UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

CIANOBACTERIAS PLANCTNICAS Y CIANOTOXINAS EN EMBALSES ESPAOLES

DAVID CARRASCO GATA Madrid, 2007

Memoria presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biolgicas

Fdo. David Carrasco Gata Licenciado en Ciencias Biolgicas

El director

Fdo. Antonio Quesada de Corral Profesor Titular Dpto. Biologa Universidad Autnoma de Madrid

ndice

ndice

ndice

Introduccin ................................................................................................................1 Objetivos ......................................................................................................................8 Captulo I......................................................................................................................9

1. Introduccin.................................................................................................... 10 1.1. Estructura subcelular y organizacin celular................................... 11 1.2. Taxonoma de las cianobacterias..................................................... 14 1.3. Ecologa de las cianobacterias......................................................... 16 1.4. Afloramientos de cianobacterias. .................................................... 18 2. Objetivos......................................................................................................... 22 3. Materiales y Mtodos. .................................................................................... 23 3.1. Zona de Estudio. .............................................................................. 23 3.1.1. Embalse de Lozoya........................................................ 23 3.1.2. Embalse de Ro Sequillo. .............................................. 24 3.1.3. Embalse de El Velln. ................................................... 24 3.1.4. Embalse de Santillana.................................................... 25 3.1.5. Embalse de Valmayor.................................................... 26 3.1.6. Embalse de San Juan. .................................................... 26 3.1.7. Embalse de Picadas. ...................................................... 28 3.2. Toma de muestras............................................................................ 29 3.3. Determinacin de Nutrientes. .......................................................... 29 3.3.1. Anlisis de amonio. ....................................................... 29 3.3.2. Anlisis de nitrato y nitrito. ........................................... 30 3.3.3. Anlisis de fosfato. ........................................................ 31 3.3.4. Anlisis de fsforo total................................................. 31 3.4. Determinacin de variables fsico-qumicas.................................... 32 3.5. Determinacin del contenido de Clorofila a.................................... 32 3.6. Determinacin de clorofila a y grupos algales por mtodos fluoromtricos......................................................................................... 32 3.7. Identificacin de gneros cianobacterianos..................................... 34 3.8. Anlisis estadstico. ......................................................................... 34

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ndice 4. Resultados....................................................................................................... 35 4.1. Embalse de Lozoya.......................................................................... 35 4.1.1. Nutrientes. ..................................................................... 35 4.1.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 37 4.1.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 37 4.2. Embalse de Ro Sequillo. ................................................................ 40 4.2.1. Nutrientes. ..................................................................... 40 4.2.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 43 4.2.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 44 4.3. Embalse de El Velln. ..................................................................... 45 4.3.1. Nutrientes. ..................................................................... 47 4.3.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 48 4.3.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 49 4.4. Embalse de Santillana...................................................................... 51 4.4.1. Nutrientes. ..................................................................... 51 4.4.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 54 4.4.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 56 4.5. Embalse de Valmayor...................................................................... 58 4.5.1. Nutrientes. ..................................................................... 58 4.5.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 60 4.5.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 63 4.6. Embalse de San Juan. ...................................................................... 64 4.6.1. Nutrientes. ..................................................................... 64 4.6.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 67 4.6.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 69 4.7. Embalse de Picadas. ........................................................................ 72 4.7.1. Nutrientes. ..................................................................... 72 4.7.2. Variables fsico-qumicas. ............................................. 74 4.7.3. Clorofila a y fitoplancton............................................... 77 4.8. Relaciones de clorofila a total y clorofila a de cianobacterias con los factores ambientales analizados.............................................................. 81 4.9. Especies de cianobacterias presentes en la Comunidad de Madrid. 85

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ndice 4.10. Presencia de Afloramientos de cianobacterias en los embalses de la Comunidad de Madrid. ........................................................................... 94 4.11. Estado trfico de los embalses analizados..................................... 99 5. Discusin. ......................................................................................................100

Captulo II ................................................................................................................111
1. Introduccin.................................................................................................. 112 1.1. Estructura qumica de las microcistinas. ....................................... 112 1.2. Sntesis de las microcistinas .......................................................... 114 1.3. Organismos productores ................................................................ 119 1.4. Funcin de las Microcistinas ......................................................... 121 1.5. Toxicidad de las microcistinas ...................................................... 122 1.6. Microcistinas en el ecosistema ...................................................... 123 1.7. Efectos de las microcistinas sobre los seres humanos................... 127 1.8. Legislacin. ................................................................................... 128 2. Objetivos....................................................................................................... 130 3. Materiales y Mtodos. .................................................................................. 131 3.1. Zona de Estudio. ............................................................................ 131 3.2. Toma de muestras.......................................................................... 131 3.3. Determinacin del contenido de clorofila a................................... 132 3.4. Determinacin de clorofila y grupos algales por mtodos fluoromtricos....................................................................................... 132 3.5. Cultivo de la Cepa Microcystis aeruginosa UAM 247.................. 132 3.6. Extraccin y anlisis de microcistinas........................................... 132 4. Resultados..................................................................................................... 135 4.1. Limite de cuantificacin. ............................................................... 135 4.2. Eficiencia de Extraccin de las toxinas ......................................... 136 4.3. Microcistina en las Embalses de la Comunidad de Madrid........... 137 4.3.1. Presencia de microcistinas en el Embalse de Lozoya.. 138 4.3.2. Presencia de microcistinas en el embalse de Ro Sequillo. ............................................................................................... 140 4.3.3. Presencia de microcistinas el embalse de El Velln.... 142

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ndice 4.3.4. Presencia de microcistinas en el embalse de Santillana. ............................................................................................... 144 4.3.5. Presencia de microcistinas en el embalse de Valmayor ............................................................................................... 148 4.3.6. Presencia de microcistinas en el embalse de San Juan.151 4.3.7. Presencia de microcistinas en el embalse de Picadas. . 153 4.3.8. Variantes qumicas de microcistinas en todos los embalses. ............................................................................... 155 4.3.9. Relacin entre microcistinas y clorofila. ..................... 157 4.3.10. Patrn temporal de aparicin de microcistinas.......... 162 5. Discusin ...................................................................................................... 165

Captulo III ..............................................................................................................177

1. Introduccin.................................................................................................. 178 1.1. Estructuras de las pptido sintetasas.............................................. 178 1.2. Pptido sintetasas responsables de la sntesis de microcistinas .... 181 1.3. Variantes qumicas dentro de las microcistinas............................. 182 1.4. Diversidad gentica de los potenciales productores de microcistinas en los afloramientos.............................................................................. 184 1.5. Diversidad Cianobacteria y microcistinas. .................................... 185 2. Objetivos....................................................................................................... 187 3. Materiales y Mtodos. .................................................................................. 188 3.1. Zona de Estudio. ............................................................................ 188 3.2. Toma de muestras.......................................................................... 188 3.3. Anlisis de especies cianobacterianas planctnicas potencialmente toxicas presentes en el embalse de Santillana, extraccin y anlisis de microcistinas y anlisis de parmetros ambientales. ............................ 188 3.4. Amplificacin del gen mcyB, y anlisis de polimorfismos de fragmentos de restriccin. .................................................................... 189 3.5. Anlisis de Maldi-Tof ................................................................... 190 3.6. Realizacin de anlisis quimio-taxonmico. ................................. 191

ndice 4. Resultados..................................................................................................... 192 4.1. Determinacin del tamao mnimo de la colonia de Microcystis necesaria para el anlisis de Maldi-Tof. ............................................... 192 4.2. Anlisis de Microcistinas por HPLC. ............................................ 196 4.3. Especies cianobacterianas planctnicas presentes......................... 197 4.4. Relacin entre los tipos de microcistinas observadas y los parmetros ambientales. ....................................................................... 299 4.5. Anlisis de polimorfismo de fragmentos de restriccin. ............... 201 4.6. Tipos de microcistinas presentes en colonias de M. aeruginosa analizadas por Maldi-Tof. .................................................................... 203 4.7. Diversidad de las colonias de M. aeruginosa en un afloramiento masivo................................................................................................... 204 5. Discusin. ..................................................................................................... 209

Captulo IV ..............................................................................................................216
1. Introduccin.................................................................................................. 217 1.1. Estructura qumica de la anatoxina-a y biosntesis........................ 218 1.2. Organismos productores. ............................................................... 220 1.3. Toxicidad de las anatoxinas........................................................... 222 1.4. Anatoxinas en el ecosistema.......................................................... 223 1.5. Legislacin. ................................................................................... 225 2. Objetivos....................................................................................................... 226 3. Materiales y Mtodos. .................................................................................. 227 3.1. Zona de Estudio. ............................................................................ 227 3.1.1. Embalse de Arcos. ....................................................... 227 3.1.2. Embalse de Zujar. ........................................................ 228 3.1.3. Embalse de Cazalegas. ................................................ 228 3.1.4. Embalse de Rosarito. ................................................... 229 3.1.5. Embalse de Puentes Viejas. ......................................... 230 3.1.6. Embalse de El Atazar. ................................................. 231 3.1.7. Embalse de Cuerda del Pozo. ...................................... 232

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ndice 3.2. Toma de muestras.......................................................................... 233 3.3. Anlisis de especies cianobacterianas planctnicas presentes potencialmente txicas. ........................................................................ 233 3.4. Extraccin y anlisis de Anatoxina. .............................................. 234 4. Resultados..................................................................................................... 237 4.1. Presencia de cianobacterias potencialmente productoras de anatoxina-a en embalses espaoles. ..................................................... 237 4.2. Presencia de anatoxina-a en embalses espaoles. ......................... 240 4.2.1. Presencia de anatoxina en el embalse de Santillana. ... 240 4.2.2. Presencia de anatoxina-a en el embalse de Rosarito. .. 243 5. Discusin ...................................................................................................... 245

Captulo V................................................................................................................250
1. Introduccin.................................................................................................. 251 1.1. Estructura qumica de la cilindrospermopsina y biosntesis.......... 251 1.2. Organismos productores. ............................................................... 253 1.3. Toxicidad de la cilindrospermopsina............................................. 255 1.4. Cilindrospermopsina en el ecosistema. ......................................... 256 1.5. Legislacin. ................................................................................... 257 2. Objetivos....................................................................................................... 258 3. Materiales y Mtodos. .................................................................................. 259 3.1. Zona de Estudio. ............................................................................ 259 3.2. Toma de muestras.......................................................................... 259 3.3. Determinacin de parmetros qumicos. ....................................... 259 3.4. Determinacin de parmetros qumicos. ....................................... 259 3.5. Anlisis biolgicos. ....................................................................... 260 3.6. Ensayo de toxicidad....................................................................... 260 3.7. Extraccin y anlisis de cilindrospermopsina. .............................. 260 3.8. Relacin entre cilindrospermopsina intracelular y extracelular y como afectan los factores ambientales. ................................................ 262 4. Resultados..................................................................................................... 264 4.1. Caractersticas Ambientales. ......................................................... 264 4.2. Estructura de la comunidad fitoplanctnica. ................................. 265

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ndice 4.3. Toxicidad de las muestras.............................................................. 267 4.4. Concentraciones de cilindrospermopsina. ..................................... 268 4.5. Relacin entre cilindrospermopsina intracelular y extracelular y como afectan los factores ambientales . ............................................... 269 5. Discusin .......................................................................................................273

Discusin ..................................................................................................................277 Conclusiones ..........................................................................................................280 Bibliografa .............................................................................................................283 Anexo ............................................................................................................................. I

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Introduccin

INTRODUCCIN

Introduccin

Introduccin
Las cianobacterias son bacterias Gram-negativas capaces de realizar la fotosntesis oxignica. Estos organismos tienen importancia en aspectos relacionados con el ser humano, ya que por ejemplo las especies fijadoras de nitrgeno contribuyen a la fertilidad del suelo y el agua, aunque tambin en mltiples ocasiones son responsables de disminucin de la calidad de las aguas superficiales (Bartram y col., 1999).

Una caracterstica importante que presentan las cianobacterias y que es comn a otros organismos tanto procariontes, como eucariontes (especialmente hongos y plantas) es que poseen un metabolismo secundario muy activo. En general se considera metabolismo secundario, a todo aquel metabolismo que no esta implicado en la gliclisis, el ciclo de Krebs, y en la fotosntesis y rutas asociadas, que es considerado metabolismo primario y que sera idntico en todos los organismos (con la salvedad de la fotosntesis) (Seigler 1998). Como podemos observar, la utilizacin de una definicin por exclusin, hace que la idea de metabolismo secundario sea laxa, incluyendo a gran nmero de compuestos producidos por los organismos que presentan un metabolismo secundario activos.

Algunos de los compuestos producidos por este metabolismo secundario se caracterizan por presentar efectos nocivos sobre otros organismos, ya sea sobre los que compiten con ellos de manera natural en su ecosistema, u otros que en principio slo entraran en contacto de manera accidental. Esta capacidad de producir compuestos txicos no la presentan todas las cianobacterias, aunque algunos de los gneros potencialmente productores estn ampliamente esta ampliamente distribuidos a lo largo de cuerpos de agua dulce de todo el mundo.

Introduccin Los compuestos txicos producidos por las cianobacterias son qumicamente diversos, as que la clasificacin de los diferentes tipos de toxinas se ha realizado en funcin del efecto que producen sobre los animales, o en rganos derivados de animales. Segn esta clasificacin, existen 5 clases de toxinas producidas por las cianobacterias: hepatoxinas, neurotoxinas, citotoxinas, dermatotoxinas y endotoxinas

Hepatotoxinas: Son el tipo de cianotoxinas ms comn (Sivonen y Jones 1999). Se han encontrado dos familias de compuestos que presentan efectos txicos sobre el hgado, son las microcistinas y nodularinas, son pptidos de pequeo tamao (7 aminocidos en el caso de la microcistina, y 5 en le caso de las nodularinas) que poseen varios aminocidos raros. Tienen como rgano diana el hgado (Dawson 1998).

Neurotoxinas: Qumicamente se han encontrado tres grandes grupos de toxinas producidas por las cianobacterias y que son capaces de mostrar efectos txicos a nivel neuronal, o en la interaccin entre las neuronas y el msculo. Estas son: Anatoxina-a, anatoxina-a (s) y saxitoxinas. Las dos primeras toxinas son producidas exclusivamente por cianobacterias, mientras que las ultimas tambin son producidas por los dinoflagelados (mareas rojas) ((Devlin y col., 1977), (Matsunaga y col., 1989)y (Sivonen y Jones 1999)).

Citotoxinas: Dentro de este grupo encontramos un nico tipo de toxinas las cilindrospermopsinas. Estas toxinas fueron definidas en un primer momento como hepatotoxina, pero estudios posteriores han mostrado que son capaces de causar daos en mltiples rganos y sistemas: hgado, riones, corazn, estomago, glndulas adrenales, sistema vascular y linftico (Falconer y Humpage 2006).

Introduccin

Dermatotoxinas: se encuentran entre las toxinas menos estudiadas, sus efectos se han visto sobre todo asociados a cianobacterias marinas, y se conoce muy poco de su modo de actuacin y de su toxicidad se han definido dos grupos qumicamente diferentes: aplisiatoxinas y lingbiatoxinas. Tienen efectos inflamatorios y son potentes promotores de tumores y activadores de la protein kinasa C (Sivonen y Jones 1999).

LPS: los LPS (lipopolisacridos), compuestos que son producidos por todas las cianobacterias, puesto que los LPS, son constituyentes de las paredes celulares de las bacterias Gram negativas. Dadas las similitudes entre las bacterias Gram negativas y las cianobacterias todas las especies de cianobacterias presentan LPS, aunque hasta el momento todos los LPS estudiados presentan una toxicidad muy inferior al de otras bacterias Gram negativas como las que presenta el gnero Salmonella (Sivonen y Jones 1999).

Como hemos indicado con anterioridad no todas las cianobacterias son capaces de producir compuestos txicos, de hecho para los 4 primeras clases de toxinas el nmero de gneros que han presentado cepas productoras es muy limitado. Se consideran gneros potencialmente txicos aquellos en los cuales se han encontrado al menos una especie capaz de producir toxinas (Codd y col., 2005a). Bajo estas premisas se han encontrado al menos 18 gneros de cianobacterias potencialmente txicos (Tabla 0.1), entre ellos cabe destacar por su amplia distribucin en los cuerpos de agua europeos tres de ellos: Anabaena, Planktothrix y Microcystis que son probablemente los tres gneros que presentan una mayor probabilidad de producir afloramientos txicos (Sivonen y Jones 1999). Aunque cabe indicar que existen claras diferencias entre estos gneros en los tipos de toxinas producidas y en la probabilidad que presentan cada uno de estos gneros de presentar cepas txicas.

Introduccin

Gneros Anabaena Anabaenopsis Aphanizomenon Cylindrospermopsis Hapalosiphon Lyngbya Microcystis Nodularia Nostoc Oscillatoria Phormidium Planktothrix Raphidiopsis Schizothrix Synechocystis Umezakia Woronichinia

Tipo de toxina Producida Microcistinas, anatoxina-a , anatoxina-a (s), saxitoxinas y cilindrospermopsina Microcistinas Anatoxina-a, saxitoxinas, y cilindrospermopsina Saxitoxinas y cilindrospermopsina Microcistinas Saxitoxinas, Lingbiatoxina-a y Apliatoxina Microcistinas Nodularinas Microcistinas Microcistinas, Anatoxina-a, Lingbiatoxina-a y Apliatoxina Anatoxina-a Microcistinas y Saxitoxin Anatoxina-a y cilindrospermopsina Lingbiatoxina-a y Apliatoxina Microcistinas Anatoxina-a y cilindrospermopsina Microcistinas

Tabla 0.1. Gneros cianobacterianos potencialmente productores de toxinas. Extrado de (Codd y col., 2005a).

Existen cuatro formas principales de exposicin de estas toxinas en los seres humanos: por ingestin oral, por contacto epidrmico, y finalmente una forma de entrar en contacto poco probable pero que ha ocurrido que es la inyeccin intraperitoneal (Azevedo y col., 2002), y por inhalacin que est muy limitada a las exposiciones relacionadas con los deportes acuticos (Tabla 0.2).

Introduccin
Ruta de Exposicin Ao 1975 1979 Agua de Bebida 1981 72-90 1988 Australia China Brasil 25000 personas Anlisis estadstico 2000 incluyendo 88 muertes Microcistina Microcistina No analizada Dao heptico Cncer de hgado primario Gastroenteritis Gastroenteritis, Garganta irritada, Ampollas 1989 Aguas Recreativas 1995 Australia 777 Hepatotoxinas Escocia 10 Microcistina en la boca, Dolor abdominal, Fiebre, Vmitos, Consolidacin pulmonar Gastroenteritis, Sntomas similares a la gripe, Llagas en la boca, Fiebre, Irritacin en ojos y orejas 1996 1974 Hemodilisis 1996 Brasil 117 (50 muertos) Microcistinas Escocia EEUU 11 23 Microcistinas LPS Erupcin, Fiebre Fiebre, Mialgia, Resfriado, Vmitos Problemas Visuales. Nauseas, Vmitos, Dao heptico Localizacin EEUU Australia Casos Cerca de 5000 149 Toxina presente No analizada Cilindrospermopsina Sntomas Gastroenteritis Gastroenteritis, Dao en el rion, Dao heptico e intestinal

Tabla 0.2. Incidentes sobre la salud de seres humanos en los que se han visto involucrados cianobacterias o los compuestos que ellas producen. (Extrado de (Codd y col., 2005b)).

Introduccin Cuando analizamos los sntomas que se han asociado a la presencia de cianobacterias y de sus toxinas, podemos observar que muchos de ellos son comunes a otras dolencias e intoxicaciones, lo que dificulta la atribucin mdica de la causa de la dolencia a la presencia de cianobacterias. Adems, se da la circunstancia de que el conocimiento de las patologas relacionadas con la toxicosis por cianobacterias no est ampliamente distribuido por los servicios mdicos. Otra de las cosas que podemos observar es que nicamente tres de las toxinas que son producidas por cianobacterias se han implicado con problemas sobre los seres humanos, estos son las microcistinas, la cilindrospermopsina y los LPS, mientras que las neurotoxinas se han asociado sobre todo a problemas con animales de granja o de compaa (Codd y col., 2005b).

A lo largo de esta tesis vamos a estudiar la presencia de cianobacterias potencialmente toxicas y de tres cianotoxinas en embalses espaoles. En el primer capitulo analizaremos la importancia que presentan las cianobacterias planctnicas potencialmente toxicas en 7 embalses que sirven como fuentes de agua potable a la mayor parte de la Comunidad de Madrid, en el segundo y en el tercero estudiaremos la presencia de microcistinas, posiblemente la toxina de cianobacterias mas importante en esos siete embalse, y analizaremos el cambio de las estirpes productoras en uno de los embalses analizados respectivamente. En el cuarto capitulo analizaremos como de importante es la anatoxina-a en Espaa, y finalmente en el quinto captulo mostraremos la presencia de cilindrospermopsina en un embalse espaol causada por Aphanizomenon ovalisporun.

Objetivos

Objetivos
El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es estudiar la importancia de las cianobacterias potencialmente txicas y sus toxinas en los embalses de la espaoles. Como objetivos secundarios tenemos:

Analizar la presencia e importancia de las cianobacterias potencialmente toxicas en la poblacin fitoplanctnica durante el periodo en que la concentracin de clorofila en los lagos y embalses de la zona templada suele ser mas elevada.

Estudiar la concentracin de microcistinas, anatoxina-a y de los potenciales productores en los embalses de la Comunidad de Madrid, regin donde los embalses son un recurso estratgico fundamental como fuente de agua potable.

Determinar la concentracin de cilindrospermopsina y e identificar a su posible productor en el embalse de Arcos.

CAPTULO I

CAPTULO I

Introduccin

Cianobacterias planctnicas en embalses de la Comunidad Autnoma de Madrid

1. Introduccin
Hasta el momento los datos sobre la abundancia de las cianobacterias planctnicas potencialmente txicas en los embalses de nuestra regin son muy escasos. Esto haca recomendable el realizar un estudio sobre la presencia de estos organismos en nuestros embalses, de modo que sirviera de referencia a futuros estudios o como punto de partida a un posible procedimiento de monitorizacin de nuestros embalses. Las cianobacterias tambin conocidas como cianofceas, algas verde-azuladas o cianoprocariotas es el grupo de procariotas fotosintticos ms relevante en diversidad y biomasa. Son las nicas bacterias fotosintticas que poseen clorofila a y que por lo tanto son capaces de desarrollar fotosntesis oxignica. Poseen un sistema muy similar al de los eucariotas fotosintticos, con dos fotosistemas similares a los de estos organismos, el fotosistema I y el fotosistema II, de hecho fueron los primeros organismos que desarrollaron fotosntesis oxignica. Se han descubierto fsiles con estructuras similares a las cianobacterias actuales con una edad aproximada de 3500 millones de aos (Bisby 1995), lo que indicara su antigedad evolutiva. A pesar de esta antigedad, cabe destacar que dentro de las algas las cianobacterias conforman el grupo que presenta el menor nmero de especies (Bisby 1995), aunque el concepto de especie, como en todos los organismos que no poseen reproduccin sexual, depende del sistema de clasificacin utilizado. A este respecto existen dos sistemas de clasificacin bsicos para cianobacterias: el sistema bacteriolgico y el sistema botnico, aunque en los ltimos aos se han intentado unificar ambos sistemas.

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Introduccin

1.1. Estructura subcelular y organizacin celular.

La clula vegetativa se caracteriza por presentar un protoplasto rodeado por una envuelta similar a la que presentan las bacterias Gram-negativas. En ocasiones, la pared celular se rodea de una cpsula o vaina mucilaginosa que facilita la agregacin de las clulas y puede servirles de proteccin contra la desecacin. En la parte central se encuentra el material gentico, formado por un cromosoma circular de ADN (Makino y Tsuzaki 1971) y los ribosomas. La mayor parte de este protoplasto se encuentra ocupado por tilacoides, que como en el caso de los que se encuentran en los cloroplastos, contienen los principales componentes del aparato fotosinttico: pigmentos, centros de reaccin y cadena de transporte electrnico (Figura I.1). Una caracterstica fundamental de estos organismos es la presencia, entre los pigmentos antena, de una familia de compuestos capaces de captar longitudes de onda de la luz que normalmente no son utilizadas por otros organismos fotosintticos (Figura I.2). Estos compuestos son las ficobilinas, de las cuales las tres ms importantes son la ficocianina, aloficocianina y ficoeritrina, que les permiten utilizar la gama verde del espectro luminoso.

Figura I.1. Cadena fotosinttica presente en las cianobacterias (extrado de http://www.genome.ad.jpg/kegg/pathway/map/map00195.html).

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Introduccin

Figura I.2. Espectro de absorcin de los principales pigmentos fotosintticos. Extrado de (Purves y col., 1992)). Dispersos en el citoplasma se encuentra una serie de inclusiones y sustancias de reserva. Los ms importantes son los grnulos de polifosfato, grnulos de glucgeno; grnulos de cianoficina, glbulos lipdicos y los carboxisomas. Aparte de estos grnulos que se encuentran en todas las cianobacterias, algunas de ellas presentan otro tipo de estructuras, las vesculas de gas. stas ltimas son tambin inclusiones citoplasmticas de forma cilndrica que pueden llenarse de gas permitiendo a las cianobacterias modificar su densidad celular. Estas vesculas confieren a las cianobacterias planctnicas una importante ventaja ecolgica sobre otros elementos de la poblacin fitoplactnica ya que les permite modificar su posicin vertical en la columna de agua, con lo que pueden adquirir nutrientes en las zonas profundas de la columna de agua o energa fotosinttica en la superficie de sta (Walsby 1987). Las cianobacterias filamentosas que pertenecen a las secciones IV y V de la taxonoma bacteriolgica y a los rdenes Oscillatoriales, Nostocales y Stigonematales de la taxonoma botnica, presentan diferenciacin celular, mostrando tipos celulares diferentes a estas clulas vegetativas, que son los heterocistos y acinetos (Figura I.3).

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Introduccin

Figura I.3. Fotografa de Aphanizomenon aphanizomenoides 400x. Se muestran en una mismo filamento A = acineto y H = heterocisto Los heterocistos son clulas diferenciadas que presentan como funcin fundamental la fijacin biolgica de nitrgeno. Normalmente son de mayor tamao que las clulas vegetativas. La fijacin biolgica del nitrgeno es realizada por la enzima nitrogenasa y consiste en la reduccin del nitrgeno molecular a amonio, molcula nitrogenada que puede ser incorporada en la clula a compuestos orgnicos. Esta enzima tiene un gran inconveniente, su sensibilidad al oxgeno molecular, esto hace necesario que para que esta enzima funcione se ha de reducir forzosamente la tensin parcial de oxgeno en las proximidades de la enzima. Es por ello por lo que algunas cianobacterias han desarrollado diversas estrategias que les permiten fijar nitrgeno, en un sistema tan rico en oxgeno como es nuestro planeta (Adams 2000). Una de las estrategias ms extendidas dentro del Filum ha sido el desarrollo de estos heterocistos, como lugar en el que diferentes mecanismos aseguran una muy baja concentracin de oxgeno. El otro tipo celular diferente a las clulas vegetativas son los acinetos. Este tipo celular es una forma de resistencia que aparece cuando las condiciones ambientales son desfavorables. Tienen la capacidad de germinar despus de una larga exposicin al fro, desecacin y limitacin de fosfato (Herdman 1989). Los acinetos se forman a partir de las clulas vegetativas por acumulacin de nuevas capas de materiales polisacardicos en el lado exterior de la pared celular y por la formacin de acmulos de reserva en el protoplasma (fundamentalmente grnulos de cianoficina y de glucgeno). Tambin ocurren otros cambios fisiolgicos y qumicos como el incremento del contenido de

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Introduccin ARN, la desaparicin de las actividades biosintticas, la fotosntesis y los grnulos de polifosfato (Huber 1985). Cuando las condiciones ambientales mejoran, los acinetos pueden germinar dando lugar a un nuevo filamento.

1.2. Taxonoma de las cianobacterias.

La clasificacin de cianobacterias como ocurre en todo el mundo procarionte es problemtico. Dado que en un primer momento (antes de los estudios de microscopia electrnica), las cianobacterias al igual que las bacterias fueron clasificadas como plantas, existen dos sistemas taxonmicos diferentes, uno botnico y otro bacteriolgico. Aunque en los ltimos aos con el apoyo de las herramientas genticas se est intentando revisar y unificar ambos sistemas de clasificacin. El sistema bacteriolgico (Rippka y col., 1979) divide a las cianobacterias en cinco secciones en funcin de la organizacin y el modo de divisin que presentan los diferentes organismos, estas secciones son: Seccin I (orden Chroococcales en el sistema botnico). Engloba las cianobacterias unicelulares que se multiplican por fisin binaria o gemacin. Las clulas tienen forma esfrica, cilndrica u ovalada. Ej. Synechocystis. Seccin II (orden Pleurocapsales). Agrupa a las cianobacterias unicelulares que pueden formar colonias y que se multiplican por fisin mltiple, dando lugar a clulas hijas de menor tamao llamadas baeocitos. Ej. Dermocarpella. Seccin III (orden Oscillatoriales en el sistema botnico). Incluye cianobacterias filamentosas sin heterocistos, que se dividen en un nico plano. La multiplicacin se produce por rotura de filamentos y en algunos gneros tambin mediante la germinacin de acinetos, o la formacin de hormogonios. Ej. Planktothrix. Seccin IV (orden Nostocales en el sistema botnico). Dentro de esta seccin nos encontramos a las cianobacterias filamentosas con heterocistos, que se dividen en un solo plano y se reproducen mediante rotura de tricomas,

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Introduccin formacin de hormogonios o germinacin de acinetos. Ej. Anabaena, Aphanizomenon. Seccin V (orden Stigonematales en el sistema botnico). Formadas por las cianobacterias filamentosas con heterocistos en las que la divisin celular se realiza en dos planos, dando lugar a tricomas ramificados. La reproduccin se realiza como en las dos secciones anteriores. Ej. Mastigocladus. La aproximacin botnica (p.e. (Geitler 1932); (Komarek y Anagnostidis 1989)) se basa fundamentalmente en las caractersticas morfolgicas que estos organismos presentan como son: los planos de divisin celular, presencia de vaina alrededor del individuo o la colonia, pigmentacin, medidas del tricoma y de la clula, forma celular y en menor medida en las caractersticas ecofisolgicas que presentan las especies. Esta aproximacin utiliza las pautas del cdigo botnico de nomenclatura. Segn esta taxonoma botnica se distinguen 4 rdenes diferentes, estos son: Chroococcales. Engloban a las cianobacterias unicelulares tanto a las que forman colonias como a las que no. Dentro de este orden se distinguen 7 familias, que se agrupan en funcin del tipo de clula, la envuelta que presentaban y el tipo de reproduccin: Gloeobacteraceae (p.e. Gloeobacter), Synechococcaceae (p.e. Synechococcus), Merismopediaceae (p.e. Merismopedia ) Mycrocystaceae (p.e. Microcystis), Entophysalidaceae (p.e. Siphononema), Hydrococcaceae (p.e. Hydrococcus), Chamaesiphonaceae (p.e. Chamaesiphon), Dermocarpellaceae (p.e. Cyanocystis), Xenococcaceae (p.e. Xenococcus), Hyellaceae (p.e. Pleurocapsa). Oscillatoriales. Engloban a las bacterias filamentosas sin heterocistos, ni acinetos. Este orden engloba 6 familias: Pseudoanabaeneceae (p.e. Pseudoanabaena), Schizotrichaceae (p.e Schizothrix), Borziaceae (p.e. Borzia), Phormidiaceae (p.e. Phormidium), Gomontiellaceae (p.e. Hormoscilla) y Oscillatoriaceae (p.e. Oscillatoria).

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Introduccin Nostocales. Engloba a las bacterias filamentosas que presentan heterocistos y acinetos, pero no verdaderas ramificaciones. Engloba a 4 familias que se diferencian por la morfologa de las colonias, los filamentos, diferenciacin y posicin de heterocistos y acinetos. Las familias sn: Scytonemataceae (p.e. Scytomena), Microchaetaceae (p.e. Microchaete), Rivulariaceae (p.e. Gloeotrichia), Nostocaceae (p.e Anabaena). Stigonematales. Dentro de este orden se encuentran las cianobacterias que presenta heterocistos y talos morfolgicamente complicados (ramificaciones). Dentro de este orden podemos diferenciar 8 familias que tienen como caractersticas definitorias fundamentales: la estructura de los talos, tipo de ramificacin, posicin de los heterocistos y procesos reproductivos. Las familias son: Chlorogloeopsaceae (p.e. Chlorogloeopsis), Capsosiraceae (p.e. Capsoria), Stigonemataceae Bourzinemataceae (p.e. (p.e. Stigonema), Fischerellaceae Loriellaceae (p.e. (p.e. Fischerella), Geitleria),

Borzinema),

Nostochopsaceae (p.e. Mastigocoleus), Mastigocladaceae (p.e. Mastigocladus).

1.3. Ecologa de las cianobacterias.

Las cianobacterias son ubicuas, se han encontrado desde los polos, hasta los desiertos ms clidos. Esto es debido a la gran plasticidad ecolgica que presentan (Whitton y Potts 2000). Este grupo de algas pueden llegar a dominar el plancton de lagos y ocanos tropicales; tambin son caractersticas de otros ecosistemas acuticos como ros, fuentes termales etc. Junto con estos ecosistemas acuticos, tambin es posible encontrar cianobacterias adaptadas a ambientes terrestres, llegando a ser muy abundantes en suelos tropicales y en suelos saturados de agua por ejemplo en jardines encharcados (Figura I.4). Las cianobacterias que viven en el medio acutico se pueden clasificar ecolgicamente en dos grupos, planctnicas y bentnicas. Las primeras se caracterizan

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Introduccin por vivir libremente en la superficie o en la columna de agua, mientras que las segundas viven en el fondo o asociadas a un sustrato. Las cianobacterias juegan un papel muy importante como colonizadores primarios ya que incorporan materia orgnica al suelo y previenen la erosin. As mismo son la poblacin dominante en ambientes inhspitos como crteres volcnicos, fuentes termales, charcas y lagos alpinos o polares y sistemas lacustres y fluviales altamente contaminados (por vertidos orgnicos o inorgnicos) (Gibson y Smith 1982). Gracias a la capacidad fijadora de N2 que presentan algunas cianobacterias, son a menudo los nicos habitantes de aguas extremadamente deficientes en nitrgeno.

Figura I.4: Foto de Nostoc creciendo subaerofticamente. (Foto cedida por A. Quesada) En los ambientes terrestres, como hemos indicado con anterioridad las cianobacterias son una parte importante de la microflora. Predominan en los ambientes microaerobios y prximos al pH neutro de los suelos de arrozales anegados (Roger y Kolasooriya 1980). En los suelos polares de la tundra las cianobacterias abundan con un papel importante como productores primarios e incorporadores de N2 atmosfrico (Oliver y Ganf 2000). Las rocas de la Antrtida son otro medio extremo en el que aparecen las cianobacterias, as como en zonas desrticas junto a lquenes y algas. Finalmente, hay que destacar que las cianobacterias son capaces de formar relaciones simbiticas con gran cantidad de organismos: hongos, algas verdes,

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Introduccin diatomeas, musgos, angiospermas, protozoos, etc. (Whitton y Potts 2000). En estas asociaciones la cianobacteria excreta amonio para el hospedador, excepto en las asociaciones con hongos (lquenes), en las que aporta glucosa. El hospedador, a cambio le proporciona un sustrato donde desarrollarse y los metabolitos necesarios para el crecimiento. Las cianobacterias simbiticas tienen mayor actividad nitrogenasa y mayor porcentaje de heterocistos que las de vida libre y bajos niveles de glutamina sintetasa enzima necesaria para la incorporacin del amonio a los aminocidos.

1.4. Afloramientos de cianobacterias.

El crecimiento de un organismo depende de su habilidad para optimizar la obtencin de recursos, la eficiencia con que utiliza esos recursos y cmo minimiza las perdidas. Por ello es improbable que un organismo tenga la flexibilidad metablica que le permita dominar bajo todas las condiciones ambientales. De esta manera cuando domina en un momento y lugar, podemos suponer que las caractersticas que ese organismo presenta son especialmente adecuadas para las condiciones en las que se encuentra. Cuando se dan estas condiciones, en ocasiones las cianobacterias producen acumulaciones masivas de biomasa distribuida en la superficie o en la columna de agua, a estas acumulaciones masivas se las denomina afloramientos, o el trmino en ingls blooms. El trmino afloramiento est pobremente definido, pero en general una definicin aceptada es: incremento de biomasa fitoplanctnica significativamente superior a la media que presenta el ecosistema donde se encuentra, bajo esta definicin cualquier cuerpo de agua independientemente de su estado trfico puede presentar afloramientos. Esta definicin es tan abierta que en aguas dulces con usos de aguas potables o recreacionales suelen hacerse una modificacin de la definicin por la cual se describe un afloramiento en funcin de la concentracin celular que puede causar daos a los seres humanos. En este caso estaramos hablado de afloramiento cuando la concentracin de clorofila a sea superior de 10 g L-1, concentracin que equivale aproximadamente a 20000 clulas por mL. Cuando las cianobacterias dominan ese

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Introduccin afloramiento hablamos de afloramiento de cianobacterias o cianobacteriano (Oliver y Ganf 2000). Los afloramientos cianobacterianos no son un fenmeno nuevo y se han encontrado pruebas de su existencia en tiempos remotos (Reynolds y Walsby 1975), pero no ha sido hasta la actualidad en que su impacto sobre la calidad del agua se ha tenido ms en cuenta, especialmente debido a la produccin de toxinas. Si aadimos adems el dato de que existe una correlacin entre la cantidad de fsforo y la importancia de las cianobacterias dentro de la poblacin fitoplanctnica general (Watson y col.,, 1997). Parece indicar que a medida que la eutrofizacin de los lagos y embalses ha aumentado, en muchos casos debido a causas antrpicas, se ha incrementado la probabilidad de que se desarrollen afloramientos de microalgas en general y de cianobacterias en particular. No todos los autores estn de acuerdo sobre las caractersticas que promueven la formacin de los afloramientos. Se han propuesto diversas causas y probablemente la razn de que aparezcan sea una mezcla de todas ellas y algunas otras que aun no han sido definidas. Esta multitud de variables que estaran interactuando y promoveran la aparicin de un afloramiento sera la razn por la cual en la actualidad no existe ninguna forma eficiente de predecir la formacin de un afloramiento. Las principales razones que se han publicado para explicar la aparicin de los afloramientos son: Las vesculas de gas que les permiten regular su posicin en la columna de agua. Esta propiedad las da una ventaja importante sobre otras micro-algas, especialmente en aguas profundas donde la intensidad de la turbulencia es baja (Oliver 1994). Las importantes diferencias en los complejos antena de los fotosistemas y en la composicin de los pigmentos fotosintticos que estos organismos presentan en comparacin con otros miembros del fitoplancton. A mediados de los aos 80 se defenda que las cianobacterias tenan bajos requerimientos lumnicos pero en a actualidad no est claro que esta diferencia se traduzca en diferentes respuestas a

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Introduccin cambios en la intensidad lumnica, longitud del da y composicin espectral (Oliver y Ganf 2000). La energa necesaria para sintetizar las vesculas de gas en las cianobacterias podra ser suficiente para favorecer a las algas verdes bajo condiciones de baja luz. Durante los aos 80 tambin se defenda que la temperatura del agua entre 2540 C (Robarts y Zohary 1987) favoreca a las cianobacterias. No obstante, en la actualidad no hay evidencias que soporten la hiptesis que las cianobacterias capaces de formar afloramientos prefieran temperaturas superiores a otras micro-algas (Oliver y Ganf 2000), de hecho en la Comunidad de Madrid se han descrito afloramientos durante momentos en que la temperatura del agua era inferior a 25C (Sanchis y col., 2002). La forma qumica de nitrgeno inorgnico que est disponible podra influir en qu tipo de algas tuviera xito. Se ha propuesto que las cianobacterias no fijadoras de nitrgeno son favorecidas por el amonio, las fijadoras, por la deficiencia de nitrgeno y las micro-algas por el nitrato. Aunque no existen pruebas concluyentes acerca de estas preferencias sobre las formas nitrogenadas (Oliver y Ganf 2000). Hay evidencias abrumadoras de que el ratio NT:PT per se no influye sobre la presencia de cianobacterias. Sin embargo, las fijadoras de nitrgeno pueden aparecer si el ratio NT:PT es bajo indicando que el nitrgeno es limitante (Oliver y Ganf 2000), pero incluso las cianobacterias no fijadoras aparecen cuando la relacin es baja (Elser 1999). Se ha propuesto que las cianobacterias son ms eficientes en condiciones en las que nos encontramos bajas concentraciones de carbono inorgnico (CO2) (Caraco y Miller 1998). Tambin se ha propuesto que las cianobacterias seran ms eficientes en la competicin por los elementos traza (Hyenstrand y col.,, 1998), pero hay pocos datos disponibles y no es consistente con la filogenia, por lo que son necesarios ms datos para poder confirmar sta como una de las

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Introduccin razones que expliquen la aparicin de afloramientos cianobacterianos (Oliver y Ganf 2000). Finalmente la ltima idea que desde los aos 80 se ha defendido como una de las ideas fundamentales para explicar la aparicin de afloramientos es la resistencia natural que presentan, sobre todo por parte de las colonias ms grandes, a la predacin por parte del zooplancton, lo que puede ser una ventaja sobre las dems micro-algas (Wiegand y Pflugmacher 2005). Sin embargo, (Elser 1999) ha propuesto un modelo conceptual, segn el cual el ltimo factor que controlara la aparicin de un afloramiento de cianobacterias txicas sera la presencia o no de Daphnia, aunque son necesarios una serie de factores nutricionales e hidrodinmicos previos que favoreceran la aparicin del afloramiento. Esto junto con otras caractersticas como son la produccin de compuestos alelopticos que les permitiran desplazar al resto de los grupos algales (Hulot y Huisman 2004). Recientemente se ha propuesto un mtodo que intenta integrar esta complejidad utilizando para ello las interacciones ecolgicas (por ejemplo la comunidad de fitoplancton interacciona con virus, hongos, bacterias, zooplancton y niveles trficos superiores, (Sommer 1989)). Puesto que la sucesin de especies en el ecosistema depende de la interaccin de mltiples factores ambientales y esto se observara analizando esta sucesin de las especies en el fitoplacton. Por ejemplo (Roelke y Buyukates 2002) ha propuesto que en el embalse de Hartbeespoort, que se caracteriza por presentar afloramientos de M. aeruginosa, para que este ocurra, era necesario que se dieran dos condiciones: por un lado que existiera una sucesin de especies rpida y por otro lado que la diversidad que presentara el embalse antes del afloramiento fuera baja, de manera que en los embalses que presentan una diversidad elevada y la sucesin entre especies lenta, sera caracterstico una resistencia a la presencia de afloramientos de cianobacterias txicas.

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Objetivos

2. Objetivos
Se conoce poco de cual es la relevancia de las cianobacterias en los embalses espaoles. Esta falta de informacin y la importancia estratgica que tienen los embalses para el consumo de la poblacin, invita a analizar la presencia de este tipo de organismos en los embalses ms relevantes que abastecen a la poblacin. En este trabajo nos hemos centrado particularmente en los embalses de la Comunidad de Madrid. Los objetivos de este capitulo son: Analizar la presencia e importancia de las cianobacterias en la poblacin fitoplanctnica durante el periodo en que la concentracin de clorofila a en los lagos y embalses de la zona templada suele ser ms elevada. Estudiar dentro de la poblacin de cianobacterias tpicas en los embalses de la Comunidad de Madrid la importancia de las cianobacterias potencialmente txicas y su diversidad. Relacionar la presencia de afloramientos de cianobacterias con las condiciones ambientales de cada embalse. Establecer una definicin de afloramiento para los embalses de la Comunidad de Madrid.

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Materiales y Mtodos

3. Materiales y Mtodos.

3.1. Zona de Estudio.

La zona de estudio incluye los embalses de Lozoya, Ro Sequillo, El Velln, Santillana, Valmayor, San Juan y Picadas todos ellos situados en ros pertenecientes a la cuenca hidrogrfica del Tajo. Estos embalses pueden contener ms del 42% de agua embalsable de la Comunidad de Madrid. Estos cuerpos de agua se muestrearon en el periodo de mxima probabilidad de formacin de afloramientos entre el mes de Junio y Noviembre en el ao 2001.y de Julio a Noviembre en el ao 2002. 3.1.1. Embalse de Lozoya. El embalse de Lozoya se encuentra situado en la provincia de Madrid, en el trmino municipal de Lozoya del Valle y Pinilla del Valle. Recibe aguas del ro Lozoya y su cuenca est dominada fundamentalmente por gneiss, situndose el embalse en una zona donde tambin encontramos margas y conglomerados (Figura I.5) y (Figura I.12). Algunas de las caractersticas hidromtricas del embalse se pueden observar en la Tabla I.1.

Figura I.5: Foto del embalse de Lozoya. Marcados los puntos de muestreo L1 y L2

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Materiales y Mtodos 3.1.2. Embalse de Ro Sequillo.

El embalse de Ro Sequillo se encuentra situado en los trminos municipales de Pinilla de Buitrago, El Cuadrn y Buitrago de Lozoya y embalsa aguas del ro Lozoya, (Figura I.6) (Figura I.12). Este embalse que embalsa 49 Hm3 (Tabla I.1) presenta una profundidad media de casi 17,5 m. El embalse se encuentra construido en una zona donde geolgicamente domina el gneiss.

Figura I.6: Foto del embalse de Ro Sequillo. Marcado el punto de muestreo

3.1.3. Embalse de El Velln.

Situado en los municipios de El Velln y Pedrezuela (Figura I.7) (Figura I.12), este embalse est construido en una zona geolgicamente ms compleja que los embalses anteriores estando su cuenca dominada por gneiss y granitos como toda la Sierra Norte de Madrid, pero tambin encontramos areniscas y conglomerados y es particularmente importante una veta de calizas y margas. Algunas de las caractersticas de esta presa pueden verse en la Tabla I.1

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Figura I.7: Foto del embalse de El Velln. Marcado el punto de muestreo 3.1.4. Embalse de Santillana. El embalse en Santillana embalsa aguas de ro Manzanares, afluente del Tajo. Este embalse se encuentra situado en los trminos municipales de Manzanares el Real y Soto del Real (Figura I.8) (Figura I.12). Cabe destacar que junto al embalse del Atazar, es el embalse que presenta una mayor superficie mxima, con un volumen mximo embalsado de 91 Hm3 (Tabla I.1). Geolgicamente la cuenca del ro est fundamentalmente dominada por rocas granticas, presentando en el margen superior areniscas y alguna pequea zona caliza.

