 30 para determinao de acares redutores foi feita em duplicata e, concludo este processo, leram-se as transmitncias em espectrofotmetro. Os resultados foram transformados em absorvncia utilizando-se a mesma equao citada anteriormente. Substituindo-se as absorvncias na varivel y da equao da curva, obtemos a concentrao padro da soluo (mg/mL) de cada tubo. Essa concentrao multiplicada por 10mL (volume total do tubo) e o resultado divide-se por 0,5mL (volume de amostra adicionada). Assim, encontra-se a concentrao de carboidratos ou acares redutores da amostra.

Tubos

T - tempo 0'

ABS - tempo 0'

mg/mL soluo

mg/mL carboidrato

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A 100 0 B 6,1 1,21 C D 8,4 1,08 Grupo 2 A 99,7 0,001305 B 5 1,30103 C 8,4 1,075721 D 6,5 1,187087 Grupo 3 A 100,5 -0,00217 B 5,3 1,275724 C 7,9 1,102373 D 8,5 1,070581 Grupo 4 A 100 0 B 74,4 0,128427 C 88,2 0,054531 D 68,3 0,165579 Tabela 5. Concentrao de carboidratos no tempo 0

Grupo 1

0,348866 0,310933 0,375428 0,309685 0,34218 0,368044 0,317462 0,308185 0,033272 0,01171 0,044113

6,977328 6,218669 7,508564 6,193696 6,843609 7,360883 6,349234 6,163702 0,665443 0,2342 0,882258

Tubos Grupo 1 A B C D A B C D A B C D A B

T - tempo 30' 99,4 8,2 14,9 9,3 100 11 15,3 19,9 100 6,9

ABS tempo 30' 0,002614 1,086186 0,826814 1,031517 0 0,958607 0,815309 0,701147 0 1,161151

mg/mL soluo 0,312739 0,237056 0,296787 0,275512 0,233699 0,200387 0,334613

mg/mL carboidrato 6,25477 4,741115 5,93573 5,510241 4,673973 4,007744 0

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

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C 19,8 0,703335 D 11,6 0,935542 Tabela 6. Concentrao de carboidratos no tempo 30

0,201026 0,268782

4,020512 5,375635

2.2.2 DISCUSSO 2.2.2.1 Sacharomyces cerevisiae Segundo Pelczar et al. (1997), as clulas de leveduras so imveis, no possuem flagelos. So caracterizadas por sua forma de reproduo por brotamento ou germulao. Apresentam, em sua estrutura, gua, substncias nitrogenadas, carboidratos, lipdios, vitaminas, minerais entre outros. Como seres vivos, necessitam de fontes de fatores qumicos e fsicos para seu crescimento e sua reproduo, como carbono, oxignio, etc. A fonte de carbono de extrema importncia para esses micro-organismos crescerem e obterem energia. Essa fonte geralmente orgnica e proveniente de carboidratos. Os acares simples, como glicose e frutose so assimilados por quase todas as leveduras. Os oligossacardeos e polissacardeos j so mais seletivos a certas leveduras (PELCZAR et al., 1997). O gnero Saccharomyces foi descoberto h 150 anos. A levedura Saccharomyces cerevisiae no patognica e devido ao seu uso na histria mundial (principalmente na sua aplicao em pes e etanol), empregada at hoje em processos fermentativos (BASSO, T. O., 2011). Na fermentao os acares so co-fermentados levando a produo de etanol (CH3CH2O), o que envolve 12 reaes, cada uma catalisada por uma enzima especfica, que por sua vez so afetadas por outros fatores (o que pode prejudicar ou ajudar a reao). A levedura metaboliza o acar para gerar energia (ATP) para biossntese de clulas e manuteno celular (BASSO, T. O., 2011). A levedura, por intermdio da "invertase", hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, acares esses que so absorvidos pela clula (ASSNCIO, D. C., 2002).