Figura I.8: Foto del embalse de Santillana. Marcados los puntos de muestreo S1 y S2.

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Materiales y Mtodos 3.1.5. Embalse de Valmayor.

El embalse de Valmayor almacena aguas del ro Aulencia, siendo el nico situado en este ro, afluente del ro Guadarrama. Est construido en terrenos pertenecientes a los municipios de El Escorial, Valdemorillo y Colmenarejo (Figura I.9) (Figura I.12). Geolgicamente est construido en una zona grantica con algunos gneiss. Este embalse se encuentra entre los mayores de la Comunidad de Madrid con un volumen de agua embalsado de 124 Hm3 y junto con el embalse de San Juan el nico en el cual se permite la navegacin a vela. Otros datos acerca de las caractersticas del embalse puede verse en la Tabla I.1.

Figura I.9: Foto del embalse de Valmayor. Marcados los puntos de muestreo V1, V2 y V2.

3.1.6. Embalse de San Juan.

El embalse de San Juan, se encuentra situado en el ro Alberche dentro del trmino municipal de San Martn de Valdeiglesias (Figura I.10) (Figura I.12). Se encuentra en una zona geolgicamente dominada por gneiss. Es el mayor de los embalses analizados con una profundidad media de 21,2 m y embalsa ms de 138 Hm3 (Tabla I.1).

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Figura I.10: Foto del embalse de San Juan. Marcado el punto de muestreo. 3.1.7. Embalse de Picadas. El embalse del Picadas se encuentra aguas abajo del de San Juan, embalsando igualmente aguas del ro Alberche. Esta construido en terrenos de los municipios de Navas del Rey y San Martn de Valdeiglesias (Figura I.11) (Figura I.12), siendo el embalse ms pequeo de todos los muestreados con un volumen embalsado de 15,2 Hm3 y una profundidad media de 16,3, lo que indica que se trata de un embalse situado en una valle profundo, pero ocupando muy poca superficie, 91,7 ha Tabla I.1 Respecto a la geologa nos encontramos en una zona grantica.

Figura I.11: Foto del embalse de Picadas. Marcado los puntos de muestreo P1 y P2.

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Figura I.12. Situacin de los embalses analizados, 1 = Lozoya , 2 = Rio Sequillo, 3 = El Velln, 4 = Santillana, 5 = Valmayor, 6 = San Juan, 7 = Picadas. V. max (Hm3) 38 49 41 91 124 138 15,2 Area Max. (ha) 480 280 393 1044 755 650 91,7 Prof. Max. (m) 25 56 47 36 51 67 58 Prof. Media (m) 7.9 17.5 10.4 8.7 16.4 21.2 16.3 Longitud/ Latitud 40 56 45 N 3 47 07 W 40 58 36 N 3 39 31 W 40 45 43 N 3 3729 W 40 42 49 N 4 49 5 W 40 32 10 N 4 0319 W 40 23 37 N 4 19 06 W 40 20 11 N 4 15 12 W

Embalse Lozoya Ro Sequillo El Velln Santillana Valmayor San Juan Picadas

Tabla I.1: Caractersticas morfomtricas de los embalses de Lozoya, Ro Sequillo, El Velln, Santillana, Valmayor, San Juan y Picadas. V = Volumen, Prof. = profundidad y Max. = mxima. La profundidad media fue obtenida de la divisin del Volumen mximo, por el rea mxima.

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3.2. Toma de muestras.

Las muestras fueron recogidas en botes de polietileno previamente lavados con cido clorhdrico al 10% y posteriormente aclarados con agua desionizada (miliRho, Millipore). La toma de muestra se realiz a varios metros de la orilla y a una profundidad de 50 cm, evitando la recogida de material biolgico acumulado si es que ste se encontraba presente. Las muestras recogidas se mantuvieron a 4 C hasta realizar el procesamiento sin dejar pasar ms de 4 horas tras la toma de stas. Se tomaron tres botes diferentes, uno para el anlisis taxonmico, otro para el anlisis de clorofila a y microcistina y un ltimo bote para el anlisis de las caractersticas qumicas del agua y anlisis de fluoromtrico de concentracin de clorofila a y de grupos algales. Finalmente, tambin se tom una muestra en un bote de 100 mL estril para la medida de fsforo total. Las muestras se tomaron en el mismo punto en todos los muestreos y en los embalses en los que se observ un afloramiento de microalgas se realiz el muestreo en un segundo punto suficientemente alejado del punto de muestreo usual, con el fin de obtener una mejor visin del embalse en global. En el caso del embalse de Valmayor se eligieron dos puntos extras diferentes en el ao 2002 (V2) y en el ao 2003 (V2)

3.3. Determinacin de Nutrientes.

Se realizaron medidas de la concentracin de nitrgeno inorgnico (amonio, nitrato y nitrito), fosfato y fsforo total. Para las 4 primeras variables se utiliz agua filtrada por GF/F (Whatman, Gran Bretaa) de 47 mm de dimetro, con un valor nominal de tamao de partcula retenida de 0,7 m, para el fsforo total se utiliz agua sin filtrar.

3.3.1. Anlisis de amonio. Para la medida de amonio (N-NH4+) se utiliz un laboratorio porttil modelo DREL/2010 (Hach, EEUU), equipado con espectrofotmetro de campo, realizando todas las

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Materiales y Mtodos medidas en las siguientes 4 horas a la obtencin de las muestras. Las medidas se efectuaron segn una variacin del mtodo Nessler, modificado por Hach siguiendo los principios de (APHA 1998). El rango de deteccin estuvo entre 0,01 y 2,5 mg L-1 de N-NH4+. 3.3.2. Anlisis de nitrato y nitrito.

La determinacin de nitrato y nitrito se realiz simultneamente mediante electroforesis capilar (CIA System, Waters. EEUU). Se trata de una tcnica de separacin en funcin de la diferente movilidad de los compuestos al ser inyectados en un capilar bajo el efecto de un campo elctrico. La deteccin de los diferentes compuestos se realiza mediante la lectura de la absorbancia en la regin del UV/vis. La medida se hizo utilizado un capilar de slice fundido de 75 m de dimetro y 60 cm de longitud, rodeado de poliamida salvo en la zona que se utiliza como celda de medida para evitar la perdida de sensibilidad que el recubrimiento producira. La diferencia de potencial aplicado a ambos lados del capilar fue de 20 Kv, estando el polo positivo en el lado donde se encontraba la celda de deteccin. La toma de muestra se realiz por electromigracin, el cual consiste en la aplicacin de un potencial de 5 Kv, que concentra los aniones antes de proceder a su inyeccin. Esto permite aumentar el lmite de deteccin, aunque en ese caso la conductividad de la muestra afecta a la determinacin. Para evitar esta interferencia se calcul una relacin entre la seal y la conductividad de una concentracin conocida y con ello se corrigieron los datos obtenidos. La longitud de onda a la cual se realiz la deteccin fue de 214 nm empleando una lmpara de Zinc; a esta longitud de onda absorben tanto el nitrato como el nitrito, permitiendo la deteccin directa de ambos iones. Para la realizacin de los anlisis se utiliz un electrolito basado en el sulfato sdico. Para su preparacin se mezclaron 142 mg de Na2SO4, 2,5 mL de OFM-OH (Waters, EEUU), 2 mL de una solucin cido brico (40 gr L-1) y se enraso con agua Milli-Q hasta alcanzar un volumen final de 100 mL. El electrolito obtenido se filtr por una membrana GV de 0,22 m (Millipore, EEUU). Con los elementos descritos, el rango de deteccin estuvo entre 0,02 y 2 mg L-1 de N-NO2- y N-NO3-.

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Materiales y Mtodos 3.3.3. Anlisis de fosfato. La medicin de fosfato se realiz slo en las muestras del ao 2003 y para ello se sigui como en el caso de del nitrato y el nitrito un mtodo utilizando la electroforesis capilar. No obstante, el fosfato no absorbe en la regin del UV/vis, por esta razn hay que utilizar un mtodo indirecto de medida. En este caso, el electrolito utilizado estuvo basado en el cromato, que absorbe a 254 nm (lmpara de mercurio). En este caso cuando llega a la celda de deteccin el in, se produce una disminucin en la absorbancia de electrolito proporcional a la concentracin de analito. Tanto el capilar, como las condiciones elctricas fueron las mismas que las utilizadas en el anlisis de nitrato y nitrito. El electrolito utilizado fue cromato sodico 7 mM / OFM-OH 0,5 mM ajustado a pH = 8 con cido brico. Antes de su anlisis se aadi a las muestras clorato que sirvi como patrn interno y evito las diferencias de carga que producen las diferencias de conductividad de las muestras. El rango de deteccin estuvo entre 0,01 y 0,5 mg L-1 de P-HPO42-.

3.3.4. Anlisis de fsforo total.

Para analizar el fsforo total de las muestras de agua bruta son necesarias dos reacciones consecutivas. En una primera reaccin se realiz una digestin cida con persulfato potsico que tiene como objetivo el liberar todo el fsforo presente en la materia orgnica. Para ello a cada 50 mL de muestra se le aadi 10 mL de reactivo de digestin. Este reactivo de digestin contena 6 % (peso/volumen) K2S2O8 y H2SO4 a una concentracin 0,36 N. Posteriormente se autoclav la mezcla durante 30 minutos a 121C. Posteriormente y tras esperar a que la muestra se atemperara se equilibro el pH de la muestra a pH = 7 con NaOH. El anlisis de la cantidad de fsforo presente en la muestra ya digerida fue realizado siguiendo el mtodo del cido ascrbico (mtodo 4500-P) siguiendo al instrucciones descritas en el (APHA 1998). El rango de deteccin fue entre 0,01 y 0,5 mg P L-1.

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3.4. Determinacin de variables fsico-qumicas.

Las variables fsico-qumicas, temperatura, conductividad, oxgeno disuelto, turbidez y pH, fueron medidos in situ por medio de una sonda multiparamtrica YSI modelo 6920 (EEUU) calibrada con anterioridad. Para ello, la sonda se sumergi permitiendo que el oxgeno disuelto se estabilizara durante varios minutos antes de comenzar la toma de muestras.

3.5. Determinacin del contenido de Clorofila a.

Las muestras para el anlisis de clorofila a fueron conservadas a 4 C hasta su llegada al laboratorio donde fueron filtradas a travs de filtros GF/F (Whatman, Gran Bretaa) de 47 mm de dimetro, con un valor nominal de tamao de partcula retenida de 0,7 m. Para la filtracin se utiliz una rampa de filtracin de aluminio (Pall corp., EEUU) y una bomba de vaco Me 4P (Vacuubrand GMBH, Alemania), a presin negativa moderada, con el fin de de evitar la rotura celular. El volumen de filtracin fue de 500 mL. Las extracciones se realizaron a partir del material retenido en los filtros cortndolos en pequeos pedazos, que fueron introducidos en un tubo de centrifuga. Al material retenido en cada filtro se le realizaron 2 extracciones consecutivas de 24 horas con metanol al 90%. La medida de absorbancia fue realizada a dos longitudes de onda, 750 y 665 nm, en un espectrmetro de doble haz Hitachi U-2000 (Hitachi, Japn). La absorbancia fue convertida en concentracin aplicando el coeficiente de extincin de Marker (Marker y col., 1980).

3.6. Determinacin de clorofila a y grupos algales por mtodos fluoromtricos.

La determinacin fluoromtrica de la clorofila a total y su asignacin a los diferentes grupos algales (algas verdes, diatomeas, criptofitas y cianobacterias) fue realizada mediante un fluormetro porttil marca BBE Moldake (Alemania).

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Materiales y Mtodos

La realizacin de la asignacin de los distintos grupos algales se basa en el diferente espectro de excitacin/emisin que los organismos presentan. Los diferentes grupos algales se caracterizan por presentar diferentes y caractersticos pigmentos en sus sistemas fotosintticos (Tabla I.2). El mtodo fluoromtrico se basa en las diferentes caractersticas pticas de los pigmentos y la emisin de fluorescencia de la clorofila a que provocan al ser excitados a diferentes longitudes de onda, permitindonos as establecer una asignacin de qu proporcin de la clorofila a total pertenece a cada uno de estos grupos. El fluormetro utilizado posee 5 LEDs que emiten en 5 longitudes de onda diferentes, 450, 525, 570, 590 y 610 nm y posteriormente el sistema recoge la fluorescencia producida a la longitud de onda de 680 nm en que emite la clorofila a.

Longitud de onda (nm) 450 525 570 590 y 610

Pigmento Clorofila a y b Fucoxantina Peridina Ficoeritrina Ficocianina

Grupo algal Chlorophyceae Bacillariophyceae Dinophyceae Cryptophyceae Cyanophyceae Cyanophyceae

Tabla I.2. Identificacin de las longitudes de onda emitidas por cada uno de los LEDs y pigmento al que excitan y grupo algal al que pertenecen. Las muestras se analizaron en las 5 horas siguientes a su recogida, se mantuvieron en oscuridad y a su llegada a laboratorio fueron dejadas atemperar durante 30 minutos pasados los cuales y despus de realizar un blanco con agua de la muestra filtrada por filtros GF/F, para evitar las interferencias que las sustancias amarillas pudieran producir, se analizaron las muestras recogidas sin realizar ningn tipo tratamiento previo. Una prdida de calibracin del aparato impidi obtener los datos de grupos algales el ao 2002 desde mediados de octubre hasta el final del periodo de muestreo.

33

Materiales y Mtodos

3.7. Identificacin de gneros cianobacterianos.

Para la identificacin de las especies de cianobacterias planctnicas, una muestra de agua de un litro fue mantenida sin mover durante la noche para permitir que las cianobacterias con capacidad de flotacin subieran a la superficie. Posteriormente fueron recogidas con una pipeta y se identificaron microscpicamente en un microscopio ptico Olympus BH-2 (Japn) segn ((Geitler 1932); (Komarek y Anagnostidis 1989) y (Komarek y Anagnostidis 1999)). La abundancia relativa de las especies de las cianobacterias presentes se realiz en categoras siguiendo la siguiente escala de abundancias: 0 = Ausencia, 1 < 1%, 2 =1-10%, 3 = 11-25%, 4 = 26-50%, 5 = 51-75%, 6 = 75-100% (Necchi y col., 1991).

3.8. Anlisis estadstico.

El anlisis estadstico se realiz por medio de los paquetes estadsticos SigmaStat 3.01 y SPSS 14.0. El anlisis de correspondencias se realiz por el paquete informtico CANOCO 4.0.

34

Resultados

4. Resultados.
Poco se conoce acerca de la importancia que las cianobacterias tienen en los embalses de la Comunidad de Madrid y en extensin en los cuerpos de agua dulce mediterrneos. Pero dado que la eutrofizacin parece incrementar la importancia de las cianobacterias sobre otros organismos fotosintticos, podra esperarse que estos organismos fueran relevantes dentro de la poblacin fitoplactnica presente en los embalses de la Comunidad de Madrid. Para estudiar su importancia se seleccionaron 7 embalses y se analizaron la presencia de cianobacterias planctnicas, los nutrientes y las caractersticas fsico-qumicas del agua. Los valores encontrados en los puntos secundarios en los embalses analizados fueron muy similares a los encontrados en el punto principal, aquel que fue muestreado en todas las ocasiones. Los datos recogidos en los puntos secundarios pueden verse en el ANEXO, salvo para el embalse de Picadas que muestra claras diferencias entre un punto y otro, razn por la cual se tratarn en este capitulo.

4.1. Embalse de Lozoya.

El embalse se muestre en el punto principal en 11 ocasiones en el ao 2002 y en 12 ocasiones en 2003. El punto secundario, se muestre en un ocasin en el ao 2002 y en dos en el ao 2003. En general, este embalse present concentraciones superiores de biomasa en 2002 en comparacin a las obtenidas durante 2003 y respecto a las variables qumicas las concentraciones encontradas fueron del mismo rango en ambos aos, siendo los mximos encontrados ligeramente inferiores tambin en 2003 a los hallados en 2002.

4.1.1. Nutrientes. Como nutrientes se midieron las concentraciones de nitrato, nitrito y amonio (nitrgeno inorgnico disuelto o NID) y de fsforo total desde el mes de agosto del 2002 en adelante y del fosfato soluble en 2003 (Figura I.13). En general las concentraciones de nutrientes se mantuvieron bajas hasta finales de octubre momento en el cual, coincidiendo con la rotura de la termoclina, se produjo una entrada de nutrientes a la parte ftica del sistema. Este incremento en los nutrientes fue especialmente importante en el caso del nitrato en ambos aos 35

Resultados y del fosfato soluble en 2003, nico ao para el cual existen valores para esta variable en todos los embalses. Respecto a la relacin entre nitrgeno inorgnico y el fsforo total, hallamos tendencias contrarias en ambos aos. As, mientras que en el 2002 se alcanzan los mximos valores (superiores a 20) a finales de ao, coincidiendo con la rotura de la termoclina, en el 2003 los valores nicamente fueron superiores a 5 en el primer muestreo del ao, en el mes de junio, mantenindose estables a partir de ese momento. El fsforo total por otro lado present patrones de concentracin diferentes al resto de nutrientes, alcanzndose los valores ms elevados en los meses de agosto, septiembre y octubre antes de la rotura de la termoclina.
2002
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
1000 600 500 400 300 200 100 0

2003
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
600 500 400 300 200 100 0

Amonio Nitrato Nitrito

Amonio Nitrato Nitrito

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
120 120 100 100 80 60 40 20 0

2003
Fosfato soluble Fosforo total

Fosforo Total (g P L-1)

Fsforo (g P L-1)

80 60 40 20 0

jul
25

ago

sep

oct

nov

dic
25

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
20 20

2003

NID/Ptot (g N g P )

15

NID/Ptot (g N g P )

-1

-1

15

10

10

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.13. Concentraciones de nutrientes en el embalse de Lozoya. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003 36

Resultados 4.1.2. Variables fsico-qumicas.

Dentro de las variables fsico-qumicas la temperatura fue la que present valores ms similares en los aos (Figura I.14), El resto de ellos presentaron mayores diferencias. As, en el caso de la turbidez, oxgeno disuelto y pH el ao 2002 presentan un pico en el mes de septiembre en el cual las tres caractersticas son superiores a las que se presentaron en ese mismo momento en el ao siguiente, aunque la turbidez aparece ligeramente desplazada en el tiempo con respecto a las otras dos variables. En el ao 2003 si embargo en ese mismo momento puede observarse una tendencia contraria, mostrando tanto el oxgeno disuelto y del pH una disminucin respecto a resto del ao. Respecto a la conductividad los valores observados son propios de aguas con baja carga de sales disueltas como ocurre en zonas de rocas silceas en las que se encuentra situada la cuenca de este embalse. De este modo, en el 2002 los valores fueron estables durante todo el ao mientras que en el 2003 encontramos valores bastante inferiores al principio del periodo de muestreos elevndose posteriormente hasta valores similares a los que se presentaron en 2002.

4.1.3. Clorofila a y fitoplancton. El embalse de Lozoya ha presentado concentraciones de clorofila a muy variables en ambos aos. En el ao 2002 la concentracin de clorofila a tanto media como mxima fue muy superior a la que se determin en el ao 2003. As, en el ao 2002 la concentracin mxima se alcanz en el mes de septiembre y fue superior a 100 g Clo a L-1(Figura I.15). Por otro lado, en el ao 2003 las concentraciones mximas de clorofila a fueron inferiores a 20 g Clo a L-1, si bien el mximo de este ao se encontr tambin en el mes de septiembre. Cuando analizamos la preponderancia de los diferentes grupos algales, observamos que las cianobacterias fueron el grupo ms importante durante el periodo de muestreo en los dos aos estudiados, con un porcentaje medio de presencia superior al 50% en ambos aos (79,6% 23,4% en el ao 2002 y 59,4% 21,4% en el 2003). Esta importancia relativa se puede observar claramente en los momentos en los que se alcanzaron las concentraciones mximas de clorofila a, puesto que los mximos de los dos aos coinciden con el momento en el que las cianobacterias fueron el grupo dominante en la poblacin de fitoplanctnica, siendo

37

Resultados especialmente claro en el ao 2002 en el cual, coincidiendo con el mximo de biomasa algal, las cianobacterias dominaron de manera exclusiva la poblacin.

30 25 20 15 10 5 0

40 35 30

Temperatura del agua (C)

2002 2003

Turbidez (NTU)
2002 2003

25 20 15 10 5 0

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

110 100 80 70 60 50 40 30 20 10 0 90

14 12

Oxigeno disuelto (mg L )

Conductividad (S cm )

-1

-1

10 8 6 4 2 0

2002 2003

2002 2003

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

pH

6 4 2 0

2002 2003

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.14. Variables fsico-qumicas analizadas en el embalse de Lozoya. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxgeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003

38

Resultados

2002
140 120
-1

2003
100 80 60 40 20 0 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 jun jul ago sep oct nov dic 100 80 60 40 20 0

% de grupos algales

Clo a g L

80 60 40 20 0 jun jul ago sep oct nov dic

Figura I.15. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el embalse de Lozoya. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. Ntese la diferencia en la escala del eje Y. En paralelo al resto de anlisis se realiz el anlisis microscpico de las especies de cianobacterias planctnicas presentes (Figura I.16). Los dos aos se caracterizaron por presentar una elevada diversidad de cianobacterias (fue el embalse que present un mayor numero de especies de cianobacterias diferentes). Adems, es un embalse que se caracteriza por presentar una abundancia elevada de cianobacterias filamentosas fijadoras de nitrgeno, siendo posible identificar hasta 5 especies de cianobacterias filamentosas fijadoras: 4 de ellas pertenecientes al gnero Anabaena y otra perteneciente al genero Aphanizomenon. Las otras cuatro especies de cianobacterias presentes pertenecieron al orden de las Chroococales: tres pertenecientes al gnero Microcystis y la otra perteneciente al gnero Woronichinia. Durante todo el periodo de muestreo en el ao 2002, el gnero ms abundante fue el gnero Anabaena, siendo especialmente importante la especie A. crassa que fue dominante en el momento en que la concentracin de clorofila a alcanz el mximo. Posteriormente y en paralelo a la disminucin de clorofila a, se produjo un cambio en el gnero ms importante en la poblacin cianobacteriana, que pas a ser W. naegeliania y adems se apreci una ligera subida de M. aeruginosa. Finalmente, en los ltimos muestreos, el gnero Anabaena volvi a

Clo a g L

-1

100

39

% de grupos algales

Resultados ser el dominante, perteneciendo a este gnero las especies codominantes que podamos encontrar. En el ao 2003 se incrementa en general la importancia de las cianobacterias pertenecientes al orden Chrocoocales, de tal manera que dos gneros de dicho orden, Microcystis y Woronichinia, dominaron la poblacin a lo largo del ao. En un primer momento fue Microcystis el gnero que domin hasta principios de septiembre y posteriormente fue sustituida por Woronichinia. Respecto a la presencia de Anabaena, estuvo presente durante todo el periodo de muestreo, pero slo lleg a ser mayoritaria en una fecha puntual en todo el periodo de muestreo, aunque en momentos concretos lleg a codominar junto a las Chrocoocales. Respecto a la diversidad en nmero de especies fue muy similar al encontrado en 2002, detectndose seis especies diferentes, siendo en este caso los gneros Microcystis y Anabaena la que ms especies diferentes mostraron con tres cada una. Las tres especies ms importantes durante este ao fueron, M. aeruginosa, A. flos-aquae y W. naegeliana que fueron sucedindose a lo largo del ao.

4.2. Embalse de Ro Sequillo.

Este embalse se encuentra aguas abajo del embalse de Lozoya y se muestre en un solo punto. Se analiz en nueve ocasiones en 2002 y siete ocasiones en 2003. Este embalse present valores de biomasa y de caractersticas qumicas similares en los dos aos de muestreo.

4.2.1. Nutrientes. Como ndice de nutrientes se midieron las concentraciones de nitrato, nitrito y amonio (nitrgeno inorgnico disuelto o NID) y de fsforo total desde el mes de agosto del 2002 en adelante y el fosfato soluble en 2003 (Figura I.17). Los valores observados en el 2003 parecen indicar que no llegamos a observar la rotura de la termoclina, puesto que los valores mximos de nitrgeno inorgnico disuelto y fsforo se observaron a principio de la temporada de muestreo mantenindose bastante estables con posterioridad y sin que pueda verse el incremento tpico que ocurre despus la rotura de la estratificacin, fenmeno que s observamos en el ao 2002. 40

Resultados

2002
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
2 3 -7 -0 2 7 -7 -0 2 2 2 -8 -0 2 3 -9 -0 2 1 0 -8 -0 2 -0 20-9 2 3-10 -0 2 10-1 0 -0 2 1 6 -1 0-02 5 -1 1 -02 2 2 -1 1-02

2003
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
15 -1 003 4903 24 -1 003 30 -1 11 -1 203 -0 3 5603 16 -7 -0 3 20 -8 -0 3 30 -7 -0 3 18 -9 -0 3 910 -0 3 110 -0 3 47 003

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

Figura I.16. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el embalse de Lozoya. 41

Resultados Esta idea se encuentra apoyada porque la temperatura del agua en el ao 2003 no alcanz el valor mnimo observado en el ao 2002. Las concentraciones de nutrientes en general parecen ser superiores de todas maneras en el ao 2002 comparadas a las obtenidas en el ao 2003. Por ejemplo, durante los meses de septiembre y octubre las concentraciones de nitrgeno inorgnico fueron aproximadamente el doble en el 2002 que en el 2003, cosa que tambin ocurre con el fsforo total. Cuando analizamos la relacin NID/Ptot se observa un comportamiento inverso en ambos aos. As en el ao 2003 los valores alcanzaron un mximo superior a 15 a principios de septiembre, mientras que en 2002 el mximo fue ligeramente superior a 6 y se observ a principios de la temporada de muestreo, en el mes de junio.
2002
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
800 400

2003
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
250 200

A m o n io N itra to N itrito

A m o n io N itra to N itrito

300

150

200

100

100

50

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

2002
120 60 100 80 60 40 20 0 0

2003
F o s fa to s o lu b le F o s fo ro to ta l

Fosforo Total (g P L-1)

Fosforo (g P L-1) ju l ago sep oct nov d ic

40

20

ju n

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

2002
20 20

2003

NID/Ptot (g N g P )

15

NID/Ptot (g N g P )

15

-1

10

-1

10

ND

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

Figura I.17. Concentraciones de nutrientes en el embalse de Ro Sequillo. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003.

42

Resultados

4.2.2. Variables fsico-qumicas. Las variables fsico-qumicas fueron muy similares en los dos aos (Figura I.18). Slo en el caso de la conductividad existen pequeas diferencias entre los dos aos, encontrndonos valores de aproximadamente 90 S cm-1 en el ao 2002 y de 70 S cm-1 en el ao 2003. Cabe destacar que en este embalse el pH estuvo cercano a la neutralidad durante los dos aos analizados

30 25 20 15 10 5 0

40 35 30

Temperatura del agua (C)

2002 2003

Turbidez (NTU)
2002 2003

25 20 15 10 5 0

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

110 100 80 70 60 50 40 30 20 10 0 90

14 12

Oxigeno disuelto (mg L )

Conductividad (S cm )

-1

-1

10 8 6 4 2 0

2002 2003

2002 2003

ju n
12 10 8

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

pH

6 4 2 0

2002 2003

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

Figura I.18. Variables fsico-qumicas encontradas en el embalse de Ro Sequillo. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxgeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003.

43

Resultados 4.2.3. Clorofila a y fitoplancton.

El embalse de Ro Sequillo ha presentado concentraciones de clorofila a relativamente bajas, los mximos detectados de la misma durante los dos aos de muestreo fueron inferiores a 40 g Clo a L-1(Figura I.19), alcanzndose este mximo en los dos periodos en el mes de octubre. Como en el caso del embalse anterior, las concentraciones de clorofila a fueron claramente inferiores en el ao 2003 cuando las comparamos con el 2002, as los valores medios de la concentracin en 2003 fueron tres veces inferior a los que se mostraron en el ao 2002. Cuando analizamos la importancia de los diferentes grupos algales observamos claras diferencias entre los dos aos. Mientras que en 2002 las cianobacterias dominaron la comunidad fitoplanctnica, en el 2003 las cianobacterias fueron menos importantes, siendo las diatomeas el grupo algal ms importante cuando la clorofila a alcanz el mximo

2002
50 40 100 16 14

2003
100 80 60 40 20 0 jun jul ago sep oct nov

% de grupos algales

80 60 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

Clo a g L-1

Clo a g L-1

12 10 8 6 4 2 0

30 20 10 0 jun

Figura I.19. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el embalse de Ro Sequillo. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. Ntese la diferencia en la escala del eje Y. Cuando analizamos los cianobacterias planctnicas presentes durante este periodo (Figura I.20), podemos observar que las especies encontradas fueron similares a las encontradas en el embalse de Lozoya, situado aguas arriba de este embalse encontrndose en l

% de grupos algales

44

Resultados las mismas especies, salvo que el embalse de Ro Sequillo no present Woronichinia en 2002 y que en el 2003 no se detect ni W. naegeliana, ni M. wesenbergii Durante el ao 2002 el gnero dominante como en el caso del embalse de Lozoya fue el gnero Anabaena, pero en este caso la especie ms importante y que domin durante todo el periodo de muestreo fue A. planctonica y no A. crassa, siendo mayoritaria durante la mayor parte del periodo. La otra especie en importancia en este embalse fue la W. naegeliana mientras que el gnero Microcystis slo tuvo importancia en momentos puntuales, en el primer muestro y a principios del mes de septiembre. En el ao 2003 se incrementa en general la importancia de las cianobacterias pertenecientes al orden Chrocoocales y el gnero Microcystis en particular. Alguna especie de este orden fue como mnimo codominante en todos los muestreos en los cuales se detectaron cianobacterias en el estudio microscpico. Mientras las especies pertenecientes al gnero Anabaena, el mayoritario el ao anterior no lleg a ser dominante en ninguno de los muestreos realizados. La especie ms importante dentro del gnero Anabaena a lo largo de este ao fue diferente a lo largo del periodo analizado, en los dos primeros muestreos la especie ms importante fue A. flos-aquae, posteriormente fue sustituida A. planctonica la especie dominante el ao anterior. Respecto a la diversidad el mayor nmero de cianobacterias fue detectado cuando fue mayor la concentracin de clorofila a, detectndose en ese momento 6 especies diferentes.

4.3. Embalse de El Velln.

Este embalse se ubica en una regin peculiar dentro de las embalses de la Comunidad de Madrid puesto que esta situado en una zona donde las rocas calizas tienen cierta importancia mientras que el resto de los embalses en general se encuentran situados en zonas dominadas por rocas silceas. Este embalse se muestre en una slo punto, en 9 ocasiones en los dos aos analizados.

45

Resultados

2002
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
2 3-7-0 -02 27-7 -02 22-8 2 3-9-0 -02 20-9 -02 3-10 0-02 18-1 -02 5-11

2003
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
-03 11-6 3 4-7-0 -03 30-7 3 4-9-0 -03 18-9 -03 1-10 0-03 15-1

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

Figura I.20. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en embalse de Ro Sequillo. 46

Resultados

4.3.1. Nutrientes. El anlisis de los nutrientes presentes en este embalse a lo largo del periodo de muestreo indica que las tendencias generales a lo largo del periodo fueron muy similares en los dos aos estudiados (Figura I.21).
2003
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

2002
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
1800 1600 500 400 300 200 100 0

Amonio Nitrato Nitrito

Amonio Nitrato Nitrito

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
250 250 200 200

2003
Fosfato soluble Fosforo Total

Fosforo Total (g P L-1)

150

Fsforo (g P L-1) jul ago sep oct nov dic

150

100

100

50

50

jun
20

jun
20

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002

2003

NID/Ptot (g N g P )

15

NID/Ptot (g N g P )

15

-1

10

-1

10

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.21. Concentraciones de nutrientes en el embalse de El Velln. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003.

47

Resultados Los valores de nitrgeno se encontraron alrededor de 100 g N L-1, hasta la subida general al final del periodo de muestreo que llego a valores por encima de 500 g N L-1. Mientras que el fsforo total estuvo alrededor de 150 g P L-1 a lo largo de todo el ao. La relacin NID/Ptot present valores en general inferiores a 4, slo superando este valor cuando se alcanzaron los mximos anuales. De todas las variables analizadas, nicamente el nitrgeno inorgnico disuelto mostr ligeras diferencias entre dos aos estudiados. Los valores mximos alcanzados en el 2002 fueron casi el doble de los en encontrados en el 2003. Este hecho unido a que el fsforo total se mantuvo muy estable, hace que la relacin nitrgeno fsforo total, fuera casi dos veces mayor en 2002 que en 2003.

4.3.2. Variables fsico-qumicas.

Cuando se analizan los datos fsico-qumicos encontrados en el embalse de El Velln (Figura I.22), destaca la diferencia observada en los valores de conductividad entre el ao 2002 y el 2003, mientras que en el 2002 presenta valores superiores a 200 S cm-1, en el 2003 valores fueron claramente inferiores siendo estos de alrededor de 125 S cm-1. Esta es la unica variable que presenta diferencias. El pH muestra valores elevados ambos aos alcanzando solamente valores prximos a la neutralidad al final del periodo de muestreo. El oxgeno disuelto estuvo en concentraciones alrededor de 8 mg L-1, alcanzando mximos de 10 mg L-1 al principio de la temporada de muestro. Los valores de turbidez presentan una gran variabilidad, entre muestreos lo que dificulta encontrar diferencias entre los dos aos y finalmente la temperatura estuvo por encima de 20 C hasta el mes de mediados del mes de septiembre para caer posteriormente hasta los 10 C.

48

Resultados

30 25

20

Temperatura del agua (C)

2002 2003
15

20 15 10 5 0

Turbidez (NTU)
2002 2003

10

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

300 250 200 150 100 50 0

14 12

Oxigeno disuelto (mg L )

Conductividad (S cm )

-1

-1

10 8 6 4 2 0

2002 2003

2002 2003

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

pH

6 4 2 0

2002 2003

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.22. Variables fsico-qumicas encontradas en el embalse de El Velln. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxgeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003.

49

Resultados 4.3.3. Clorofila a y fitoplancton.

El embalse de El Velln al present bajas concentraciones de clorofila a cuando lo comparamos con otros embalse analizados y fueron muy similares en los dos aos, con medias prcticamente idnticas (17,8 7,7 g Clo L-1 en 2002 y 17,2 9,3 g Clo L-1 en 2003) y (Figura I.23). Sin embargo las concentraciones mximas de clorofila a se alcanzaron en momentos diferentes, en el mes de noviembre en el ao 2002 y en septiembre en el 2003. Respecto a la importancia de los diferentes grupos algales en este embalse observamos que en los dos aos las algas verdes fueron especialmente importantes, siendo las cianobacterias mayoritarias solo en el mes de agosto, mes que se caracteriza usualmente por presentar bajas concentraciones de clorofila a.

35 30

2002
100

2003
40 35 100 80 60 40 20 0 jun jul ago sep oct nov dic

% de grupos algales

80 60

Clo a g L-1

25 20 15 10 5 jun

Clo a g L-1

30 25 20 15 10 5 0

40 20 0 jul ago sep oct nov dic

Figura I.23. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el embalse de El Velln. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. Respecto a las cianobacterias planctnicas que pudieron ser detectadas durante este periodo (Figura I.24), nos encontramos ante el primer embalse que en ambos aos estuvo dominado por cianobacterias pertenecientes al orden Chrocoocales, y que mostr como especie mas importante dentro del orden Nostocales no a una especie perteneciente al gnero Anabaena sino a una del gnero Aphanizomenon, Aph. flos-aquae.

% de grupos algales

50

Resultados Durante el ao 2002 las dos especies mayoritarias pertenecieron al gnero Microcystis, M. aeruginosa domin durante la primera parte del ao, y posteriormente le sustituy M. wesenbergii, ninguna otra especie llego a presentar una importancia durante todo el periodo de muestreo. La sucesin entre las dos especies ocurri de manera progresiva M. wesenbergii fue mayoritaria ya hasta el final del periodo de muestreo.

En el ao 2003 se produce importante respecto al ao anterior, una de las dos especies mayoritarias M. wesenbergii, prcticamente desapareci. En este ao en las primeras fechas estudiadas fue Aph. flos-aquae la especie dominante, siendo posteriormente sustituida por una codominancia de dos especies pertenecientes al gnero Microcystis: M. aeruginosa y M. flosaquae. Tambin se observ un ligero incremento en el nmero de especies presentes, siendo la diversidad ligeramente mayor en el ao 2003 (cinco especies diferentes detectadas en el ao 2002, y siete en el 2003).

4.4. Embalse de Santillana.

El de Santillana fue el embalse que se muestre en mayor nmero de ocasiones en 9 ocasiones para el punto S1 y 4 veces el S2 en el 2002, en el ao 2003 se muestre en 12 ocasiones el punto S1 y 9 el S2.

4.4.1. Nutrientes. Este fue el embalse de todos los analizados que alcanz concentraciones de nutrientes ms elevadas, especialmente el fsforo total (Figura I.25).

51

Resultados

2002
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
2 3-7-0 -02 27-7 -02 22-8 2 3-9-0 -02 20-9 -02 3-10 0-02 18-1 -02 5-11 1-02 21-1

2003
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
03 5-603 3-7-03 30-7 03 4-9-03 18-9 -03 1-10 0-03 15-1 0-03 30-1 1-03 12-1

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

Figura I.24. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el embalse de El Velln. 52

Resultados

2002
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
1200 800 700 600 500 400 300 200 100 0

2003
1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Amonio Nitrato Nitrito

Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)

1400 1300

Amonio Nitrato Nitrito

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
600 500 400 350

2003
Fosfato soluble Fosforo total

Fosforo Total (g P L-1)

400 300 200 100 0

Fosforo (g P L-1) jul ago sep oct nov dic

300 250 200 150 100 50 0

jun
20 18

jun
20 18

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
16 14 12 10 8 6 4 2 0 16 14 12 10 8 6 4 2 0

2003

NID/Ptot (g N g P )

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

NID/Ptot (g N g P )

-1

-1

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.25. Concentraciones de nutrientes en el embalse de Santillana. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003. Nos encontramos con el embalse que present la mayor concentracin de fsforo total de todos los embalses de la Comunidad de Madrid analizados en este trabajo, los datos de fsforo alcanzan valores mximos superiores a 300 g P L-1, Mientras que las concentraciones de nitrgeno inorgnico disuelto se encontraron en niveles similares a los encontrados en otros

53

Resultados embalses. Por otro lado la relacin del nitrgeno inorgnico disuelto - fsforo total present en los dos aos valores dentro del mismo orden de magnitud con mximos superiores a 10. Cuando analizamos las tendencias que los nutrientes presentaban en cada uno de los aos, observamos que estas fueron muy similares en lo que se refiere al nitrgeno inorgnico disuelto, observando un incremento en la concentracin a medida que va avanzando la ao, alcanzando los mximos al final del periodo de muestreo, en el mes de noviembre, momento en el cual se alcanzaron valores mximos superiores a 1 mg N L-1. Este incremento en el nitrgeno se debi sobre todo al incremento de las concentraciones de nitrato que tiene lugar en ese momento, mientras que el otro compuesto nitrogenado en importancia, el amonio, fue sobre todo importante en los primeros meses analizados. Por otro lado la concentracin de fosforo total mostr tendencias completamente diferentes en los dos aos, en el 2002 los mximos tuvieron lugar en los meses de septiembre y octubre. El valor medio durante este ao fue de 230,5 g P L-1 149,2 g P L-1 y un mximo por encima de 500 g L-1. En el ao 2003 sin embargo el mximo fue menor encontrndose por debajo de 350 g P L-1 y la media del ao fue menos de la mitad que la que encontramos en el ao anterior, 113,7 g P L-1 67,7 g P L-1, estas diferencias entre los aos fueron significativas (t-student p = 0,02). La relacin nitrgeno inorgnico disuelto - fsforo total mostr mximos y mnimos similares en los dos aos (sin diferencias significativas), aunque las tendencias entre los dos fueron ligeramente diferentes mientras que en el ao 2003 los valores de la relacin comienzan a crecer a principios en el mes de septiembre y alcanzando un valor mximo a finales del mes de octubre. En el ao 2003 los valores fueron muy similares durante gran parte del ao para luego subir bruscamente en el ltimo muestreo en el mes de noviembre.

4.4.2. Variables fsico-qumicas.

Las variables en general fsico-qumicas no muestran grandes diferencias entre los dos aos muestreados, los dos nicas que presentan diferencias significativas entre los dos aos fueron la conductividad (t-student p 0,001) y la turbidez (t-student p = 0,018) (Figura I.26). En estos dos casos los valores encontrados en el ao 2002 fueron mayores a los del ao 2003. Cuando analizamos las tendencias que presentan, podemos observar que en el caso de la

54

Resultados conductividad los valores fueron bastante estables, mientras que la turbidez mostr importantes variaciones en el ao 2002, con mximos superiores a 40 NTU, mientras que en el ao 2003 los valores fueron ms estables a lo largo del ao alrededor de 10 NTU.
30 25 20 15 10 5 0 100 90

Temperatura del agua (C)

80

2002 2003

Turbidez (NTU)
2002 2003

70 60 50 40 30 20 10 0

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

14 12

Oxigeno disuelto (mg L )

Conductividad (S cm )

-1

-1

10 8 6 4 2 0

2002 2003

2002 2003

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

pH

6 4 2 0

2002 2003

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.26. Variables fsico-qumicas encontradas en el embalse de Santillana. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxgeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003.

55

Resultados Cuando analizamos la tendencias que presenta la temperatura en los dos aos analizados podemos ver que a pesar de no existir diferencias significativas, el ao 2003 (media = 19,7 C 4,5 C), parece ligeramente ms calido que el ao 2002 (media = 17,1 C 5,2 C), alcanzando el mximo valor en el ao 2003 en el mes de agosto. El resto de las variables no muestran tendencias tan claras como en los otros tres casos. Cuando analizamos el pH observamos tendencias opuestas en el ao 2002, los valores mximos se observan en el mes de octubre, mientras que en el ao 2003 mostr valores mximos en el mes de julio. Por otro lado el oxgeno disuelto no muestra ninguna tendencia clara mantenindose con valores de mximos en momentos puntales a lo largo del periodo de muestreo.

4.4.3. Clorofila a y fitoplancton.

En el embalse de Santillana se alcanzaron las mayores concentraciones de clorofila a cuando comparamos los valores con el resto de los embalses analizados, aunque se observaron grandes variaciones tanto en la concentracin mxima, como en el patrn de aparicin entre los dos aos estudiados. Por el contrario, el tipo de cianobacterias que estuvieron presentes fueron ms estables.

El punto S1 en el ao 2002 present las concentraciones de clorofila a ms elevadas de todos los embalse analizados en la Comunidad de Madrid, con concentraciones mximas superiores 120 g Clo a L-1 (Figura I.27). Junto con estos picos de biomasa (medida como clorofila a) tan elevados, este embalse muestra grandes variaciones en la concentracin en un periodo de tiempo muy corto. As, que la concentracin de clorofila a llega a multiplicarse por 10 en el plazo de 15 das. La media de clorofila a en el punto S1 durante el ao 2002 fue de 91,96 73,88 (mas de un 80% de variacin media) con una diferencia entre el valor superior e inferior de 211,6 g Clo a L-1. Cuando analizamos las tendencias que presenta la clorofila podemos observar 4 picos importantes entre los meses de septiembre y noviembre con grandes valles entre estos picos de biomasa.

56

Resultados

2002
250 200 100 60 50

2003
100 80 60 30 40 20 10 0 jun 20 0 jul ago sep oct nov dic

Clo a g L-1

Clo a g L-1

80 60 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

% de grupos algales

40

150 100 50 0 jun

Figura I.27. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el punto S1 del embalse de Santillana. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. Ntese la diferencia en la escala del eje Y.

El ao 2003 (Figura I.27), mostr concentraciones claramente inferiores a las que encontramos el ao anterior, la concentracin mxima encontrada fue ligeramente superior a 50 g Clo a L-1 y la media anual fue de 24,08 13,4. Estas diferencias en la concentracin de clorofila a entre los dos aos fueron estadsticamente significativas (test Mann-Whitney. p 0,001). Tambin fueron diferentes las tendencias observadas encontrndose el pico mximo de biomasa en el mes de Julio. Cuando analizamos los grupos algales presentes, en el 2003 el pico mximo de clorofila a coincidi con el momento en el que las cianobacterias fueron ms importantes en la poblacin fitoplactnica, por otro lado en el ao 2002 el pico de clorofila coincidi con un momento de dominancia de criptofitas, pero aunque la importancia de este grupo algal pudo ser observado mediante anlisis microscpico, tambin nos indic que las cianobacterias fueron el grupo ms importante, y que el sistema fluoromtrico fall.

Los tipos de cianobacterias planctnicas presentes en el embalse de Santillana durante los dos aos analizados en el punto S1 (figura I.28), presentan poca diversidad en cuanto al 57

% de grupos algales

Resultados nmero de especies de cianobacterias planctnicas, encontrando slo tres especies de cianobacterias en el ao 2002 y cuatro especies diferentes en el ao 2003. En los dos aos analizados una mismo cianobacteria domin durante la mayor parte del periodo de muestreo: M. aeruginosa. En el ao 2002 fue dominante en el 73% de los muestreos, todos los realizados desde finales del mes de agosto hasta el final del periodo de muestreo en el mes de noviembre, valor similar al encontrado en el ao 2003 que fue dominante en el 89% de ellos, todos los realizados salvo el primero y el ltimo muestreo. Las otras dos especies de cianobacterias que siguieron a M. aeruginosa en orden de importancia fueron Aph. flos-aquae y M. flos-aquae, que estuvieron presentes en ms del 45% de los muestreos en el ao 2002 y en ms del 55% de los muestras analizadas en le ao 2003,. La ltima especie que apareci este embalse fue A. flos-aquae, que apareci nicamente en el ao 2003 en siete ocasiones aunque siempre mostr importancia marginal dentro de la poblacin cianobacteriana.

4.5. Embalse de Valmayor.

El embalse de Valmayor fue el nico embalse junto con el de Santillana donde la clorofila a alcanz mximos elevados en los dos aos objeto de estudio.

4.5.1. Nutrientes. Las concentraciones de nutrientes observadas en el embalse de Valmayor en los dos aos fueron similares, con mximos de nitrgeno inorgnico disuelto y fosforo total similares. Sin embargo las tendencias observadas a lo largo del ao fueron ligeramente diferentes (Figura I.29).

58

Resultados

2002
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
2 2 2 3-7-0 27-7-0 22-8-0 2 3-9-0 2 2 2 2 2 2 2 8-9-0 13-9-0 20-9-0 3-10-0 18-10-0 5-11-0 21-11-0

2003
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
603 11 -6 -0 3 4703 11 -7 -0 3 16 -7 -0 3 23 -7 -0 3 30 -7 -0 3 20 -8 -0 3 27 -8 -0 3 903 311 -9 -0 3 17 -9 -0 3 24 -9 -0 3 110 -0 3 810 -0 3 15 -1 003 23 -1 003 30 -1 003 11 -1 103 5-

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

I.28. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el embalse de Santillana. 59

Resultados

Las concentraciones de nitrgeno inorgnico disuelto alcanzaron valores muy similares en los dos aos con mximos de alrededor de 800 g L-1, las tendencias sin embargo fueron ligeramente diferentes, siendo los valores en el ao 2003 ligeramente superiores a principios de periodo de muestreo. Este incremento se debi sobre todo a la concentracin de nitrato, que estuvo presente en este momento del ao 2003, mientras que no fue posible detectarlo al principio del periodo de muestreo en el ao 2002. Esta mayor concentracin de nitrgeno en la primera parte del periodo analizado se extiende aunque en menor medida hasta principios del mes de octubre. Si hacemos la media de NID encontrado hasta finales del mes del septiembre en los dos aos analizados, encontramos que el valor medio en el ao 2002 (57,1 26,9) fue casi tres veces mayor que el encontrado en el ao 2003 (151,5 127,6), aunque la variabilidad que presenta impide que las diferencias encontradas sean significativas. El fsforo total present valores y tendencias similares en ambos aos, con excepcin junio y julio, periodo para el cual no existen datos en para el ao 2002, lo que impide comprobar si existieron diferencias en el valor mximo alcanzado en este primer periodo, cosa que ha ocurrido con el nitrgeno inorgnico disuelto. Por otro lado en el caso del fosfato soluble, analizado nicamente en el ao 2003, podemos observar que slo fue detectado en 5 de los muestreos realizados, siendo el componente mayoritario del fsforo total en tres de las ocasiones: al principio, al final del periodo de muestreo y a principios del mes de octubre. Finalmente los valores de la relacin NID/Ptot muestran valores completamente diferentes en los dos aos. El en ao 2003 se observaron valores superiores a los existentes en el ao 2002, estas diferencias fueron significativas, incluso cuando se elimino del anlisis el periodo de tiempo para el cual no existan datos para el ao 2002 (test Mann-Whitney, p = 0,003). Estas se ven aun con ms claridad cuando se comparan los valores mximos encontrados, en el ao 2002 el mximo fue inferior a 1 y en el ao 2003 fue un orden de magnitud superior 9,9.

4.5.2. Variables fsico-qumicas. Los variables fsico-qumicas, fueron durante los dos aos, salvo en el caso de la conductividad, bastante similares (Figura I.30). La temperatura alcanz el mximo en el mes de agosto para posteriormente ir descendiendo progresivamente hasta alcanzar valores ligeramente superiores a 10 C. En el caso de la turbidez salvo por la falta de datos en la parte final del periodo de muestreo del ao 2002 fueron similares tanto en valores y tendencias. Tanto el oxgeno disuelto, como el pH presentaron valores similares, si bien en el caso del 60

Resultados

oxgeno disuelto no es posible observar ninguna tendencia clara, mientras que en el caso del pH se observa un mximo a principios del periodo de muestreo para posteriormente ir bajando. Los valores de conductividad como ya hemos indicado fueron muy diferentes, mostrando valores muy superiores en el ao 2003, respecto al ao 2002, siendo las diferencias significativas (t-student, p = 0,005).
2002
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1) Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

2003
Amonio Nitrato Nitrito

Amonio Nitrato Nitrito

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
200 180 200 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0

2003
Fosfato soluble Fosforo total

Fosforo Total (g P L-1)

Fosforo (g P L-1) jul ago sep oct nov dic

150

100

50

jun
10

jun
10

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
8

2003
8

NID/Ptot (g N g P )

NID/Ptot (g N g P )

-1

-1

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.29. Concentraciones de nutrientes en el embalse de Valmayor. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003.

61

Resultados

30 25 20 15 10 5 0

40 35 30

Temperatura del agua (C)

2002 2003

Turbidez (NTU)
2002 2003

25 20 15 10 5 0

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jul

ago

sep

oct

nov

dic

200 180

14 12

Conductividad (S cm )

-1

160 140 120 100 80 60 40 20 0

Oxigeno disuelto (mg L-1)

10 8 6 4 2 0

2002 2003

2002 2003

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jul

ago

sep

oct

nov

dic

pH

6 4 2 0

2002 2003

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.30. Concentraciones de nutrientes en el embalse de Valmayor. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003.

62

 4.5.3. Clorofila a y fitoplancton.

Resultados

En el embalse de Valmayor encontramos concentraciones elevadas de clorofila a en los dos aos estudiados, observndose de manera puntual concentraciones superiores a 50 g Clo a L-1. Las concentraciones medias durante el periodo de muestreo en el punto V1 (Figura I.31) (el punto analizado en todas las ocasiones y en los dos aos) fueron ligeramente superiores en el ao 2002 (33,3 23,1 g Clo a L-1) que en el ao 2003 (25,5 17,3 g Clo a L-1) en el ao aunque estas no fueron significativas. Los mximos encontrados en los dos aos fueron en este embalse tambin muy similares 80 g Clo a L-1 en el ao 2002 y 60 g Clo a L-1 en el 2003. Cuando analizamos el patrn de present la clorofila a en ambos aos s podemos observar claras diferencias entre los dos. En el ao 2002 las mayores concentraciones de clorofila a aparecieron en la primera parte del periodo de muestreo, alcanzndose el mximo en el mes de agosto siendo no observndose variaciones bruscas en la clorofila a. Mientras que en el ao 2003 las concentraciones mximas de clorofila a se alcanzaron en los meses de septiembre y octubre periodo en el cual se observaron variaciones de hasta 6 veces en un periodo de dos semanas.

2002
100 80 100 70 60

2003
100 80

% de grupos algales

80 60 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

50 40 30 20 10 0 jun 20 0 jul ago sep oct nov dic 60 40

60 40 20 0 jun

Figura I.31. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el embalse de Valmayor. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. Ntese la diferencia en la escala del eje Y.

% de grupos algales

Clo a g L-1

Clo a g L-1

63

Resultados

Respecto a las especies de cianobacterias planctnicas que aparecieron, nos encontramos ante el embalse que menor cantidad de especies diferentes present (Figura I.32). En ambos aos slo fue posible detectar las tres especies, y estas fueron las mismas: M. aeruginosa, M. flos-aquae y Aph. flos-aquae. Sin embargo si se modific la cianobacteria dominante en cada uno de los aos. En el ao 2002, la especie que domin en ocho de los muestreos (72,7% del total) fue Aph. flos-aquae, mientras que en el ao 2003 la especie que domin la poblacin de cianobacterias en un mayor nmero de ocasiones fue M. aeruginosa que tambin domin la poblacin en ocho de los muestreos realizados (57%). Cuando analizamos ms en profundidad en qu en ambos aos las dos especies dominantes se comportaron de manera similar en los dos aos. En el ao 2002 Aphanizomenon domin desde principios del periodo de muestreo hasta el final, mientras que M. aeruginosa estuvo presente en cantidades poco importantes hasta el mes de septiembre, momento en que fue sustituida por M. flos-aquae que termin dominando la poblacin de cianobacterias al final del periodo. En el ao 2003 M. aeruginosa domin desde el principio del periodo de muestreo, hasta finales del mes de septiembre, momento en el que fue sustituido como dominante por Aph. flos-aquae que domin durante parte del mes de octubre para ser posteriormente sustituida de nuevo por M. aeruginosa.

4.6. Embalse de San Juan.

El embalse de San Juan situado en la zona noroeste de la Comunidad de Madrid fue en el mismo nmero de ocasiones en los dos aos: 9.

4.6.1. Nutrientes. El punto SJ situado en el embalse de San Juan mostr en general bajas concentraciones de nutrientes en los dos aos, siendo estas especialmente bajas en el ao 2002 (Figura I.33).

64

Resultados

2002
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
3 -7-0 2 1 2 -7 -0 2 2 7-7 -02 6 -8 -0 2 2 2 -8 -0 2 3 -9 -0 2 2 0 -9 -0 2 3 -1 0 -0 2 1 8 -1

ND
0 -0 2 5 -1 1 -0 2 2 1 -1 1 -0 2

2003
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
703 903 03 03 03 29 -1 013 -1 16 -7 -0 3 30 -7 -0 3 18 -9 -0 3 20 -8 -0 3 11 -9 -0 3 24 -9 -0 3 210 -0 3 910 -0 3 24 -1 016 -1 044103

ND

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

Figura I.32. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el embalse de Valmayor. ND = No detectado. 65

Resultados
2002
Nitrgeno inorgnico Disuelto (g L-1)
600

2003
Nitrgeno inorgnico Disuelto (g L-1)
1000 900 800 500 400 300 200 100 0

700

A m o n io N itra to N itrito

A m o n io N itra to N itrito

300

200

100

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

2002
30 25 70 60

2003
F o s fa to s o lu b le F o s fo ro to ta l

Fosforo Total (g L-1)

20 15 10 5 0

Fosforo (g L-1) ju l ago sep oct nov d ic

50 40 30 20 10 0

ju n
35 30 25 20 15 10 5 0

ju n
25

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

2002
20

2003

NID/Ptot (g P g N )

NID/Ptot (g P g N )

-1

-1

15

10

ND

ND ND

ND

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

ju n

ju l

ago

sep

oct

nov

d ic

Figura I.33. Concentraciones de nutrientes en el embalse de San Juan. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003. ND = no determinado. Cuando analizamos los nutrientes encontrados en el embalse en cada uno de los aos estudiados observamos que las concentraciones de nitrgeno inorgnico se encontraron entre las ms bajas encontradas en los embalses analizados, e incluso con la entrada de nutrientes que se suele producir cuando se rompe la termoclina, los valores mximos alcanzados fueron de inferiores a 700 g N L-1. Las concentraciones de fsforo total en el ao 2002 se encontraron salvo en tres ocasiones por debajo del lmite de deteccin y los valores mximos alcanzados fueron los ms bajos detectados en todos los embalses, alrededor de 20 g P L-1. Dado los valores encontrados bajo nuestro lmite de deteccin, slo se pudo calcular la relacin DIN Ptot slo en tres ocasiones, en las cuales presentaron valores muy divergentes: 1,2, 7,9 y 66

Resultados 31,9. Los nutrientes en el ao 2003 tambin fueron bajos, pero ms prximos a los detectados en otros embalses. El fsforo total fue posible detectarlo en todos los muestreos, presentando valores ligeramente superiores a 40 g P L-1 (dos veces superior a valor mximo detectado en el ao 2002) y mantenindose ms o menos estable a lo largo del ao. El nitrgeno inorgnico sin embargo no present valores ms elevados a los detectados en ao anterior presentndose valores mximos superiores a 500 g N L-1 en el mes de octubre, coincidiendo los mximos con las dos nicas ocasiones en las que fue posible detectar el nitrato. La relacin DIN- Ptot pudo determinarse durante todo periodo de muestreo, mostrando generalmente valores alrededor de 2 , si bien la relacin subi de manera clara cuando se produjo la inyeccin de nitrato presentando valores en ese momento de 9,9 y 15,4. El fosfato inorgnico nicamente se detect en los dos ltimos muestreos del ao 2003 representando al menos el 50% del fsforo total. 4.6.2. Variables fsico-qumicas. Las variables fsico-qumicas presentaron valores y tendencias muy similares en los dos aos muestreados (Figura I.34). La temperatura se comport de manera similar a la encontrada en el resto de los embalses con valores mximos superiores a 24 C alcanzados en agosto, momento a partir del cual comenz a disminuir progresivamente hasta valores inferiores a 15 C en el mes de noviembre. La turbidez mostr valores bajos, inferiores 15 NTU. La conductividad se comport de manera diferente en los dos aos analizados en el ao 2003 se mantuvo ms o menos estable alrededor de 70 S cm-1. Mientras que en 2002 present un salto en los valores observados entre los meses de Julio y agosto, en el mes de julio, present valores de 90 S cm-1, para caer a partir de siguiente muestreo a valores similares a los encontrados en el ao 2003. La concentracin de oxgeno present valores mximos al principio del periodo en estudio, aunque las tendencias posteriores fueron ligeramente diferentes entre los aos, en el ao 2002 encontramos se mantuvieron ms o menos estables hasta el final del periodo analizado. Mientras que en el 2003, el patrn fue menos estable con picos de concentracin importantes en junio septiembre. Finalmente, el pH tambin muestra una tendencia a disminuir a lo largo del periodo de muestreo, alcanzando el mximo, cercanos a 10, en junio o julio y mnimos, alrededor de 7, en el mes de noviembre.

67

Resultados

30 25 20 15 10 5 0

40 35 30

Temperatura del agua (C)

2002 2003

Turbidez (NTU)
2002 2003

25 20 15 10 5 0

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

110 100 80 70 60 50 40 30 20 10 0 90

14 12

Oxigeno disuelto (mg L-1)

Conductividad (S cm )

-1

10 8 6 4 2 0

2002 2003

2002 2003

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

pH

6 4 2 0

2002 2003

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.34. Variables fsico-qumicas analizadas en el embalse de San Juan. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxgeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003.

68

Resultados 4.6.3. Clorofila a y fitoplancton.

En el embalse de San Juan se ha encontrado concentraciones de clorofila a relativamente bajas, similares a las encontradas en los embalses de El Velln y Ro Sequillo. El mximo en ambos aos fue similares, inferiores a 30 g Clo a L-1(Figura I.34). Las concentraciones medias de clorofila a sin embargo fueron ligeramente diferentes en los dos aos. En el ao 2003, fueron ligeramente inferiores a las encontradas en el ao 2002; 13,8 8,9 g Clo a L-1 en el ao 2002 por 10,3 5,6 g Clo a L-1. Respecto a la importancia de los diferentes grupos algales observamos que las cianobacterias fueron el grupo algal ms importante, con una media del 46% 30% en el ao 2002 y 41% 24% en el ao 2003, el segundo grupo en importancia sin embargo vari entre los dos aos. En el ao 2002, fueron las algas verdes con valores de 29% 20% y en el ao 2003 las diatomeas con valores de 32% 23%. Cuando comparamos el momento en que se alcanz la concentracin mxima de clorofila a con cuando las cianobacterias alcanzaron mayor preponderancia en la poblacin fitoplanctnica, vemos ligeras diferencias entre los dos aos, en el ao 2002, las cianobacterias fueron importantes representando en ese momento como mnimo del 40% de la poblacin pero no fue el grupo dominante que fueron las algas verdes, mientras que en el ao 2003 representaron el 69% de la poblacin cuando se alcanz la concentracin de clorofila a ms alta.

Finalmente, en lo relativo a las especies de cianobacterias (Figura I.35) en el ao 2002 se encontraron mediante estudio microscpico cinco especies diferentes, de estas, dos pertenecieron al gnero Microcystis: M. aeruginosa y M. flos-aquae, otras dos al gnero Anabaena: A. flos-aquae y una especie que no fue posible identificar y finalmente una al gnero Aphanizomenon: Aph. flos-aquae. Mientras en el 2003 la diversidad de cianobacterias fue ligeramente mayor siendo posible identificar siete especies diferentes, las cuatro identificadas a nivel de especie el ao anterior y otras tres W. naegeliana, A. plaktonica y A. crassa.

69

Resultados

2002
30 25 100 30 25

2003
100 80 60 40 20 0 jun jul ago sep oct nov dic

% de grupos algales

80 60

20 15 10 5 0 jun

20 15 10 5 0 may

40 20 0 jul ago sep oct nov dic

Figura I.35. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el embalse de San Juan. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. Durante el ao 2002 (Figura I.36)la especie dominante fue M. aeruginosa, que domin en 7 de las ocasiones analizadas desde el mes de agosto al mes de noviembre. La otra especie que en importancia durante este ao, fue Aph. flos-aquae que aunque slo domin la poblacin en una ocasin, como hizo A. flos-aquae, fue la segunda especie de importancia en nmero de ocasiones en las que apareci con cuatro. Las otras dos especies presentes durante este ao fueron Anabaena sp. y M. flos-aquae que se encontraron en el mes de noviembre. En el ao 2003 (Figura I.36) al igual que en el ao anterior la especie ms importante fue M. aeruginosa aunque su importancia global en la comunidad disminuy ligeramente. Si cambi sin embargo la segunda especie en importancia, esta fue A. flos-aquae que domin la poblacin en dos ocasiones y fue codominante en otras dos. En general durante este ao en el embalse de San Juan parece aumentar la importancia del orden Nostocales sobre Chroococales dominante el ao anterior, puesto que aparecieron dos especies del gnero Anabaena que no se detectaron el ao anterior A. crassa y A. planktonica, mientras M. flos-aquae que en el 2002 tuvo cierta importancia, en este ao se present durante todo el periodo analizado pero slo de manera marginal. Finalmente Aph. flos-aquae tambin disminuy su importancia, dejando de dominar la poblacin de cianobacterias en las fechas analizadas.

% de grupos algales

Clo a g L-1

Clo a g L-1

70

Resultados

2002
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
3 -7 -0 2 277 -0 2 228 -0 2 3 -9 -0 2 209 -0 2 0 -0 2 1002 1 -0 2 1102

3 -1

18-

5 -1

21-

2003
Distribucion Relativa
6 5 4 3 2 1 0
03 5-603 4-7-03 30-7 03 4-9-03 18-9 -03 2-10 0-03 15-1 0-03 29-1 1-03 13-1

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

Figura I.36. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el embalse de San Juan. 71

Resultados

4.7. Embalse de Picadas.

El embalse de Picadas se encuentra situado aguas abajo del embalse de San Juan muestreado en el punto P1 en 8 ocasiones en el ao 2002 y en 14 ocasiones en el punto P1 y en 8 ocasiones el punto P2 en el ao 2003.

4.7.1. Nutrientes. Cuando analizamos la concentracin de nutrientes en el punto P1, que fue muestreado en los dos aos estudiados, observamos que en general las concentraciones de nutrientes fueron ligeramente mayores en el ao 2003, que en el ao 2002. (Figura I.37). En cuanto a como se comport el nitrgeno inorgnico disuelto, vemos que las concentraciones medias fueron similares (305 317 g N L-1) en el ao 2002 y en el ao 2003 (342 396 g N L-1), aunque los mximos alcanzados si parece diferentes. En el ao 2003 este fue casi dos veces superior al que present el ao 2002. El fsforo total por otro lado si muestra diferencias significativas (tstudent p = 0,01) en el ao 2002 la media fue de 23,8 23 g P L-1 y en 2003 dos veces ms alto 56,7 26,6 g P L-1. Adems, cuando analizamos el patrn que presentaron las concentraciones de este compuesto, observamos que tambin parecen existir claras diferencias. El ao 2002 se caracteriza por presentar grandes variaciones a lo largo del ao. Mientras que en ao 2003 las concentraciones se mantuvieron ms o menos estables a lo largo del periodo analizado. El fsforo soluble, que nicamente se analiz en el ao 2003, tuvo especial importancia al final del periodo objeto de anlisis, momento en el cual represent la mayor parte de del fsforo total presente. La relacin DIN Ptot durante el ao 2002 mostr valores muy diferentes: desde valores inferiores a 2 hasta valores superiores a 45. Mientras el ao 2003 present un rango ms estrecho con valores mximos de 16,7 y mnimos de 1,1. Cuando estudiamos cmo se comportaron las concentraciones de nutrientes en el punto secundario analizado en 2003 (Figura I.38) y los comparamos con los encontrados en el punto principal (P1) en el mismo momento, encontramos diferencias importantes en funcin de que nutriente comparado. Los valores de NID fueron similares, aunque el mximo encontrado en el punto P2 (24 de octubre) fue dos veces superior al encontrado en el punto P1 en esa misma

72

Resultados

fecha. Respecto al fsforo total esta similitud desaparece y se observan claras diferencias significativas (t-student apareado p = 0,008) siendo la concentracin media encontrada en el en el punto P2 cuatro veces superior al presentaba en el punto P1. Esta diferencia observada en el fsforo total, hizo que las diferencias entre ambos puntos en la relacin DIN/Ptot tambin fuera significativa (t-student apareado p = 0,01).
2002
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1) Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

2003
1400 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Amonio Nitrato Nitrito

Amonio Nitrato Nitrito

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
120 120 100 100

2003
Fosfato soluble Fosforo total

Fsforo Total (g P L-1)

Fsforo (g P L-1) ago sep oct nov dic

80 60 40 20 0

80 60 40 20 0

jul
50 45

jun
20 18

jul

ago

sep

oct

nov

dic

2002
40 35 30 25 20 15 10 5 0 16 14 12 10 8 6 4 2

2003

NID/Ptot (g N g P )

ND ND

NID/Ptot (g N g P )

-1

-1

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.37. Concentraciones de nutrientes del punto P1 en el embalse de Picadas. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot para el ao 2002 y 2003 y de fosfato soluble para el ao 2003. ND = no determinada 73


P2 2003
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
1800 1600 1400 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Resultados
P2 2003
800 700 600 300

Fosforo (g P L-1)

Amonio Nitrato Nitrito

Fosfato soluble Fosforo total

250 200 150 100 50 0

jun

jul

ago

sep
10

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

P2 2003
8

NID/Ptot (g N g P )

-1

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.38. Concentraciones de nutrientes del punto P2 en el embalse de Picadas. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot y de fosfato soluble para el ao 2003.

4.7.2. Variables fsico-qumicas. Los valores encontrados, como en el punto SJ del embalse de San Juan, fueron muy similares en el punto P1 en los dos aos muestreados (Figura I.39). La temperatura alcanz valores mximos superiores a 24 C en el mes de agosto, para a partir de ese momento disminuir hasta valores inferiores a 15 C en el mes de noviembre en el ao 2002 y ligeramente superiores en el 2003. La turbidez fue la nica variable que present diferencias entre los dos aos, encontrndose en general valores superiores en el ao 2003 que en el 2002, diferencias que fueron significativas (t-student p = 0,049). Mientras que tanto el pH como el oxgeno disuelto y la conductividad mostraron valores y patrones similares cuando comparamos los dos aos.

74


P1
30 25 20 15 10 5 0 40 35 30

Resultados
P1
2002 2003

Temperatura del agua (C)

Turbidez (NTU)
2002 2003

25 20 15 10 5 0

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

P1
110 100 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 90 14 12

P1
Oxigeno disuelto (mg L-1)

Conductividad (S cm )

-1

10 8 6 4 2

2002 2003

2002 2003

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

P1

pH

6 4 2 0

2002 2003

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura I.39. Variables fsico-qumicas analizadas en el punto P1 del embalse de Picadas. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxgeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003. Respecto a cmo se comportaron los diferentes puntos de muestreo analizados en el ao 2003 (Figuras I.39 y I.40) las variables temperatura, oxgeno disuelto y pH fueron muy

75

Resultados

similares no encontrndose diferencias significativas. En el caso del la turbidez si existen valores superiores en el punto P2 respecto al punto P1, pero la gran variabilidad que este valor presenta, hace que las diferencias observadas no sean significativas. Finalmente la conductividad si mostr valores ligeramente superiores en el punto P1, que el punto P2, siendo significativas las diferencias observadas (test de Wilcoxon p = 0,023).
P 2 2 00 3
30 25 20 15 10 5 0 400 350 300

P 2 2 00 3

Temperatura del agua (C)

Turvidez (NTU) ju n ju l ago se p o ct nov d ic

250 200 150 100 50 0

ju n

ju l

ago

se p

o ct

nov

d ic

P 2 2 00 3
130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 12 10 8 6 4 2 0

P 2 2 00 3
Oxigeno disuelto (mg L )

Conductividad (mS cm )

-1

ju n
12 10 8

ju l

ago

se p

o ct

nov

d ic

-1

ju n

ju l

ago

se p

o ct

nov

d ic

P 2 2 00 3

pH

6 4 2 0

ju n

ju l

ago

se p

o ct

nov

d ic

Figura I.40. Concentraciones de nutrientes del punto P2 en el embalse de Picadas. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot y de fosfato soluble para el ao 2003.

76

 4.7.3. Clorofila a y fitoplancton.

Resultados

El embalse de Picadas ha presentado una gran diversidad en cuanto a los valores de clorofila a encontrados, especialmente entre los valores encontrados en los dos puntos muestreados en el ao 2003. El punto P1 que fue analizado en ambos aos, mostr concentraciones de clorofila a inferiores a 40 g Clo a L-1(Figura I.41), con una media de; 14,4 11,9 g Clo a L-1 en el ao 2002 y 12,0 5,8 g Clo a L-1 en el ao 2003, siendo el mximo alcanzado en el 2002 (38,3 6,6 g Clo a L-1) ligeramente superior al encontrado en el ao siguiente (20,4 0,5 g Clo a L-1). Los patrones de aparicin de la clorofila a tambin fueron ligeramente diferentes encontrado la mxima concentracin en el 2002 en el mes de octubre, mientras que en el ao 2003, se observa dos picos mximos uno en el mes de julio y otro en el mes de septiembre. Analizando la importancia de los diferentes grupos algales encontramos que las cianobacterias fueron el grupo algal que present una mayor importancia en este embalse, destacando el ao 2003 durante en cual este grupo represent como media el 72% 19% de la clorofila a total, dominando la poblacin en casi todos las fechas salvo en la ltima en el mes de noviembre y alcanzando los valores mximos en porcentaje cuando los valores totales de clorofila a eran mximos.

50 40

2002
100

22

2003
100 80 60 40 20 0 jun jul ago sep oct nov dic

% de grupos algales

80 60 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

18

16 14 12 10 8 6 4 2 may

30 20 10 0 jun

Figura I.41. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el punto P1 del embalse de Picadas. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos. 77

% de grupos algales

20

Clo a g L-1

Clo a g L-1

Resultados

P2 2003
120 100 100 80 60 60 40 40 20 0 may 20 0 jun jul ago sep oct nov dic

80

Figura I.42. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el punto P2 del embalse de Picadas en el ao 2003. Se muestran las concentraciones de clorofila a determinadas mediante extraccin metanlica (lnea continua) y % de esa clorofila a (barras) que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo) determinada por mtodos fluoromtricos.

El punto P2 present concentraciones de clorofila a mucho mayores a las encontradas en el punto P1 en el mismo momento (Figura I.42 y Figura I.41) alcanzando un valor mximo superior a 100 g Clo a L-1 y un valor medio durante el periodo analizado 42,3 29,3 g Clo a L-1, valor casi 4 veces superior al encontrado en ese mismo periodo en el punto P1 (14,2 5 g Clo a L-1) existiendo diferencias significativas entre los dos puntos analizados (t-student apareado p = 0,032). Respecto a que porcentaje de esta clorofila a perteneca a cianobacterias las diferencias fueron menores encontrando valores ligeramente superiores en el punto P2 (88% 9%), que el punto P1 (73% 11%) aunque tambin las diferencias observadas fueron significativas (t-student apareado p = 0,037)

% de grupos algales

Clo a g L-1

78

Resultados

Despus de comprobar que las cianobacterias fueron elementos importantes de la poblacin fitoplancton queda por analizar cuales fueron las especies de cianobacterias que estuvieron presentes (Figura I.43). En total en los dos aos pudieron detectarse siete especies diferentes, de esas cinco estuvieron presentes en los dos aos: M. aeruginosa y M. flos-aquae, A. flos-aquae, A. crassa y Aph. flos-aquae. Adems, encontramos una especie de Anabaena que no fuimos capaces de identificar en el ao 2002 y A. planktonica en 2003.

Durante el ao 2002 es difcil identificar ninguna especie que podamos considerar dominante durante el periodo objeto de estudio: M. aeruginosa domin en tres ocasiones, Aph. flos-aquae domin en otras dos y finalmente A. flos-aquae domin en una. Esto significa que ninguna especie domin en ms del 38% de los muestreos realizados. M. aeruginosa fue importante sobre todo en agosto y septiembre, Aph. flos-aquae en el mes de octubre y A. flosaquae en el primer muestreo en el mes de julio.

En el ao 2003 s podemos identificar una especie claramente dominante, M. aeruginosa que domin la poblacin en 8 ocasiones (67% de las fechas analizadas), especialmente durante los meses de septiembre y octubre cuando se present el segundo pico de clorofila a. En el resto de ocasiones las especies ms importantes fueron A. flos-aquae que domin en la primera parte del periodo de muestreo y estuvo presente durante el resto de muestreos, y Aph. flos-aquae que domin en cuando se produjo la sucesin entre las dos especies mayoritarias. De las otras tres especies detectadas slo una de ellas M. flos-aquae present importancia relativa en el ltimo muestreo realizado donde fue la segunda especie detrs de M. aeruginosa.

Las especies de cianobacterias presentes en ambos puntos de muestreo (Figura II.43 y II.44) fueron las mismas: M. aeruginosa, M. flos-aquae, Aph. flos-aquae y A. flos-aquae. En cuanto a los valores de abundancia que presentaron, estos fueron prcticamente idnticos en los puntos en la misma fecha, siendo M. aeruginosa la especie dominante en todos los muestreos salvo en el primero.

79

Resultados

2002
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0 3-7-02 22-8-02 3-9-02 20-9-02 3-10-02 18-10-02 5-11-02 21-11-02

2003
Distribucin relativa
6 5 4 3 2 1 0
5603 4703 4903 15 -1 003 24 -1 003 13 -1 103 3 3 3 3 3 11 -9 -0 18 -9 -0 210 -0 24 -9 -0 30 -7 -0 910 -0 3

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

W. naegliana

Figura I.43. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el punto P1 del embalse de Picadas. 80

Resultados

P2 2003
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0

03 20 024 -1 0-

03

00

00

00

00

00

-2

-2

-2

-2

4-

-9

-9

-9

10

10

-2

11

18

24

2-

9-

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

A. crassa A. flos-aque

16

-1

Anabaena sp. Aph. Flos-aque

20

9-

04

W. naegliana

Figura I.44. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el punto V2 en el ao 2003.

4.8. Relaciones de clorofila a total y clorofila a de cianobacterias con los factores ambientales analizados.
La clorofila a total ha mostrado grandes variaciones, no slo entre los diferentes embalses analizados sino en un mismo embalse. Vistas estas grandes diferencias entre las concentraciones mximas y mnimas, se ha ver si estas variaciones se correlacionaban con alguna de las variables analizadas y estas variables entre s. Para ello la clorofila a determinada por mtodos espectrofotomtricos se correlacion con los factores ambientales, nutrientes, variables fsico-qumicas y los valores de clorofila a obtenidos por medidas fluoromtricas (Tabla I.3). Cuando analizamos las correlaciones cruzadas entre las diferentes variables, la correlacin ms fuerte observada, como caba esperar, se encuentra entre los valores de clorofila a determinada mediante el tcnicas espectrofotomtricas y fluoromtricas, puesto que en principio es el mismo parmetro medido por tcnicas diferentes. Otras correlaciones que cabe la pena destacar fueron las que se observan entre las concentraciones de clorofila a pertenecientes a cianobacterias y algas verdes y la clorofila a total. En cuanto a como se correlacionan los dos grupos algales mayoritarios en los embalses de la Comunidad de Madrid, las algas verdes y las cianobacterias entre si, podemos observar que las concentraciones de clorofila a de cada uno de estos grupos no mostraron correlacin, pero si cuando lo que comparamos son los porcentajes de cada uno de estos grupos, siendo la correlacin altamente 81

Resultados

significativa y negativa (-0,7). Los otros dos grandes grupos que restan, las criptofitas y las diatomeas, fueron excluidos del anlisis por presentar una importancia marginal en los embalses analizados. Estos grupos tambin se correlacionaron cuando comparamos las concentraciones de clorofila a de cada grupo con las clorofila a total la Figura I.45 nos permite observar con ms en detalle como se correlacionan, en ella podemos observar que cuando se alcanzaron las concentraciones mximas de clorofila a (por encima de 50 g Clo a L-1) es la clorofila a perteneciente a las cianobacterias la que mejor se ajusta a la clorofila a total, mientras que las concentraciones de clorofila a perteneciente a algas verdes no super en ningn caso los 50 g Clo a L-1. En cuanto a los nutrientes y su correlacin tanto con la clorofila a total y la clorofila a de los diferentes grupos algales, cabe destacar que nicamente presentaron una fuerte correlacin positiva con el fsforo total. Respecto al resto de los factores ambientales observamos que la clorofila a total se correlacion de manera positiva con el pH, con el oxgeno y con la turbidez, las cuales parecen ser causas de la biomasa algal ms que consecuencias de la misma. En el caso de los diferentes grupos algales y sus correlaciones con los nutrientes, la clorofila a de algas verdes se correlacion especialmente con el fsforo total y de manera mucho ms dbil con la turbidez, el NID y el pH. Las cianobacterias, se correlacionaron de manera especial con fsforo total, el pH y de manera mucho ms dbil con el nitrato, el oxgeno disuelto. Cabe destacar que aunque sea con un valor de correlacin Pearson muy bajo las cianobacterias se correlacionaron de manera negativa con la relacin NID/Ptot. Cuando analizamos como se comportaron estos factores respecto a los porcentajes de cada grupo algal encontramos efectos contrarios sobre los dos grandes grupos por parte de la conductividad que parece favorecer muy ligeramente a al porcentaje de algas verdes y mientras que el pH se correlaciona positivamente con el porcentaje de cianobacterias, aunque los valores de correlacin de Pearson fueron muy bajos en todos los casos. Finalmente, en esta tabla podemos observar las correlaciones entre los diferentes nutrientes, eliminando aquellos que presentan una fuerte autocorrelacin, al estar incluidos en otro factor (p.e el nitrato y el amonio en el DIN, o el Ptot en la relacin NID/Ptot), observamos como caba esperar que tanto el NID y sus componentes se correlacionan negativamente con la temperatura, tambin podemos destacar que el pH se correlacion fuertemente con el fsforo total y que la turbidez se correlacion de manera negativa con el NID y sus componentes, y positivamente con la temperatura y el oxgeno disuelto.

82

Resultados

Clo a esp. Clo a esp. Clo a Flu. Clo a Gr. Clo a Ci. % Gr. % Ci. Amonio Nitrato NID Ptot NID/Ptot Temp. Cond. O2 dis. pH Turb.

Clo a Flu.
0,830(**)

Clo a Gr.
0,719(**) 0,847(**)

Clo a Ci.
0,419(**) 0,456(**) -0,052

% Gr.
-0,020 -0,084 0,253(**) -0,398(**)

% Ci.
0,054 0,037 -0,282(**) 0,533(**) -0,687(**)

Amonio
0,034 0,163(*) 0,084 0,111 0,058 -0,171(*)

Nitrato
0,056 0,166(*) 0,054 0,176(*) -0,029 -0,116 0,339(**)

NID
0,071 0,158(*) 0,159(*) -0,040 0,059 -0,250(**) 0,524(**) 0,909(**)

Ptot
0,634(**) 0,720(**) 0,570(**) 0,414(**) -0,035 0,026 0,309(**) 0,208(**) 0,199(**)

NID/Ptot
-0,134 -0,155 -0,086 -0,193(*) 0,049 -0,160 0,165(*) 0,531(**) 0,549(**) -0,268(**)

Temp.
-0,043 -0,099 0,037 -0,059 0,162(*) 0,079 -0,557(**) -0,612(**) -0,672(**) -0,154(*) -0,405(**)

Cond.
0,086 0,029 0,155 -0,028 0,243(**) -0,159(*) 0,125 0,017 0,062 0,348(**) -0,162(*) -0,034

O2 dis.
0,294(**) 0,193(*) 0,106 0,207(*) 0,053 0,110 -0,273(**) -0,158(*) -0,201(**) -0,068 -0,087 0,179(*) -0,072

pH
0,477(**) 0,528(**) 0,195(*) 0,446(**) -0,226(**) 0,258(**) 0,241(**) -0,005 0,061 0,627(**) -0,128 -0,144 -0,001 0,046

Turb.
0,258(**) 0,173(*) 0,263(**) 0,112 0,119 0,119 -0,497(**) -0,468(**) -0,547(**) -0,003 -0,324(**) 0,665(**) 0,043 0,537(**) 0,034

Tabla I.3: Correlaciones entre las variables analizadas. Para ms informacin ver pgina siguiente 83

Resultados Tabla I.3. Correlaciones entre las variables analizadas (pagina anterior): Correlacin de Pearson entre los factores analizados. Se muestra el valor de coeficiente de Pearson, en negrita los valores significativos (* = p < 0,05, ** = p 0,01). Clo a esp. = clorofila a calculada por medios espectrofotomtricos, Clo a Flu. = clorofila a calculada fluoromtricamente. Gr. = algas verdes. Ci. = cianobacterias. NID = nitrgeno inorgnico disuelto. Ptot = fsforo total. Temp. = Temperatura. Cond. = conductividad. O2 dis. = oxgeno disuelto. Turb. = turbidez. Respecto a los como afectan el fosfato soluble y la relacin NID/Psol al resto de las variables y como nicamente se disponan de datos para el ao 2003, se realiz el mismo que el realizado anteriormente pero slo para este ao. En el mismo se pudo observar que la relacin NID/Psol slo se correlacionaba con los dos variables de los cuales deriva el fsforo soluble y con el NID. Mientras que las correlaciones positivas del fosfato soluble pueden verse en la tabla I.4.

Especie Amonio Nitrato Nitrito NID Fosforo total NID/Psol NID/Ptot Temperatura Conductividad Oxgeno Turbidez pH

Correlacin de Pearson 0,519(**) 0,287(**) -0,022 0,344(**) 0,256(**) -0,311(**) 0,168 -0,238(*) 0,150 -0,467(**) -0,057 -0,370(**)

Tabla I.4. Correlaciones del fosfato soluble con el resto variables qumicas y quimico-fsicas analizadas: Correlacin de Pearson entre los factores analizados. Se muestra el valor de coeficiente de Pearson, en negrita los valores significativos (* = p < 0,05, ** = p 0,01). NID = Nitrgeno inorgnico disuelto, Psol = Fosfato soluble, Ptot = Fosforo total.

84

Resultados Finalmente se intent establecer un modelo matemtico que nos permitiera definir la concentracin de clorofila a en funcin de las variables fsico-qumicas y nutrientes. En el proceso de construccin del modelo nicamente quedaron incluidas 4 de las variables introducidas, estas fueron: el fsforo total, turbidez, pH y concentracin de oxgeno, siendo las mismas variables independientemente del proceso de modelizacin utilizado: el Backward Stepwise Regresin o el Forward stepwise Regresion, y en ningn caso explicaron mas del 20% de la varianza por lo que no fue posible desarrollar un modelo adecuado.
Correlacin entre la clorofila total y la de cianobacterias Clorofila a de Cianobacterias (g L-1)
160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 10 100 160

Correlacin entre la clorofila total y la de algas verdes Clorofila a de algas verdes (g L-1)

140 120 100 80 60 40 20 0 1 10 100

Clorofila a total (g L-1)

Clorofila a total (g L-1)

Figura I.45. Correlaciones entre la clorofila a total y la clorofila a pertenecientes a algas verdes y cianobacterias. Los datos pertenecen a medidas realizadas por mtodos fluoromtricos.

4.9. Especies de cianobacterias presentes en la Comunidad de Madrid.

En total se han identificado 8 especies de cianobacterias planctnicas diferentes en los embalses estudiados (Figura I.46). Pero no todas ellas fueron igualmente importantes en la Comunidad de Madrid, para analizar este hecho, y debido a que los embalses se muestrearon en un numero diferente de ocasiones, se decidi intentar en la medida de lo posible evitar el sesgo que podra sufrir el anlisis si se ponan los datos obtenidos en todos los embalses, puesto que los embalses en los que las cianobacterias potencialmente txicas presentaron una mayor importancia fueron muestreados en un mayor nmero de ocasiones, y si se utilizaran todos los datos estos tendra una mayor importancia en el estudio. Para ello se realiz una

85

Resultados seleccin de las muestras, ste consisti en que solamente se consider el punto principal de cada embalse y slo se utilizaron los muestreos para las fechas para los cuales se tenan datos de al menos 6 embalses. Una vez considerados estos condicionantes se redujo el nmero total de muestras de 177 a 122.

Figura I.46: Cianobacterias identificadas a nivel de especie en los embalses analizados. A = M. wesenbergii, B = A. planktonica, C = Aph. flos-aquae, D = A. crassa, E = M. flos-aquae, F = W. naegeliana, G = A. flos-aquae, H = M. aeruginosa, La barra negra corresponde a 100 m 86

Resultados Un primer factor a analizar fue si existan diferencias en la abundancia que cada una de las especies presentaba entre los aos 2002 y 2003, el anlisis estadstico mostr que no existan diferencias (test Mann-Whitney en rangos) (datos no mostrados) por lo que para aumentar la potencia del anlisis estadstico para el resto de estudios se consideraron los datos de los dos aos juntos. Posteriormente analizamos el porcentaje de muestras en las que apareca cada una de las especies (Tabla I.5), lo que nos permite definir dos grandes grupos de cianobacterias, las cianobacterias que presentan frecuencias medias totales superiores al 50% de las muestras y que pueden considerarse comunes y las que se encuentran por debajo de ese valor consideradas poco abundantes. Curiosamente puede observarse un salto en el porcentaje de aparicin que presentan las especies, las especies consideradas poco abundantes no presentaron en ningn caso valores superiores al 33%. Adems estas especies raras presentan en general un patrn de aparicin contrario a las consideradas comunes siendo ms frecuentes en el ao 2002, que en 2003. La nica especie dentro de las raras que no present este patrn inverso fue precisamente la que present un valor de frecuencia ms elevada A. planktonica, que en este aspecto se comport como las especies consideradas comunes. En total son cuatro especies encontradas que pueden considerarse comunes, dentro de las cuales aparece una clara gradacin en cuanto su presencia. M. aeruginosa fue la ms comn estando presente en el 80%, de los muestreos, luego aparece otro grupo que engloba a las especies Aph. flos-aquae y M. flos-aquae que estuvieron presentes en alrededor del 60% de las muestras y finalmente A. flos-aquae que es la ltima de las especies comunes y se encontr en un 50% de las ocasiones. En el otro extremo entre las cianobacterias menos comunes nos encontramos M. wesenbergii, W. naegeliana y las Anabena spp., que estuvieron presentes en alrededor del 10% de los muestreos y que en general limitaron su presencia a los embalse de Lozoya y Ro Sequillo.

Tan o ms importante que la presencia o ausencia de las diferentes especies de cianobacterias es cual fue la abundancia relativa, que cada una de las especies present. La metodologa semicuantitativa utilizada dificulta la presentacin de los datos (una clasificacin en rangos de presencia, sin que los rangos fueran homogneos. Para ms informacin ver materiales y mtodos). Por esta razn se decidi mostrar los datos caractersticos que permiten comparar la estructura que muestran las frecuencias para cada una de las especies (Tabla I.6).

87

Resultados Primero analizamos si existan diferencias en la abundancia que las especies presentaba entre los dos aos, este estudio mostr que nicamente dos especies se comportaron de manera diferente entre los dos aos, estas especies fueron: M. aeruginosa (test Mann-Whitney, p = 0,029) y A. flos-aquae (test Mann-Whitney, p = 0,05) (datos no mostrados). En los dos casos la abundancia fue superior en el ao 2003 que en el 2002 a pesar de esta diferencia se decidi agrupar los datos de los dos aos para realizar el resto del anlisis. La tabla I.6 nos permite identificar una especie clramente ms importante que el resto: M. aeruginosa present

valores de abundancia por encima del resto en abundancia relativa al resto de las especies, encontrndose en valores superiores de abundancia. La mediana que presenta esta especie es 4, lo que implica que en el 50% de las muestras esta especie represent ms del 26% de las cianobacterias presentes. Es ms, estudiando el percentil 75 observamos que como poco en el 25 % de las muestras represent ms del 50% de las cianobacterias presentes. Las siguientes especies en orden de importancia fueron: Aph. flos-aquae, M. flos-aquae y A. flos-aquae. El resto de las especies presentaron frecuencias de aparicin bajas, como hemos podido ver en la Tabla I.5 y por lo tanto los valores mostrados en esta tabla estn muy sesgados por el gran nmero de muestras en los cuales no pudo observarse su presencia, lo que dificulta su comparacin. Las diferencias encontrados entre ellos significativas (anlisis Kruskal-Wallis p 0,001). Un anlisis posterior que permita analizar todas las comparaciones mltiples y que nos permitiera identificar cuales de los grupos se diferenciaban, lo que se realiz mediante un anlisis de Tukey (Tabla I.7). Los resultados muestran que las abundancias de M. aeruginosa fueron significativamente diferentes al del resto de las especies, lo que confirma que fue la especie ms abundante en los embalses analizados. Despus podemos definir otro grupo formado por M. flos-aquae y Aph. flos-aquae y A. flos-aquae que no presentan diferencias entre ellos, pero si con el resto de organismos minoritarios, y un tercer y ltimo grupo formado por el resto de especies identificadas. As finalmente encontramos que existen tres grandes grupos en cuanto a su importancia, uno que incluira a M. aeruginosa, la cianobacteria ms abundante, otro que incluira las cianobacterias con una abundancia media (M. flos-aquae y Aph. flos-aquae y A. flos-aquae) y finalmente las cianobacterias que pueden considerarse raras, el resto.

88

Resultados % de aparicin 2002 78,6 55,7 20,0 18,6 46,7 27,1 25,7 10 60,0 % de aparicin 2003 83,6 60,7 4,9 11,5 55,7 24,6 32,8 1,6 75,4

Especie M. aeruginosa M. flos-aquae M. wesenbergii W. naegeliana A. flos-aquae A. crassa A. planctonica A. ssp Aph. flos-aquae

Media 80,3 59,1 13,9 16,4 51,1 26,2 28,6 6,5 67,2

Tabla I.5. Frecuencia de aparicin de las especies cianobacterianas en los embalses analizados. Para calcular estos valores se consideraron los muestreos para lo que se tenan datos para al menos 6 de los embalses analizados y se consider nicamente el punto principal. Siendo el % sobre el total de las muestras utilizadas que cumplieron estas condiciones (n = 122).