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Figura 2. Hidrlise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose so acares redutores (ASSNCIO, D. C., 2002). A primeira amostra foi tirada em 0 minutos para determinar qual seria a quantidade de carboidratos gastos depois de 30 minutos de fermentao e assim sucessivamente. Para os grupos que deram certo observou-se apenas uma pequena diferena nos tempos. Como observado no grupo 2 de 7,56 mg/mL de carboidrato em 0 minutos foi para 6,29 mg/mL em 30 minutos. No grupo 3 de 6,19 mg/mL em 0 minutos observou-se 4,00 mg/mL aps 30 minutos. Isso se deve a duas possveis causas: a primeira que o tempo de fermentao foi insuficiente para que a levedura conseguisse utilizar o carboidrato ou porque nesse caso nesse padro que ela atua. A Saccharomyces cerevisiae leva cerca de 60 minutos para iniciar, enfim, o processo fermentativo. Isso explica da reduo da concentrao de carboidratos ser pequena (RIBEIRO, C. A. F.; HORII, J., 2012). 2.2.2.2 MTODO DE DNS O mtodo de DNS (cido dinitrossaliclico) foi desenvolvido com base nos escritos de Sumner no ano de 1921 e citado alguns anos depois em 1959 por Miller em seu livro. Este um mtodo de quantificao de carboidratos que baseia-se no fato de alguns monossacardeos, tais como a glicose e a pentose, serem aucares redutores, ou seja, possuem um grupo carbonlico e cetnico livres capazes de se oxidarem na presena de agente oxidantes em solues alcalinas. Ou seja, pode-se dizer que os acares redutores so carboidratos doadores de eltrons, os quais reduzem os agentes oxidantes por possurem os tais grupos aldedicos ou cetnicos livres ou potencialmente livres estes que, como dito anteriormente, oxidam-se em meios alcalinos. de grande valia a determinao desses acares, j que os mesmos participam de diversas rotas metablicas, tais como a rota da pentose, o ciclo de Krebs e a gliclise. Sabendo-se a concentrao de acares redutores em um sistema pode-se determinar a velocidade da reao enzimtica ou atividade enzimtica (ALMEIDA, 2006).

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O DNS basicamente serve para prevenir o regente da ao do oxignio. J o fenol utilizado para apresentar uma maior colorao, possibilitando uma maior visualizao. J o hidrxido de sdio o redutor da ao da glicose sobre o prprio DNS. (SCHMIDT et al., 2010).

Figura 3. Oxidao da carbonila pelo DNS (SCHMIDT et al., 2010). Aps a reduo do 3,5 di-nitrosaliciato (amarelo forte) e a oxidao da glicose formase 3-amino-5-nitro-saliciato (laranja-marrom forte) que lido no comprimento de onda de 546 nm no espectrofotmetro determinando a concentrao dos acares redutores (SCHMIDT et al., 2010). Na aula prtica ocorreram problemas em que no houve mudana de cor do amarelo para o laranja-marrom. Isso deve ter acontecido pela contaminao de algum reagente quando fora utilizado a mesma amostra e/ou vidraria para dois grupos distintos. 3 CONCLUSO Com esta prtica, conclui-se que, nos grupos em que o mtodo foi bem sucedido, os tempos de fermentao de 0 e de 30 no foram suficientes para que a levedura consumisse o carboidrato. Nota-se tambm que os tempos de hidrlise dos tubos C e D para determinao de acares totais (de 10 e 15) tambm no afetaram de maneira significante nos resultados obtidos. Esse mtodo um mtodo barato e rpido, porm no muito especfico, o que pode apresentar interferentes durante a identificao, causando inviabilidade na resposta obtida.

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REFERNCIAS

ALMEIDA, M. M., TAVARES, D. P. S. A., ROCHA, L. S. C. O., SILVA, F. L. H, MOTA,J. C.;CINTICA DA PRODUO DO FERMENTADO DO FRUTO DO MANDACARU. Rev. Bras. de Produtos Agroindustriais, v.8, n1, p.35-42, 2006u ASSNCIO, D. C. Cintica Enzimtica. Universidade Federal de So Paulo, 2002. BASSO, T. O. MELHORAMENTO DA FERMENTAO ALCOLICA EM Saccharomyces cerevisiae POR ENGENHARIA EVOLUTIVA. Instituto de Cincias Biomedicas da Universidade de So Paulo, 2011.
LEHNINGER, A. L; NELSON, D.L; COX, M.M. Princpios de Bioqumica Traduzido por Arnaldo Antnio Simes, Wilson Roberto Navega Lodi. Sarvier 3 Edio, So Paulo, 2002.

PELCZAR Jr., M. J.; CHAN, E.C.S; KRIEG, N.R. Microbiologia: Conceitos e Aplicaes. 2 ed. Vol 1.So Paulo, Pearson Makron Books, 1997.

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RIBEIRO, Carlos Alberto Frana; HORII, Jorge. POTENCIALIDADES DE LINHAGENS DE LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae PARA A FERMENTAO DO CALDO DE CANA. Sci. agric., Piracicaba, v. 56, n. 2, 1999. Disponvel em <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010390161999000200001&lng=en&nrm=iso>. Acesso em 18 Out. 2012. SCHMIDIT, V. W.; BUTZKE, A. C.; LINDEMANN, C.; CARVALHO, T. Determinao de Acares Redutores pelo mtodo de DNS. Universidade Federal do Rio Grande, 2010.