Especie M. aeruginosa M. flos-aquae M. wesenbergii W. naegeliana A. flos-aquae A. crassa A. planctonica A. sps. Aph. flos-aquae

Rango 0-6 0-6 0-6 0-6 0-6 0-6 0-5 0-4 0-6

Mediana 4 1 0 0 1 0 0 0 2

25% / 75% 1/5 0/2 0/0 0/0 0/2 0/1 0/1 0/0 0/3

Tabla I.6. Frecuencias de aparicin de las diferentes especies cianobacterianas encontradas en los embalses de la Comunidad de Madrid. Las muestras utilizadas para realizar este clculo fueron aquellas en las cuales se tenan datos para al menos 6 de los embalses analizados y solamente en el punto principal. Se muestran, el rango, la mediana, el valor que presenta el valor que hace el 25% de las muestras y el 75%

89

Resultados
M. aeruginosa M. aeruginosa M. flos-aquae M. wesenbergii W. naegeliana A. flos-aquae A. crassa A. planctonica A. sps. Aph. flos-aquae M. flos-aquae M. wesenbergii W. naegeliana A. flos-aquae A. planctonica Aph. flos-aquae

A. crassa

A. sps.

Si

Si Si

Si Si No

Si No Si Si

Si Si No No Si

Si Si No No Si No

Si Si No No Si No No

Si No Si Si Si Si Si Si

Tabla I.7. Diferencias entre la abundancia de las especies de cianobacterias planctnicas encontradas en los embalses analizados. Las muestras utilizadas para realizar este clculo fueron aquellas en las cuales se tenan datos para al menos 6 de los embalses analizados y slo en el punto principal. Si, corresponde con los grupos que mostraron diferencias significativas (test de Tukey, p < 0,05).

90

Resultados Todo el anlisis anterior muestra que uno de los factores fundamentales que diferencia a las especies es el nmero de muestras en las cuales no es posible detectar una muestra y por lo tanto presenta un valor de abundancia de 0. Este hecho dificulta encontrar diferencias entre las especies raras, puesto que la comparacin se basa en el establecimiento de percentiles, lo que nos permite comparar la distribucin de las frecuencias observadas. Esto hace que todas las especies raras se agrupen juntas. Por ello, y con el fin de observar si existan diferencias entre ellas, consideramos que si eliminamos los valores iguales a cero y realizamos la comparacin de las diferentes especies, esto nos permitir conocer si las especies minoritarias presentan diferente importancia en la Comunidad de Madrid y adems podran mostrar si una vez que una especie es detectada y por lo tanto las condiciones para que aparezca se dan, existe alguna especie cianobacteriana que dominar sobre el resto, o si todas presentan distribuciones de abundancias similares. Una vez eliminados los valores iguales a 0 (Tabla I.8), podemos ver que la mayor parte de las diferencias que existan entre las diferentes especies desaparecieron. M. aeruginosa sigue mostrando valores importantes tanto de mediana, que en este caso alcanza un valor de 5 (lo que indica cuando estuvo presente en un embalse, en el 50% de las muestras representaba el 50% o ms de la poblacin). El resto de las especies sin embargo presenta valores muy similares, sin que se observaran diferencias claras entre ellas. Esto se demuestra cuando realizamos el test de Kruskal-Wallis sobre estos datos, este sigui detectando diferencias entre grupos estadsticamente significativas (p 0,001), pero cuando analizamos las diferencias las especies (test de Dunns, datos no mostrados), nicamente se encontraron diferencias significativas entre M. aeruginosa y las especies que se encontraron en mas del 25% de las muestras, estas fueron Aph. flos-aquae, M. flos-aquae, A. flos-aquae, A. crassa y A. planctonica. En el resto de las posibles relaciones entre especies no se encontraron diferencias significativas. Lo que indicara que en general, salvo para M. aeruginosa que parece adaptarse a casi todo el rango ambiental que se presenta en los embalses analizados y adems parece dominar en casi todos ellos, el resto una vez aparece en el embalse presenta una importancia en el similar, puesto que suelen presentar valores de abundancia similares. Otro factor importante de este trabajo fue intentar establecer cuales eran las especies de cianobacterias que se asociaban entre si, lo que indicara que sus requerimientos ecolgicos podran ser similares, para ello se realiz un estudio de anlisis de correspondencias entre

91

Resultados ellas. Para realizar este anlisis no se consideraron las cepas del gnero Anabaena de las cuales no se conoca la especie, puesto que en principio podran ser de mltiples especies y presentar requerimientos ecolgicos diferentes. Primero se considero si la especie estuvo presente o no, sin considerar la abundancia relativa que presentaban, para ello se le construy una matriz a la que cada especie se le dieron valores de cero (ausente) y uno (presente) (Figura I.47a). En esta grafica podemos observar que aparecen dos grandes grupos, uno de ellos implica a las tres cianobacterias ms abundantes, M. aeruginosa, M. flos-aquae y Aph flosaquae. El otro gran grupo engloba a dos especies de Anabaena, A. crassa, A. planctnica y tambin a W. naegeliana. En una posicin intermedia entre estos dos grupos encontramos a la especie A. flos-aquae en una situacin intermedia entre los dos grupos. Finalmente la ltima especie considerada en este anlisis M. wesenbergii, que se encontr fundamentalmente en el ao 2002 en el embalse de El Velln, aparece alejada del resto. Esto podra indicar que sus requerimientos ecolgicos podran ser diferentes a los que presentaban las otras dos especies de Microcystis encontrados en este trabajo. Para ver si las abundancias afectaban a la distribucin de las diferentes especies, se realiz otro anlisis vectorial en el que se utilizaron los valores de abundancia (Figura I.47b) y no slo la presencia y ausencia. Sin que los datos variaran de manera significativa.

Especie M. aeruginosa M. flos-aquae M. wesenbergii W. naegeliana A. flos-aquae A. crassa A. planctonica A. sps. Aph. flos-aquae

Nmero de muestras 99 72 18 20 60 32 35 8 82

Rango 1-6 1-6 1-6 1-6 1-6 1-6 1-5 1-4 1-6

Mediana 5 2 2 3 2 1 2 3 2

25% / 75% 2/6 1/3 2/6 2/4 1/4 1/3 1/4 2/4 2/3

Tabla I.8. Frecuencias de aparicin de las diferentes especies cianobacterianas encontradas en los embalses de la Comunidad de Madrid. Las muestras utilizadas para realizar este clculo fueron aquellas en las cuales se tenan datos para al menos 6 de los embalses analizados y nicamente el punto principal. Se muestran, el rango, la mediana, el valor que presenta el valor que hace el 25% de las muestras y el 75%

92

Resultados

Figura I.47 Anlisis de correspondencia: relacin de las diferentes especies de cianobacterias. Figura A: relacin teniendo en cuenta nicamente la presencia o ausencia de los especies. Figura B: relacin teniendo en cuenta la abundancia relativa de las especies. En ambos casos no se consideraron las cepas del gnero Anabaena encontradas que no fueron identificadas a nivel de especie, en ambos casos la varianza explicada fue superior al 70%.

93

Resultados El siguiente paso fue intentar correlacionar la presencia de cada una de las cianobacterias con las variables fsico-qumicas y ambientales que aparecan, con el fin de saber si era posible establecer cuales eran las condiciones ambientales ms adecuadas para las diferentes especies de cianobacterias planctnicas que se han encontrado. Los estudios de anlisis cannico de correspondencias entre las variables analizadas y las abundancias relativas de cianobacterias han presentado en todas las posibles variaciones analizadas han explicado menos del 30% de la varianza total, y ninguna de las variables analizadas presentaron relaciones significativas (anlisis de permutaciones de Monte Carlo datos no mostrados). Bajo estas condiciones no fue posible identificar cuales fueron las condiciones ideales para cada uno de las especies analizadas.

4.10. Presencia de Afloramientos de cianobacterias en los embalses de la Comunidad de Madrid.

Como hemos visto en la introduccin no existe una definicin clara de afloramiento, si aceptamos la definicin propuesta en la introduccin de 10 g Clo a L-1, todos los embalses analizados presentaran afloramientos y en algunos de ellos se extenderan durante todo el periodo de muestreos. Puesto que una de las definiciones ms aceptadas de afloramiento es un crecimiento de algas superior al nivel basal del embalse, vamos a intentar establecer un nivel de clorofila a nico para todos los embalses analizados partir del cual pudiramos considerar que ha ocurrido un afloramiento. Con el fin de establecer este valor lmite se hizo una media de todas las concentraciones de clorofila a encontradas en todos los embalses, eliminando aquellas que sobrepasaron los 100 g Clo a L-1, ya que de normalmente estas concentraciones pueden sin duda ser considerados como afloramientos, y sesgaran el valor medio, de esta manera podremos establecer cual es la concentracin basal media durante el periodo analizado en los embalses de la Comunidad de Madrid. La media de todos los embalses fue de 22,2 21,3 g Clo a L-1. Teniendo en cuenta la media y la desviacin estndar se decidi establecer la concentracin a partir de la cual se considerara afloramiento, este fue de 50 g Clo a L-1 en dos veces el valor medio determinado para la Comunidad de Madrid.

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Resultados Una vez definido el valor a partir del consideramos que se ha producido un afloramiento analizamos los datos encontrados en cada uno de los embalses analizados, lo que nos permitira determinar cual fue el nmero de afloramientos que han ocurrido durante los dos aos analizados y en qu embalses han tenido lugar. Tambin sera de inters determinar cuanto dur el evento, la intensidad del afloramiento y cual fue la especie que domin. Para las fechas en las cuales se dispona de datos de dos puntos diferentes de una embalse se realiz la media aritmtica para definir si exista o no afloramiento y para calcular tanto la clorofila a media, como la clorofila a mxima, la especie dominante en los dos puntos fue en todos los casos idnticos. Bajo estas condiciones durante los periodos analizados se han detectado 8 afloramientos en la Comunidad de Madrid. Estos han tenido lugar en cuatro de los siete embalses analizados con concentraciones medias de clorofila a en cuatro ocasiones por encima de 90 g Clo a L-1 (Tabla I.9). El embalse de Santillana destaca entre todos los estudiados por haber presentado el mayor nmero de afloramientos con un total de 4, tres de ellos en el ao 2002, en los meses de septiembre y octubre y el restante en el mes de julio del ao 2003 y se ha alcanzado la mayor concentracin de clorofila a. Otro de los embalses estudiados y que tambin present afloramientos en los dos aos analizados fue el embalse de Valmayor, en este, observamos un afloramiento en el ao 2002 entre los meses de julio y agosto donde las algas verdes fueron alrededor del 50% de la clorofila a total encontrada y otro en octubre de 2003 este que solo present una duracin de una semana, pero que mayoritariamente estuvo dominado por cianobacterias. Finalmente los dos ltimos embalses que presentaron afloramientos fueron los de Lozoya y Picadas, presentaron un afloramiento en los meses de septiembre del 2002 y octubre del 2003 respectivamente. La duracin de esos eventos fue en todos los casos menor de 4 semanas y en la mayor parte de los casos se extendieron menos de una semana, que fue la mayor frecuencia de muestreo utilizada en este trabajo, como media, los afloramientos duraron 2 semanas. Finalmente, hay una especie que domin claramente los afloramientos encontrados, en seis de los ocho afloramientos la especie dominante fue M. aeruginosa, en los otros dos fueron especies del orden nostocales las que fueron dominantes.

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Resultados Cuando comparamos el nmero de afloramientos que se presentaron en cada ao, podemos observar que mientras que en 2002 se detectaron 5 afloramientos (tres de ellos en el embalse de Santillana), en 2003 slo fueron 3. Las concentraciones medias y mximas encontradas fueron netamente diferentes en ambos ao, en todos los casos fueron superiores en el 2002 puesto que todos los afloramientos presentaron concentraciones superiores a las que encontramos en el ao 2003. De hecho, todos los afloramientos detectados en el ao 2003 estuvieron siempre muy cerca del lmite de 50 g Clo a L-1 a partir del cual se consider que exista un afloramiento. Esta diferencia entre las concentraciones de clorofila a se confirm cuando se compararon las concentraciones de clorofila a que se obtuvieron en ambos aos, y que fueron significativamente mayores en el ao 2002 que en el ao 2003 (test MannWhitney, p = 0.012).

Media Clo a Embalse y ao Duracin (g Clo a L )

-1

Clo a Mx. Fecha (g Clo a L-1) 110,6 3/9/2002 178,1 12/9/2002 232,7 7/10/2002 138,9 5/11/2002 50,9 9/7/2003 79,4 20/8/2002 52,3 16/10/2003 103,2 16/10/2003 Cianobacteria Dominante

Lozoya 2002 Santillana 2002 Santillana 2002 Santillana 2002 Santillana 2003 Valmayor 2002 Valmayor 2003 Picadas 2003

2 semanas 4 semanas 2 semanas 1 semana 1 semana 4 semanas 1 semana 1 semana

104,1 9,1 95,8 53,6 194,7 53,6 138,8 50,9 60,2 18,7 52,2 57,9

A. crassa

M. aeruginosa

M. aeruginosa

M. aeruginosa

M. aeruginosa

Aph. flos-aquae

M. aeruginosa

M. aeruginosa

Tabla I.9. Afloramientos de cianobacterias encontrados en los embalses de la Comunidad de Madrid. Clo a = concentracin de clorofila a. Mx. = mxima.

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Resultados Finalmente, nos quedaba confirmar si el valor utilizado para definir el afloramiento era correcto en todos los embalses o no, para ellos se represent este valor lmite y las concentraciones de clorofila a en cada uno de los embalses (como en el caso anterior e caso de existir datos para dos puntos se represent la media aritmtica para los dos valores) (Figura I.48). En esta figura podemos observar que en general el valor utilizado fue adecuado, los embalses de El Velln, San Juan, Ro Sequillo fueron los embalses en los que la clorofila a nunca se super este valor y sus concentraciones de clorofila a fueron de las menores obtenidas, En los dos primeros las concentraciones se mantuvieron ms o menos estables en los dos aos, sin que apareciera ningn pico de clorofila a claramente superior a la media anual. El parece que dentro de este tro de embalses que mostr un pico que puede ser considerado un afloramiento y que no supero el valor lmite es el embalse de Ro Sequillo que en el mes de octubre del 2002 mostr un pico claramente superior a la media anual. Los otros cuatro embalses analizados y que presentaron afloramientos puede ser divididos en dos grupos: uno definido por los embalses Lozoya, Santillana y Valmayor, y otro en el que encontraramos a Picadas. En el primer grupo los tres embalses presentaron concentraciones de clorofila a superiores en el ao 2002 a las que pudimos encontrar en el 2003. En el primero de los aos los afloramientos que pueden observarse alcanzaron concentraciones de clorofila a tan elevadas que el valor lmite que define afloramiento permite identificar correctamente los afloramientos que ocurrieron. Por otro lado en el ao 2003, que present concentraciones inferiores de biomasa, solamente se super este valor de referencia en dos de los embalses y de manera puntual (los afloramientos solamente duraron una semana), encontrndose en estos dos embalses (Santillana y Valmayor) cerca de este valor mnimo en otros momentos, en otras ocasiones aunque sin superarlo. El segundo grupo formado nicamente por el embalse de Picadas sin embargo, mostr un patrn de aparicin diferente a los tres anteriores, en el ao 2002 mostr un comportamiento similar al del embalse de ro Sequillo en ese mismo ao mostrando concentraciones bajas comparadas con otros embalses. Mientras que en el ao 2003 present un comportamiento claramente diferente entre los dos puntos de muestreo, a pesar de estas desviaciones encontradas, parece que el valor definido parece ser til en la definicin del afloramiento encontrado en este ao, permitiendo detectar casi todos los afloramientos que tuvieron lugar.

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Resultados
Lozoya 2002

Lozoya 2003

Rio Sequillo 2002

Rio Sequillo 2003

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

El Velln 2002

El Velln 2003

Santillana 2002

Clo a g L- 1

Santillana 2003

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

Valmayor 2002

Valmayor 2003

San Juan 2002

Clo a g L- 1

San Juan 2003

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

Picadas 2002

Picadas 2003

Clo a g L- 1

Figura I.48: Concentraciones de clorofila a en los embalses analizados y su comportamiento respecto al valor establecido para considerarlo un afloramiento. Con una flecha se marcan los momentos en que se ha considerado que estbamos ante un afloramiento. La lnea marca el valor de 50 g de Clo a L-1 98

Clo a g L- 1

Clo a g L- 1

Resultados

4.11. Estado trfico de los embalses analizados.

Los datos recogidos pueden ser utilizados para definir el estado trfico que presentan los embalses analizados, teniendo en cuenta que estos datos representan slo parte del ao y que faltan datos en de invierno y primavera que sera necesarios para definir sin lugar a dudas el estado trfico que los mismos presentan. A pesar de ello decidimos utilizar la clasificacin de la OCDE para calcular cual era el estado trfico general de los embalses analizados calculando la media de la clorofila a y el fsforo total con todos los datos obtenidos para cada embalse (Tabla I.10), lo que nos permitira como mnimo establecer una gradacin de estado trfico entre los embalses. Segn esta clasificacin, Cinco de ellos se clasifican como eutrficos, e los dos restantes los embalses el de Santillana y El Velln pueden ser clasificados de hipereutrficos, el primero de ellos para los dos parmetros analizados, el fsforo total y la concentracin media de clorofila a, y el segundo solo para el fsforo total.

Media Ptot Embalse Lozoya Ro Sequillo El Velln Santillana Valmayor San Juan Picadas (g P L-1) 65,7 26,7 49.9 30,5 152,1 32,6 146,1 104,6 91,8 29,0 30,8 23,2 96,2 130,2

Media Clo a (g Clo a L-1) 24,8 29,9 13,1 10,5 16,6 7,6 47,1 49,7 29,5 18,7 11,2 6,2 24,9 32,5

Clasificacin segn la OCDE Eutrfico Eutrfico Hipereutrfico Hipereutrfico Eutrfico Eutrfico Eutrfico

Tabla I.10. Valores medios de fsforo total y clorofila a en los siete embalses analizados. Ptot = fsforo total. Clo a = concentracin de clorofila a.

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Discusin

5. Discusin.
El agua es un recurso imprescindible para la vida y en gran parte de Espaa es considerado como un recurso escaso. Por ello es de especial importancia tener un conocimiento exhaustivo de los compuestos u organismos que pueden afectar a su calidad. Los afloramientos de microalgas en general y de cianobacterias en particular son un factor que puede tener mltiples efectos sobre la calidad de este recurso (Metcalf y Codd 2004), aunque existen pocos estudios acerca que importancia tienen en nuestros embalses ((Moreno y col., 2005); (Aboal y Puig 2005); (Barco y col., 2004); (Sanchis y col., 2002); (Ariosa y col., 2005) y (Quesada y col., 2002)). Estudios realizados con anterioridad mostraban que la existencia de este tipo de afloramientos en uno de los principales embalse de la Comunidad de Madrid (Sanchis y col., 2002), por lo que nos planteamos hacer un estudio ms en profundidad que permitiera determinar cmo de importantes son las cianobacterias dentro de la poblacin fitoplactnica en los embalses de la Comunidad de Madrid y si la formacin de afloramientos poda considerarse un hecho comn. Con ese fin se eligieron 7 de los principales Embalses de la Comunidad de Madrid que representan el 42,4% del total del agua embalsada que en Madrid. Todos los embalses estudiados pueden clasificarse en funcin de su comportamiento trmico como monomcticos con un periodo de estratificacin que ocurre de primavera hasta el otoo (Margalef 1983), en nuestro caso todos los embalses analizados se muestrearon cuando la termoclina estaba ya formada. La aparicin de esta termoclina tiene importantes efectos sobre los nutrientes, las caractersticas fsico-qumicas y las variables biolgicas, hace que las masas de agua estratificadas presenten concentraciones de nutrientes bajas en el epilimnion (capa superior) comparadas con las que existen en el hipolimnion (capa inferior). Cuando la estratificacin se rompe (finales de octubre, principios de noviembre) se puede observar una brusca subida en la concentracin de nutrientes, en especial de NID, efecto que se ha podido ver en todos los embalses analizados a excepcin del de Ro Sequillo en el ao 2003, en el cual parece que no llegamos a ver la mezcla total al realizar el ltimo muestreo en el mes de octubre y no en el mes de noviembre como en el resto de embalses. Analizando ms

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Discusin en profundidad el comportamiento de este NID se pudo ver que durante el periodo de estratificacin (antes de la rotura de la termoclina) el componente fundamental de este nitrgeno inorgnico es el amonio, sin que sea posible, en la mayor parte de los casos, detectar la presencia del otro componente fundamental del DIN, el nitrato. Esto cambia cuando tiene lugar la rotura de la termoclina, en este momento la importancia de cada uno de estos compuestos en el NID cambia, la concentracin de nitrato sufre un gran incremento que lo convierte en el componente mayoritario. Esto queda de manifiesto cuando analizamos las correlaciones del NID con las distintas variables donde observamos una correlacin del 0,9 con el nitrato y solamente del 0,5 con el amonio, lo que es debido a que en los momentos en que la concentracin de NID es alta, el componente principal de este es el nitrato. La concentracin de amonio obviamente tambin se incrementa, pero no en la misma proporcin que el nitrato. Esto puede deberse a que al romperse la termoclina se produce una oxidacin del amonio (componente mayoritario del DIN en el hipolimnion) al encontrarse con una mayor concentracin de oxgeno. La idea de que este incremento se deba en gran parte a la escorrenta superficial no puede descartarse, aunque el ao 2002 se caracteriz por presentar un otoo poco lluvioso y hasta mediados de noviembre (con posterioridad a la subida del nitrato) no se observaron incrementos en la cantidad del agua embalsada, lo que indica una baja escorrenta superficial ( o una mayor demanda de agua), y las tendencias de nitrato en DIN fueron similares a las encontradas en el 2003 que present una mayor escorrenta. Respecto al fsforo soluble, para el cual nicamente existen datos para el ao 2003, se mantuvo en general en niveles por debajo del lmite de deteccin hasta el mes de octubre, prcticamente el final del periodo de muestreo. Existen dos embalses que sin embargo se apartan de esta tnica, Santillana y El Velln, en los cuales fue posible detectar fosfato soluble durante casi durante todo el periodo para el cual existen datos. Se ha publicado que el fsforo reactivo soluble es el principal factor que explica la dominancia de las cianobacterias no fijadoras de nitrgeno (p. e Microcystis) (Xie y col., 2003), parte de nuestros datos parecen estar de acuerdo con esta hiptesis, por ejemplo en los dos embalses anteriores los momento es lo que se produce un aumento de la concentracin de clorofila a coincide con bajadas en una inmovilizacin de este fosfato soluble. Esta reduccin puede observarse de manera puntual en otros embalses como el de Picadas, pero el hecho es que en la mayora de la muestras no fue posible detectar la presencia de fosfato soluble y que existen muestras en las

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Discusin cuales la presencia de fsforo soluble (como en el embalse de Santillana en los meses de septiembre y octubre) o en general en los meses de octubre en el resto de los embalses sin que esto implicara un incremento en la concentracin de clorofila a. La razn de este comportamiento puede deberse a que son muy numerosos los factores que implican el crecimiento de las algas como ya hemos indicado en la introduccin (Oliver y Ganf 2000), de hecho se han descrito mltiples recursos como limitantes para el fitoplancton ((Hecky y Kilham 1988); (Huisman y Weissing 2001)). Adems la metodologa utilizada en este trabajo dificulta la obtencin de datos que apoyen esta hiptesis, los pulsos de fsforo deben en teora ser muy cortos al tener los organismos una gran avidez por el, lo que producira la inmovilizacin del mismo transformndolo en fsforo total con gran rapidez. El hecho de que en pocos de los embalses analizados sea posible detectar la forma reactiva soluble del fsforo hasta la rotura de la termoclina, apoya la idea de que el fsforo reactivo soluble nada ms se incorpora al sistema es tomado por las organismos. Para poder obtener datos validos, la frecuencia de muestreo debera haber sido muy superior al que se ha utilizado en este estudio. Seis de los embalses analizados pueden clasificarse de eutrficos y en todos ellos cianobacterias potencialmente txicas han dominado la poblacin fitoplanctnica durante extensos periodos de tiempo. Si unimos estos dos factores, hemos de concluir que todos ellos pueden potencialmente dar lugar a importantes biomasas de organismos potencialmente txicos, afloramientos, y como hemos visto en los datos la presencia de afloramientos es un hecho comn en varios de los embalses analizados. Aunque los intentos por determinar si las concentraciones de fsforo total afectaban a las especies u ordenes de cianobacterianas presentes no han tenido xito. Aunque el embalse que present un valor mayor, el embalse de Santillana, ha sido dominado fundamentalmente por M. aeruginosa, lo que estara de acuerdo con lo defendido por (Xie y col., 2003), esta especie ha dominado tambin en el embalse de Valmayor que trficamente hablando present valores similares al embalse de Lozoya, un embalse que podemos considerar dominado por especies del genero Anabaena, lo que indicara que existen mltiples factores, adems del P, que controlan si en un embalse aparecen fundamentalmente Nostocales o Chroococales. Despus queda comentar cmo el fsforo total y las relaciones NID/Ptot y NID/Psol afecta a la clorofila a y a los grupos algales. Estos factores junto con el nitrgeno total (Ntot) y la relacin Ntot Ptot (que no fueron medidos en este trabajo), son las variables que ms se

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Discusin han utilizado para explicar o predecir en que embalses van a dominar las cianobacterias (p.e. (Downing y col., 2001), (Xie y col., 2003), (Hecky y Kilham 1988)). Aunque ni los estudios de laboratorio ni los estudios ecolgicos globales en lagos, proporcionan pruebas concluyentes de si alguno de ellos juega un papel preponderante para que las cianobacterias sean dominantes en el ecosistema ( Downing y col., 2001). En nuestro caso ninguna de las relaciones (ni NID/Ptot, ni NID/Psol) se ha correlacionado con los grupos algales presentes. Ya se ha descrito que en ningn caso hay leyes determinsticas que expliquen la dominancia de las cianobacterias (Pearl y col.,, 2001), es mas ya ha sido propuesto que por lo menos la relacin Ntot Ptot puede no ser causa de los afloramientos de cianobacterias si no su resultado (Xie y col., 2003). En nuestro caso slo una de las variables presenta una correlacin fuerte tanto con la clorofila a de cianobacterias, como con los otros tipos clorofila a, este es el fsforo total. Esta correlacin ha sido descrita como una manera de predecir la dominancia de cianobacterias en lagos canadienses (Downing y col., 2001), aunque en nuestro caso se correlaciona con la clorofila a, tanto total, de cianobacterias como de algas verdes. Desde nuestro punto de vista esta correlacin como ya ha sido descrita para la relacin Ntot Ptot es debida a los afloramientos de cianobacterias y no causa del mismo. En nuestros embalses que se caracterizan en general por presentar bajas concentraciones de fsforo soluble, al menos en el ao 2003 para el cual existen datos, podemos considerar que el fsforo total se comporta ms como una medida de biomasa que como un factor que controlara la aparicin de cianobacterias. Aunque como defiende (Huisman y Hulot 2005) en nuestro caso no hemos diferenciado entre especies fijadoras o no fijadoras que podran tener diferentes requerimientos en las relacin N-P y por lo tanto esa puede ser la razn por la cual no hemos obtenido una correlacin clara entre las relaciones, NID/Psol (para el ao 2003) y NID/Ptot y la cianobacterias. En cuanto a las variables fsico-qumicas podemos establecer dos grandes grupos, uno son las vairables que se encuentran directamente influenciados por los organismos que se aparecen en el sistema, en especial por el fitoplancton, estos son el oxgeno disuelto, el pH y la turbidez. Por otro lado nos encontramos las variables que en principio dependen en fundamentalmente de las caractersticas ambientales no biolgicas como son la temperatura y la conductividad. La temperatura se comporta en todos los embalses analizados de manera casi idntica, puesto que al encontrarse todos ellos en una zona geogrficamente pequea

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Discusin todos ellos reciben una cantidad de energa del sol similar no existiendo diferencias significativas entre ellos. Esta variable si tiene como cabe esperar un gran efecto sobre los nutrientes (como podemos observar en la tabla de correlaciones), pues el gradiente de temperatura es el responsable de la formacin de la termoclina. Resulta curioso el efecto significativo que la temperatura presenta sobre el porcentaje de algas verdes que presenta esta presente en un momento determinado, aunque correlacin positiva sea muy pequea (0,16). Esto podra indicar que, las elevadas temperaturas favorece a las algas verdes y no a las cianobacterias como haba sido publicado con anterioridad (Robarts y Zohary 1987) y que como hemos indicado en la introduccin (Oliver y Ganf 2000), haciendo que las algas verdes dominen a las cianobacterias en los meses calidos. Algo que confirmara los estudios iniciales que indicaron que las algas verdes se desarrollan especialmente en los meses de verano cuando las temperaturas del agua son elevadas (por ejemplo en el embalse de Sau entre los aos 1964 y 1972 (Margalef 1983)). Finalmente, la conductividad present exclusivamente efectos sobre el porcentaje de los dos grandes grupos, algas verdes y cianobacterias adems de manera inversa, favorece a las algas verdes y negativamente a las cianobacterias, eso si, los valores de Pearson fueron muy bajos y podran deberse un resultado espurio, puesto que en general las variaciones de conductividad en los embalses analizados tampoco en muy grande. Respecto a las caractersticas fsico-qumicas que estn directamente influenciados por la actividad biolgica, el pH fue en casi todo momento bsico en los embalses analizados, esta basificacin del medio esta correlacionada positivamente con la clorofila a (con valores cercanos a valores 0,5 del coeficiente de correlacin de Pearson, en el caso de la clorofila a total medida por mtodos espectrofotomtricos y ligeramente superiores en el caso de la clorofila a total medida por mtodos fluoromtricos). La razn que podra explicar correlacin sera la modificacin del equilibrio carbnico-bicarbonato que ocurre en lagos y embalses debido a la produccin primaria que retira carbono inorgnico del medio (Margalef 1983) y que obviamente depende de la cantidad de biomasa presente (del cual la clorofila a es su principal indicador) . Algo similar pasa con el oxgeno disuelto, que es un subproducto de la fotosntesis oxignica por lo que tambin tiende a correlacionarse con la clorofila a. Y finalmente nos queda hablar de la turbidez que es debida a las partculas en suspensin. Este parmetro por tanto en sistemas no turbulentos que remuevan el sedimento, depende en parte de los organismos fotosintticos que flotan, a mayor biomasa mayor turbidez como ocurre en

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Discusin este caso. Para estas dos ltimas variables la correlacin no es tan buena como la que observamos en el caso del pH, porque otros factores como el viento, puede modificar tanto el oxgeno en disolucin al facilitar el intercambio con la atmsfera, lo cual disminuye la fuerza de la correlacin entre estos dos factores y la biomasa medida como clorofila a. Durante el periodo analizado son dos los grupos mayoritarios que se han encontrado, las algas verdes y las cianobacterias, los otros dos grupos diatomeas y pueden considerarse minoritarios. Como media el 47% de la clorofila a perteneca a cianobacterias, mientras que la algas verdes represent el 33% de la concentracin de clorofila a lo que indica que las cianobacterias son el grupo fitoplanctnico ms importante en los embalses estudiados de la Comunidad de Madrid. Adems, estos grupos son en general autoexcluyentes, como indica la fuerte correlacin negativa que presentan los % de cada uno de ellos. Este mayor dominio que presentan las cianobacterias sobre las algas verdes, ya ha sido estudiado en mltiples trabajos y las posibles explicaciones han sido ya descritas en la bibliografa, este trabajo no permite indicar cual de ellas es la responsable de este dominio, pero posiblemente las razones ms plausibles que lo explican son: su capacidad para controlar su flotacin ((Huisman y Hulot 2005) y referencias dentro de ella), la produccin de compuestos con efectos alelopticos sobre los posibles competidores algales, lo que les permitira desplazar a las algas verdes en este caso (p.e (Kearns y Hunter 2000) (Kearns & Hunter 2001)) y la resistencia a la depredacin que presentan las cianobacterias, no solamente por que en muchos casos su tamao y su forma impiden su depredacin (Burns 1968), sino porque no son un alimento nutricionalmente adecuado para ellos al carecer por ejemplo de cidos grasos esenciales para el desarrollo del zooplancton (Nielsen 2006). Desde nuestro punto de vista como ya hemos indicado una de las ideas ms extendidas que explica el dominio de las cianobacterias en funcin de la concentracin de fsforo sera una consecuencia y no una causa. Lo que ocurrira simplemente es que las cianobacteria pueden alcanzar poblaciones mayores que el resto de los grupos fitoplactnicos que presentan tasas de predacin menores que las algas verdes, sus principales competidores, esta capacidad de alcanzar poblaciones mayores implicara que son capaces de alcanzar concentraciones de fsforo total mayores. Desde luego existen otras posibles explicaciones que ayudaran a explicar como las cianobacterias son capaces de alcanzar poblaciones mayores que las algas verdes, como seran: la flotacin, que les permite concentrarse en la superficie y as concentrar el fsforo total en una zona

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Discusin determinada, o la produccin de compuestos alelopticos, que les permitira ser mejores competidores desplazando a al resto de los grupos algales y por tanto alcanzar mayores biomasas. Por ejemplo (Candfield y col.,, 1989) encontr dbiles correlaciones entre nutrientes (concentraciones y ratios) y dominancia de cianobacterias, pero fuerte con la biomasa algal presente, lo que podra apoyar nuestras hiptesis, de que la relacin entre el fsforo total y la biomasa de cianobacterias no sea una causa sino un efecto. El periodo de estudiado, como hemos comentado, coincidi con el periodo en el que las especies de cianobacterias potencialmente txicas dominaron la poblacin de cianobacterias planctnicas presentes, este mismo periodo de dominio se ha observado en otros pases del rea mediterrnea como por ejemplo Grecia (Cook y col., 2004) donde el periodo de dominio coincidi con el periodo analizado en este trabajo de Junio a Noviembre, o en Israel las cianobacterias dominaron en el lago Kinneret (el antiguo mar de Galilea) en verano y en otoo (Zohary 2004). En otras zonas europeas, por ejemplo en Centroeuropa, este dominio de la poblacin por parte de las cianobacterias potencialmente toxicas comienza ligeramente antes que en zonas mediterrneas, en mayo, continuando hasta el mes de noviembre. Esta diferencia en el periodo de dominio parece que es debido a la importancia que en esos pases presenta un gnero cuya importancia en la regin mediterrnea es menor Planktothrix que parece ser capaz de dominar al poblacin en este primer momento ((Fastner y col., 1999); (Willame y col., 2005)) adelantando el periodo de afloramientos respecto a los pases mediterrneos. Microcystis, el gnero cianobacterias mas importante en el mediterrneo, comienza a ser importante en junio, tanto en Centroeuropa, como en la zona mediterrnea ((Fastner y col., 1999); ( Cook y col., 2004)). Los tres gneros principales de cianobacterias planctnicas encontrados en la Comunidad de Madrid han sido; Microcystis, Aphanizomenon y Anabaena, estos junto con el gnero Planktothrix son tambin los gneros potencialmente txicos ms abundantes en Europa y se caracterizan por dominar los cuerpos de aguas monomcticos eutrficos, como los encontrados en la Comunidad de Madrid, y que presentan tanto una fuerte estabilidad en la columna de agua y los nutrientes que facilitan el crecimiento masivo de estos organismos (Reynolds 1981). Junto con estas tres gneros hemos encontrado otro que de manera puntual (excepto en el embalse de Lozoya donde domin parte del ao 2003) se ha localizado en

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Discusin algunos de los embalses y que en la actualidad se cree que en ocasiones tambin podra presentar cepas toxicas: Woronichinia y que ha sido descrito como relativamente abundante en los cuerpos de aguas estudiados en Blgica y Luxemburgo (Willame y col., 2005) donde se situ en el mismo grupo de abundancia que Anabaena y Aphanizomenon y despus de los dos gneros ms comunes en centroeuropea Microcystis y Planktothrix. En total se han detectado 9 especies diferentes, pero no todas presentan la misma importancia. La especie mayoritaria en muestra regin es M. aeruginosa, la especie planctnica potencialmente txica posiblemente ms importante en la zona mediterrnea (Cook y col., 2004), no slo porque es abundante entre la poblacin cianobacteriana de los embalses, si no que tambin parece tener una mayor capacidad para alcanzar grandes poblaciones dando lugar a afloramientos. Un ejemplo de esto es el hecho de que la mayor parte de los afloramientos encontrados en este trabajo estaban dominados por esta especie. En la zona escandinava tan importante como M. aeruginosa, son las especies pertenecientes al gnero Anabaena (Sivonen y col.,, 1992), en centroeuropa como ya hemos indicado con anterioridad P. rubescens es tan importante como M. aeruginosa. Tras esta especie nos encontramos con un grupo de especies M. flos-aquae, Aph. flos-aquae y A. flos-aquae. Finalmente en la zona mediterrnea seran las cuatro ultimas especies las dominantes (Vardaka y col.,, 2005), que coinciden con las que hemos encontrado en este trabajo. M. aeruginosa parece la clara dominadora en los embalses de la Comunidad de Madrid, cuando aparece en un embalse, en el 50% de las veces representa el 50% o ms de la poblacin de cianobacterias en el 50%, lo que da a estas especie una importancia fundamental en los embalses de la zona. Este valor es mayor al encontrado en Alemania (Fastner y col., 1999) y similares a los encontrado en otros pases mediterrneos, como en Grecia (Cook y col., 2004). Este valor de abundancia relativa es claramente superior a las cianobacterias que se presentaron en el alrededor del 25% de las muestras analizadas. Sin embargo, las especies raras W. naegeliana, A. sp y M. wesenbergii no presentaron diferencias significativas con M. aeruginosa cuando consideramos nicamente los muestras positivas y no las totales. Esto parece indicar que cuando estas especies aparecen, lo cual ocurre en un nmero muy bajo de ocasiones, pueden llegar a representar una parte importantes de la poblacin de cianobacterias. Una posible causa de esto sera que estas cianobacterias aparecen en uno o en dos embalses (El Velln 2003 en el caso de M. wesenbergii y Lozoya 2003 en el caso de W. naegeliana) lo

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Discusin que significara que estas especies presentan un rango ecolgico ms estrecho que el resto, razn por la cual aparecen en tan pocas muestras. Pero si las condiciones para que estas especies aparezcan, se presentan, las especies se muestran muy eficientes llegando a dominar la poblacin. En el otro extremo encontraramos a M. aeruginosa que presentara unos requerimientos ecolgicos ms amplios, esto le permite aparecen un mayor nmero de muestras, adems esa amplitud de requerimientos ecolgicos que presenta, le permitira desplazar al resto que aparecen en sus mismas situaciones. Para analizar cuales eran las especies suelen aparecer juntas, se realizo el estudio factorial, lo que nos permiti establecen dos grandes grupos. Por un lado aparecen M. aeruginosa, M. flos-aquae y Aph. flos-aquae y por otro lado dos especies de Anabaena y W. naegeliana. A la hora de estudiar los grupos funcionales propuestos por (Reynolds y col., 2002) que se basan en las asociaciones funcionales que presenta un organismo, de manera que los organismos con requerimientos ecolgicos similares aparecen asociados Aphanizomenon al ser una cianobacteria fijadora debera coincidir con Anabaena y por lo tanto deberan asociarse y tener requerimientos ecolgicos similares. Esta asociacin Anabaena/Aphanizomenon se ha encontrado en lagos Griegos (Vardaka y col., 2005). Sin embargo, cuando analizamos los datos obtenidos en este estudio encontramos una asociacin diferente, Aph. flos-aquae no se asocia con las especies del gnero Anabaena, sino con Microcystis, esto parece indicar que en este caso tanto Aph. flos-aquae como Microcystis presentan requerimientos similares, a pesar de que una es una especie fijadora de nitrgeno. De hecho los intentos de detectar fijacin biolgica de nitrgeno en muestras dominadas por Aph. flos-aquae en el embalse de Santillana se encontraron siempre por debajo del lmite de deteccin (D. Sanchis comunicacin personal). Adems, en al bibliografa existen ejemplos en las que estas dos cianobacterias codominaron en los afloramientos (Welker y col. 2003), como ha ocurrido por ejemplo en los embalses de Santillana y Valmayor. Esto nos hace creer que en este caso el considerar a Aph. flos-aquae asociada a otras fijadoras de N2, podra no ser la nica posibilidad, puesto que en nuestro caso parece ser que presenta requerimientos ecolgicos similares a los que tiene M. aeruginosa, como confirma el hecho de que coincidan en muchas casos en el mismo momento en el mismo embalse, codominando la poblacin de cianobacterias. Mientras A. flos-aquae se alejara de Aph flos-aquae y servira de puente con el otro gran grupo que incluira, a las otras dos especies de Anabaena identificadas y W. naegeliana. Es curioso que los dos grupos fundamentales presenten miembros de orden Chroococcales y Nostocales mezclados, lo cual

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Discusin parece insinuar que la distribucin en grupos funcionales propuesta por (Reynolds y col., 2002) no es adecuada para los embalses en estudio. Finalmente, M. wesenbergii parece tener un rango ecolgico mucho ms estrecho que las otras dos especies del gnero Microcystis puesto que no se asocian entre ellos, eso si, cuando estas condiciones se dan parece tratarse como hemos indicado antes de una especie que presenta una competitividad muy grande, siendo capaz de dominar la poblacin de cianobacterias de una manera muy eficiente. Muchos afloramientos de cianobacterias han sido descritos en la bibliografa en las ltimas dcadas, pero no hay ninguna definicin plenamente aceptada de que es un afloramiento. Como ya hemos visto en la introduccin que una de las ms aceptadas es la de establecer un lmite de 10 g Clo a L-1 cuando las cianobacterias son dominantes (Oliver y Ganf 2000). Pero como todas las definiciones que proponen un valor lmite igual para todos los embalses y situaciones, son difciles de aplicar, por ejemplo si aplicramos esa definicin a los embalses analizados en este trabajo todos los embalses presentaran afloramientos y en muchos casos este se extendera durante prcticamente o todo el periodo de muestreos. Esto chocara con la idea de afloramiento, que es cu crecimiento de algas por encima de la media. Esta falta de definicin clara de lo que es un afloramiento dificulta la comparacin de datos, puesto que lo que para un investigador es un afloramiento puede no serlo para otro y viceversa. Por ello nos hemos decidido por poner un valor basal mnimo para todos los embalses analizados que se base en la concentracin de clorofila a media que ocurre durante el periodo de muestreos. Nuestra definicin de 50 g Clo a L-1, puede parecer alta para muchos pases y situaciones, sin embargo parece apropiada para este estudio y posiblemente es adecuado para los embalses espaoles en particular y para los embalses y lagos mediterrneos en general. Puesto que salvo en uno de los embalses analizados el de Ro Sequillo, parece que ha sido capaz de detectar todos los afloramientos producidos. Con este valor lmite, cuatro de los siete embalses analizados en este trabajo y cinco de los ocho embalses analizados en al Comunidad de Madrid ((Barco y col., 2004) (Almodovar y col.,, 2004)) presentaron afloramientos de cianobacterias. La presencia de afloramientos de cianobacterias parece mayor en los embalses analizados que en otras zonas del rea mediterrnea como Grecia donde nicamente el 27% de los embalses analizados presentaban afloramientos de cianobacterias (Cook y col., 2004). Esto

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Discusin podra explicarse por varias razones, una de ellas es que la frecuencia de muestreo utilizada en este trabajo, mayor que en el trabajo anterior, el nico que de este estilo que existe en la zona mediterrnea. Normalmente en estos trabajos gran cantidad de embalses son muestreados con frecuencias menores a las utilizadas en este trabajo (por ejemplo 2 veces en todo el verano) con el fin de ampliar la bsqueda a la mayor cantidad de cuerpos de aguas posibles. Una mayor frecuencia de muestreo podra permitir detectar un mayor nmero de afloramientos, puesto que como hemos visto en este trabajo presentan una corta duracin (de menos de una semana). Otras posibles explicaciones seran la propia definicin de afloramiento o que los embalses analizados presenten una mayor probabilidad de presentar afloramientos de cianobacterias que otros embalses analizados en la zona mediterrnea.

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CAPTULO II

CAPTULO II

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Introduccin

Microcistinas en embalses de la Comunidad de Madrid (CAM)

1. Introduccin
Dentro de la gran diversidad de compuestos que pueden ser producidos por las cianobacterias uno de los ms importantes, tanto por el efecto txico que presenta como por lo abundante que es en los cuerpos de aguas dulces, es la microcistina (Fastner y col., 1999). El nombre de microcistinas se debe al organismo del cual se aislaron por primera vez, Microcystis aeruginosa (Carmichael y col., 1988).

1.1. Estructura qumica de las microcistinas.

Qumicamente hablando, las microcistinas son heptapptidos cclicos que poseen varios aminocidos no proteinognicos (Figura II.1). El ms caracterstico de ellos es el cido (2S,3S,8S,9S) 3 amino 9 metoxy 2, 6 ,8 trimetil 10 fenildeca 4 ,6 dienoico, tambin conocido por el nombre de Adda. Este aminocido tambin es caracterstico de otro grupo de toxinas muy relacionadas, las nodularinas. Adems de este aminocido, la estructura general de las microcistinas presenta otros 6 aminocidos, los ms comunes son: D-alanina (D-Ala), D-eritro--metil-aspartico (D-MeAsp), Dglutamato (D-Glu), N-metildehidroalanina (Mdha) y dos aminocidos variables denominados genricamente X y Z, estos dos ltimos son siempre L-aminocidos, normalmente los dos nicos ismeros L presentes en la molcula (Gulledge 2002). En lo que respecta a la estructura espacial de estos compuestos (Figura II.2) se asemejan a una silla de montar con la cadena lateral del Adda sobresaliendo sin mostrar ninguna estructura bien definida (Trogen y col., 1998).

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Introduccin Existen 71 diferentes variantes de microcistinas descritas hasta el momento (Codd y col., 2005a), teniendo todas ellas una masa molecular de alrededor de 1000 Da (entre 900 y 1100), son solubles en agua y, exceptuando posiblemente las ms hidrofbicas, son incapaces de atravesar la membrana celular. Debido a su estructura qumica estos compuestos son extraordinariamente estables, tolerando grandes variaciones en la qumica del agua donde se encuentran disueltos, como por ejemplo cambios en el pH ((Harada y Tsuji 1998); (Harada K.I. y col., 1996)).

Figura II.1: Estructura general de las microcistinas. ciclo-(D-Ala -X -DMeAsp -Z -Adda -D-Glu -Mdha ).
3 4 5 6 7

Figura II.2: Estructura tridimensional de la microcistina. Para aumentar la claridad de la estructura en silla de montar las cadenas laterales de los aminocidos variables (X y Z) no han sido representadas.

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Introduccin Existiendo tantas variantes qumicas de microcistinas, un aspecto muy importante es el establecimiento de una nomenclatura que nos permita una rpida identificacin del compuesto del que estamos hablando. La nomenclatura de estos compuestos se basa en los dos aminocidos variables X y Z, genricamente hablamos de la microcistina XZ derivando su nombre de la nomenclatura del cdigo de una letra de los aminocidos. Aparte de estos dos aminocidos variables, se han encontrado modificaciones en todos los aminocidos que forman parte de la molcula, las cuales se incluyen en el nombre cuando estn presentes, siendo las dos modificaciones ms frecuentes las desmetilaciones en los residuos 3 (D-MeAsp, se incorpora al nombre DAsp3) y 7 (D-Mdha, se incorpora al nombre Dha7) (Sivonen y Jones 1999). Dentro de estas 71 variantes, las toxinas ms frecuentes en el ecosistema, parecen ser la microcistinas LR, RR, YR y sus variantes desmetiladas en los residuos 3 y 7.

1.2. Sntesis de las microcistinas

Las microcistinas no estn codificadas en el ADN, son sintetizadas por una ruta alternativa a la va ribosomal. La sntesis implica a dos tipos de enzimas, sintetasas peptdicas no-ribosmicas (NRPS) y las poliqutido sintasas (PKS). Las NRPS son una gran familia de protenas modulares, en las que cada modulo se encarga de la activacin, modificacin y condensacin de cada uno de los aminocidos que forman los pptidos no ribosmicos (Figura II.3). Por otro lado, las PKS son las enzimas responsables de la sntesis del Adda. Esta familia de enzimas, tambin modulares, son capaces de producir un gran nmero de compuestos a partir de los siguientes grupos: acetilos, propionilos o butirilos (Figura II.3), todos ellos son activados por su unin a Coenzima-A. Los compuestos que pueden producir las PKS a partir de estos monmeros mnimos son de una enorme diversidad (Cane y col., 1998). Qumicamente todos son definidos como compuestos que contienen alternativamente grupos carbonil y grupos metilenos. Las PKS son muy comunes en el mundo bacteriano y gracias a ellas se producen un gran nmero de compuestos bioactivos con importantes funciones farmacolgicas entre ellos algunos son: antibiticos como la eritromicina A, supresores

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Introduccin de la respuesta inmune como la rapamicina o compuestos anticancergenos como la epotilona B (http://linux1.nii.res.in/~pksdb/polyketide.html).

Figura II.3: Ejemplo de modularidad de las NPRS y las PKS. C = dominio de condensacin, A = Adenilacin, Negro = Tiolacin, KS = - Cetoacil sintasa, AT = Acil tranferasa, CM = C-metiltransferasa, DH = Dehidratasa, KR = Cetoacil reductasa, ACP = Protena transportadora del grupo acilo. Extrado de Tillett y col., 2000.

Como hemos indicado con anterioridad para sintetizar las microcistinas son necesarias por un lado las NRPS responsables de la unin de los diferentes aminocidos y de las PKS responsables de la sntesis del compuesto ms caracterstico de las microcistinas: el Adda.

Hasta el momento se conoce la estructura gnica de la regin responsable de la produccin de microcistinas en 4 organismos (3 especies). Dos cepas de Microcystis: M. aeruginosa PCC 7806 (Tillett y col., 2000) y M. aeruginosa K-139 (Nishizawa y col., 2000), una de Anabaena: (Rouhiainen y col., 2004) y una de Planktothrix (Christiansen y col., 2003). En estos organismos todas las enzimas responsables de la sntesis de

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Introduccin microcistinas se encuentran agrupadas en un nico opern, si bien la estructura del mismo vara en cada caso.

Microcystis fue el primer organismo en el cual se secuenci el promotor responsable de la sntesis de microcistinas, este tiene un tamao aproximado de 55 Kpb, y en total codifica 10 protenas, 6 de las cuales son enzimas multifuncionales con dominios PKS y NRPS. Los 10 genes en este organismo se organizan alrededor de un promotor bidireccional (Figura II.4), hacia un lado y en el siguiente orden nos encontramos: mcy A, mcy B, mcy C (NRPS) implicados en la sntesis del pptido (Tillett y col., 2000). En la direccin contraria nos encontramos: mcy D, mcy E, mcy F, mcy G, mcy H, mcy I y finalmente mcy J. Por otro lado, los operones de los otros dos gneros difieren del encontrado en Microcystis. En el gnero Anabaena los genes se encuentran ordenados de manera diferente como puede verse en la Figura II.4 aparece un promotor unidireccional justo antes de mcy D (Figura II.4). y en Planktothrix

De los diez genes mencionados, ocho se encuentran implicados directamente en la produccin de las microcistinas (Figura II.5). Posiblemente la protena codificada por mcy G es el iniciador de la sntesis y parece ser la encargada de activar el fenilacetato (dominio NRPS), que posteriormente es transferido a la 4-fosfopanteteina del primer dominio transportador. A continuacin, los 4 dominios PKS que poseen Mcy G prosiguen con la sntesis del Adda el cual es terminado de sintetizar por las protenas Mcy D y Mcy E. Esta ltima enzima, que tambin es un hbrido PKS-NPRS, ser la encargada de proporcionar el enlace en entre el grupo amino de Adda y el glutamato, gracias al dominio de condensacin (NRPS) que esta enzima posee, uniendo la parte PKS de la sntesis con la parte NRPS. Posteriormente y en orden de actuacin actan las siguientes enzimas: Mcy A y Mcy B que incorporan los cuatro siguientes aminocidos (dos cada uno) y Mcy C que incorporar el ltimo (Tillett y col., 2000). La molcula obtenida se cree que con la ayuda de otra enzima se terminar de ciclar (Christiansen y col., 2003). La funcin de las cuatro enzimas restantes son (Tillett y col., 2000):

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Introduccin Mcy J es responsable de la O-metilacin del Adda Mcy F es una racemasa que posiblemente es la encargada de proporcionar el Dasprtico y lo mas probable tambin D-metil-asprtico Mcy H posee homologa con trasportadores ABC y parece estar implicado en el transporte de las microcistinas, siendo imprescindible para su sntesis (Pearson y col., 2004). Mcy I de funcin actualmente desconocida.

Figura II.4: Estructura del opern responsable de la sntesis de microcistinas en los diferentes organismos en los que se conoce su estructura. En negro esta marcado el transportador ABC, en verde las pptido sintetasas, en azul las poliqutido sintasas y en gris las enzimas modificadoras . Extrado de Brner y Dittmann 2005.

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Introduccin

Figura II.5: Modelo propuesto para la formacin de la microcistina LR. Los rectngulos representan los dominios pptido sintetasa, A = aminoacil adenilacin, C = condensacin, AMT = aminotransferasa, el rectngulo negro representa el motivo de tiolacin de las NRPS. Los crculos representan los motivos de las poliqutidos sintetasa, KS = cetoacil sintetasa, AT = acetiltranferasa, ACP = Protena transportadora del grupo acilo, KR cetoacilreductasa, DH= dehidratasa, CM = CM = C-metiltranferasa, OM = O-metiltranferasa. (extraido de (Tillett y col., 2000))

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Introduccin

1.3. Organismos productores

Las cianobacterias son los principales organismos productores de microcistinas Dentro de este Filum no todos los gneros poseen especies productoras, as los gneros descritos como potencialmente productores (aquellos en los cuales se han encontrado especies productoras) ms importantes son: Microcystis; Planktothrix; Anabaena; Oscillatoria; Nostoc; Anabaenopsis; Hapalosiphon; (Sivonen y Jones 1999) Woronichinia (Cronberg y col., 1999) y Aphanocapsa (Domingos y col., 1999). Si bien, ni todas las especies de estos gneros poseen la capacidad de producir microcistinas ni dentro de una especie productora todas las cepas son productoras. Diferentes estudios de campo han intentado establecer un porcentaje de riesgo para los diferentes gneros cianobacterianos potencialmente productores. Probablemente uno de los ms completos, en cuanto al nmero de muestras analizadas, es el trabajo realizado por Fastner y colaboradores 1999, calcul el porcentaje de muestras que presentaban microcistinas cuando la especie dominante perteneca a uno de los tres gneros productores ms comunes en los embalses y lagos europeos: Microcystis, Planktothrix y Anabaena. Los datos obtenidos mostraban que en esta situacin casi el 100% de las muestras presentaban microcistinas. El gnero cianobacteriano productor de microcistinas ms comn en la zona mediterrnea es el gnero Microcystis (Cook y col., 2004), dentro del cual las especies ms comunes son: M. aeruginosa, M. flos-aquae, M. viridis y M. wesembergii. Como hemos indicado anteriormente no todas las especies presentan la misma probabilidad de producir microcistinas. Aun as, dentro de este genero se puede establecer una gradacin en cuanto a la probabilidad que presentan cada una de estas especies de ser toxicas, este es: M. aeruginosa > M. flos-aquae > M. wesenbergii (Via-Ordorika y col., 2004) (Figura II.6). En el caso del gnero Planktothrix las dos principales especies, P. agardii y P. rubescens (Figura II.6), se caracterizan por un elevado riesgo de producir microcistinas, siendo en el caso de P. rubescens cercano al 100%, puesto que dentro de lo que nosotros sabemos, en todas las especies aisladas y siempre que se ha analizado un afloramiento donde este organismo ha sido dominante se han detectado este tipo de toxinas. En cuanto a la produccin de microcistinas por el gnero Anabaena (Figura 119

Introduccin II.6), la dificultad que presenta su taxonoma hace que muchas de las cepas aisladas no estn caracterizadas a nivel de especie, sin embargo los trabajos realizados en los que se ha identificado la especie muestran que A. flos-aquae y A. lemmermanii, son la de mayor probabilidad de ser txicas, si bien diversos autores las consideran la misma especie (Geitler 1932).

Figura II.6: Cianobacterias productoras de microcistinas ms comunes en lagos y embalses Europeos. Extrado de Geitler 1932 y Komarek y Anagnostidis 1999.

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Introduccin

1.4. Funcin de las Microcistinas

Una de las cuestiones que con ms frecuencia se hacen acerca de las microcistinas, es si presentan alguna funcin dentro de los organismos que las producen, hasta ahora se han propuesto varias hiptesis: Defensa contra depredadores. Implicacin en fotosntesis. Molcula quelante de hierro. Molcula implicada en sealizacin. Molcula implicada en divisin celular. Ninguna de las hiptesis ha sido demostrada ni completamente descartada, existiendo para cada una de ellas datos experimentales que les sirven de apoyo. La defensa contra los depredadores se apoya por un lado por su efecto txico sobre muchos de ellos y por otro porque su produccin parece responder a la presencia de posibles depredadores aumentando la concentracin intracelular (Jang y col., 2003). Su implicacin en fotosntesis est apoyada porque su localizacin intracelular mayoritariamente radica en los tilacoides (se trata de una endotoxina que se encuentra casi en su totalidad en el interior celular) (Lahti y col., 1997). Aunque el mutante de Microcystis sp. 7806, incapaz de sintetizar este tipo compuestos, no parece estar afectado en la fotosntesis lo que crea dudas acerca de esta hiptesis (Hesse y col., 2001). Su posible funcin como quelante de hierro se ha intentado explicar, por un lado a travs de estudios qumicos que demuestran la capacidad quelante que este compuesto posee (Utkilen y Gjolme 1995) y por otro lado porque en el opern responsable de su sntesis se han encontrado posibles promotores reconocidos por la protena Fur, factor sigma implicado en la regulacin del metabolismo del hierro (Martn-Luna y col., 2006) congreso). Las dos ltimas posibilidades nombradas en la lista inicial, han sido las que ha aparecido en la escena cientfica ms recientemente y se basan en el primer caso en la utilizacin de tcnicas de protemica que permitieron identificar una protena con homologa a otra relacionada con qurum sensing y en la segunda porque el mutante incapaz de sintetizar microcistinas formaba sincitios con mayor frecuencia que el silvestre (Clauner y col., 2004).

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Introduccin

1.5. Toxicidad de las microcistinas

Hasta ahora hemos hablado de la estructura, sntesis y funciones de las microcistinas, pero quizs la razn que hace tan interesante a este grupo de compuestos es su efecto sobre otros organismos. Hasta el momento se ha detectado que estos compuestos son txicos para: plantas, bacterias, invertebrados no artrpodos, artrpodos y vertebrados (desde peces a mamferos) (Wiegand y Pflugmacher 2005). Este amplio rango de organismos afectados se debe a la inhibicin especfica sobre las protenfosfatasas PP1 y PP2A que poseen estos compuestos (Dawson 1998). Esta inhibicin se debe a que el Adda es capaz de unirse covalentemente al residuo de cistena que las dos enzimas poseen en su centro cataltico, Cys-266 en el caso de la PP1 (Mackintosh y col., 1995) y Cys-273 en el caso de la PP2A (Runnegar y col., 1995). No obstante, no es necesaria esta unin covalente y nicamente es necesario que el residuo de Adda se site en el bolsillo hidrofbico del centro activo para inhibir la accin de las enzimas (Goldberg y col., 1995). La importancia de este aminocido (Adda) queda de manifiesto porque modificaciones estructurales en el mismo o su eliminacin dan lugar a la desaparicin de la inhibicin sobre la PP1 y PP2A (Abdel-rahman y col., 1993). Asimismo, la linearizacin del pptido y la presencia de enantimero Z (ismero geomtrico) en el doble enlace del Adda (C6) dan lugar a una disminucin en inhibicin ((Nishiwaki-Matsushima y col., 1991); (Bourne y col., 1996)). Cuando examinamos las constantes de disociacin de las microcistinas y las proten-fosfatasas nos encontramos que debido a la fuerte capacidad inhibitoria de las toxinas, las constantes exactas slo pueden obtenerse por extrapolacin de la concentracin de fosfatasa a cero. Con esta extrapolacin se obtiene un rango de 0,06-6 nM para la PP1 y 0,01-2 nM para la PP2A (Dawson 1998). Cuando se estudia el efecto de las microcistinas sobre el organismo completo un factor muy importante en la toxicidad es la va de entrada por la cual este compuesto entra en el organismo y del organismo que se estudia. En principio las microcistinas, excepto probablemente las ms hidrofbicas, slo pueden atravesar la membrana si existe algn transportador que las reconozca, el transpotador que reconoce a esta familia de compuestos es el de cidos biliares y por lo tanto los daos observados en

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Introduccin mamferos suelen localizarse fundamentalmente en el hgado. Una vez dentro de los hepatocitos el efecto sobre las proten-fosfatasas da lugar a una hiperfosforilacin del citoesqueleto, especficamente los filamentos intermedios y las citoqueratinas 8 y 18 (Toivola y col., 1997). Esto produce una desestructuracin general del citoesqueleto que da lugar a la desaparicin de los hepatocitos provocando una hemorragia centroglobular (Figura II.7) (Toivola y col., 1998) que termina por producir la muerte. Las microcistinas potencialmente pueden afectar a otros organismos si son capaces de entrar en el citoplasma celular.

Figura II.7: aspecto del hgado del ratn despus de una dosis letal de Microcistina LR. A = hgado control. B = hgado despus de una dosis letal. extrada de Azevedo y col., 2002. No todos los tipos de microcistinas existentes poseen la misma toxicidad y estas diferencias no pueden explicarse solamente por su efecto sobre las proten-fofatasas (Ito y col., 2002), pues existe mucha mayor diferencia entre la toxicidad intraperitoneal de por ejemplo Mc-LR y Mc-RR (DL50 = 50 g kg-1 y DL50 = 600 g kg-1) (Sivonen y Jones 1999) que entre las diferentes constantes de inhibicin que presentan, donde la mayor diferencia se observa sobre la PP2A, donde la Ki de la Mc-LR es el doble de la Mc-RR, lo que indicara que existen otros factores aparte del efecto sobre las protenfosfatasas que afectaran a la DL50, lo que podra explicarse por dos causas: una mejor detoxificacin y una mejor excrecin de las microcistinas menos txicas como parecen indicar los datos experimentales en ratones (Ito y col., 2002).

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Introduccin Aparte de este efecto directo causado por la unin de las microcistinas sobre la PP1 y PP2A, podemos observar otro indirecto. El proceso de detoxificacin de las microcistinas implica acomplejar este compuesto con glutatin (Ito y col., 2002). Cuando una concentracin suficientemente alta de un compuesto txico aparece en los hepatocitos, como resultado indirecto, la cantidad de glutation reducido en el hgado disminuye y aumenta la probabilidad de dao por estrs oxidativo. Este incremento de especies reactivas del O2, parece ser el causante del dao que sobre el DNA son capaces de causar las microcistinas (Wiegand y Pflugmacher 2005).

1.6. Microcistinas en el ecosistema

El efecto de las microcistinas en el ecosistema no esta clara. Parece obvio que, ecolgicamente hablando, los mamferos, que son los organismos ms sensibles a estos compuestos, no son la diana a nivel trfico. Por ello, es interesante conocer al menos someramente cules podran ser los efectos sobre otros grupos de organismos, algunos de los cuales s entran en competencia directa con las cianobacterias productoras de microcistinas. Entre los organismos que pueden entrar en contacto con las microcistinas o sus productores en los lagos y embalses nos encontramos a: Otros grupos fitoplanctnicos. Plantas acuticas. Zooplancton. Bivalvos. Crustceos. Peces. Aves. Mamferos.

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Introduccin En primer lugar vamos a hablar del efecto que tienen las microcistinas sobre los otros organismos que forman parte del fitoplancton. Este efecto se ha detectado tanto en campo como en laboratorio, si bien en este ltimo caso las relaciones se han realizado de manera indirecta y parecen indicar efectos alelopticos de las cianobacterias productoras de microcistinas con otros miembros del fitoplancton (Wiegand y Pflugmacher 2005). Los efectos directos encontrados en estudios de laboratorio de estos compuestos sobre otros miembros del fitoplancton han sido varios, por ejemplo Singh y col., 2001 mostraron que la microcistina LR aumentaba la lisis de cianobacterias no productoras como Nostoc muscorum. Mientras que su efecto sobre un alga verde como Chlamydomonas reinhardtii fue la disminucin en la motilidad y por tanto el posterior aumento en la sedimentacin (Kearns y Hunter 2001). El efecto de las microcistinas sobre las plantas acuticas ha sido escasamente investigado. Por ejemplo la presencia de Microcystis en co-cultivo con Lemna minor reduce su crecimiento (Weiss y col., 2000). Mientras que la microcistina soluble tambin parece afectar a este tipo de organismos por ejemplo el macrfito Ceratophyllum demersum vea reducido su crecimiento en presencia de concentraciones tan bajas como 1 g L-1 (Pflugmacher 2002). El mecanismo de toxicidad de las microcistinas en las plantas es claramente diferente al descrito para animales, puesto que las plantas carecen del rgano diana de estas toxinas caracterstico en animales. En este caso la toxicidad se da por un aumento de estrs oxidativo, que aparece al disminuir la cantidad de glutation reducido en el interior celular al intentar la planta detoxificar las microcistinas presentes en su citoplasma uniendo este glutation a la microcistina libre (Wiegand y Pflugmacher 2005), este incremento en las concentraciones de oxgeno reactivo intracelular es el responsable de los daos que se producen en las clulas vegetales. La inhibicin del zooplancton por las microcistinas se considera una de las posibles funciones de las microcistinas, lo que unido a la estructura fsica de algunos productores potenciales como por ejemplo Microcystis (formacin de colonias), dificulta el que en general el zooplancton se alimente de estos organismos. Cuando se estudia el efecto de las microcistinas y del organismo productor ms estudiado,

125

Introduccin Microcystis, sobre diferentes miembros del zooplancton, por ejemplo sobre Daphnia nos encontramos muy diversas reacciones, por ejemplo, Daphnia pulicaria parece ser la menos sensible del grupo, mientras que Daphnia pulex es la ms sensible (Wiegand y Pflugmacher 2005). Daphnia magna tiene un comportamiento curioso, es insensible a la microcistina disuelta, pero no a la ingestin de clulas de especies productoras de microcistina, de hecho la exposicin previa a un Microcystis txico incrementa su resistencia (Gustafsson y Hansson 2004). Por otro lado, otros organismos como el coppodo Diaptomus birgeri muestran una sensibilidad intermedia a las cepas txicas de Microcystis (Demott y col., 1991). Como podemos apreciar existe una gran diversidad en cuanto al efecto que estas toxinas tienen sobre los que supuestamente son sus organismos diana. Los peces parecen ser en general poco sensibles a las microcistinas. De hecho, las mortalidades en masa que se han detectado durante afloramientos txicos se han asociado ms con cambios de pH o la bajada en la tensin parcial de O2, que con la presencia de estas toxinas. Los rganos diana son como en mamferos el hgado y tambin el rin y las clulas epiteliales de las branquias (Wiegand y Pflugmacher 2005). Una importancia especial de este tipo de organismos viene dada por que pueden ser considerados una va alternativa para la entrada de microcistinas en la cadena trfica que desemboca en los seres humanos (De Magalhaes y col., 2001) por su potencial acumulacin en los msculos de algunas especies. Mltiples ejemplos de muerte de animales y aves se encuentran a lo largo de la historia como resultado de ingestin accidental, al beber o comer afloramientos o tapetes de cianobacterias que estaban formados por especies productoras de microcistinas. Los animales que han resultado fundamentalmente afectados han sido vacas y perros (Codd y col., 2005b). Dentro de las aves tienen particular importancia las muertes masivas de flamencos que recientemente han tenido lugar en diversos lugares del mundo como Espaa (Alonso-Andicoberry y col., 2002), Estados Unidos (Chittick y col., 2002) y Kenia (Ballot y col., 2004; Krienitz y col., 2003).

126

Introduccin

1.7. Efectos de las microcistinas sobre los seres humanos

Un punto aparte merecen los efectos de las microcistinas sobre los seres humanos, como ya hemos comentado en la introduccin general diversos casos de intoxicacin por cianotoxinas se han publicado desde el siglo XIX hasta la actualidad. Tanto la gastroenteritis como la hepatoenteritis son enfermedades comunes en los seres humanos debido a la gran cantidad de factores, especialmente infecciones vricas o bacterianas, que pueden causarlas. Debido a esta gran cantidad de posibles causas es difcil establecer una relacin directa entre cianobacterias y estas sintomatologas que son comunes en casos de contaminacin con microcistinas y slo si se han detectado cianobacterias txicas se puede relacionar un posible envenenamiento por estos compuestos (Falconer 2005). Uno de los ms claros ejemplos del efecto de las microcistinas sobre los seres humanos ocurri en Australia (presa de Malpas, Armidale, Nueva Gales del Sur) (Falconer y col., 1980). En este embalse se detect un afloramiento dominado por M. aeruginosa cerca de la toma de agua del mismo y como parte del tratamiento se utiliz sulfato de cobre, conocido alguicida que lisa las clulas, liberando as la microcistina almacenada en el interior celular al medio circundante. El posterior tratamiento de potabilizacin (cloracin) se mostr inadecuado para la eliminacin de este tipo de toxinas, muy estables al tratamiento tradicional con cloro. Ello qued de manifiesto cuando posteriormente al acceder a los datos clnicos se detect que el hgado de la poblacin que haba bebido agua contaminada haba resultado daado (se observ un aumento en las enzimas marcadoras de dao heptico). En el momento que esto ocurri no exista la metodologa que permitiera determinar la concentracin de microcistina en agua, lo que impidi establecer relaciones entre dosis recibida y dao observado (Falconer y col., 1983). Aunque existen datos contrastados de intoxicaciones agudas, es ms complicado el estudio de la exposicin a concentraciones subletales durante largos periodos de tiempo (exposicin crnica). En este caso los datos epidemiolgicos recogidos en China (Zhou y col., 2002; Yu 1995), correlacionan la presencia de microcistinas con el cncer de hgado y de colon. Esto queda de manifiesto ante la existencia de datos de laboratorio

127

Introduccin que sugieren que las microcistinas podran causar procesos tumorognicos, si bien esta actividad como promotor de tumores necesita ser comprobada por procedimientos estndar y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) todava no considera a las microcistinas como molcula promotora de tumores (Falconer 2005).

1.8. Legislacin.
Debido a los posibles efectos adversos sobre los seres humanos, en 1997 la OMS estableci un valor gua que pudiera ser utilizado por los pases como una indicacin que utilizar en sus legislaciones. Este valor fue obtenido utilizando los valores de NOAEL (No Observed Adverse Effect Level; dosis mxima a la cual no se observan efectos adversos), a partir de un estudio realizado en ratones e incorporando una serie de factores de incertidumbre. Este valor permite calcular una TDI (Tolerable Daily Intake; ingesta diaria tolerable) sin que aparezcan efectos negativos sobre el organismo. Para calcular este valor como hemos mencionado antes se han de establecer una serie de factores de incertidumbre, los utilizados fueron: 10 por la diferente sensibilidad dentro de cada especie, 10 por las diferencias entre especies y 10 por la limitacin de datos disponibles. Todos juntos dan un factor de incertidumbre global de 1000.

TDI =

40 40 g/(kg d) (utilizando datos de ratn) g/(kg d) = 0 ,04 g/(kg d) = 1000 Factor de incertidumbre

Con este valor TDI se puede calcular un valor gua para aguas de bebida que se calcul siguiendo la formula escrita a continuacin y aplicando los siguientes factores: un peso corporal de 60 kg; un factor de 0,8 porque supone que el 80% de la microcistina que podemos tomar va a ser a travs del agua y finalmente dividiendo por la estimacin de agua que consume un adulto diariamente, 2 litros al da. Aplicando estos valores se obtiene:

Valor Gua =

0,04 60 0,8 = 0,96g / L 2

128

Introduccin Redondeando este valor se obtiene el valor gua de la OMS 1 g L-1. Todos estos valores se han calculado utilizado los valores toxicolgicos de la microcistina LR, nica para la cual existen valores realistas de toxicidad, aunque no es la nica toxina presente en ambientes acuticos. A partir de este valor gua una serie de pases han puesto en marcha legislaciones con el fin de regular los valores mximos que deben cumplir las aguas de consumo (Chorus 2005), uno de ellos fue Espaa que en 2003present una legislacin de aguas de consumo en los que estableci un valor mximo para aguas de consumo medido a la salida de la estacin potabilizadora de 1 g L-1 de microcistina total (Real decreto 140/2003).

129

Objetivos

2. Objetivos
Como hemos podido ver el captulo anterior, la presencia de cianobacterias potencialmente productoras de microcistinas es comn en las aguas de los embalses de la Comunidad de Madrid. En base a ello, los objetivos de este captulo son: Analizar la presencia y prevalencia de microcistinas en embalses utilizados para aguas de consumo en la Comunidad de Madrid, as como determinar las concentraciones a las que se presentan dichos compuestos Identificar cules son los posibles organismos productores de estos compuestos en cada embalse analizado. Identificar qu embalses dentro de los analizados muestran una mayor probabilidad de presentar este tipo de compuestos. Establecer un periodo de mxima probabilidad de aparicin de estas toxinas en la Comunidad de Madrid.

130

Materiales y Mtodos

3. Materiales y Mtodos.

3.1. Zona de Estudio.

La zona de estudio coincide con la descrita en el captulo I.

3.2. Toma de muestras.

Se tomaron dos tipos de muestras para anlisis de microcistinas: por un lado muestras de la fraccin sestnica, esto es muestras no concentradas. Por otro lado muestras concentradas con una red de fitoplancton (Wildco 48-C60 USA,) de 80 m de tamao de poro. Las primeras muestras se tomaron de la misma manera que las muestras destinadas a su anlisis taxonmico descrita en el captulo anterior. Ambas muestras fueron tomadas entre 5 y 20 metros de la orilla (en funcin de la profundidad del embalse). Una vez situados, la red se lanzo a 10 metros de distancia, recogiendo la muestra justo por debajo de la superficie. Esto se repiti 10 veces (el volumen aproximado que fue concentrado, considerando un dimetro de boca de 13 cm. fue de 1300 litros). Posteriormente la muestra fue resuspendida en un volumen aproximado de 100 mL. Ambas muestras, concentradas y no concentradas, se guardaron a 4 C hasta su procesamiento en laboratorio. Se tomaron dos muestras distintas en cada punto de muestreo dadas las grandes variaciones de concentracin de microcistinas que stas pueden presentar en los diferentes embalses y momentos de muestreo, variando de unos pocos ng L-1 hasta mg L-1 (en los acumulados que se formaron en la orilla). En las muestras que presentaban concentraciones en el orden de g L-1, su deteccin fue relativamente sencilla en muestras sin concentrar. Sin embargo, el estudio de la potencialidad de produccin de microcistinas por el sistema requera concentrar previamente la muestra para poder determinar su concentracin.

131

Materiales y Mtodos

3.3. Determinacin del contenido de clorofila a.

La concentracin de clorofila a se realiz siguiendo el protocolo descrito en el captulo I, extrayndose en este caso tanto las muestras no concentradas, como las concentradas a travs de la red de fitoplancton.

3.4. Determinacin de clorofila y grupos algales por mtodos fluoromtricos.

La determinacin de la concentracin de clorofila a y la determinacin fluoromtrica de grupos algales se realiz como ha sido descrito previamente en el captulo I.

3.5. Cultivo de la Cepa Microcystis aeruginosa UAM 247.

La cepa de M. aeruginosa UAM 247, fue crecida en BG-11 modificado (Sanchis y col., 2004) hasta fase estacionaria, momento en el cual se recogi por filtracin con vaco suave a travs de filtros de GF/F.

3.6. Extraccin y anlisis de microcistinas.

Las muestras para anlisis de microcistinas fueron conservadas a 4 C hasta su llegada al laboratorio donde fueron filtradas a travs de filtros GF/F (Whatman, Gran Bretaa) de 47 mm de dimetro, con el mismo sistema utilizado para la determinacin de clorofila. El volumen de filtracin fue de 500 ml en el caso de la muestra no concentrada por red y de 30 ml en la muestra concentrada (siempre que la presencia de biomasa no recomendara su reduccin). Una vez filtrada la muestra se conserv a -20C hasta su extraccin, concentracin y anlisis.

132

Materiales y Mtodos La extraccin de las microcistinas se realiz por duplicado, para ello los filtros fueron extrados con una solucin metanol-agua 90% (90% metanol para anlisis de Merck 10% de agua mili-Rho). El filtro fue recortado e introducido en un tubo de centrifuga, se aadieron 4 ml de la solucin de metanol 90%, y se agit en un vortex Reax 2000 (Heidolph, Alemania) a mxima velocidad durante 2 min y posteriormente se introdujo en un bao de ultrasonidos Ultrasons (J.P.Selecta, Espaa) durante 10 minutos y posteriormente se guardo a 4 C durante 24 horas. Finalmente fue centrifugada a 5000 rpm en una centrfuga Labofuge Ae, equipada con un rotor basculante (Heraeus Sepatech, Alemania) y se retir el sobrenadante. Este proceso fue repetido una vez ms aadiendo otros 3ml de metanol 90%. Los dos sobrenadantes se conservaron a -20 C antes de concentrarse. La concentracin de la muestra se realiz en dos pasos, en un primer paso la muestra se llevo a sequedad con un rotavapor modelo R (Bchi, Suiza) a 40 C y se resuspendi en un volumen de 2 mL de metanol 100%, este se introdujo en un tubo eppendorf, y posteriormente se concentr mediante una centrifuga concentradora modelo Howe girovap GL (Girovap, Italia), tambin a 40 C. Finalmente el extracto se resuspendi en un volumen 400 L, doscientos de los cuales se pasaron a travs de un filtro de nylon y se introdujeron en un vial de HPLC (cromatografa lquida de alta resolucin) para su anlisis. El anlisis de las muestras para detectar la presencia de microcistinas fue realizado con un HPLC modelo 2695 Alliance, con un inyector automtico y un detector con un conjunto de diodos modelo 996 (Waters, EEUU). Para la separacin cromatogrfica se utiliz el gradiente descrito por Lawton y col., 1994 modificando la concentracin del aditivo TFA (cido trifluoro-actico) de 0,1% a 0,05%. Las dos fases mviles fueron agua miliQ + 0,05% TFA y acetonitrilo + 0,05% TFA. La columna utilizada fue Purospher RP 18 endcapped (5 m) 4.6 mm x 250 mm (Merck, Alemania). Las microcistinas se identificaron por su tiempo de retencin y espectro de UV caracterstico (Meriluoto y Spoof 2005). La concentracin de microcistina fue calculada relacionando el rea obtenida para los picos identificados como microcistinas a 238 nm con los obtenidos a esa misma longitud de onda para cantidad conocidas de los tres

133

Materiales y Mtodos patrones de microcistina de los que se dispuso Mc-LR, YR y RR (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) (Figura II.8 y Figura II.9). La concentracin de los picos para los cuales no se tena patrn, se calcul relacionando el rea del patrn de la microcistina Mc-LR con el rea de esos picos de microcistina desconocida, y su concentracin se calculo como microcistina equivalente de Mc-LR.

Figura II.8. Ejemplo de inyeccin de patrones de microcistinas. Por orden:

microcistina RR (tiempo de retencin 11,4), YR (tiempo de retencin 16,4) y LR (tiempo de retencin 17,7)

Figura II.9. Espectro caracterstico del las microcistinas. La Figura A

representa el espectro tpico de las microcistinas que no poseen ni tiroxina ni triptfano en su molcula (por ejemplo Mc-RR o Mc-LR). La Figura B representa las microcistinas que poseen tiroxina en su molcula (Mc-YR), obsrvese el cambio del mximo de absorcin.

134

Resultados

4. Resultados.

Como hemos visto en el captulo primero, todos los embalses analizados en la Comunidad de Madrid, que representan ms del 40% del agua embalsada en la regin, presentaron en algn momento del periodo de anlisis (de julio a noviembre en 2001 y de Junio a noviembre de el 2002) cianobacterias que potencialmente eran capaces de producir microcistinas, siendo especialmente importantes las especies pertenecientes al gnero Microcystis. Esta alta presencia indica a priori que existe una elevada probabilidad de encontrar este tipo de toxinas en esta Comunidad Autnoma.

4.1. Limite de cuantificacin.

Para determinar cual era la menor cantidad inyectada de microcistinas que nuestro sistema nos permita detectar, se inyectaron concentraciones crecientes de microcistina LR (posiblemente la microcistina ms importante de y la nica para la se ha establecido un valor gua razonado) en el sistema cromatogrfico utilizado en este trabajo. Para ello se inyectaron por triplicado las siguientes cantidades 10, 20, 50, 100, 500, 1000 y 2000 ng. En las condiciones experimentales utilizadas nuestro limite de deteccin y cuantificacin fue de 20 ng inyectados, manteniendo una respuesta lineal a lo largo de todo el gradiente utilizado (Figura II.10). Este valor obtenido se encuentra muy prximo al valor publicado de 25 ng inyectados. Con este limite de cuantificacin y utilizando las condiciones de nuestro proceso de extraccin y concentracin e inyectando 100 l de muestra, podemos calcular un limite de deteccin y cuantificacin en condiciones ideales (definidas como la ausencia de otro compuesto que presente tiempos de retencin similares) inferior a 0,02 g L-1, dos ordenes de magnitud inferior al valor gua establecido en la legislacin vigente, si bien en muestras de campo se han detectado valores inferiores.

135

Resultados
Limite de cuantificacin
400000

Cuentas = 195,82 x Mc inyectada R2 = 0,999

300000

Area (cuentas)

200000

100000

0 0 500 1000 1500 2000

Mc inyectada (ng)

Figura II.10. Recta de regresin para la microcistina LR.

4.2. Eficiencia de Extraccin de las toxinas

Con el fin de optimizar y definir cual era la metodologa de extraccin de las toxinas de las partculas retenidas en los filtros ms eficiente entre las varias que han sido descritas, antes de realizar los anlisis de microcistinas de las muestras de campo, se hicieron una serie de extracciones seriadas sobre el mismo filtro utilizando una cepa de Microcystis aeruginosa UAM 247 aislada del embalse de Santillana. Para ello se utilizaron dos concentraciones de metanol diferentes, 90% y 75% en solucin acuosa (Tabla II.1), de cada una de las concentraciones se realizaron 4 repeticiones para cada uno de los tratamientos. Dentro de los valores obtenidos se consider el mayor valor medio obtenido de los dos extractos como 100% de la toxina presente y se correlacion con el otro valor para obtener el porcentaje extrado, los resultados obtenidos fueron:

136

Resultados
Concentracin de metanol % de Mc Extradas SD

75 % 90 %

85 % 100 %

11 10

Tabla II.1. Efecto sobre la extraccin de microcistinas en funcin de la concentracin de metanol utilizada. SD = desviacin estndar.

Tambin se estudi cuntas extracciones eran necesarias para extraer con mayor eficiencia las microcistinas, para ello se realizaron tres extracciones consecutivas y se analiz el porcentaje sobre el total que presentaba cada una de ellas. Para ello se realizaron 4 repeticiones con metanol 90% (Tabla II.2) y se considero el 100% de la microcistina extrada a la suma de las tres extracciones. Los resultados obtenidos fueron:

Extraccin

% de Mc Extradas

SD

1 Extraccin 2 Extraccin 3 Extraccin

92,8% 6,9% 0,3%

7,4 7,0 0,3

Tabla II.2. Efecto sobre la eficiencia de extraccin, del nmero de extracciones consecutivas. % de Mc Extradas, es el porcentaje de toxina obtenida en cada una de las

extracciones respecto del total. SD = desviacin estndar.

4.3. Microcistina en las Embalses de la Comunidad de Madrid.

En total se han analizado 170 muestras procedentes de 7 cuerpos de agua de la Comunidad de Madrid, los mismos que se analizaron en el captulo I, estos son los embalses de: Lozoya, Ro Sequillo, El Velln, Santillana, Valmayor, San Juan y Picadas. En todos ellos fue posible identificar microcistinas en alguna de las muestras analizadas tanto en el 2002 como en el 2003. En total en el 65% (el 49% en 2002 y 74% en 2003) de las muestras concentradas por red fue posible detectar microcistinas, mientras que en las muestras no 137

Resultados concentradas en el 43% (31% en 2002 y 50% en 2003) las microcistinas se encontraron por encima del lmite de deteccin.

La existencia de estos dos tipos de muestras nos permitir analizar como afectan las dos metodologas ms importantes en la recogida de muestras al anlisis de microcistinas: la utilizacin de una red de fitoplancton y la toma de muestras sin concentrar filtradas directamente a travs de filtros GF/F. Como consideracin inicial hemos de indicar que la forma en que fueron tomadas las muestras de red no permite realizar una estimacin cuantitativa de las mismas en g L-1, por la imposibilidad de realizar una medida precisa del volumen de agua que pasa a travs de la red (un clculo aproximado puede verse en Materiales y Mtodos). A pesar de esto, este tipo de muestras si ofrecen una informacin muy vlida en cuanto a presencia de este tipo de toxinas en los embalses objeto de estudio al permitirnos detectar concentraciones muy por debajo de lo que nos permitiran detectar las muestras sin concentrar. Mientras las muestras no concentradas nos permiten obtener las concentraciones volumtricas de microcistinas, valor de gran importancia en la gestin del recurso.

4.3.1. Presencia de microcistinas en el Embalse de Lozoya.

El embalse de Lozoya present microcistinas en los dos aos estudiados, tanto en la fraccin concentrada como en la no concentrada (Figura II.11) (Tabla II.3). Los momentos en que aparecieron este tipo de toxinas coinciden temporalmente en los dos aos, a finales del verano principios del otoo, pero el nmero de muestras que presentaron microcistinas fue diferente, siendo mayor el nmero de muestras positivas en el ao 2003.

138

Resultados .
0,14 0,12

Lozoya 2002

120 100 80 60 40 20 0

0,10 0,08 0,06 0,04 0,02

Lozoya 2003

20 18 16 14 12 10 8 6 4

g Mc g chl a-1

0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

0,00 jun

2 jul ago sep oct nov dic

LR RR YR Sin patron Clo a g l-1

Figura II.11. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de Lozoya. Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).

Fecha de muestreo

[Mc]

Relacin

[Mc LR]

[Mc RR]

[Mc YR]

g L-1 0,075 0,078 0,257 0,158

g Mc g clo a-1 0,0031 0,0058 0,013 0,014

g L-1 0,075 0 0,257 0,158

g L-1 0 0,078 0 0

g L-1 0 0 0 0

3-10-02 5-11-02 15-10-03 23-10-03

Tabla II.3. Concentracin y tipos de microcistinas detectadas en el embalse de Lozoya.

Cuando analizamos los resultados de las muestras concentradas por red en las que se detectaron microcistinas, nicamente en uno de los muestreos (el del 5-11-2002) se observa una incongruencia con las muestras no concentradas, puesto que estas se detectaron en la fraccin no concentrada y sin que estas aparecieran en la muestra concentrada por la red de 139

g chl a L-1

0,10

g chl a L-1 g Mc g chl a-1

Resultados fitoplancton. Si comparamos los valores obtenidos en los dos tipos de muestras observamos que en todos ellos la relacin Mc (Clo a)-1 fue inferior en el caso de las muestras no concentradas que en las concentradas. Los valores encontrados muestran adems que los valores ms elevados de la relacin Mc Clo a-1 no se obtuvieron en los picos de biomasa, con lo que no coinciden los picos de clorofila con los valores ms elevados de la relacin Mc clo a-1.

Respecto a las concentraciones de microcistinas encontradas en las muestras no concentradas, solo en dos ocasiones en cada uno de los aos fue posible detectar. Cuando analizamos las concentraciones y tipos de toxinas que presentaron observamos, que las concentraciones nunca superaron los 0,3 g L-1 y que los valores de la relacin toxina/clorofila indican que las poblaciones de algas presentes en este embalse presentaron una baja capacidad toxica, como tambin muestra la Mc clo a-1 de las muestras concentradas por red.

En cuanto a las especies qumicas de microcistinas que estuvieron presentes, podemos ver, por un lado que la microcistina LR fue la especie qumica ms comn tanto en el 2002, como en el ao 2003 y que en el caso de las muestras concentradas por red normalmente represent ms del 50% de la microcistina presente. El segundo tipo de microcistina ms importante fue la microcistina RR que normalmente present una concentracin menor.

4.3.2. Presencia de microcistinas en el embalse de Ro Sequillo.

En el embalse de Ro Sequillo como en el caso anterior se puede observar que el ao 2003 fue el que present mayor nmero de episodios txicos. En este ao fue posible detectar microcistinas en todos los muestreos salvo en el primero (junio) en las muestras concentradas por red, alcanzando el mximo en los meses de septiembre y octubre (Figura II.12). Adems de las diferencias en el nmero de muestras positivas, las diferencias entre ambos aos en las relaciones Mc/Clo a fueron de dos ordenes de magnitud, esto indicara que la potencialidad txica de las cianobacterias presentes fue muy diferente entre los dos aos (como podemos 140

Resultados observar en el captulo I. El ao 2003 se caracteriz por presentar a M. aeruginosa como especie dominante. Por otro lado las bajas concentraciones de clorofila obtenidas en este embalse en los dos aos de estudio, especialmente en el 2003, hizo que en slo una ocasin en cada uno de los dos aos, en los mes de octubre (en el ao 2002) y noviembre (en el ao 2003), fuera posible detectar microcistinas en las muestras no concentradas, sin superar en ninguno de los dos casos el valor de 0,07 g L-1 (Tabla II.4).

Respecto a cuales fueron las tipos qumicos de microcistina presentes podemos observar que cuando las concentraciones son bajas nicamente aparecio Mc-LR, mientras que cuando las concentraciones aumentaron aparecieron tambin otras variantes, primero MC-YR y posteriormente MC-RR.

Rio Sequillo 2002

0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 jun 40 35 0,8

Rio Sequillo 2003

16 14

g Mc g Chl a-1

g chl a L-1 g Mc g Chl a-1

30 25 20 15 10 5 0 jul ago sep oct nov dic

0,6

12 10

0,4

8 6

0,2

4 2

0,0 jun

0 jul ago sep oct nov

LR RR YR Sin patron

Clo a g L-1

Figura II.12. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de Ro Sequillo Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).

Fecha de

[Mc]

Relacin

[Mc LR]

[Mc RR]

[Mc YR]

141

g chl a L-1

Resultados
muestreo

g L-1

g Mc g clo a-1

g L-1

g L-1

g L-1

5-11-02 15-10-03

0,021 0,068

0,0015 0,01

0,021 0,068

0 0

0 0

Tabla II.4. Concentracin y tipos de microcistinas detectadas en el embalse de Ro Sequillo.

4.3.3. Presencia de microcistinas el embalse de El Velln.

En el embalse de El Velln, el nmero de muestras que presentaron microcistinas fue similar en ambos aos, en siete ocasiones en 2002 y en cinco en 2003 (Figura II.13). En cambio, s existen diferencias tanto en la relacin Mc Clo a-1 que fue mayor en el 2003 como en el momento en que aparecieron las microcistinas. stas aparecieron entre julio y septiembre en el 2002 y entre septiembre y octubre en 2003, este cambio en el patrn de aparicin no haba ocurrido en ninguno de los dos embalses anteriores. Tambin y en paralelo a este cambio temporal, existe un cambio en los tipos qumicos de microcistinas encontradas, en 2002 la toxina mayoritaria fue la Mc-LR, siguindola en importancia la microcistina YR. En 2003, la toxina mayoritaria fue la microcistina RR, existiendo en general una mayor diversidad en los tipos qumicos de microcistinas detectadas. Respecto a las microcistinas en la fraccin sestnica no concentrada, nicamente se detectaron microcistinas en dos ocasiones en el ao 2003. Las concentraciones pueden considerarse medias, alrededor de 0,3 g Mc L-1 similares a las encontradas en el embalse de Lozoya en ese mismos ao. La toxina mayoritaria detectada en los dos casos fue la microcistina LR, si bien en una de las ocasiones tambin fue posible detectar la microcistina RR (Tabla II.5).

142

Resultados
El Vellon 2002
0,30 0,25
-1

El Vellon 2003
35 30 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 10 0,0 jun 5 jul ago sep oct nov dic 40 35

g chl a L g Mc g Chl a-1

g Mc g Chl a

25 20 15

0,15 0,10 0,05 0,00 jun

20 15 10 5 jul ago sep oct nov dic

LR RR YR Sin patron Clo a g L-1

Figura II.13. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de El Velln. Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).

Fecha de muestreo

[Mc]

Relacin

[Mc LR]

[Mc RR]

[Mc YR]

g L-1

g Mc g clo a-1

g L-1

g L-1

g L-1

1-10-03 15-10-03

0,209 0,341

0,0134 0,0191

0,125 0,341

0,083 0

0 0

Tabla II.5. Concentracin y tipos de microcistinas detectadas en el embalse de El Vellon.

143

g chl a L-1

0,20

25

-1

30

Resultados 4.3.4. Presencia de microcistinas en el embalse de Santillana.

En el embalse de Santillana se detectaron altas concentraciones de microcistinas de manera recurrente en los dos aos objeto de estudio. De hecho en las muestras concentradas por red pudo detectarse toxina en todos los muestreos realizados excepto en uno (Figura II.15). Cuando analizamos el patrn de aparicin observamos que los mximos, como ocurri en el embalse de El Velln, tuvieron lugar en momentos distintos. En el ao 2002 las mximas concentraciones se detectaron entre los meses de septiembre y noviembre y en el ao 2003 entre junio y septiembre (Figura II.14, Figura II.15). Este fue el embalse en el que se detectaron las mayores concentraciones de microcistinas en la Comunidad de Madrid, alcanzndose en la fraccin concentrada por red relaciones Mc clo a-1 superiores a 2 y en la fraccin sestnica no concentrada valores superiores a 1 g Mc L-1 durante varios meses, con mximos superiores a 40 g Mc L-1.

Analizando ms en profundidad la variacin espacio-temporal que presentan las concentraciones de microcistinas podemos observar, por un lado que, en general, existen grandes diferencias en la concentracin que presentan puntos opuestos del embalse como podemos observar por las barras de error de la Figura II.15. Por otro lado que en periodos de una semana las concentraciones en un mismo punto pueden cambiar bruscamente pasando de ms de 10 g L-1, a estar por debajo del limite de deteccin y viceversa. Tambin podemos observar que las concentraciones de microcistinas mayores no se alcanzan simultneamente a las concentraciones mximas de clorofila, algo que hemos observado en los otros embalses.

Los valores mximos obtenidos en las muestras no concentradas fueron similares en los dos aos con una media en el embalse (considerado dos puntos en orillas opuestas) superior a 40 g Mc L-1 y tambin la extensin temporal (tiempo que la toxina pudo detectarse), en el caso del ao 2003 se pudieron detectar microcistinas durante cuatro meses, mientras que en 2003 la extensin de tiempo fue de tres meses.

144

Resultados
Santillana 2002
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 jun 180 160 3,0 2,5

Santillana 2003
60 50

g Mc g Chl a-1

100 80 60 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

1,5 1,0 0,5 0,0 jun

30 20 10 0 jul ago sep oct nov dic

LR RR YR Sin patrn
Clo a g L-1

Figura II.14. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de Santillana. Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).
Santillana 2002
70 60 180 160 140 80 100

Santillana 2003
60 50 40 60 30 40 20 20 0 jun 10 0 jul ago sep oct nov dic

g Clo a L-1

g Mc L-1

40 30 20 10 0 jun

100 80 60 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

g Mc L-1 g Clo a L-1

Figura II.15. Concentracin de microcistinas y clorofila en la fraccin no concentrada por en el embalse de Santillana. Las barras de error indican la desviacin

estndar en los momentos en las que se analizaron la concentracin de microcistinas en dos puntos separados del embalse.

g Mc L-1

120

145

g Clo a L-1

50

g chl a L-1

120

g Mc g Chl a-1

140

g chl a L-1

2,0

40

Resultados Cuando comparamos los datos de la relacin clorofila/toxina de la fraccin concentrada por red (Figura II.14) y no concentrada (Figura II.16), podemos ver que durante los momentos en que la concentracin de microcistinas super el 1 g Mc L-1 la relacin Mc/Clo a en la las muestras no concentradas por red fueron siempre cercanas o superiores a 0,1 g Mc L-1 en esa misma fraccin, es decir que nicamente son necesarios 10 g clorofila para que se supere el valor gua propuesto por la OMS. Es interesante tambin comparar la concentracin de clorofila que presentaron los dos aos analizados y las concentraciones de microcistinas que se alcanzaron en cada uno de ellos, como podemos ver la relacin Mc/Clo a muestra valores en el ao 2003 casi dos veces superiores a los encontrados en el 2002, diferencia que se mantuvo durante los momentos en los que la concentracin de microcistinas fue elevada. Esta gran diferencia entre los dos aos indican que los organismos presentes en del ao 2003 fueron ms txicos que los encontrados en el 2002, al menos cuando se utiliza la clorofila a como valor de de biomasa.

Santillana 2002
0,8 180 160 2,0 1,8 1,6

Santillana 2003
60 50 40 30 20 10 0 jul ago sep oct nov dic

g Clo a L-1

g Mc L-1

120 0,4 100 80 60 0,2 40 20 0,0 jun 0 jul ago sep oct nov dic

g Mc L-1

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 jun

g Mc g Clo a-1 g Clo a L-1

Figura II.16. Relacin microcistinas/clorofila y clorofila en las muestras no concentradas por red en el embalse de Santillana. Las barras de error indican la desviacin

estndar en los momentos en las que se analizaron la concentracin de microcistinas en dos puntos separados del embalse. Cuando analizamos las tendencias que presentaron los tipos de qumicos de microcistinas presentes tanto en la fraccin concentrada por red (Figura II.14), como en la no

146

g Clo a L-1

0,6

140

Resultados concentrada (Figura II.17), observamos que en los puntos con mayor concentracin de microcistinas el tipo de toxinas presentes fue similar, encontrando por un lado el grupo de toxinas comunes (LR, RR e YR) casi durante todo el periodo de muestreo en la fraccin concentrada por red y generalmente dos de ellas en la no concentrada. Y otro grupo formado por el resto de toxinas que en general, slamente se detectaron cuando las concentraciones de microcistina total fueron elevadas. Analizando ms en profundidad las diferencias entre los diferentes tipos de microcistinas, observamos que las variantes que se detectaron tenemos que el tipo LR fue detectado en 24 ocasiones (100% de las muestras que presentaron este tipo de compuestos), el RR detectada en 20 (83%) y el YR en 15 (63%). Dentro del segundo grupo, las microcistinas para las cuales no exista patrn en total se detectaron, en total en 11 ocasiones y en proporciones muy similares en los dos aos (5 de 8 en 2002 y 7 de 16 en 2003), aunque esta similitud desaparece cuando analizamos el nmero de toxinas diferentes que aparecieron, en el 2003 se presentaron como media 3,43 0,98 toxinas diferentes en cada ocasin, mientras que en al ao 2002 el nmero fue inferior de 1,33 0,82, esto indica que la poblacin en el ao 2003 presento una mayor diversidad en cuanto a produccin de microcistinas se refiere.
Santillana 2002
60 50 80

Santillana 2003

g Mc g Chl a-1

40 30 20 10 0 jun

g Mc g Chl a-1
jul ago sep oct nov dic

60

40

20

0 jun

jul

ago

sep

oct

nov

LR RR YR Sin patrn

Figura II.17. Concentracin de los diferentes tipos de microcistinas las muestras no concentradas por red con en el embalse de Santillana. Se muestra slo los tipos de

microcistinas presentes en el punto donde se determin mayor concentracin de microcistinas.

147

Resultados Dentro de las toxinas analizadas la microcistina LR no slo fue la microcistina que apareci en un mayor nmero de ocasiones, sino que adems en general represent la mayor parte de la microcistina total detectada, como media casi el 60% de la microcistina total (Tabla II.6). La microcistina RR fue la siguiente en importancia en cuanto a porcentaje del total, representando el 27% de la microcistina total y finalmente dentro de las comunes fue la microcistina YR la que tuvo una menor importancia con un 7%. Este valor de la microcistina YR fue similar al que mostr en conjunto el de resto de microcistinas.

Tipo de Mc LR RR YR Otras

% sobre el total SD 59% 19% 27 15 7 19 7 11

Tabla II.6. Porcentaje de las diferentes microcistinas sobre el total. Media SD (n

= 24).

4.3.5. Presencia de microcistinas en el embalse de Valmayor

El embalse de Valmayor fue especialmente diverso en lo que se refiere a la proporcin de muestras que presentaron microcistinas, mientras en el ao 2002 nicamente fue posible detectar microcistinas en dos muestras concentradas por red, en 2003 el nmero de muestreos en las que se detectaron microcistinas fue muchsimo mayor (10) (Figura II.18). En lo que se refiere a las concentraciones de toxina, en el 2002 el mximo fue de 0,7 g Mc g Clo a-1 y en el 2003 llego a ser de ms del doble (1,57) y fue posible detectar este tipo de compuestos durante un periodo superior a 3 meses, a pesar de presentar concentraciones de clorofila inferiores a las encontradas en el ao 2002. Cabe destacar la muestra que apareci en julio del 2002 que mostr una gran diversidad de microcistinas con ms de 15 especies qumicas 148

Resultados diferentes que no se pudieron identificar en su totalidad por la ausencia de patrones. En 2003 la microcistinas mayoritarias fueron la Mc-LR, mientras con respecto a la segunda toxina en importancia, en la primera parte del periodo txico fue la Mc-YR y en la segunda la Mc-RR.

Valmayor 2002
0,8 100 80 60 0,4 40 0,2 20 0 jul ago sep oct nov dic 1,8 1,6

Valmayor 2003

70 60

g Mc g Chl a-1

g chl a L-1 g Mc g Chl a-1

0,6

1,4 40 30 20 10 0 jul ago sep oct nov dic

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

0,0 jun

0,0 jun

LR RR YR Sin patrn Clo a g L-1

Figura II.18. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de Valmayor. Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).

En el caso de las muestras no concentradas, el embalse de Valmayor present microcistinas tambin en los dos aos, pero mientras que en el 2002 present toxinas en una sola ocasin y presentado concentraciones inferiores a 0,03 g Mc L-1 y una baja relacin Mc/Clo a, de 0,0026 (Tabla II.7), en el ao 2003 este tipo de compuestos se detectaron en concentraciones moderadas y continuadas entre los meses de septiembre y noviembre (Figura II.20).

149

g chl a L-1

1,2

50

Resultados
Fecha de muestreo [Mc] Relacin [Mc LR] [Mc RR] [Mc YR]

g L-1 0,026

g Mc g clo a-1 0,0027

g L-1 0,026

g L-1 0

g L-1 0

4-10-02

Tabla II.7. Concentracin y tipos de microcistinas detectadas en el ao 2002 en el embalse de Valmayor.

En el ao 2003 como hemos indicado en el prrafo anterior fue posible detectar microcistinas durante los tres ltimos meses de muestreo y en tres momentos puntuales las concentraciones medias en el embalse fueron superiores a 1 g Mc L-1 (Figura II.19), alcanzndose un valor mximo cinco veces superior a este valor. De nuevo como en el caso en el embalse de Santillana los valores mayores se alcanzaron justo antes de que la biomasa expresada como clorofila a alcanzase su valor mximo, esto se puede observar mucho mejor cuando representamos la relacin entre clorofila a y microcistinas, donde podemos observar una brusca disminucin justo despus de alcanzar el mximo.
Valmayor
7 6 60 0,25 50

Valmayor
60 50 40 0,15 30 0,10 20 0,05 0,00 jul 10 0 ago sep oct nov dic

g Clo a L-1

g Mc L-1

40 30

4 3 2 1 0 jul 20 10 0 ago sep oct nov dic

g Mc L-1 g Clo a L-1

g Mc g Cho a-1 g Clo a L-1

Figura II.19. Concentracin de microcistinas, relacin Mc/Clo a y clorofila en las muestras no concentradas por red en el embalse de Valmayor en el ao 2003. Las barras

de error indican la desviacin estndar en los momentos en las que se analizaron la concentracin de microcistinas en dos puntos separados del embalse. El 24 de septiembre se analizaron dos puntos de muestreo, pero slo se detectaron microcistinas en uno de ellos, el valor que se representa en esa ocasin es el del punto donde se detectaron

150

g Clo a L-1

g Mc g Clo a-1

0,20

Resultados

En cuanto a los tipos de microcistinas observados en el embalse de Valmayor, se observa una menor diversidad respecto a la encontrada en el embalse de Santillana, como mximo se encontraron slo dos variantes de microcistinas. En todos los casos una de ellas fue MC-LR y en el 33% de las muestras se encontr tambin microcistina YR (5 muestras de 15 totales) Figura II.20. Cuando analizamos la importancia tienen estas toxinas respecto al total, podemos ver dos partes diferenciadas, en una primera parte la microcistina YR es la toxina mayoritaria, para posteriormente, despus de una brusca cada en la concentracin, sufrir un cambio pasando a ser la microcistina LR la toxina mayoritaria. Cabe destacar que esta segunda parte representa la mayor parte de las muestras que presentaron microcistinas, si bien las concentraciones alcanzadas fueron menores.

Valmayor
6 5

g Mc g Chl a

4 3 2 1 0 jun

LR RR YR
Sin patron

-1

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura II.20. Concentracin de los diferentes tipos de microcistinas las muestras no concentradas por red en el embalse de Valmayor en el ao 2003. Se muestra slo los

tipos de microcistinas presentes en el punto donde se determin mayor concentracin de microcistinas.

4.3.6. Presencia de microcistinas en el embalse de San Juan.

En el embalse de San Juan se pudieron detectar microcistinas en las muestras de red en ambos aos estudiados (Figura II.21), si bien el mximo detectado en 2003 fue ms de dos

151

Resultados veces superior al encontrado en 2002, pero en la fraccin no concentrada nicamente se detectaron en una ocasin en el ao 2003 coincidiendo adems con una muestra en la que no fue posible detectar microcistinas en la muestra concentrada de red, la concentracin alcanzada present una concentracin superior a 3 g Mc L-1. Las dos toxinas mayoritarias que pudieron detectarse fueron la microcistina RR y la LR, siendo en este caso la microcistina RR la mayoritaria.

San Juan 2002

0,07 0,06 30 25 0,35 0,30

San Juan 2003

24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 jul ago sep oct nov dic

g Mc g Chl a-1

0,05 0,04

g Mc g Chl a-1

g chl a L-1

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 jun

15 0,03 0,02 0,01 0,00 jun 10 5 0 jul ago sep oct nov dic

LR RR YR Sin patron Clo a g L-1

Figura II.21. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de San Juan. Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).

Fecha de muestreo

[Mc]

Relacin

[Mc LR]

[Mc RR]

[Mc YR]

g L-1 3,12

g Mc g clo a-1 0,435

g L-1 1,37

g L-1 1,72

g L-1 0

4-9-03

Tabla II.10. Concentracin y tipos de microcistinas detectadas en el embalse de Ro Sequillo.

152

g chl a L-1

20

0,25

Resultados

4.3.7. Presencia de microcistinas en el embalse de Picadas.

En el embalse de Picadas fue posible detectar microcistinas en un elevado porcentaje de los muestreos (el 65%) (Figura II.22), pero slo en 2003 fue posible detectar microcistinas en la fraccin no concentrada. Cuando comparamos la relacin Mc Clo a-1 en las muestras concentradas por red encontradas en los dos aos observamos valores similares, de alrededor de 0,05 g Mc g clo a-1, salvo en un momento puntual en 2003 que present un valor 6 veces superior al resto. El patrn de presencia fue similar en ambos aos con la mayor parte de las muestras positivas en los meses de septiembre y octubre. En cuanto a la presencia de toxinas en las muestras no concentradas slo el ao 2003 mostr concentraciones detectables de este tipo de compuestos.

Picadas 2002
0,05 50 0,30

Picadas 2003
120

0,04

40

0,25

100

g Mc g Chl a-1

g chl a L-1

0,15

60

0,02

20

0,10

40

0,01

10

0,05

20

0,00 jun

0 jul ago sep oct nov dic

0,00 jun

0 jul ago sep oct nov dic

LR RR YR Sin patrn Clo a g L-1

Figura II.22. Presencia de microcistinas fraccin concentrada por red en 2002 y 2003 en el embalse de Picadas. Relacin microcistina-clorofila de los diferentes tipos de

microcistinas cuando estuvieron presentes (barras). Las microcistinas de las cual no se tiene patrn se calcularon como equivalentes de Mc-LR y se sumaron. En lneas se muestra la concentracin de clorofila en la fraccin sestnica (Para ms informacin ver el captulo I).

153

g chl a L-1

0,03

30

g Mc g Chl a-1

0,20

80

Resultados Analizando ms en profundidad la presencia de microcistinas en las muestras no concentradas durante el ao 2003 observamos que estas aparecieron de manera recurrente durante los meses de septiembre y octubre (Figura II.23), encontrado el mximo justo a principios de septiembre. Cabe destacar que en ese momento slo fue posible detectar la presencia de microcistinas en el punto secundario (para mas informacin ver captulo I). La concentracin que en ese momento se alcanz fue ligeramente superior a 1 g Mc L-1. Posteriormente la se observa una brusca disminucin para posteriormente estabilizarse en valores alrededor de 0,3 g Mc L-1, para finalmente detectarse de nuevo en un nico punto de muestreo, en este caso en el punto principal el ms cercano al muro de la presa. Esto indicara un posible desplazamiento del organismo productor desde la cola del embalse a la cabecera.
Picadas
1,4 1,2 70 60 0,08

Picadas
70 60

g Mc g Clo a-1

g Clo a L-1

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 jun

40 30 20 10 0 jul ago sep oct nov dic

40 0,04 30 0,02 20 10 0,00 jun 0 jul ago sep oct nov dic

g Mc L-1 g Clo a L-1

g Mc g Cho a-1 g Clo a L-1

Figura II.23. Concentracin de microcistinas, relacin Mc/Clo a y clorofila en las muestras no concentradas por red en el embalse de Picadas en el ao 2003. Las barras de

error indican la desviacin estndar en los momentos en las que se analizaron la concentracin de microcistinas en dos puntos separados del embalse. Desde principios de septiembre a 15 de octubre se analizaron dos puntos diferentes del embalse, en los cuando en esas fechas no se muestra barra de error porque o no se detectaron microcistinas o nicamente se detectaron en uno de los puntos de muestreo. Cuando analizamos como se modifica la relacin Mc/Clo a a lo largo de este periodo, podemos observar que la relacin present valores muy bajos (inferiores a 0,08), lejanos de los que se encontraron en los embalses que tambin presentaron este tipo de toxinas de manera 154

g Clo a L-1

g Mc L-1

1,0

50

0,06

50

Resultados recurrente en las muestras no concentrada (Santillana y Valmayor). Respecto al tipo qumico de microcistinas encontradas en todas las muestras apareci la variante LR y solamente en la primera de las muestras presentaron la variante RR, representado menos del 20% de la microcistinas total.

4.3.8. Variantes qumicas de microcistinas en todos los embalses.

Cuando analizamos las los tipos de microcistinas en los siete embalses en conjunto en los dos tipos de muestras se observa una mayor cantidad de variantes qumicas en las muestras concentradas por red (Tabla II.11) que en las muestras no concentradas (Tabla II.12). De todas maneras las tres microcistinas que fueron las ms comunes, la microcistina LR, RR e YR, se encontraron en mas del 50% de las muestras concentradas por red en las que se detectaron este tipo de compuestos, aunque otras 6 estuvieron presentes en al menos el 20 % en alguno de los dos aos muestreados en las muestras concentradas por red (las nicas representadas en la Tabla II.11) y slo tres de ellas se presentaron en menos de este 20% en los dos aos muestreados (datos no mostrados).

Tipo de Mc

2002

2003

LR RR YR WR RT = 14,7 RT = 15,7 RT = 17,2 RT = 19,5 RT =20

90 % 52 % 59 % 24 % 34 % 34 % 24 % 28 % 0%

96 % 66 % 55 % 6% 5% 20 % 0% 20 % 24 %

Tabla II.11. Porcentaje de las muestras concentradas por red en los que se detectaron los diferentes tipos qumicos de microcistinas. Los tipos de microcistinas

155

Resultados indicadas son aquellas que se detectaron en un 20% de las muestras o superior. Aquellas microcistinas que no fueron identificadas se denominaron por su tiempo de retencin (RT). Los datos indican claramente que las microcistinas ms comunes fueron la LR, RR e YR, cabe destacar que la microcistina LR (la que presenta una toxicidad mayor en ratn DL50 = 50 g kg-1) estuvo presente en ms del 90% de las muestras concentradas por red, mientras que las otras dos toxinas mayoritarias se encontraron en valores muy similares, ligeramente superiores al 50% de las muestras en las que se detect este tipo de toxinas en caso de las muestras concentradas por y del 63% y 37% respectivamente en el caso de las muestras no concentradas (Tabla II.12).
Tipo de Mc 2002 2003 Total

LR RR YR RT = 12,9 RT = 15,7 RT = 17,2

94 44 39 28 0 22

100 69 36 5 20 0

99 63 37 11 15 5

Tabla II.12. Porcentaje de las muestras no concentradas por red en los que se detectaron los diferentes tipos qumicos de microcistinas. Los tipos de microcistinas

indicadas son aquellas que se detectaron en un 20% de las muestras o superior. Aquellas microcistinas que no fueron identificadas se denominaron por su tiempo de retencin (RT). Respecto al resto de microcistinas, que no fue posible identificar al carecer de patrones, Hay que estacar que la mayor parte aparecieron durante los momentos de bloom y las que presentaron los mayores porcentajes se detectaron sobre todo, o exclusivamente en el embalse de Santillana, especialmente en la caso de las muestras no concentradas. De hecho todas ellas se detectaron en los momentos de mayor concentracin de las microcistinas identificadas en el embalse de Santillana, mientras que en el resto de embalses salvo de manera puntual en Valmayor no se encontraron variantes de microcistinas diferentes a las tres mayoritarias. sto es especialmente importante en el ao 2002 donde nicamente se detect un afloramiento txico en el embalse de Santillana y ao en que todas la microcistinas raras

156

Resultados que representaron ms del 10% del total fueron detectadas en ese embalse. Podemos destacar las que encontramos a tiempos de retencin 15,7 y 19,5 que posean un espectro de absorcin similar la microcistina LR, que se encontraron de manera repetida en los dos aos con porcentajes superiores o iguales al 20%. La microcistina WR pudo ser determinada por espectrometra de masas (datos no mostrados) y fue la nica variante con triptfano que pudo detectarse en un nmero significativo de ocasiones.

4.3.9. Relacin entre microcistinas y clorofila. Se ha analizado si la clorofila se correlacionaba con la concentracin de microcistinas encontradas con el fin de ver si era posible utilizar el valor de clorofila presente como indicativo de potencialidad txica, tanto en las muestras concentradas por red como en las no concentradas. Cuando se intenta correlacionar la concentracin de clorofila y microcistinas presentes en los extractos de las muestras concentradas se observa una correlacin baja (R2 = 0,24, datos no mostrados) aunque mejora perceptiblemente cuando no se consideran los valores que presentaron microcistinas por debajo del limite de deteccin (R2 = 0,46) (Figura II.24), lo que indica que existe ligera correlacin entre estos dos valores.

Correlacion Mc y Clo a muestras positivas

12 10

[Mc] = 0,455x[Clo a] - 0,456 R2 = 0,46

g Mc mL

-1

0 0 1 2 3 4

g Clo a mL-1

10

11

12

Figura II.24. Correlacin entre concentracin de clorofila y de Mc en muestras de red. Slo se incluyeron las muestras que presentaron microcistinas.

157

Resultados

Una caso aparte puede considerarse el embalse de Santillana en el cual s podemos observar una correlacin positiva entre concentracin de clorofila y microcistinas presentes (Figura II.25). La varianza explicada en este caso es superior al 60%. Tambin podemos observar en estas graficas que numerosas muestras concentradas por red presentaban concentraciones de Mc superiores a las de concentraciones de clorofila muestras especialmente toxicas. Esto ocurri especialmente en los embalses de Santillana tanto en 2002 como en 2003 (Figura II.14) y en Valmayor en el ao 2003 (Figura II.18), cuando se desarrollo un afloramiento de Microcystis aeruginosa (para ms informacin ver captulo1). Cabe destacar que gran parte de las muestras concentradas por red analizadas durante la realizacin de este trabajo mostraron concentraciones de clorofilas superiores al valor lmite establecido de 1 g clo a mL-1
Santillana
12

10

[MC] = 0,882 [Clo a] - 0,095 R2 = 0,63

g Mc mL-1

0 0 2 4 6 8 10 12

g Clo a mL-1

Figura II.25. Correlacin entre concentracin de clorofila y de Mc en muestras de red en el embalse de Santillana. En al correlacin estn representados los datos obtenidos en

los aos 2002 y 2003.

Cuando analizamos si existe correlacin entre la concentracin de clorofila y la de microcistinas en las distintas muestras no concentradas (Figura II.26) podemos observar que al contrario de lo observado en el caso de las muestras concentradas por red, no aparece ningn tipo de correlacin entre la clorofila y la concentracin de microcistinas, ni en el total de las

158

Resultados muestras ni cuando nicamente se consideraron las muestras en las cuales se detect la presencia de este tipo de toxinas. Podemos encontrar tanto muestras que presentaron altas concentraciones de clorofila con bajas o nulas concentraciones de microcistinas, como concentraciones moderadas de clorofila con concentraciones de microcistinas superiores a 60 g Mc L-1.

Correlacin Entre Mc y Clo a sestonica

80

Correlacin entre Mc y Clo a solo en muestras positiva

80

[Mc] = 0,127 [Clo a] - 0,512 R2 = 0,19

60 -1

[Mc] = 0,134 [Clo a] + 2,014 2 R = 0,172

60

40

g Mc L-1
0 50 100 150 200 250

g Mc L

40

20

20

g Clo a L-1

50

g Clo a L

100

-1

150

200

250

Figura II.26. Correlacin entre concentracin de clorofila y de Mc en las muestras no concentradas. En la primera figura podemos ver todas las muestras analizadas

y en la segunda slo se incluyeron las muestras que presentaron microcistinas.

En este caso ninguno de los embalses por separado present ninguna correlacin que mostrara un soporte significativamente mayor a los encontrados cuando todos las datos fueron considerados en conjunto. Por otro lado si ampliamos la grafica que muestra la correlacin entre Mc y Clo a , (Figura II.27) podemos observar que el valor limite de clorofila a partir del cual podemos observar valores de concentracin de microcistinas superiores a 1 g L-1, se sita por ligeramente por debajo de 10 g L-1 de clorofila a.

159

Resultados

Correlacin Entre Mc y Clo a sestonica

10

g Mc L

-1

0 0 10 20 30
-1

40

50

g Clo a L

Figura II.27. Detalle de la grfica que muestra la correlacin entre concentracin de clorofila y de Mc en las muestras no concentradas. Slo se muestran los valores bajos

de clorofila y microcistinas.

Como hemos indicado en el captulo I, slo en el ao 2003 fue posible obtener valores de clorofila para los distintos grupos algales con el fluormetro de todas las muestras analizadas, que son las nicas que se exponen a continuacin. La Figura II.28 muestra que tampoco existe correlacin entre la clorofila a de cianobacterias y la concentracin de microcistinas, ni cuando tomamos los datos globales (datos no mostrados), ni cuando consideramos nicamente las muestras que presentaron este tipo de toxinas, lo cual parece indicar que la presencia de cianobacterias no puede utilizarse como indicativo de presencia de este tipo de compuestos. Estas figuras tampoco muestran un valor lmite de clorofila a de cianobacterias claro a partir del cual podemos encontrar concentraciones moderadas de

microcistinas, ya que por ejemplo se han encontrado concentraciones de clorofila a de cianobacterias inferiores a 5 g L-1 que presentaban concentraciones de Mc superiores a 1 g L-1.

160

Resultados
Correlacin entre Mc y Clo a de cianobacterias solo en muestras positivas
80

[Mc] = 0,2 [Clo a] + 2,07 2 R = 0,079

60

g Mc L

-1

40

20

0 0 20 40 60 80 100

g Clo a L-1

Figura II.28. Correlacin entre concentracin de clorofila a de cianobacterias y de Mc en muestras las muestras no concentradas. En la primera figura podemos ver todas

las muestras analizadas y en la segunda slo se incluyeron las muestras que presentaron microcistinas. Cuando se analiz la correlacin microcistina-clorofila a en cada uno de los embalses que presentaron microcistinas por separado solamente en uno de ellos se pudo observar esta correlacin, este fue el embalse de Santillana, que adems de presentar el mayor nmero de muestras con microcistinas present una correlacin positiva entre la concentracin de stas y la cantidad de clorofila a de cianobacterias Figura II.29. En esa figura aparte de la correlacin entre clorofila a de cianobacteria y Mc podemos observar que a partir de 5 g L-1 de clorofila a de cianobacterias podemos observar valores elevados de microcistinas. Curiosamente en este embalse, como hemos indicado en el captulo I, la especie de cianobacteria que domin la poblacin cianobacteriana durante gran parte del periodo de muestreo fue Microcystis aeruginosa.

161

Resultados

Correlacin Entre Mc y Clo a de Cianobacterias

80

[Mc] = 1,23 [Clo a] - 5,93 R2 = 0,75

60
-1

g Mc L

40

20

0 0 10 20 30 40
-1

50

60

g Clo a L

Figura II.29. Correlacin entre concentracin de clorofila a de cianobacterias y de Mc en muestras las muestras no concentradas en el embalse de Santillana.

Por la forma en que fueron tomadas las muestras de red, nicamente fue posible comparar stas con las no concentradas a travs de sus relaciones Mc / Clo a y no directamente en g Mc L-1. Cuando hacemos esta comparacin, podemos observar que las relaciones de las muestras de red sistemticamente tienen una mayor cantidad de Mc por unidad de clorofila que las muestras no concentradas (Figura II.30), los datos indican que la red incrementa en casi tres veces la relacin Mc/Clo a, respecto a la muestra no concentrada, existiendo diferencias significativas (test Mann-Whitney en rangos, P = 0,007), no existiendo una correlacin fuerte entre los datos de red y seston (datos no mostrados).

162

Resultados

1,2

1,0

g Mc g Clo a-1

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 Red Sestnica

Figura II.30. Media de las relaciones microcistina-clorofila a y desviacin estandar obtenidas en 2002 y 2003. Slo se utilizaron los valores que mostraron toxinas en

las dos muestras

4.3.10. Patrn temporal de aparicin de microcistinas.

Una de los objetivos de este trabajo era estudiar si exista un momento a lo largo del ao en el cual era ms probable encontrar microcistinas en los cuerpos de agua de la Comunidad de Madrid, para ello se analiz en cada uno de los aos estudiados el nmero de embalses que presentan microcistinas para cada uno de los meses analizados, tanto en las muestras concentradas por red que nos informaran de la potencialidad del sistema, como en las no concentradas que tiene un valor en la gestin. En los dos tipos de muestras y aos (Figura II.31 y Figura II.32) observamos patrones de aparicin muy similares, si bien en general el nmero de embalses que presentan toxinas es mayor en las muestras red por su mayor sensibilidad, tanto en cuanto al nmero de embalses que presentan este grupo de toxinas. El momento en que es ms probable que un embalse de la Comunidad presente toxina es entre los meses de septiembre y octubre y en menor proporcin noviembre. Un anlisis especial merece el mes de Julio, que presenta en las muestras concentradas por red otro pico de probabilidad, que no aparece en las muestras no concentradas. Esto podra indicar que en general existe la potencialidad toxica en la poblacin, pero no se da se alcanzan las

163

Resultados concentraciones necesarias de productores para que sea posible detectarla en las muestras no concentradas.
2002
% de embalses que presentan Mc
100

2003
% de embalses que presentan Mc
100 80

80

60

60

40

40

20

20

0
o e io Ag os to br e br e ub r Ju ni Ju l ov ie m ie m O ct

0
o io Ag os to e O ct
e ub r O ct

Se pt

Se pt

Figura II.31. Porcentaje de embalses que presentan microcistinas en las muestras concentradas por red. Porcentaje que presentan MC en los aos objeto de estudio (2002 y

2003). N=7 de embalses analizados.

2002
% de embalses que presentan Mc
100

2003
% de embalses que presentan Mc
100 80

80

60

60

40

40

20

20

Ag os to

Ju ni o

io

Ju ni o

br e

br e

io

br e

N
vi em br e

Ag os to

ub r

vi em

ie m

Ju l

Ju l

pt

O ct

Figura II.32. Porcentaje de embalses que presentan microcistinas en las muestras sestonicas. Porcentaje que presentan MC en los aos objeto de estudio (2002 y 2003). N=7 de

embalses analizados.

pt

ie m

ov ie m br e

br e ie m

Ju ni

Ju l

ub r

164

Discusin

5. Discusin
En el ao 2002 cuando esta tesis comenz los datos sobre presencia de microcistinas en los lagos, ros y embalses espaoles eran casi inexistentes. Esa falta de datos, sobre todo cuando se comparaban con los existentes en otros pases de nuestro entorno, como por ejemplo Portugal haca aconsejable hacer un estudio en profundidad de la presencia de este tipo de compuestos en aguas espaolas y en nuestro caso particular, de su presencia en los embalses de la Comunidad de Madrid. El inters en la presencia de este tipo de compuestos en esta Comunidad se debe a la explotacin intensiva de los recursos hdricos de los que dispone, especialmente de las aguas superficiales. En estas circunstancias se haca recomendable realizar una vigilancia intensiva de los cuerpos de agua superficiales que son susceptibles de presentar organismos potencialmente productores de microcistinas. En los ltimos aos el panorama respecto a las microcistinas ha cambiado de manera muy importante ya que propiciado fundamentalmente por la aparicin en la legislacin espaola de un valor gua para este tipo de sustancias (real decreto 140/2003), se ha empezado a estudiar el trema de forma sistemtica en la mayor parte de las Cuencas Hidrogrficas espaolas. Nuestra legislacin obliga a medir la concentracin de microcistinas a la salida de las estaciones de potabilizacin o en el depsito de cabecera, cuando exista sospecha de eutrofizacin. Esta ley a nuestro entender presenta algunos problemas conceptuales, por un lado en el articulado de esta ley se habla de microcistinas totales, lo que dificulta su aplicacin, puesto que para la mayor parte de las toxinas no existen estndares que permitan su cuantificacin, haciendo imposible en muchos casos el determinar la concentracin de microcistinas total. Tampoco establece ningn mtodo de medida recomendado, dentro de los publicados en la literatura cientfica. Simultneamente a la aparicin de legislacin, en los ltimos aos han comenzado a aparecer en revistas internacionales artculos que recogen la presencia de este tipo de toxinas en embalses y ros espaoles ((Moreno y col., 2005),(Aboal y col., 2005),(Aboal y Puig 2005),(Barco y col., 2004) y (Carrasco y col., 2006)). El mtodo de extraccin propuesto en este trabajo vara ligeramente de otros descritos en la bibliografa. Los datos obtenidos muestran sin embargo que ste parece ser adecuado

165

Discusin para los propsitos que se perseguan en la realizacin de este trabajo. En general los artculos publicados que comparan diversas metodologas de extraccin ((Barco y col., 2005) y (Fastner y col., 1998)), concluyen que el mejor extractante de las microcistinas es una mezcla de metanol-agua y que los valores ideales de metanol para extraerlas varan entre el 70% y el 80% de metanol, realizando dos extracciones y usando un bao de ultrasonidos. En estas condiciones se extrajeron ms del 90% de la toxina sestnica. En general estos artculos utilizaron material liofilizado y no material filtrado a travs de filtros GF/F GF/C que posteriormente es congelado hasta su anlisis, que fue el mtodo utilizado en este trabajo. Por ello se decidi realizar una pequea comprobacin de cuales seria las mejores condiciones de trabajo. En nuestro caso hemos encontrado exista una mayor eficiencia cuando utilizbamos metanol 90% para realizar la extraccin, que utilizando metanol 75%. Este cambio en la concentracin de metanol presentaba una ventaja adicional que nos permita determinar la concentracin de clorofilas y la concentracin de toxinas simultneamente. Las pequeas diferencias que encontramos entre nuestro mtodo y los publicados, pueden deberse por una lado al diferente material utilizado (filtros y no lifilos) y por otro al diferente volumen de extraccin utilizado. Cuando se extraen lifilos el volumen suele ser de 2-3 mL (en funcin del nmero de extracciones), por el contrario cuando se extraen filtros GF/F se necesita utilizar un volumen mayor de hasta 7 mL mejorando quizs la extraccin con concentraciones mayores de metanol. A la vista de los resultados obtenidos podemos concluir que el mtodo utilizado es vlido y que es capaz de extraer como media ms del 99% de la toxina sestnica presente en el interior de las clulas. Durante los ltimos aos se ha intentado determinar cual podra ser la forma ms correcta de relativizar los valores de microcistinas a la biomasa presente en las muestras. En los experimentos de laboratorio como en las muestras de campo, los valores que se utilizan con ms frecuencia son el peso seco y el biovolumen (Kardinaal y Visser 2005). La utilizacin del peso seco, sin duda la ms utilizada, aunque muy til tiene desde nuestro punto de vista tiene una serie de inconvenientes que en muchos casos no se han tenido en cuenta, tales como : El incremento en peso de que pueden causar la presencia de otros organismos no algales (zooplancton), partculas inorgnicas en suspensin sales disueltas y que pueden afectar a la medida desvirtuando parcialmente los resultados obtenidos, al subestimar la toxina presente por unidad de peso. Por otro lado la utilizacin del biovolumen tiene como principal

166

Discusin inconveniente la gran cantidad de tiempo que es necesario invertir en el anlisis de cada muestra y que puede llegar a ser limitante en los anlisis. En nuestro caso, hemos optado por utilizar como medida de biomasa la clorofila a, pues a pesar de que las concentraciones de clorofila por clula pueden variar segn varios factores fisiolgicos (p.e historia luminosa o la concentracin de nutrientes), es una medida que evita en parte los factores que pueden afectar en el peso seco (zooplancton, particular inorgnicas en suspensin y sales disueltas sobre todo) y por otro lado es mucho ms fcil de calcular que el biovolumen, facilitando los anlisis. Cuando analizamos los datos sobre presencia de microcistinas en la Comunidad de Madrid observamos que el 100% de los embalses estudiados presentaban microcistinas bien en las muestras concentradas o en la fraccin sestnica sin concentrar. Como vimos en el captulo I las especies de cianobacterias que presentan capacidad potencial de producir estos compuestos son muy comunes y podemos concluir que con los datos obtenidos, que las microcistinas tambin lo son. Tambin nos parece importante destacar que las concentraciones encontradas han superado en numerosas ocasiones el valor de 1 g Mc L-1, valor que se ha establecido como valor gua para agua de consumo a la salida de la ETAP en la legislacin vigente. Aunque es importante puntualizar que los datos presentados en este trabajo son siempre de agua bruta y no despus del tratamiento potabilizacin, por lo que este valor nicamente nos servir, a lo largo de la discusin para establecer un valor a partir del cual sera necesario establecer nuestro lmite de alarma y comprobar que estos compuestos no existen en el agua tratada. Este trabajo tambin muestra que estas toxinas son muy comunes en nuestra Comunidad, no nicamente por aparecer en todos los embalses analizados, sino por el nmero de muestras en las que este tipo de compuestos se detect, el 60% de las muestras de red presentaron microcistinas. Estos valores son muy parecidos a otros encontrados en el resto del mundo y en particular en Europa, como Alemania (Fastner y col., 1999) donde el 72% de las muestras presentaron microcistinas, Dinamarca (Henriksen y Moestrup 1997) donde el 66% de las muestras aparecieron este tipo de compuestos y centrndonos aun ms en la zona mediterrnea, estos valores se repiten, encontramos valores del 70% en Francia (Vezie y col., 1997) y del 60% en Portugal (Vasconcelos 1994). Estos datos tan homogneos indicaran que

167

Discusin nos encontramos ante un problema paneuropeo puesto que este tipo de toxinas son muy comunes en los lagos y embalses del continente. De todas maneras nos parece importante sealar que los muestreos buscando este tipo de compuestos en el en la zona templada del hemisferio norte, incluido este trabajo, se realizan normalmente en los momentos en los que las cianobacterias presentan una mayor importancia dentro de la poblacin fitoplanctnica y cuando la concentracin de algas es ms importante (meses de verano y de otoo (Oliver y Ganf 2000), y posiblemente en los meses de invierno y principios de primavera no suelan encontrarse tantas muestras que presenten microcistinas. Las concentraciones de microcistinas encontradas en este trabajo presentan grandes diferencias no slo entre los diferentes embalses sino tambin entre los dos aos analizados. El ao 2003 present un mayor porcentaje de muestras en las cuales fue posible detectar microcistina. En este ao en todos los embalses, excepto en el embalse de el Velln, se detect la presencia de microcistinas en un mayor nmero de muestreos, en total, una media del 46% 32% de los muestreos realizados en el cada embalse presentaron microcistinas en 2002 mientras que en el 2003 este se elev hasta el 70% 18%. Estas diferencias sin embargo no fueron significativas debido a la gran desviacin estndar que se observa, sobre todo en el 2002, que existieron diferentes tendencias en los dos aos estudiados en cuanto a la importancia que tuvieron estas toxinas en los embalses estudiados. Estas diferencias no solamente se observaron en el nmero de muestras que presentaron microcistinas, sino tambin en la concentracin que presentaron que fueron tambin mayores en el ao 2003, valga como ejemplo que en el ao 2003 fue posible detectar microcistinas en la fraccin no concentrada en todos los embalses analizados mientras que en el ao 2002 nicamente en cuatro de los siete embalses analizados fue posible detectarlas. Es difcil comparar los datos obtenidos con los presentes en la bibliografa, en general los estudios sobre la presencia de microcistinas suelen agruparse en dos tipos de artculos: unos en los que estudia en profundidad un nico embalse a un embalse (p.e. (Maatouk y col., 2002); (De Magalhaes y col., 2001); (Briand y col., 2002) y (Welker y col., 1999)), y otros que suelen afectar a mltiples cuerpos de aguas, normalmente a nivel nacional, que no suelen tener en cuenta los diferentes embalses analizados individualmente presentando datos globales a nivel de pas o regin (p.e.(Fastner y col., 1999); (Henriksen y Moestrup 1997); (Vasconcelos 1994); (Willame y col., 2005) y (Kim y col., 1995)). Por esta razn son muy escasos los trabajos

168

Discusin publicados en los que se indica el nmero de cuerpos de agua que present toxinas. Entre los trabajos que presentan datos sobre el nmero de embalses que presentaban microcistinas en una regin o pas cabe destacar: Park y col., 1998 donde encontraron que el 80% de los embalses y lagos analizados en Corea presentaban microcistinas Aboal y Puig 2005 que mostraron que el 100% de los embalses analizados de la cuenca del Segura presentaban microcistina, si bien en este trabajo los organismos productores en los embalses eran bentnicos y no planctnicos y finalmente Graham y col., 2004 que en el medioeste norteamericano encontraron que el 78% de los embalses analizados presentaban este tipo de toxinas. Estos datos muestran que los valores encontrados en la Comunidad de Madrid, donde el 100% de los embalses analizados presentaban microcistinas, son muy similares a los encontrados en pases tan distantes como Corea y Estados Unidos. Esta similaridad en los datos parece indicar que en la mayor parte de los embalses y lagos eutrficos es posible detectar microcistinas en algn momento del ao y que en principio muchos ellos tienen la capacidad de producir afloramientos txicos, si se dan las condiciones ambientales adecuadas. Siguiendo ms en profundidad el anlisis de los valores de microcistinas y como se relacionaron con las concentraciones de clorofila encontradas los diferentes aos, podemos observar que en ao 2002 se presentaron mayores concentraciones de clorofila, que las encontradas en 2003, sin embargo salvo en el embalse de Lozoya, fue este ao 2003 el que present mayores mximos de toxicidad (expresadas como g Mc g clo a-1), esto como ya hemos indicado en los resultados indica que los organismos presentes en el ao 2003 posean una mayor capacidad txica que los que aparecieron el ao anterior, lo que se vio reflejado en los tambin mayores valores de microcistina por litro encontrados en 2003 respecto a 2002. Comparando los valores de la relacin clorofila microcistina encontrados en las muestras de red con los encontrados en Alemania por Fastner y col., 1999, donde las muestras fueron recogidas con una red de plancton de 40 m, en lugar de con la de 80 m utilizada en este trabajo, observamos que los valores fueron similares a los descrito en los embalses de la Comunidad. En los lagos alemanes el rango de la relacin toxina/clorofila se situ entre 0 y 2,5 g Mc g Clo a-1 (este valor mximo se encontr en una muestras dominada por Planktothrix), mientras que en Madrid, el rango encontrado fue de entre 0 y 2,45 g Mc g Clo a-1. A pesar de esta similitud en los valores mximos, analizando los datos ms en

169

Discusin profundidad, el percentil 75 se sita en los embalses de la Comunidad entre los valores de 0,52 y 0,02 g Mc g Clo a-1, mientras que en el caso de los lagos alemanes (Fastner y col., 1999) se obtuvo un valor superior para el percentil 75 inferior al encontrado en Madrid, siendo este ligeramente superior a 0,3 g Mc g Clo a-1 Esta diferencia puede deberse a que en nuestro caso hemos utilizado todos los muestras que presentaron microcistinas, incluyendo cuando Microcystis no domin la poblacin de cianobacterias, mientras que en el trabajo de Fastner y col, 1999 se consideraron por separado las muestras donde Microcystis domin la poblacin de las muestras en las que fue subdominante, y el valor de 0,3 g Mc g Clo a-1 es el obtenido para las muestras en que Microcystis domin. Respect al valor mximo encontrado, si parecen existir claras diferencias entre los valores encontrados para las muestras en las que domin Microcystis, cuando las comparamos con las alemanas. El mximo encontrado en los embalses de la Comunidad de Madrid es muy superior al encontrado en latitudes superiores como por ejemplo Alemania, el valor mas alto de la relacin toxina/clorofila en los embalses alemanes, cuando domin esta especie fue de alrededor de 1 mientras que en los embalses analizados en este estudio este valor fue de 2,45, esta diferencia junto con el mayor valor encontrado en el limite superior del percentil 75% parece indicar que las cepas de Microcystis, presentes en Espaa, y probablemente en la zona mediterrnea presenta una mayor capacidad de producir este tipo de compuestos. En total durante los dos aos estudiados, se han detectado afloramientos en los que fue posible detectar microcistinas en tres embalses diferentes: Santillana, Valmayor y Picadas (esto representa que casi el 50% de los embalses analizados). Adems de otros dos afloramientos de cianobacterias donde no fue posible detectar microcistinas (uno en Valmayor y otro en Lozoya, (para ms informacin ver captulo I). Todos los afloramientos txicos se caracterizaron por presentar en alguno de los puntos analizados concentraciones superiores a 1 g Mc L-1, alcanzndose las concentraciones mximas en el embalse de Santillana con valores ligeramente superiores a 70 g Mc L-1. Estas concentraciones obtenidas, cabe recalcar, se obtuvieron tomando la muestra a 0,5 m de profundidad evitando en caso de existir recoger la acumulacin superficial. Bajo esta condiciones las concentraciones encontradas estn entre las ms altas descritas en la bibliografa cuando Microcystis domin la poblacin fitoplantnica (p.e (Fastner y col., 1999), (Welker y col., 2003) y (Cook y col., 2004)), si bien el hecho no existir una metodologa de muestreo perfectamente definida, dificulta las comparaciones,

170

Discusin especialmente cuando existen acumulaciones presentes (muestras que pueden presentar concentraciones de microcistinas del orden de mg L-1) ((Cook y col., 2004) y (Sivonen y Jones 1999)) lo que pueden hacer variar en gran medida los valores de concentracin de microcistina por litro. Cuando analizamos la diferencias entre los distintos afloramientos, podemos observar que presentaron grandes variaciones en la concentracin de microcistinas y en la relacin microcistina clorofila a pesar de que todos estuvieron dominados por la misma especie de cianobacteria Microcystis aeruginosa, las concentraciones mximas de microcistina variaron de ms de 70 g Mc L-1 en el embalse de Santillana en el ao 2003 a valores ligeramente por encima de 1 g Mc L-1 en el embalse de Picadas en ese mismos ao, a pesar de encontrarnos valores superiores de clorofila en el embalse de Picadas que los existentes en el de Santillana. Estas variaciones entre los afloramientos han sido encontradas en multitud de ocasiones y se han explicado por las enormes variaciones en produccin de toxinas que se puede encontrar entre cepas de la misma especie de Microcystis ((Moreno y col., 2004) y (Kardinaal y Visser 2005)) incluso cuando estas cepas han sido aisladas de un nico embalse en un mismo momento y que impiden determinar la toxicidad de una muestra observando al microscopio la composicin de especies que una muestra presenta. Cuando analizamos las variaciones temporales que se observan en los diferentes embalses podemos ver que en cortos periodos de tiempo pueden existen grandes variaciones en la concentracin de microcistinas, dentro del mismo embalse encontramos variaciones de un orden de magnitud en una semana y a lo largo del ao de ms de tres ordenes de magnitud. Estas variaciones son similares a los encontradas por ejemplo por Welker y col., 2003 en el lago Mggelsee, por Kotak y col., 1995 en tres lagos hipereutrficos en Canad o por Wicks y Thiel 1990 en el embalse de Hartbeespoort en Sudfrica y confirma que las grandes variaciones tanto espaciales (entre lagos diferentes o dentro del mismo lado) como temporales son muy comunes. Estas grandes variaciones y lo comunes que son aconsejan que las frecuencias de muestreos en los embalses en los que se sospecha la presencia de cianobacteria potencialmente txicas, sean elevadas con el fin de cuantificar microcistinas en cortos espacios de tiempo y poder ser capaz as de responder a los cambios bruscos de concentracin que pueden encontrarse. Estas variaciones pueden deberse desde procesos de mezcla debidos a procesos fsicos como el viento, como ocurri en Santillana en 2002 o ser de origen biolgico

171

Discusin como discutiremos posteriormente al hablar de las correlaciones entre la concentracin de clorofila y la de microcistina. Los datos existentes sobre microcistinas en embalses espaoles son limitados, nicamente se han publicado cuatro trabajos sobre presencia de microcistinas en embalses espaolas en revistas internacionales, uno de ellos metodolgico (Barco y col., 2002) en el cual se analizaron diversas muestras de afloramientos sin precisar en las condiciones en que se tomaron, que cianobacterias estaban presentes o la concentracin de clorofila que presentaban las muestras. En otro de ellos se publicaron datos sobre la presencia de microcistinas en el embalse del Atazar, embalse que present un afloramiento de Planktothrix rubescens en el ao 2003 (Barco y col., 2004) que mostr una concentracin mxima de 19,1 g L-1, que es despus de la determinada en el embalse de Santillana en este trabajo la mayor concentracin de microcistinas por litro publicadas en Espaa. Otro de los trabajos analiz varios embalses situados en la cuenca del Segura (Aboal y Puig 2005), en esta cuenca las microcistinas presentes en la columna de agua presentaron valores medios y bajos (inferiores a 0,2 g L-1) y curiosamente en este caso los productores fueron cianobacterias bentnicas y no planctnicas que son las productoras ms comunes en lagos y embalses. Estas cianobacterias bentnicas presentaron concentraciones de microcistinas relativamente bajas con un valor mximo de 8,611 g g-1, lejano de los valores encontrados en afloramientos txicos de organismos planctnicos en los cuales de manera frecuente se encuentran valores tres ordenes de magnitud superiores (del orden de g mg-1) similares a los encontrados en las acumulaciones de este trabajo (datos no mostrados) y en otros pases Europeos ((Henriksen ) y (Vasconcelos y col., 1996)). Por ltimo esta la cuenca hidrogrfica en la cual se publicado datos de presencia de microcistinas ha sido la cuenca del Guadiana (Moreno y col., 2005). En este trabajo los organismos potencialmente productores encontrados en la columna de agua fueron M. aeruginosa y Oscillatoria spp. y las concentraciones mximas detectadas fueron inferiores a 0,12 g Mc L-1. Podemos observar que los valores detectados en estos trabajos (especialmente en la cuenca del Segura y del Guadiana) se encuentran lejos de los valores obtenidos es este trabajo con concentraciones mximas superiores a 70 g Mc L-1. Estas diferencias encontradas pueden deberse por un lado a que M. aeruginosa, posiblemente el principal organismo productor de microcistinas en aguas mediterrneas ((Willame y col., 2005) y (Cook y col., 2004)) no se encontrase en concentraciones demasiado altas, o bien que las la cepa

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Discusin presente tuviese una baja capacidad de produccin de este tipo de compuestos, como ocurri en el embalse de Picadas en el ao 2003, donde un afloramiento dominado por Microcystis aeruginosa con una concentracin mxima de clorofila superior a 100 g L-1, present concentraciones de microcistinas ligeramente superiores a 1 g Mc L-1. Cuando comparamos la concentracin de microcistinas con la concentracin de clorofila a presente en cada momento, podemos observar que como norma general la relacin toxina/clorofila es mxima, antes o despus del momento en que ocurren los picos mximos de clorofila. Esto indica que la poblacin fotosinttica es ms txica justo antes o despus de que se alcance el pico mximo de biomasa. Esto parece coincidir con los resultados encontrados por ((Welker y col., 2003) y (Kardinaal y Visser 2005)) que indican que son ms txicos los organismos existentes cuando las concentraciones de clorofila o biomasa son menores. La explicacin ofrecida por estos autores es que durante el desarrollo del afloramiento se seleccionan las cepas menos toxicas, que incrementan ms su biomasa que las ms toxicas durante el desarrollo del afloramiento, de esta manera al alcanzar la biomasa mxima, las cepas productoras de toxinas seran minoritarias. Esta conclusin soporta parcialmente los resultados obtenidos durante la realizacin de este trabajo, puesto que las mayores relaciones toxina clorofila no se alcanzaron nunca en los momento es que la concentracin de clorofila fue mxima, pero en nuestro caso no encontramos la correlacin negativa entre la concentracin de microcistinas y la biomasa cianobacteriana (datos no mostrados), indicando que podran existir otros factores, posiblemente fisiolgicos, que modularan la concentracin intracelular de microcistinas durante los episodios txicos y que explicaran los resultados obtenidos. En las correlaciones entre microcistina y clorofila tambin podemos observar que los resultados obtenidos dependen por un lado de la metodologa utilizada y del embalse que se esta analizando. Cuando analizamos las muestras de red podemos observar que existe una correlacin positiva entre la cantidad de clorofila a que tienen las muestras y la concentracin de microcistinas que las mismas presentan, en la bibliografa existen trabajos en los cuales esta tambin se encontr una correlacin positiva (p.e. (Kotak y col., 1995) y (Welker y col., 1999)), sin embargo cuando se utilizaron los datos de las muestras sin concentrar, no fue posible encontrar esta correlacin. Esta diferencia entre los datos de las muestras concentradas

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Discusin por red y sin concentrar puede deberse al efecto que otros organismos fotosintticos pueden tener sobre la medida de clorofila. Al utilizar una red de 80 m de tamao de poro, la muestra se enriquece en organismos coloniales de gran tamao, como pueden ser Microcystis, Esta mayor proporcin del organismo productor mas importante en los embalses analizados podra explicar la correlacin positiva en las muestras concentradas por red y no en las no concentradas. Junto con este factor de concentracin de organismos potencialmente txicos, ((Mikalsen y col., 2003) y (Via-Ordorika y col., 2004)) han mostrado que dentro del genero Microcystis existe una mayor probabilidad de producir microcistinas cuanto mayor es el tamao de la colonia, este factor tambin influira en el enriquecimiento en microcistina respecto a clorofila que observamos en las muestras de red. La suma de estos dos efectos sumados sera por lo tanto la razn que explicara porque existe una correlacin en las muestras concentradas por red y no en las no concentradas. Un anlisis aparte merece el embalse de Santillana, nico embalse que mostr correlacin significativa entre la concentracin de clorofila y la concentracin de microcistina en el ao 2003. Esta diferencia entre los datos totales y los encontrados en el embalses de Santillana probablemente se deben no slo al organismo dominante que se encuentra en ese embalse (para ms informacin ver captulo I), sino que adems parece ser que en todo momento la poblacin de Microcystis estuvo dominada por organismos con una gran capacidad de produccin de microcistinas lo que explicara el porque fuimos capaces de detectar microcistinas durante casi todo el periodo de muestreo, aunque las concentraciones de clorofila de cianobacterias fueran relativamente bajas. Estudiando el momento en el cual las microcistinas aparecieron en los embalses analizados podemos observar la existencia de ligeras diferencias entre las muestras concentradas por red y las no concentradas. En las muestras concentradas por red aparece un incremento en el nmero de embalses que presentan microcistinas en el mes de julio que no se ve reflejado en las muestras no concentradas. Esto podra indicar que en ese momento no se dan las condiciones adecuadas para que las cianobacterias toxicas dominen la poblacin en dicho mes, pero que estas si las condiciones adecuadas se aparecen, como ocurri en Santillana 2003, las microcistinas pueden aparecer y alcanzar concentraciones extremadamente altas, lo que indicara que el pico de potencialidad txica, no lleve aparejado

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Discusin la presencia de toxinas en la fraccin no concentrada. Por otro lado en los meses de septiembre, octubre (el mes con mayor riesgo) y noviembre no aparecen grandes diferencias entre muestras concentradas por red y no concentradas, lo que indicara que son los meses con mayor probabilidad de encontrar microcistinas en los embalses de la Comunidad de Madrid. En otros pases nos encontramos con dinmicas de aparicin similares, pero desplazadas temporalmente, en pases europeos de latitudes ms elevadas como Dinamarca (Henriksen y Moestrup 1997) y Alemania (Fastner y col., 1999) los valores mximos suelen encontrarse en los meses de junio, julio, agosto y septiembre con un mximo en el mes de julio, aunque en Alemania donde Planktothrix tiene una especial incidencia los meses de septiembre y octubre presentan tambin muestras donde es posible detectar microcistinas. Las diferencias entre Espaa y esos pases, son probablemente debidos a deferencias climatolgicas existentes, que inducen estos cambios observados pasando los mximos de localizarse en verano en centroeuropa, a encontrarse a finales del verano principios del otoo en la Comunidad de Madrid. No existen datos de cual es la situacin en otros pases mediterrneos acerca de cual es la distribucin de microcistinas en lagos y embalses a lo largo del verano y otoo, pero parece lgico suponer que nos deberamos de encontrar una situacin similar a la que hemos descrito para Madrid. Finalmente nos queda analizar los diferentes tipos qumicos de microcistinas encontrados durante la realizacin de este trabajo. Como en el resto de Europa las toxinas mayoritarias en nuestro estudio fueron por orden de frecuencia la microcistina LR, RR y la YR (Via-Ordorika y col., 2004) y (Sivonen y Jones 1999), esto diferencia a las microcistinas producidas por las cepas europeas de las encontradas en el lejano oriente donde la microcistina mayoritaria es la microcistina RR (Kim y col., 1995) (Park y col., 1993) (Baldia y col., 2003), si bien las diferencias metodolgicas (extraccin metanlica en Europa y extraccin con 5% de actico en el lejano oriente) podra ser la responsable de las diferencias observadas, al extraer los mtodos empleados de manera diferencial las microcistinas con diferente hidrofobicidad (especialmente la microcistina RR) (Fastner y col., 1998). La importancia de determinar los tipos qumicos de las microcistinas presentes en las muestras, especialmente de las mayoritarias, viene de las grandes diferencias en toxicidad que estas presentan (Sivonen y Jones 1999). Las variantes LR y YR han sido identificadas dentro del grupo de las toxinas ms txicas, con DL50 intraperitoneal de 50 g kg-1, mientras que la

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Discusin segunda en importancia la microcistina RR muestra un menor toxicidad con una DL50 intraperitoneal 12 veces menor de 600 g kg-1 (Sivonen y Jones 1999). Esta diferencia de toxicidad no se tiene en cuenta en la legislacin vigente, donde el valor de TDI se calculo considerando nicamente la toxicidad de la microcistina LR. Para evitar estas diferencias de toxicidad (Wolf y Frank 2002) definieron el concepto de microcistina equivalente, con el cual intentaban al expresar las concentraciones de microcistinas teniendo en cuenta su toxicidad. Para ello multiplicaban la concentracin de cada microcistina por un factor de equivalencia de toxina (TEF) que seria de uno para la microcistina LR y para el resto el resultado de dividir la toxicidad de la microcistina LR por la suya (en el caso de la Mc-RR seria de 0,08). Utilizando esta metodologa le valor mximo presentado en Santillana en 2003 de 73.7 g Mc l-1 tendra un valor de 42 g microcistina equivalente L-1 (considerando que las microcistinas desconocidas tenan un TEF =1). Esta metodologa nos permitira una mejor gestin al tener en cuenta no solamente la concentracin de microcistinas sino la toxicidad de las mismas.

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CAPTULO III

CAPTULO III

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Introduccin

Variaciones de los tipos de microcistinas y su correlacin con las variaciones en el gen mcyB en el embalse de Santillana

1. Introduccin

Existe una gran diversidad en los tipos de microcistinas que producen las cianobacterias, y esta diversidad es importante porque las diferentes microcistinas presentan grandes variaciones en la toxicidad en funcin de la secuencia peptdica que presentan (Sivonen y Jones 1999). Esta elevada diversidad qumica dentro de las microcistinas se ha intentado relacionar con cambios en las secuencia de las protenas responsables de su sntesis ((Mikalsen y col., 2003; Kurmayer y col., 2002)).

1.1. Estructuras de las pptido sintetasas.

En el captulo II, ya hemos tratado brevemente este tipo de protenas. Ahora analizaremos en profundidad su estructura y las funciones que presentan.

Las pptido sintetasas son protenas modulares donde cada mdulo se encarga de realizar la incorporacin de un aminocido a la molcula en crecimiento. Cada uno de estos mdulos esta compuesto por varios dominios, cada uno de ellos con una actividad enzimtica diferente. Se define como mdulo cada seccin de la cadena

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Introduccin polipeptdica de una NRPS que es responsable de la incorporacin de una subunidad al pptido en crecimiento (von Dohren y col., 1997). En la naturaleza podemos observar que cada uno de estos mdulos puede coincidir con una protena, pero en algunos casos una protena puede poseer varios mdulos (von Dohren y col., 1997). Como hemos visto se necesitan para lograr la sntesis de los pptidos no ribosmicos al menos cuatro dominios o actividades enzimticas descritos a continuacin:

Dominio de adenilacin: Es el dominio responsable de la activacin especfica de los precursores de la sntesis (Figura III.1), que pueden ser grupos de aminocidos, imino-cidos, hidroxi-cidos o varios cidos carboxlicos. En todos los casos la activacin tiene lugar cuando se transfiere alguno de estos grupos al AMP. Adems, en este dominio se encuentra el principal mecanismo de control que asegura que la secuencia primaria de los pptidos sintetizados por las pptido sintetasas sea correcta, aunque no es el nico mecanismo. En todos estos dominios se han encontrado diez regiones conservadas (A1-A10) (Welker y Von Dohren 2006). La especificidad de este dominio viene dada por la estructura tridimensional de este centro activo que slo permite la entrada del sustrato especfico de la adenilacin (Finking y Marahiel 2004). En bacterias se han descrito 200 dominios de adenilacin, relacionados o con sistemas NRPS o con acil-CoA sintetasas.

Dominio de Tiolacin: Son los encargados de transportar los aminocidos o los pptidos que estn siendo sintetizados desde el dominio de adenilacin al centro del dominio de condensacin (Figura III.1). Todos los dominios descritos de este tipo poseen un residuo de serina conservado. Este ser el sitio que posteriormente es modificado postranscripcionalmente con la unin de una coenzima, que normalmente es un grupo fosfopantetenico (4PP), (Finking y Marahiel 2004), y en donde se unir el aminocido o el pptido.

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Introduccin

Figura III.1. Estructura tridimensional de los dominios de adenilacin, tiolacin y condensacin. (extrado de (Finking y Marahiel 2004)) Dominio de condensacin: El dominio de condensacin posee en el centro activo un lugar de unin para dos pptidos incorporados al transportador fosfopantetenico, uno de ellos viene del modulo anterior y el otro del modulo posterior de manera que en este dominio se cataliza la formacin del enlace peptdico (Welker y Von Dohren 2006) (Figura III.1).

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Introduccin Dominio tioesterasa: No es directamente responsable de la sntesis del pptido, pero es el dominio responsable de liberar el pptido ya terminado del portador fosfopantetenico al final de la sntesis (Figura III.1). Esta liberacin se da a travs del ataque nucleoflico de un intermedio acil-O-enzima tioesterasa al pptido ya formado (Finking y Marahiel 2004). Aparte de estos dominios imprescindibles existen otros dominios accesorios que suelen presentarse en los sistemas NRPS, algunos de ellos son: dominio de heterociclacin necesario en el caso de todos los pptidos cclicos, como es el caso de las microcistinas, de epimerizacin y racemasas, responsables de modificar los aminocidos a la forma D, formil-trasferasas, N-metilasas y dominios de oxidacin y de reduccin (Welker y Von Dohren 2006).

1.2. Pptido sintetasas responsables de la sntesis de microcistinas .

Como hemos visto, son cuatro los genes que presentan actividad pptido sintetasa que estn en el opern responsable de la sntesis de las microcistinas. El mcyE que codifica una protena mixta poliqutido-pptido sintetasa responsable de terminar la sntesis del Adda y que une la parte poliqutido sintasa y pptido sintetasa catalizando la unin del Adda y el aminocido glutamato presente en la molcula por medio de un enlace con el grupo carboxilo en . Posteriormente y en orden, nos encontramos tres pptido sintetasas que actan de manera coordinada y consecutiva. El gen mcyA codifica la enzima responsable de la incorporacin de los dos siguientes aminocidos de la molcula de microcistina metil-dehidroalanina (Mdha) y L-Ala. El primero en ser incorporado es una alanina que es posteriormente modificada por un dominio Nmetiltransferasa (NMT) presente en McyA transformndola en Mdha. Posteriormente se incorpora otra L-Ala que tambin es modificada por esta enzima gracias a un dominio de epimerizacin que presenta pasando a D-Ala (Challis y col., 1999)). El siguiente gen mcy, el gen mcyB, posee el primer dominio de adenilacin responsable de la

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Introduccin incorporacin del primero de los dos aminocidos variables, que dan nombre a la nomenclatura de las microcistinas (para mas informacin ver captulo II), y del siguiente, uno de los aminocidos no proteinognicos que posee la molcula, el DMetilAsp. Respecto a este aminocido, cabe destacar que el grupo carboxilo en no es activado, sino el . Esta caracterstica qumica de la molcula no microcistina no ha podido correlacionarse con la secuencia de este dominio de adenilacin puesto que el dominio de condensacin no pertenece al cluster de los dominios formadores de enlace peptdico L-D. Queda por incorporar el ltimo aminocido variable en la molcula, esto es realizado por la tercera pptido sintetasa del opern, mcyC. Esta protena posee adems un dominio tioesterasa que va a ser el responsable de la liberacin del pptido ya formado.

1.3. Variantes qumicas dentro de las microcistinas.

Como hemos descrito, en la actualidad se han identificado ms de 70 variantes qumicas diferentes de microcistinas (Codd y col., 2005), si bien cuando se analizan las cepas aisladas de los organismos potencialmente productores observamos que en general cada cepa slo produce normalmente una o dos microcistinas mayoritarias. Por ejemplo, una de las cepas perteneciente al genero Microcystis, la cepa Microcystis sp. PCC7108, presenta dos microcistinas mayoritarias Mc-LR y su variante desmetilada Mc-(D-asp3)-LR y otras dos formas minoritarias Mc-RR y Mc-YR (Dittmann y col., 1997). La utilizacin en los ltimos aos de la tcnica de espectrmetra de masas conocida como Maldi-Tof (Desabsorcin/Ionizacin de Matriz Asistida por Laser Espectrometra de Masas por Tiempo de Vuelo)ha permitido detectar la presencia de microcistinas en muestras increblemente pequeas (es capaz de detectar la presencia de este tipo de compuestos en colonias individuales de Microcystis). De este modo, aplicar esta metodologa a las muestras de campo ha permitido analizar el nmero de variantes de microcistinas que son capaces de producir colonias individuales del genero Microcystis en condiciones naturales. As, por ejemplo (Via-Ordorika y col., 2004)

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Introduccin analizando ms de 250 colonias pertenecientes al genero Microcystis llegaron a encontrar hasta 8 variantes diferentes de microcistinas. Por otro lado, las cepas de Microcystis aisladas en la Comunidad de Madrid en general presentan tpicamente dos o tres microcistinas mayoritarias y es posible llegar a encontrar en total mas de 10 tipos diferentes de microcistinas producidas por un nico organismo productor, aunque en este caso los datos se obtuvieron mediante anlisis por HPLC y no por Maldi-Tof. Las determinaciones por HPLC permite detectar un mayor numero de variantes minoritarias (D. Sanchis comunicacin personal), puesto que normalmente se parte de mayores cantidades de biomasa para realizar los anlisis. Como hemos visto en el captulo II (XX), de todas la variantes encontradas, son tres las microcistinas mayoritarias en todo el mundo (p.e. (Via-Ordorika y col., 2004) y (Sivonen y Jones 1999)) incluida la Comunidad de Madrid (Carrasco y col., 2006), stas son las variantes LR, RR e YR, si bien generalmente las muestras suelen presentar simultneamente como mayoritarias slo una o dos de estas variantes.

Esta gran diversidad de microcistinas producidas por un nico organismo que en principio presenta un nico opern de genes mcy, parece indicar que los dominios de adenilacin de los genes mcy, que son los principales responsables de la especificidad en el tipo de aminocido incorporado, no muestran una eficiencia muy elevada en el reconocimiento de dichos aminocidos. (Kurmayer y col., 2002) Por tanto, sugieren que no es posible determinar el tipo de microcistina producida por un organismo en funcin de la secuencia gentica que presentan las pptido sintetasas y concluyen que esta inespecificidad impedira hacer ningn tipo prediccin respecto a las microcistinas producidas. Sin embargo, (Mikalsen y col., 2003) posteriormente indicaron que la secuencia de aminocidos que presentaban los dominios de adenilacin s poda utilizarse para predecir el tipo de microcistinas generado por un organismo particular, al menos en el caso de las microcistinas producidas mayoritariamente. Estos datos contradictorios parecen indicar que es necesario un estudio en mayor profundidad de este tema antes de poder concluir nada.

183

Introduccin

1.4. Diversidad gentica de los potenciales productores de microcistinas en los afloramientos.

En los ltimos 5 aos se han realizado numerosos estudios sobre el estudio de la diversidad de los genes mcy (especialmente el gen mcyB, responsable de la incorporacin del primer aminocido variable). Estos trabajos se han basado en la secuenciacin de los genes responsables de la sntesis de las microcistinas en dos cepas de Microcystis ((Tillett y col., 2000), (Nishizawa y col., 2000)) y posteriormente en Anabaena y Planktothrix (Rouhiainen y col., 2004), (Christiansen y col., 2003). El conocimiento de estos genes ha permitido la utilizacin de cebadores especficos diseados especialmente para reconocer las zonas conservadas presentes en los dominios de adenilacin, llegando a disearse cebadores especficos para una nica especie productora (Hisbergues y col., 2003) o para estudiar la diversidad gentica que estos genes presentan en el ambiente (Rinta-Kanto y Wilhelm 2006). En muchos de los casos la estructura de dominios repetidos, conservados en todos las dominios de adenilacin (A1-A10), se han utilizado para disear los cebadores utilizados en estos trabajos (Figura III.2).

Figura III.2. Estructura de los dominios conservados en los dominios de adenilacin. (Extrado de (Konz y Marahiel 1999)). En negro se muestra la situacin de las 10 zonas conservadas implicadas en la adenilacin del sustrato. El gnero productor potencial de microcistinas sobre el cual se han realizado un mayor nmero de estudios ha sido Microcystis, al ser posiblemente el principal productor de microcistinas en el mundo y como hemos visto en el captulo II en la Comunidad de Madrid. (Via-Ordorika y col., 2004) mostr que existe una relacin entre la presencia de genes del opern mcy y microcistinas en colonias aisladas de gran parte 184

Introduccin de Europa, encontrando que existan diferencias entre las diferentes morfoespecies analizadas, como veremos en el prximo apartado de la introduccin.

1.5. Diversidad Cianobacteria y microcistinas.

En los ltimos aos y gracias por un lado a la identificacin del opern responsable de la produccin de microcistinas y por otro a la aplicacin de la tcnica de Maldi-tof se ha podido iniciar el estudio de la produccin de microcistinas a nivel de colonia (Fastner y col., 2001), esto ha permitido identificar diferencias de produccin entre distintas especies de Microcystis e incluso diferenciar clones dentro de la misma especie. Estos anlisis, han mostrado que se pueden encontrar tanto situaciones en las que existen varias especies productoras simultneamente, como otras en las que aparece una especie, pero con diversos clones. Respecto a la probabilidad que presentan las especies de Microcystis de producir microcistinas se han publicado dos trabajos fundamentales. Estos dos trabajos fueron: uno, el trabajo que puede considerarse el inicio este tipo de estudios(Fastner y col., 2001) que analiz la poblacin de Microcystis en el lago Wannsee, Alemania y otro posterior en el cual se estudiaron multitud de colonias de Microcystis procedentes de 13 lagos localizados en 9 pases (Via-Ordorika y col., 2004). Los resultados obtenidos fueron similares, en la mayor parte de las colonias de la especie M. aeruginosa (el 75% en el trabajo de (Via-Ordorika y col., 2004) y el 98% en (Fastner y col., 2001)) se detectaron microcistinas. En el extremo contrario nos encontramos la especie M. wesenbergii de la cual no han se han encontrado estirpes productoras de microcistina en Europa. Entre estos dos extremos nos encontramos al resto de las especies del gnero Microcystis: M. flos-aquae y M. panniformis con valores de alrededor del 50% y M. ichthyoblabe y M. viridis que presentan valores alrededor del 20% (Via-Ordorika y col., 2004). Otro resultado interesante, en el que nicamente se consider la especie M. aeruginosa (Wilson y col., 2005), fue la comprobacin de la existencia de una elevada

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Introduccin diversidad dentro de esta especie, encontrando una variabilidad de produccin del 79% en las cepas analizadas, siendo mayor la diversidad encontrada dentro de un lago, que la que se encuentra entre los diferentes embalses analizados.

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Objetivos

2. Objetivos
Los afloramientos txicos no suelen ser monoespecficos e incluso se ha observado la existencia de una importante diversidad dentro de la misma especie de cianobacteria potencialmente txica. Los objetivos de este captulo son: Analizar la presencia de diferentes tipos de microcistinas en el embalse de Santillana en el ao 2002 Correlacionar los cambios en la concentracin y tipos de microcistinas que aparecen con cambios morfolgicos y genticos en la poblacin de especies potencialmente txicas encontradas en cada momento. Correlacionar las sucesiones de cianobacterias con los parmetros ambientales.

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Materiales y Mtodos

3. Materiales y Mtodos.

3.1. Zona de Estudio.

La zona de estudio fue el embalse de Santillana descrito ya en el captulo I.

3.2. Toma de muestras.

Durante el ao 2002 se analiz el embalse objeto de estudio, durante el periodo tpico de aparicin de afloramientos txicos en los pases templados del hemisferio Norte, de junio a noviembre. Se tomaron muestras de la fraccin sestnica segn la metodologa ya descrita en el captulo I . Las muestras se guardaron a 4 C hasta su procesamiento, tpicamente antes de cuatro horas, en botes de polipropileno de boca ancha y lavados con cido clorhdrico.

3.3. Anlisis

de

especies

cianobacterianas

planctnicas

potencialmente toxicas presentes en el embalse de Santillana, extraccin y anlisis de microcistinas y anlisis de parmetros ambientales.
Las muestras se procesaron y analizaron como se ha descrito en el captulo I. La identificacin de las especies cianobacterianas presentes se realiz segn los criterios definidos por los siguientes autores ((Geitler 1932), (Komarek y Anagnostidis 1989; 1999; Komarek y Anagnostidis 1986)). La extraccin y anlisis de microcistinas se realiz como se ha descrito en el captulo II, mientras que los parmetros qumicos, fsicos y biolgicos se analizaron como se ha descrito en el Captulo I, finalmente los parmetros atmosfricos: precipitacin, temperatura, racha de viento mxima, horas de insolacin y porcentaje de la insolacin mxima terica se

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Materiales y Mtodos obtuvieron de la estacin meteorolgica del Instituto Nacional de Meteorologa situado en la base area de Colmenar Viejo/FAMET, a menos de 15 km del punto de muestreo.

3.4. Amplificacin del gen mcyB, y anlisis de polimorfismos de fragmentos de restriccin.

Las muestras de agua fueron filtradas a travs de filtros GF/F y mantenidas a -20C hasta su anlisis. Para la extraccin de ADN se cortaron los filtros y se les aadi Tris-HCl 1 M (pH = 7), 10 mg de lisozima, la mezcla se incub durante 15 minutos. Posteriormente se centrifug a 14000 rpm durante 10 minutos y se descarto el sobrenadante. A continuacin, se aadi 1 mL de buffer de extraccin (120 mM de tampn fosfato pH = 8, EDTA 0,1 M, ClNa 1,5 M, CTBA 1% y proteinasa K 10 mg mL-1), y se incub a 65 C durante 1 hora. Despus se aadieron 75 L de tiocianato de guanidina y 200 mL de SDS 10%, 1 minuto de agitacin, 2 minutos en un bao de ultrasonidos Ultrasons (J.P.Selecta, Espaa). Finalmente se someti a tres ciclos de congelacin (-80 C) y descongelacin (37 C). Se recuper la mayor cantidad de lquido posible y se extrajo el filtro dos veces ms con 1,5 mL adicionales de tampn fosfato (120 mM pH = 8). El liquido obtenido se extrajo con un volumen de fenol-cloroformoisoamilialcohol (25:24:1), y posteriormente con otro volumen de cloroformo-isoamilialcohol (24:1). La fase acuosa se precipit a -80 C durante una hora con un volumen de isopropanol y 0,4 volmenes de cloruro sdico 5M. Finalmente se lav con etanol 100% (-20 C) y dos veces con etanol 70% (-20 C). El ADN obtenido se utiliz para amplificar una zona de dominio de adenilacin de gen mcyB. Los cebadores utilizados fueron los descritos por (Kurmayer y col., 2002) (Tabla III.1), stos son especficos para el genero Microcystis, nico organismo potencialmente productor presente durante el periodo analizado. El fragmento obtenido fue de 1321 pb e incluye las zonas conservadas de A3-A10. La amplificacin fue realizada en un volumen de 50 L al que se el aadieron 5 L de PCR buffer, 2 L de MgCl2 (25 mM), 1 L de deoxinucletidos (10 mM), 2 L de polimerasa Tth (biotools, Espaa), 2 L de cada uno de los cebadores (concentracin final 10 pmol), 34 l de agua estril y 4 l de la extraccin de ADN. Para la amplificacin se utiliz un termociclador PCR (Perkin- Elmer GenePCR systems 2400,

189

Materiales y Mtodos EEUU) y se realiz, al igual que el anlisis de restriccin, siguiendo las condiciones descritas por (Kurmayer y col., 2002).

Nombre Tox4f Tox4r

Secuencia 5-GGATATCCTCTCAGATTCGG-3 5-CACTAACCCCTATTTTGGATACC-3

Tm 57C 59C

Tabla III.1. Cebadores utilizados y temperatura de anillamiento (Tm).

3.5. Anlisis de Maldi-Tof .

Para este anlisis se seleccionaron un nmero de colonias pertenecientes a la especie Microcystis aeruginosa provenientes de afloramientos del embalse de Santillana y se analizaron los pptidos presentes en ella por medio de Maldi-Tof. Para ello se utilizo un Maldi-Tof de la marca Broker, y se sigui el protocolo descrito por (Fastner y col., 2001). Brevemente, se seleccionaron colonias de distinto tamao, se lavaron tres veces con agua filtrada del embalse o con medio estril, en funcin de dnde haban sido recogidas y se pusieron directamente sobre placas de muestras de Maldi-Tof; cuando se sec el medio que llevaban se aadieron a cada colonia 3 L de una mezcla de Acetonitrilo/Agua (50:50) ms 0,03% de TFA al que se le aada una concentracin de 10 mg de cido 2,5-dihidroxibenzoico por mL. Esta mezcla actu simultneamente como extractante y como matriz. El anlisis de Maldi-Tof se realiz en modo de in positivo y se obtuvieron los espectros entre una relacin masa-carga (m/z) de entre 500 y 1500, regin donde pueden detectarse muchos de los pptidos producidos por las cianobacterias. Para detectar cul era el tamao de las colonias que podan ser utilizadas para este tipo de anlisis, se realiz una prueba utilizando un cultivo de Microcystis que mantena la capacidad de formar colonias, Microcystis aeruginosa UAM 247. Se seleccionaron 14 colonias de diferente tamao y se analizaron los pptidos que se detectaban en cada caso. La presencia de la colonia en la placa se confirm bajo observacin en lupa binocular (Leica MZ7.5m, Reino Unido).

190

Materiales y Mtodos

3.6. Realizacin de anlisis quimio-taxonmico.

Se seleccionaron colonias mediante lupa binocular pertenecientes al genero Microcystis y se realizaron tres lavados por agua destilada, posteriormente se midieron las colonias y se fotografiaron mediante un microscopio Olympus BH-2 (Alemania) con una cmara digital Leica 300F( Reino Unido) y se calcul el rea de cada colonia con el programa de anlisis de imagen Qwin de Leica. Posteriormente se analizaron los pptidos presentes en esas colonias como ha sido descrito en el punto anterior Para realizar los rboles quimio-taxonmicos se seleccion una regin del espectro de masas entre 900 y 1100 de relacin m/z En ese rango se realiz una deteccin de todos los posibles compuestos diferentes, se determin la intensidad de cada uno de ellos y se relativizaron las intensidades de cada uno de los picos respecto a la suma total de intensidades obtenidas en la zona entre 900 y 1100. Una vez obtenidas las relaciones para cada una de los picos se construy una matriz para cada una de las colonias y el conjunto de matrices se analiz realizando una clasificacin ascendente jerrquica. Para ello se obtuvo una matriz de distancias entre las diferentes colonias calculando el grado de similitud entre ellas mediante el coeficiente de similitud de Pearson. Una vez obtenida la matriz de distancias se construy un rbol mediante el mtodo de aglomeracin de enlace medio. Para todos estos clculos se utiliz el programa XLSTAT 2006 Versin 2006.2.

191

Resultados

4. Resultados.
Durante el ao 2002 observamos que en el embalse de Santillana se produjo un cambio en el patrn de toxinas que apareca en las muestras a lo largo del periodo analizado. Este cambio no afect a la toxina mayoritaria que fue la Mc-LR, pero la toxina acompaante cambi de Mc-YR a Mc-RR. Este cambio se observ tanto en las muestras concentradas como en las no concentradas (captulo II), si bien el cambio en el patrn de toxina producida fue mucho ms claro en las muestras no concentradas, donde el nmero de toxinas minoritarias disminuye al ser menor la cantidad de microcistina total presente. En este captulo se analizar si estos cambios fueron debidos a un cambio en la cepa mayoritaria presente en cada momento o a un cambio de toxina producida por factores ambientales que afectaron a la especificidad de la pptido-sintetasa por los aminocidos que reconoca, especialmente el mcyB, enzima encargada de la incorporacin del segundo aminocido variable que es el que sufre la modificacin qumica.

4.1. Determinacin del tamao mnimo de la colonia de Microcystis necesaria para el anlisis de Maldi-Tof.
Se seleccionaron colonias de diferente tamao de la cepa M. aeruginosa UAM 247 y se analizaron por Maldi-Tof como se ha descrito en materiales y mtodos. El nmero de clulas constituyentes de la colonia se obtuvo de forma aproximada puesto que la estructura tridimensional que presentan las colonias de este organismo y su gran densidad de clulas impide contarlo sin destruir la morfologa colonial. El hecho de utilizar colonias y no cultivos unicelulares de Microcystis (que podran ser contadas con facilidad) fue un intento de simular las condiciones que se encuentran en una situacin de campo, donde no es posible disgregar las colonias, y para mantener la especificidad respecto al morfotipo analizado o incluso de cepa que esta tcnica tan sensible permite. Los resultados obtenidos muestran que salvo en la colonia de menor tamao, en el resto fue posible identificar las microcistinas mayoritarias producidas por este organismo (Mc-LR, Mc-YR), as como otras numerosas molculas que pudieran ser ionizadas por este mtodo (Tabla III.2).

192

Resultados
N de microcistinas mayoritarias detectadas N de otras posibles microcistinas detectadas

Tamao aproximado (n de clulas)

Picos totales detectados

10-50 20-60 20-60 20-60 100-200 100-200 200-400 500-1000 500-1000 500-1000 > 3000 > 3000 > 3000 > 3000

0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

0 6 9 5 7 7 6 6 9 10 7 5 7 7

8 31 30 27 36 32 26 27 36 47 53 71 45 56

Tabla III.2: Anlisis de Maldi-Tof de colonias en funcin del tamao de la colonia. Se muestran tanto el tamao aproximado en nmero de clulas, nmero de microcistinas mayoritarias detectadas (Mc-LR y Mc-YR) y nmero total de posibles microcistinas detectadas. Los resultados obtenidos indican que es posible detectar la presencia de microcistinas en colonias de muy pequeo tamao (entre 20 y 60 clulas) lo que representa a colonias de unos 200 m de dimetro, con las colonias pequeas (20-60 clulas) los resultados obtenidos no fueron homogneos en todo el pocillo de la placa de Maldi-Tof. En este caso, para detectar microcistinas fue necesario bombardear con el lser directamente la colonia (Figura III.3), mientras que no fue posible detectar su presencia al ionizar la matriz en otras zonas de la muestra. Aunque a excepcin de un caso, fue posible identificar la presencia de microcistinas, sin embargo parecen existir ligeras diferencias tanto en el nmero de pptidos totales, que es mayor cuanto mayor es el nmero de clulas que se utilizan para el anlisis, como en la reduccin de la relacin seal/ruido especialmente en la zona con pesos moleculares entre (500 y 800) y finalmente en la intensidad total que presentan los picos detectados (Figura III.4). Cuando analizamos el nmero de picos que aparecen en la muestra y que presentan una masa similar a la de alguna de las microcistinas conocidas segn (Sivonen y Jones 1999), lo que podemos denominar otras posibles microcistinas observamos que no existen diferencias significativas en el nmero de toxinas detectadas entre las colonias de diferentes tamaos, 193

Resultados posiblemente debido a la importante desviacin existente en el nmero de toxinas detectadas en las muestras (Tabla III.2)

Figura III.3. Espectros de Maldi-Tof tpico de las muestras de un tamao de entre 20-60 clulas. A ionizacin de la matriz, B ionizacin directa de la colonia.

194

Resultados

Figura III.4. Espectros de Maldi-Tof tpico de la regin entre 500 y 800 de la relacin m/z. A espectro de la colonia tpica con un tamao entre 500-800 clulas, B espectro de la colonia tpica con un tamao entre 20-60 clulas.

195

Resultados

4.2. Anlisis de Microcistinas por HPLC.

Como ya hemos visto en el ao 2002 se detect microcistina en la fraccin sestnica del embalse de Santillana entre los meses de septiembre y noviembre (ver captulo II). El anlisis en profundidad de los tipos de microcistinas detectadas nos permiti confirmar que no existan grandes diferencias entre los dos puntos de muestreos situados en lados opuestos del embalse: S1 que se analiz en todos los muestreos realizados y S2 que se analiz en cuatro ocasiones, tres en el mes de septiembre y otra en el mes de octubre (momentos en los que la concentracin de cianobacterias fue elevada), salvo para el da 12 de julio en el cual un la presencia de un pico que interfera con la determinacin de la microcistina YR no permiti su correcta deteccin en punto S1, y si en el punto S2.

Figura III.5. Tipos de microcistinas presentes en el embalse de Santillana en el ao 2002 y concentracin de clorofila a. 196

Resultados En todos los momentos analizados de los meses de septiembre a noviembre, salvo en uno de los muestreos, fue posible detectar microcistinas y en aquellos en los que se detectaron estos pptidos, menos en el ultimo muestreo, las concentraciones detectadas fueron superiores a 1 g de microcistinas por litro y se observ un cambio en la variante de microcistinas producida (para mas informacin ver captulo II).

4.3. Especies cianobacterianas planctnicas presentes.

La poblacin de cianobacterias planctnicas del embalse de Santillana durante todo el periodo en el cual fue posible detectar microcistinas estuvo dominado por dos gneros (Figura III.6): Microcystis y Aphanizomenon (para ms informacin referente al resto del ao ver captulo I). En cuatro momentos diferentes, aparte del punto usual de muestreo, se obtuvieron muestras de otro punto situado en el lado opuesto del embalse (S2), con el fin de obtener una visin ms general de lo que estaba ocurriendo en el embalse sin estar influidos por las acumulaciones de cianobacterias producidas por el viento. Durante todo el periodo analizado, excepto el 19 de septiembre en el que Aph. flos-aquae fue mayoritario, M. aeruginosa domin la poblacin de cianobacterias potencialmente txicas llegando a ser la nica cianobacteria planctnica detectada por anlisis microscpico a mediados del mes de septiembre.

Cuando comparamos los datos obtenidos en los dos puntos de muestreo podemos (Figura III.5) observar que no existen grandes diferencias en los tipos de especies encontradas, salvo el da 12 de septiembre en el cual no se detect microcistina YR en el punto S1 y si en el S2, lo que fue debido a un compuesto que present el mismo tiempo de retencin que la McYR en el punto S1 interfiriendo en la determinacin. En cuanto a los porcentajes en los que se encuentran, stos son tambin casi idnticos existiendo pequeas diferencias en una de las fechas analizadas, pero sin que esto afecte a cul es la especie dominante, que en todos los casos fue la misma a ambos lados del embalse, Microcystis aeruginosa.

197

Resultados
S1 2002
6

Distribucin relativa

0
02 02 02 02 02 02 02 02 20 20 20 20 20 20 20 20 9/ 9/ 9/ 9/ 0/ 0/ 0/ 1/ 1/ /1 20 02

/0

/0

/0

/0

/1

/1

/1

/1

M . aeruginosa M . Flos-aquae A ph- flos-aquae

01

06

12

19

03

08

16

05

S2 2002
6

Distribucin relativa

0
02 02 02 02 02 02 02 02 20 20 20 20 20 20 20 20 9/ 9/ 9/ 9/ 0/ 0/ 0/ 1/ 1/ 21 /1 20 02

/0

/0

/0

/0

/1

/1

/1

01

06

12

19

03

08

16

Figura III.6. Especies de cianobacterias planctnicas potencialmente txicas presentes en el embalse de Santillana entre los meses de septiembre y noviembre del ao 2002. La distribucin relativa fue definida como sigue: 0, ausente; 1, < 1%; 2, 1-10%; 3, 1125%; 4, 26-50%; 5, 51-75%; 6, 75-100%.

05

/1

21

198

Resultados

4.4. Relacin entre los tipos de microcistinas observadas y los parmetros ambientales.
Con el fin de estudiar si existe una relacin entre los tipos de microcistinas observadas y los parmetros ambientales se realiz un anlisis de correlacin mltiple entre las concentraciones de microcistinas y diversos parmetros biolgicos y ambientales. Estos ltimos fueron: concentracin de clorofila-a, abundancia de las tres especies de cianobacterias presentes (M. flos-aquae, M. aeruginosa y Aph. flos-aquae), fsforo total, nitrato, nitrito, amonio, nitrgeno inorgnico disuelto, relacin entre fsforo total y nitrgeno inorgnico disuelto, oxgeno disuelto, pH, conductividad, turbidez, temperatura del agua, temperatura media del aire en los ltimos tres y siete das, precipitacin en los ltimos tres y siete das, horas de insolacin y porcentaje de insolacin sobre la mxima terica los ltimos tres y siete das y por ltimo racha de viento mximo en los ltimos tres y siete das. Como entre los datos analizados encontramos tanto parmetros cuantitativos, cualitativos como semicuantitativos se realizaron dos tipos de correlaciones: las variables cuantitativas se correlacionaron mediante el mtodo de Pearson Tabla III.4. y para las correlaciones de los parmetros cualitativos, semicuantitativos y sus interacciones con los parmetros cuantitativos se utiliz el coeficiente de correlacin de Spearman Tabla III.5. En las Tablas III.4. y III.5, podemos observar que la presencia de microcistina total se correlaciona positivamente con la presencia de M. aeruginosa y negativamente con la presencia de M. flos-aquae. En ambos casos los valores de correlacin fueron elevados y significativos. Por otro lado, adems de con estas dos especies de cianobacterias la concentracin total de microcistinas present correlaciones significativas con la relacin fsforo total - nitrgeno inorgnico disuelto y con los tipos de microcistinas LR e YR. En cuanto a la presencia de microcistinas adems de presentar correlaciones con las dos especies de cianobacterias y las variantes de microcistinas, tambin se correlacion positivamente con la turbidez, negativamente con la temperatura y la velocidad media de la racha de viento mximo en los ltimos 7 das. Respecto a como se correlacionaron las diferentes variantes de microcistinas, podemos observar por un lado que la presencia de Mc-LR se correlaciona positivamente con la concentracin de clorofila, la abundancia de M. aeruginosa, con la

199

Resultados turbidez y la media de temperatura atmosfrica en los ltimos 7 das, y negativamente con la presencia de M. flos-aquae. La concentracin de este tipo de microcistina se correlacion sin embargo con el fsforo total y con el pH. La presencia de Mc-RR se encuentra positivamente correlacionada con la concentracin de nitrato, nitrgeno inorgnico disuelto y la abundancia de M. aeruginosa, y negativamente con la mayora de los parmetros atmosfricos analizados y con la presencia de Aph. flos-aquae. La concentracin de Mc-RR estuvo influida positivamente con la concentracin de nitrgeno inorgnico y negativamente por el viento en los anteriores tres das. Finalmente la presencia de la ltima variable mayoritaria encontrada en este embalse, la Mc-YR slo present correlacin con la toxina total y con las variantes YR y LR, mientras que su concentracin estuvo influida por la relacin NID-Ptot.

VARIABLES Clorofila Toxina LR RR YR P-total Nitrato Amonio Nitrito N-inorg. N-inorg/Ptot. Temp. agua pH. Conductividad OD mg. Turbidez Precipitacin( 7 das) Precipitaciones (3 das) Temp. media (7 das) Temp. media (3 das) Media Horas de sol ( 7 das) Media Horas de sol (3 das) % insolacin max. ( 7 das) % insolacin max. (3 das) Media Viento max. (7 das) Media Viento max. (3 das)

Concentracin Mc-total 0,434 0,739 0,108 0,874 0,377 -0,077 -0,464 0,071 -0,226 0,806 0,157 0,516 0,125 0,083 0,456 -0,120 -0,158 -0,033 0,113 0,181 0,229 0,284 0,293 -0,016 0,049

LR 0,815 0,739 0,271 0,374 0,802 0,171 -0,357 0,480 0,107 0,436 0,150 0,546 0,190 0,204 0,562 0,166 -0,154 -0,149 -0,014 0,003 0,198 0,120 0,297 -0,308 -0,272

RR 0,230 0,108 0,271 -0,264 0,155 0,461 0,232 0,161 0,521 -0,270 -0,465 0,097 -0,339 0,021 0,359 0,280 0,351 -0,413 -0,420 -0,383 -0,507 -0,274 -0,467 -0,481 -0,614

YR 0,070 0,874 0,374 -0,264 0,028 -0,345 -0,456 -0,177 -0,505 0,872 0,281 0,387 0,159 0,002 0,246 -0,323 -0,256 0,145 0,272 0,339 0,363 0,382 0,390 0,282 0,364

Tabla III.4: Tabla de correlaciones paramtricas entre la microcistina total y los tipos de microcistinas y los parmetros biolgicos, fsicos y ambientales. Se ha realizado el coeficiente de correlacin de Pearson. En negrita los valores de correlacin que presentan diferencias significativas con un p 0,05. Abun = abundancia. Temp. = temperatura

200

Resultados

Clorofila Presencia toxina Toxina Presencia LR LR Presencia RR RR Presencia YR YR P-total Nitrato Amonio Nitrito N-inorg. N-inorg /Ptot. Abun. M. flos-aquae Abun. M. aeruginosa Abun. Aph. flos-aquae Temp. agua pH. Conductividad OD mg. Turbidez Precipitacin( 7 das) Precipitaciones (3 das) Temp. media (7 das) Temp. media (3 das) Media Horas de sol ( 7 das) Media Horas de sol (3 das) % insolacin max. ( 7 das) % insolacin max. (3 das) Media Viento max. (7 das) Media Viento max. (3 das)

Presencia toxina 0,434 1,000 0,630 0,832 0,630 0,372 0,359 0,509 0,445 0,354 0,308 0,174 0,229 0,330 0,000 -0,786 0,551 0,073 -0,463 -0,154 -0,424 -0,039 0,634 0,018 0,198 -0,679 -0,540 -0,331 -0,192 -0,261 -0,087 -0,540 -0,401

Presencia LR 0,626 0,832 0,757 1,000 0,757 0,447 0,432 0,098 0,535 0,497 0,229 0,000 0,276 0,250 0,078 -0,612 0,662 -0,180 -0,349 0,070 -0,164 0,140 0,624 -0,095 -0,032 -0,628 -0,440 -0,157 0,031 -0,094 0,126 -0,408 -0,377

Presencia RR 0,280 0,372 0,141 0,447 0,197 1,000 0,965 0,920 0,000 0,107 0,672 0,337 0,616 0,700 -0,280 -0,034 0,888 -0,777 -0,818 -0,164 -0,463 0,327 0,244 0,538 0,145 -0,843 -0,843 -0,758 -0,646 -0,758 -0,562 -0,758 -0,786

Presencia YR 0,287 0,424 0,730 0,509 0,427 0,098 0,236 1,000 0,920 0,215 -0,043 -0,246 -0,100 -0,096 0,055 -0,351 0,318 0,071 -0,124 0,186 0,016 -0,031 0,495 -0,428 0,212 -0,206 -0,096 0,206 0,014 0,233 0,014 0,041 -0,123

Tabla III.5: Tabla de correlaciones paramtricas entre la microcistina total y los tipos de microcistinas y los parmetros biolgicos, fsicos y ambientales. Se ha realizado el coeficiente de correlacin de Spearman. En negrita los valores de correlacin que presentan diferencias significativas con un p 0,05. Abun. = abundancia. Temp. = temperatura .

4.5. Anlisis de polimorfismo de fragmentos de restriccin.

En paralelo a la toma de muestras para el anlisis de microcistinas de tomaron muestras para analizar la diversidad del gen mcyB. Cuando analizamos el perfil de fragmentos de restriccin (Figura III.7) podemos observar que existe un cambio brusco en el patrn de fragmentos de restriccin que coincide con el cambio en el tipo de microcistinas producida. 201

Resultados En un primer momento, 6 de septiembre la poblacin estuvo dominada por un tipo del gen mcyB que presenta un fragmento de restriccin similar al que presenta la cepa de M. aeruginosa UAM 247 que produca como microcistinas mayoritarias a Mc-LR y Mc-YR. Tras un pequeo periodo en el que pudo verse la presencia tanto de una parte del gen sin digerir como de otra digerida por la enzima de restriccin, se pas a una situacin final 3 de octubre que estuvo completamente dominada por una variante del gen mcyB que no result digerida y que fue similar a la cepa de M. aeruginosa UAM 245 que present como microcistinas mayoritarias Mc-LR y Mc-RR.

Figura III.7 Anlisis de restriccin del fragmento de mcyB. Calle 1 patrones de peso molecular, calles de 2 a 10 muestras de Santillana por orden 20-8-02, 1-9-02, 6-9-02, 129-02 punto S1 y 12-9-02 punto S2, 19-9-02, 3-10-02, 8-10-02, 16-10-02, 5-11-02, 21-11-02. La calle 12 presenta el fragmento del gen mcyB perteneciente a la cepa M. aeruginosa UAM (245), calle 13 fragmento del gen mcyB de la cepa de M. aeruginosa UAM (247).

202

Resultados

4.6. Tipos de microcistinas presentes en colonias de M. aeruginosa analizadas por Maldi-Tof.

Se realizaron anlisis de Maldi-Tof sobre colonias individuales de Microcystis aeruginosa en dos fechas diferentes en el embalse de Santillana. En un primer anlisis se analizaron 12 colonias recogidas en el muestreo realizado el da 6 de septiembre, posteriormente el da 12 de ese mismo mes se seleccionaron 48 colonias ms. Los resultados obtenidos de los tipos de microcistinas que presentaban (tabla III.6) muestran que la mayor parte de la poblacin del embalse presentaba colonias productoras de las variantes YR y LR, este momento coincide con las semanas anteriores al cambio en las microcistinas mayoritarias producidas lo que indica que existe una gran homogeneidad en los tipos de microcistinas que son producidas en estos momentos. Este valor es muy significativo en el segundo muestreo realizado, donde el nmero de colonias fue mayor lo que permite llegar a conclusiones ms fiables. En total ms del 90% de las colonias analizadas presentaron como principales microcistinas detectadas (aquellas que presentaban una seal ms fuerte en el espectro de masas) las microcistinas YR y LR (en ninguna de estas colonias fue posible identificar ningn in que correspondiera la microcistina RR) siendo en total tres las colonias que presentaron como microcistinas mayoritarias los tipos LR y RR y slo dos las que no presentaron ningn tipo de microcistinas. Cabe destacar que las colonias que presentaron Mc-RR y Mc-LR tambin presentaban una seal pequea perteneciente a la Mc-YR.

Da de muestreo

N de Colonias analizadas

% colonias YR-LR

% colonias RR-LR

% colonias Sin Mc

6-9-2002 12-9-2002 Total

12 48 60

83,3 91,7 90

16,7 2,1 5

0 6,3 5

Tabla III.6: Porcentaje de colonias que presentaron como microcistinas mayoritarias YR-LR, RR-LR o ninguna en el embalse de Santillana, en los muestreos previos al cambio poblacional.

203

Resultados La tcnica de Maldi-Tof no puede considerarse cuantitativa, porque los diferentes compuestos no tienen porque ionizarse con la misma eficiencia, aun teniendo esto en cuenta parece curioso sealar que las relaciones entre la seal del pico perteneciente a la microcistina YR y a la microcistina LR en las colonias en las que estas dos toxinas fueron mayoritarias, se observaron valores muy similares entre el primer y el segundo da con valores de 0,714 0,07 y 0,648 0,08 respectivamente. Desafortunadamente la falta de datos de Maldi-tof despus del cambio cepa productora como ocurre para las variaciones vistas por HPLC.

4.7. Diversidad de las colonias de M. aeruginosa en un afloramiento masivo.

Los estudios de Maldi-Tof, no slo permiten identificar la presencia de productores de microcistinas sino que tambin pueden permitir identificar posible quimio-especies, para ello los espectros de masas obtenidos de las colonias de M. aeruginosa tanto en laboratorio como en campo fueron utilizados para analizar la diversidad de cepas de M. aeruginosa que se presentaron durante el desarrollo del afloramiento analizado. Cuando analizamos el nmero de picos presentes en las muestras estudiadas podemos observar que existen diferencias entre las distintas colonias, diferencias que pueden deberse a una mayor intensidad de la seal, existiendo una correlacin positiva entre la cantidad de picos detectados y la intensidad total de la muestra, a mayor intensidad, se observa un mayor numero de picos (Figura III.7). Por otro lado se podran pensar que el incremento en la intensidad podra ser debido a un mayor tamao de la colonia pero como podemos ver en la (Figura III.7) no existe ninguna correlacin entre el tamao y la intensidad de seal observados. Esta diferencia entre la cantidad de picos observados parece recomendar la realizacin de un anlisis semi-cuantitativo, y no sobre la presencia/ausencia de los diferentes picos, para realizar el rbol de similitudes de las colonias analizadas, en el cual se relativiza la intensidad de cada pico respecto a la intensidad de todos los picos observados en la regin de relacin m/z entre 900 y 1100.

204

Resultados

Log. intensidad vs. N de picos

35

30

y = 12,96 x - 39,99 R2 = 0,67

25

N de Picos

20

15

10

0 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4

Logaritmo de la intensidad total

Log. intensidad vs. log del tamao de picos

5,4

Logaritmo de la intensidad total

5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 4,2

y = 0,3 x + 3 R2 = 0,16

4,4

4,6

4,8

5,0

5,2

5,4

5,6

5,8

6,0

Logaritmo del tamao

Figura III.7. Correlacin entre los picos detectados y la intensidad de seal, y de la intensidad y el tamao. Nmero de picos detectados entre la relacin m/z 900 y 1100 en

las diferentes colonias de campo analizadas y el logaritmo de la intensidad total obtenida en esa regin, y el logaritmo del tamao de la colonia contra el logaritmo de la intensidad total.

205

Resultados Antes de realizar el rbol quimio-taxonmico, y puesto que no existe un consenso acerca de cual es la similitud respecto a los anlisis de Maldi-Tof que presenta una cepa de M.
aeruginosa se realiz un rbol con 14 colonias aisladas de un cultivo monoclonal con el fin de

ver cual podra ser la variabilidad intra-cepa. La Figura III.8 muestra la similitud obtenida, en ella podemos observar la aparicin de tres grandes grupos, uno mayoritario que engloba a 10 colonias que presentan una similitud superior al 89%, otro que slo presentaba una colonia, y un ltimo grupo con las tres ultimas colonias, presentando una homologa de al menos el 71%, curiosamente ninguna de las colonias presentaba homologas del 100% siendo el mximo el 98%.

5 2 8 7 9 13 3 14 11 6 1 12 4 10 0,96 0,91 0,86 0,81 0,76 0,71

Similitud

Figura III.8. Similitud del espectro de masas entre la zona de 900 y 1000 de relacion m/z. Se muestran el grado de similitud segn el coeficiente de correlacin de Pearson

con una aglomeracin de rbol de tipo enlace medio de catorce colonias de una cepa monoclonal de M. aeruginosa

206

Resultados El rbol de quimio-tipos obtenido del anlisis de las colonias de campo (Figura III.9), muestra por un lado que no existen diferencias significativas ni entre los dos das muestreados, ni en los dos puntos del embalse analizados. Esto queda patente porque en los grupos encontrados se mezclan colonias tanto de los dos puntos muestreados, como de los dos das en los que se tomaron muestras. Analizando ms en profundidad este rbol podemos observar cuatro grandes grupos que presentan una homologa de Pearson inferior al 50%, esta separacin es debida fundamentalmente al diferente patrn de presencia de microcistinas, puesto que al ser los picos mayoritarios que solan presentar las colonias, los cambios en ente patrn hace que los grupos que aparecen se diferencian fundamentalmente debido a este patrn de microcistinas. As el grupo mayoritario (lnea negra en la Figura III.9), incluye 51 de las 60 colonias analizadas (90%), presenta como microcistinas mayoritarias la Mc-YR y Mc-LR. El siguiente grupo ms cercano (lnea azul), formado por una sola colonia, tambin se caracteriza por presentar este mismo patrn de microcistinas mayoritarias, pero presenta diferencias importes en otros picos. Los otros dos otros grupos presentan el mismo nmero de colonias tres cada uno (5% del total). El primero (lnea verde) se caracteriza por presentar como tipos de microcistinas mayoritarias la Mc-RR y la Mc-LR. El otro (lnea roja) que presenta el menor valor de homologa, inferior al 10% con el resto de los grupos, se caracteriza por no presentar ninguna microcistina conocida.

La mayor divergencia dentro de estos cuatro grupos se encuentra, como era de esperar, dentro del grupo mayoritario, puesto que al presentar mayor nmero de colonias estadsticamente puede presentar una mayor divergencia dentro del mismo. Dentro de este grupo podemos definir cuatro subgrupos que se caracterizan por presentar una homologa inferior al 70%, dos de ellos engloban un bajo numero de colonias, el grupo A y B (una y dos colonias respectivamente) y los otros, el C y el D, son los que engloban la mayor parte de las colonias pertenecientes a esta rama (39 y 11 colonias respectivamente). Ninguno de los grupos, independientemente del tipo de toxina producida o de su posicin en el rbol, se pudo diferenciar por anlisis microscpico, perteneciendo todas ellas a la especie M. aeruginosa. Tampoco puede observarse ninguna relacin clara entre la intensidad o el nmero de picos y la posicin en el rbol quimio-taxonmico.

207

Resultados

A B

2 52 7 57 54 28 10 5 11 3 40 39 43 25 21 16 50 20 49 42 26 23 45 35 31 13 12 4 1 59 44 6 55 17 27 22 34 48 38 41 46 19 14 18 51 29 15 36 33 30 47 37 32 9 8 24 58 56 53

0,88

0,68

Similitud

0,48

0,28

0,08

Figura III.9. Similitud del espectro de masas entre la zona de 900 y 1000 de relacin m/z. Se muestran el grado de similitud segn el coeficiente de correlacin de Pearson con una aglomeracin de rbol de tipo enlace medio de 60 colonias de campo. Marcado con las letras A, B, C y D los diferentes grupos dentro del grupo mayoritario. Con colores rojo, verde, azul y negro los grupos con menos del 50% de homologa.

208

Discusin

5. Discusin.
Durante muchos aos se ha estado analizando la razn de la existencia de ms de 65 tipos de microcistinas diferentes. Desde un principio se investig a cerca de la causa de esta diversidad qumica que este tipo de compuestos presentaban y en estos ltimos aos se ha identificado los genes responsables de la sntesis de este tipo de compuestos ((Rouhiainen y col., 2004) ; (Christiansen y col., 2003) y (Tillett y col., 2000)). Cuando se ha intentado explicar esta diversidad en funcin de la secuencia gentica de los mdulos de adenilacin, no se ha encontrado una correlacin una correspondencia directa entre el aminocido incorporado y el que resulta de la prediccin que se realiza en funcin de la secuencia aminoacidica que presenta el dominio de adenilacin (Kurmayer y col., 2002), de manera que la diversidad seria explicada por la plasticidad cataltica de las enzimas que son responsables de la sntesis de microcistinas ((Dittmann y col., 1997); (Nishizawa y col., 2000) y (Tillett y col., 2000)). Aunque Mikalsen y col., 2003 mostraron posteriormente que exista cierta correlacin entre la estructura primara del mdulo de adenilacin y el tipo de microcistina producida, mostrando que las cepas de Microcystis que poseen en el primer modulo de adenilacin al que llamaron
mcy, similar al mcy C, produca el tipo de microcistina RR y sus variantes.

Durante el periodo en el cual fue posible detectar microcistinas slo se detectaron tres especies de cianobacterias planctnicas potencialmente txicas, aunque slo una de ellas coincidi temporalmente con el periodo en el que las toxinas pudieron detectarse. Esta coincidencia temporal refuerza la idea de que esta cianobacteria M. aeruginosa fue la principal fuente de microcistinas. Aunque no es posible identificar microscpicamente las cepas de Microcystis que son capaces de producir microcistinas, s se han establecido porcentajes, bastante similares en varios lugares del mundo, de cepas de cada especie que presentan toxicidad, por ejemplo entre el 72% y ms del 98% de colonias de M. aeruginosa presentan microcistina, o poseen alguno de los genes necesarios para su sntesis ((Fastner y col., 2001): (Via-Ordorika y col., 2004) y (Wilson y col., 2005)). Por otro lado, las otras dos especies presentes durante este periodo Aph. flos-aquae, y M. flos-aquae parecen tener una menor relevancia en la produccin de microcistinas. Aph. flos-aquae, aunque lleg a ser muy abundante durante la primera parte del periodo en el que las microcistinas fueron detectadas, presenta muy baja probabilidad de producir microcistinas, slo se ha encontrado una 209

Discusin referencia en el que esta especie sea definida como productora de hepatotoxinas (Oliver 1994), y en esa ocasin no se pudo confirmar sin lugar a dudas que esta fuera la especie productora. Por otro lado se hicieron anlisis de Maldi-Tof de algunas de las colonias del embalse de Santillana y de otros embalses y en ninguno de los casos fue posible detectar microcistinas (datos no mostrados). Por ltimo se han detectado en mltiples ocasiones cepas de M. flos-aquae productoras de microcistinas, aunque estadsticamente la probabilidad de presentar microcistinas es menor puesto que el porcentaje es inferior al 50% (Via-Ordorika y col., 2004). Adems nicamente aparece en los dos ltimos muestreos del ao y en una proporcin menor del 10%, coincidiendo con M. aeruginosa que fue dominante en esos momentos. Todos estos datos parecen favorecer la hiptesis de que la especie fundamentalmente la responsable de la produccin de microcistinas en el embalse de Santillana fue M. aeruginosa. En principio el cambio en la especie qumica que se produjo en el embalse de Santillana poda tener dos posibles causas, poda deberse a un cambio de cepa dentro de la especie mayoritaria que acarreara un cambio en los tipos de microcistinas producidas, o que ese cambio se debiera a la plasticidad cataltica de las enzimas que sintetizan las microcistinas y por lo tanto, el cambio del patrn de microcistinas no se correlacionara con un cambio en los genes que sintetizan las microcistinas, en especial el gen mcy B, cuyo segundo mdulo de incorporacin es el encargado de catalizar la introduccin del primer aminocido variable (Tillett y col., 2000) que es el que vari entre las dos microcistinas. Como ya hemos comentado con anterioridad, no existe unanimidad acerca de si la secuencia primaria de aminocidos se correlaciona con los tipos de microcistinas que produce una cepa. En el embalse de Santillana podemos ver que existe una correspondencia entre el tipo de alelo del gen mcy B que presenta la cepa mayoritaria en el embalse y la microcistina producida. Siendo este patrn similar al encontrado en los dos controles, los cuales provienen de una cepa aislada del mismo embalse, y que produce mayoritariamente las microcistinas LR y RR (consiste en la banda sin digerir), y de la cepa que produce mayoritariamente las microcistinas LR e YR (cepa que resulta digerida en al menos dos bandas). Estos dos genotipos coinciden con los tipos V y I descritos por (Kurmayer y col., 2002). El tipo I coincide exactamente en los dos casos produciendo como microcistinas los tipos YR y LR y no siendo posible detectar la variante RR. En el caso de la variante V descrita por (Kurmayer y col., 2002) encontraron 5

210

Discusin colonias que se correspondan a esta variante, cuatro de las colonias aisladas producan microcistina LR y RR, y de estas cuatro colonias dos de ellas tambin presentaban microcistina YR, la ultima colonia perteneciente a esta variante slo presentaba variantes de microcistina RR y LR desmetilada. Bajo estas premisas nos encontramos que en el caso de la variedad V del gen mcy B presentaban una mayor inespecificidad en cuanto al aminocido activado que la que presentaba la variedad tipo I. Algo muy parecido se observa en las colonias encontradas en el embalse de Santillana, si consideramos que las colonias que presentaban como mayoritarias las microcistinas LR, e YR, no presentaba microcistina RR, y por tanto deberan presentar el alelo tipo I del gen mcy B. Mientras que las colonias que presentaban como microcistinas mayoritarias RR y LR se caracterizaron por presentar un mayor nmero de microcistinas minoritarias, entre ellas la microcistina YR (datos no mostrados), deberan pues poseer el alelo tipo V del gen mcy B. As pues en el caso del embalse de Santillana podemos observar que existe una clara correspondencia entre los tipos de microcistinas mayoritarios y el alelo que se presentaba en cada uno de los casos durante todo el periodo de muestreo, como ha defendido (Mikalsen y col., 2003). La idea que proponemos es que la secuencia de los genes mcy indican cual es el sustrato preferente que las enzimas presentan, as dependiendo de ella se producirn unos tipos mayoritarios u otros, adems indicaran cual es la especificidad que presentan las enzimas a los distintos aminocidos, y posiblemente las condiciones medioambientales pueden actuar sobre esa flexibilidad en reconocer el sustrato modificando los tipos de microcistinas producidos. En condiciones de cambios ambientales extremos podra cambiar por completo el patrn de microcistinas que una cepa puede producir. No podemos olvidar que la existencia de recombinacin dentro de los genes mcy (Tanabe y col., 2004) aumenta la diversidad que este gen puede presentar y por tanto el poder de generar nuevas variantes de los genes mcy, y esto cambiar el patrn de microcistinas producidas por un cultivo o en una muestra de campo. La quimiotaxonoma se ha utilizado para la distincin de cepas cianobacterianas (Kansiz y col., 1999) y se ha propuesto su utilizacin en cianobacterias planctnicas potencialmente txicas (Fastner y col., 2001). Recientemente se ha realizado un anlisis de quimiotipos dentro del genero Microcystis (Welker y col., 2004) en el que se utilizaron los pptidos encontrados y el anlisis de componentes principales, para separar las colonias analizadas, y concluy que las diferentes morfoespecies de Microcystis no se agrupaban

211

Discusin utilizando esta metodologa. Adems concluy que M. aeruginosa era no solo el principal productor de microcistinas, si no que adems estos eran una de las causas fundamentales en la separacin de los diferentes grupos encontrados dentro de esta morfoespecie. Por todo ello nosotros hemos asumido una serie de condiciones previas antes de realizar el estudio quimiotaxnomico. As decidimos limitar el rango utilizado para el anlisis quimiotaxonmico a la regin comprendida entre 900, y 1100 m/z donde se encuentran fundamentalmente dos grandes grupos de pptidos: Las cianopeptolinas, y las microcistinas (Welker y Von Dohren 2006), aunque consideramos que al analizar solo una morfoespecie cianobacteriana, M. aeruginosa, nos daba suficiente capacidad para discriminar entre los diferentes quimiotipos. Por otro lado, las diferencias en el nmero de picos, y su correlacin con la intensidad total que stas presentaban recomendaban realizar una normalizacin a la intensidad total obtenida en la zona de trabajo, y no recomendaban la utilizacin de la presencia o ausencia de los picos para realizar el anlisis de similitud con las colonias seleccionadas. Esta intensidad no depende del tamao de la colonia, sta por lo tanto depender probablemente de la extraccin que realiza la matriz, que al tratarse de una extraccin in-situ, sin realizar ninguna ruptura celular ni homogenizacin de la muestra, puede no ser suficiente para realizar una extraccin perfecta de los pptidos. Esto hace recomendar que en posteriores trabajos, se realicen los anlisis, no en funcin del numero de disparos del lser, como se realiz en los trabajos iniciales, (Fastner y col., 2001), (Welker y col., 2003), si no en funcin de la intensidad del pico mximo como recomienda (Welker y col., 2006), o probablemente sera ms interesante realizar todos los anlisis de Maldi-Tof igualando la intensidad total recogida. Puesto que segn los datos obtenidos permitira definir un valor limite de 70000 unidades de intensidad como el adecuado. Dado la poca bibliografa existente sobre quimiotaxonoma de cianobacterias, no existe ningn valor de similitud del espectro de masas a partir del cual consideramos que estamos ante dos cepas diferentes, valor que existe cuando trabajamos con secuencias genticas (Rossello-Mora y Amann 2001). Puesto que el metabolismo es modulable, cosa que no ocurre con las secuencias genticas, deberamos encontrar en principio una mayor diversidad en la similitud que presenta el mismo quimiotipo que el que presentan las

212

Discusin secuencias genticas. Para obtener una idea de cual sera el valor de diversidad a partir del cual podemos considerar que nos encontramos con una cepa diferente, se seleccionaron colonias de diferente tamao similar a las que podemos encontrar en el campo para realizar ese mismo anlisis quimiotaxonmico, primero cabe destacar que ninguno de los clones analizados presentaba una similitud del 100% en los espectros de masas lo que sera prueba de que la diversidad metablica es mucho mayor que la gentica. El valor mnimo de similitud entre todas ellas fue 71. A pesar de que no existen todava datos suficientes para establecer con certeza cual podra ser el valor a partir del cual podemos diferenciar las cepas de cianobacterias, hemos considerado que el valor limite que define un mismo quimiotipo podra ser del 70% de similitud. Con este valor de similitud como lmite de corte entre cepas diferentes, podemos definir siete cepas de la misma especie formando parte del afloramiento durante el primera fase del mismo (hasta el 12 de septiembre), pero dos de ellas representaban ms del 83% de las colonias, y las otras seis cepas restantes el 17% restante, representando una de ellas como mximo el 5% de las colonias encontradas. Esto indica en este embalse que al menos durante el afloramiento que tuvo lugar entre los das 5 y 12 de septiembre hubo una diversidad elevada (pudieron encontrase 7 cepas quimiotaxonmicamente diferenciadas), pero slo dos de ellas presentaron mas del 80% de la poblacin. Los trabajos publicados sobre la diversidad gentica de cianobacterias del gnero Microcystis se han realizado sobre todo con muestras de mltiples embalses, o en sistemas geogrficamente grandes como el mar Bltico ((Wilson y col., 2005); (Laamanen y col., 2002); (Laamanen y col., 2001); (Yoshida y col., 2005) ; (Welker y col., 2004) y (Kim y col., 2006)). Nuestros datos indican por un lado que existe una alta diversidad dentro de la especie M. aeruginosa, lo que esta deacuerdo con los datos obtenidos por (Wilson y col., 2005)que encontr una elevada diversidad siendo sta incluso mas importante dentro de un embalse que entre embalses. Aunque esta no es la nica situacin posible, puesto que otros autores han encontrado que la diversidad en un afloramiento de cianobacterias puede ser pequea como ocurre dentro de la especie Aph. flosaquae que puede encontrase en mar bltico (Laamanen y col., 2002). Esta diferencia entre

estos dos ambientes pude deberse a que las condiciones ambientales que el mar Bltico presenta extrema para esta Aphanizomenon, de manera que solo pocas de las cepas de esta especie son capaces de sobrevivir en este ambiente.

213

Discusin No existen datos de diversidad de M. aeruginosa en afloramientos donde slo se encuentra esta especie de Microcystis. En este momento y segn los datos existentes en la bibliografa, parece que an conservando una elevada diversidad (nos encontramos 7 variantes diferentes) la mayor parte de la biomasa parece dominada por slo dos de ellos, en el articulo de (Wilson y col., 2005) basado en el aislamiento de diferentes cepas de M. aeruginosa en diferentes embalses, donde se analizaron 67 cepas aisladas, el 79 % de ellas fueron diferentes. En el embalse de Santillana por otro lado mostr una menor variabilidad, en dos momentos puntuales se analizaron 60 colonias, estas pueden dividirse en 7 grupos diferentes y el 83% de ellas pertenecen a dos nicos quimiotipos. La posible explicacin de esta baja diversidad encontrada puede explicarse por un lado si consideramos que cuando se analiza un afloramiento, debera esperarse encontrar como mayoritarias las cepas que mejor se adapten a las condiciones ambientales que se encuentran en ese momento determinado en que aparece el afloramiento, encontrndose el resto de cepas que son capaces de crecer mejor en otras condiciones como minoritarias. Esto explicara, como ya hemos comentado con anterioridad, el cambio de tipos de microcistinas mayoritarios. Las correlaciones de los tipos de microcistinas producidas parecen indicar que la cepa que producen microcistinas YR/LR se encuentran favorecidas si la relacin nitrgeno inorgnico disuelto fsforo total ms elevado, mientras que la cepa que son capaces de producir RR/LR se encuentran principalmente favorecidas por altas concentraciones de nitrgeno inorgnico total, en especial por las concentraciones de nitrato, aunque no se han realizado aislamientos de estos organismo que puedan confirmarlo. Cabe destacar que el tipo de microcistina RR, requiere mayor cantidad de nitrgeno que el tipo YR, lo que podra ayudar a explicar este cambio de cepa mayoritaria. Tambin podemos observar que el anlisis del gen mcy B nos permite detectar una menor diversidad (dos variantes principales) que la determinada por Maldi-tof , al igual que ocurra en estudios genticos (Wilsony col., 2005), esto se apoya con los datos encontrados por Maldi-tof, e indica que los genes son relativamente poco variables dentro de la poblacin de mcy dentro de M. aeruginosa. Otras correlaciones interesantes son por ejemplo las correlaciones negativas de los parmetros atmosfricos con la presencia de Mc-RR, que podran mostrar como ante un empeoramiento de las condiciones (temperatura, viento e insolacin) la poblacin de cianobacterias va disminuyendo y la Mc-RR (que aparece cuando las condiciones empiezan

214

Discusin empeorar, principios del otoo) es la que mejor muestra el efecto de estos factores. Por otro lado, la Mc-LR se correlaciona con la presencia de fsforo total, lo que indicara que a mayor biomasa (mayor cantidad de fsforo total) la concentracin de la toxina mayoritaria es mayor. Respecto a la precipitacin ya ha quedado demostrado que la precipitacin puede favorecer el crecimiento de Microcystis si aportan nutrientes (Oh y col., 2001). En cuanto a los organismos presentes y la correlacin con la microcistina, parece claro que, como cabra esperar, que el productor fundamental es M. aeruginosa el cual parece que es la nica cepa productora de microcistinas en este embalse durante este afloramiento. Estos cambios en la cepa mayoritaria ocurrieron en periodos cortos de tiempo. Desde el da 19 de septiembre, en el cual nos encontramos los dos tipos de genes mcy B, hasta el da 3 de octubre se produjo un crecimiento masivo de Microcystis y un cambio de cepa dominante. Teniendo en cuenta que un 25% de la clorofila del da 19 fue debida a las cepas que encontramos el da 19 (tenemos aproximadamente el 50% de la biomasa de cianobacterias dominada por Microcystis, y de esta parte el 50% a las cepas productoras de los tipos LR/RR), y que en el da 3 de octubre el 90% de la biomasa se debe a Microcystis y que slo parecen encontrarse la cepa/cepas productoras de los tipos LR/RR, nos encontramos que la concentracin de clorofila de esta cepa/cepas productoras en el embalse vari de 4,25 g Chl a L-1 a 91,2 g Chl a L-1 lo que supone un incremento de 21 veces en la concentracin en tan solo 14 das, esto implicara que esta cepa presentara un tiempo de generacin de menos de dos das, inferior a los publicados por (Reynolds y col., 1981) que fueron de entre cinco das y una semana. Esto indicara que durante la fase exponencial del desarrollo de un afloramiento nos encontraramos con tasa de crecimiento similares a las que presentan las algas verdes y las diatomeas, y que por lo tanto estas cianobacterias no pueden considerarse organismos de crecimiento lento. Naturalmente existen otras posibilidades, entre ellas la mas plausible podra ser el reclutamiento de un tipo de cepa que posteriormente desplaz al otro tipo de cepas que se encontraba en franco deterioro decay, pero los valores similares en cuanto a tipo de organismos encontrados en las dos orillas que habla de la homogeneidad que ocurra en le embalse que apoyara la idea de cambio en el tipo de cepas encontradas, mas que el reclutamiento de una cepa diferente.

215

CAPITULO IV

CAPTULO IV

216

Introduccin

Anatoxinas en Embalses Espaoles

1. Introduccin
Entre los compuestos que pueden ser producidos por el metabolismo secundario de las cianobacterias, se encuentra una familia heterognea de compuestos que han sido agrupados por el efecto que presentan sobre los mamferos, su capacidad neurotxica. Qumicamente hablando, estos compuestos neurotxicos se pueden dividir en tres familias diferentes:

Las saxitoxinas. Las neurotoxinas ms estudiadas, que son producidas tanto por las cianobacterias como por los dinoflagelados (causantes de las mareas rojas). La anatoxina-a y variantes. Producidas nicamente por cianobacterias. Se han descrito dos tipos principales la anatoxina-a y su principal variante qumica la homoanatoxina-a, Anatoxina-a(s) un organofosforado natural qumicamente diferente a la anatoxina-a.

En ambientes acuticos de agua dulce las neurotoxinas de cianobacterias ms estudiadas son las anatoxinas. La anatoxina-a es la primera toxina producida por cianobacterias que fue definida qumica y funcionalmente (Carmichael 1997). A pesar de esto llama la atencin la baja cantidad de trabajos publicados sobre dicha toxina cuando los comparamos con los publicados acerca de otro grupo de toxinas de cianobacterias, las microcistinas. El desconocimiento que existe en la actualidad sobre la prevalencia e importancia de esta toxina, hace que en la actualidad no se haya establecido un valor gua en ningn pas de la Unin Europea, ni existe obligacin de analizar su presencia ni en aguas de bebida ni de bao, ni siquiera cuando las cianobacterias dominan la poblacin fitoplanctnica.

217

Introduccin

1.1. Estructura qumica de la anatoxina-a y biosntesis.

La anatoxina-a es un alcaloide de pequeo tamao (p.m. = 165), qumicamente es una amina secundaria bicclica ((2-acetil-9-azabiciclo[4.2.1]-non-2,3-ene) (Figura VI.1). Aparte de esta toxina dentro del grupo de las anatoxinas, suelen incluirse otros dos compuestos. Uno de ellos es una variante qumica de la anatoxina-a, la homoanatoxina-a, un compuesto muy similar que slo se diferencia por la existencia de un grupo propionil en lugar de un grupo acetil en el carbono-2 (Figura IV.1). El otro compuesto es la anatoxina-a(s) que al ser tan diferente qumicamente hablando nos ha parecido correcto separarlo en un grupo de toxina diferente, y no nos vamos a referir a l en este captulo.

+
NH2

CH3

+
NH2

CH2 CH3

Figura IV.1: Estructura qumica de la anatoxina-a y la variante homoanatoxina-a. Extrado de Sivonen y Jones 1999

Estructuralmente la anatoxina-a est relacionada con los alcaloides de la clase de los tropanos, entre los que se encuentra la cocana (Hemscheidt y col., 1995) si bien el anillo es ligeramente diferente al encontrado en plantas vasculares (con siete carbonos en lugar de ocho) (Moore 1999). Son slo dos los trabajos publicados acerca de la posible va biosinttica de la anatoxina-a. En ellos se establecen dos posibles vas de sntesis. El primero de los estudios se realiz utilizando
14

C (Gallon y col., 1994) y

defiende que el anillo de pirrolidina que poseen tanto la anatoxina-a como la homoanatoxina-a siguen la misma ruta que la descrita en plantas superiores para la produccin de la familia de alcaloides tropanos. El segundo, publicado con

218

Introduccin posterioridad, utilizando metodologas ms finas (13C y resonancia magntica nuclear) (Hemscheidt y col., 1995) defiende que los datos obtenidos son incompatibles con la va de sntesis propuesta por (Gallon y col., 1994), al indicar los datos experimentales que el C-1 del aminocido iniciador de la sntesis (ellos postulan que se trata del glutmicosemialdehido) se mantiene en la molcula final (Figura IV.2). Este mantenimiento del primer carbono sera incompatible con la otra va de sntesis propuesta por (Gallon y col., 1994).
+

H CO2H HO2C NH2

CHO HO2C NH2

+ N H

3 Ac CoA
CO2H
HO2C

N H

SAM
H
+

O + N H + N H

Anatoxina-a

Homoanatoxina-a

Figura IV.2: Posible ruta biosinttica de la anatoxina-a y la variante homoanatoxina-a. SAM = S-adenosilmetionina, Ac CoA = Acetil-Coenzima A. Extrado de Hemscheidt y col., 1995.

219

Introduccin En cuanto a cuales podran ser las actividades enzimticas implicadas en la sntesis de anatoxina-a no existen datos concluyentes, slo un artculo (Gallon y col., 1994) se ha publicado acerca de posibles de actividades enzimticas implicadas en su sntesis. En este artculo se indica que los genes responsables de la sntesis de anatoxina-a no se localizaran en el cromosoma, si no en un plsmido (la modificacin de un plsmido que pasa de 10 a 6,5 Kb da lugar a la prdida de la capacidad de produccin de anatoxina-a), si bien falta cualquier confirmacin posterior acerca de esta localizacin plasmdica, Aparte de esta posibilidad tambin se indica que las siguientes actividades enzimticas podran estar relacionadas con la sntesis (Gallon y col., 1994) : Arginina descarboxilasa. Ornitina descarboxilasa. Diamina oxidasa. Las dos primeras actividades seran responsables de la sntesis de putrescina y la siguiente de ciclar la putrescina y transformarla en 1- pirrolina, que sera posteriormente transformada en anatoxina-a. Esta ruta de sntesis fue posteriormente invalidada por (Hemscheidt y col., 1995), lo que pone en duda los datos obtenidos en este trabajo, y por lo tanto dificulta el concluir nada acerca de las enzimas responsables de la sntesis de anatoxina-a.

1.2. Organismos productores.

Las cianobacterias son los nicos organismos productores de anatoxina-a y homoanatoxina-a, si bien dentro de ese filum slo se han detectado especies capaces de producirlas en unos pocos gneros. Estos gneros para los cuales se han detectado especies productoras son: Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Cylindrospermum, Planktothrix y Raphidiopsis (Codd y col., 2005b) (Figura IV.3). Este tipo de toxinas han sido detectadas tanto en muestras naturales dominadas por alguno de estos gneros definidos como productores, como mediante el aislamiento de cepas de cianobacterias productoras para todos ellos. Cuando analizamos el numero de especies aisladas que son capaces de producir anatoxina-a u homoanatoxina-a, observamos que slo se han publicado la existencia de 220

Introduccin diez cepas de las cuales ocho de ellas estn caracterizadas a nivel de especie y las restantes a nivel de gnero, siendo estas ltimas Oscillatoria sp. cepa 193 (PCC 9240), (Araoz y col., 2005), y Cylindrospermum sp. (Sivonen y col., 1989). Entre las caracterizadas a nivel de especie nos encontramos, Oscillatoria formosa NIVA CYA-92 (PCC 10111) (Araoz y col., 2005), Planktothrix rubescens (Viaggiu y col., 2004b; Viaggiu y col., 2004b), Anabaena flos-aquae (Carmichael y col., 1979), Phormidium favosum (Mikalsen y col., 2003), Raphidiopsis mediterranea (Namikoshi y col., 2003), Anabaena planktonica (Bruno y col., 1994b), Aphanizomenon flos-aque (Rapala y col., 1993) y Aphanizomenon issastchencoi (Wood y col. 2007). El nmero de cepas aisladas es muy bajo, especialmente cuando lo comparamos con las cepas aisladas productoras de microcistinas. Esta falta de datos hace difcil establecer de manera fiable cules son las especies potencialmente productoras de anatoxinas dentro de estos gneros.

Figura IV.3: Gneros cianobacterianos productores de anatoxina. A=Cylindrospermum, B=Oscillatoria, C=Planktothrix, D=Anabaena,

E=Aphanizomenon y F=Raphidiopsis. Extrado de Geitler 1932.

Otra dificultad aadida al establecimiento de las posibles especies productoras viene dada por la similitud que presentan, en especial los gneros Anabaena y Aphanizomenon. Las diferencias entre estos dos gneros, y sobre todo entre las especies que los forman no estn nada claras. Estudios filognicos han mostrado que las especies

221

Introduccin pertenecientes a ambos gneros estn mezclados cuando se realiza un rbol filogentico (Rajaniemi y col., 2005). En este trabajo se demuestra que las especies de Aphanizomenon y las de Anabaena planctnicas forman un nico genero, y que en todas las posibles especies definidas en funcin de la similitud del 16S (Stackebrandt y Goebel 1994), nos encontramos morfotipos pertenecientes a Aphanizomenon y a Anabaena simultneamente. Esto refuerza la idea sobre la dificultad de definir cules son las especies potencialmente productoras de anatoxina, al dificultar en muchas ocasiones la variabilidad morfolgica que estos organismos presentan la correcta identificacin microscpica del organismo responsable a nivel de especie.

1.3. Toxicidad de las anatoxinas.

El mecanismo de accin se basa en que son agonistas colinrgicos, es decir, son capaces de unirse a los receptores nicotnicos de acetilcolina lo que activa el impulso nervioso. Adems este tipo de compuestos presenta una elevada afinidad (mayor que la acetilcolina) por estos receptores, esto evita que la toxina sea liberada y desplazada del tejido. Esto ltimo, junto con la resistencia que presentan a la accin de las acetilcolinesterasas, aumenta el efecto que presentan. El resultado de esta activacin del impulso nervioso por un lado y la incapacidad posteriormente de desactivarse, produce una despolarizacin local que abre los canales de Ca2+ y Na+ dependientes de voltaje. Como resultado de esta estimulacin persistente se produce una inhibicin de cualquier impulso nervioso posterior, produciendo una parlisis muscular. Esta parlisis muscular es la responsable en mamferos de la muerte por fallo respiratorio. Adems, esta inhibicin es muy rpida (tras la inyeccin intraperitoneal de una dosis letal la muerte ocurre antes de transcurrir 30 minutos), por tanto antes de identificar la naturaleza qumica del compuesto, y debido a esta rapidez con la que ocurra la muerte fue conocido como VFDF, Very Fast Death Factor, factor de muerte muy rpido (Fawell y col., 1999). De hecho en ensayos con muestras que presentaban elevadas concentraciones de anatoxina-a la muerte de los ratones inyectados intraperitonealmente (i.p) ocurri en un intervalo de tiempo de entre 2 y 19 minutos (Sivonen y col., 1989).

222

Introduccin Cuando analizamos las dosis letales 50, observamos que los dos compuestos, la anatoxina-a y la homoanatoxina, presentan valores muy similares con DL50 de 200 y 250 g Kg-1 respectivamente, para inyecciones i.p. (Briand y col., 2003). Esta toxicidad se ve aumentada cuando la inyeccin se realiza de manera intravenosa, de esta manera la anatoxina-a presenta valores de DL50 menores de 100 g Kg-1 (Fawell y col., 1999). Finalmente, es importante destacar que los valores de DL50 para una ruta de exposicin por va oral son entre uno y dos ordenes de magnitud superiores a los intraperitoneales (entre 2000, y 20000 g Kg-1), encontrndonos con un periodo de latencia despus de la administracin seguida por los sntomas de intoxicacin. La muerte del organismo expuesto a este tipo de toxinas, puede evitarse con ventilacin mecnica, pero cuando sta se elimina, incluso despus de elevados periodos de tiempo tras la exposicin de la toxina el organismo muere. Esta persistencia del compuesto indicara que la inhibicin que se observa es irreversible (Fawell y col., 1999). Respecto a los efectos sobre el desarrollo, no se han observado efectos teratognicos, es decir no se han observado daos sobre fetos o embriones, a concentraciones inferiores a 2,46 mg kg-1, y tampoco se han observado efectos de carcinogenicos a dosis subletales despus de 28 das de exposicin (Fawell y col., 1999).

1.4. Anatoxinas en el ecosistema.

Comparado con la que se sabe acerca de las microcistinas y cul es el efecto que presentan en el ecosistema, se sabe muy poco acerca de este otro grupo de toxinas cianobacterianas. Se conoce cul es su efecto sobre mamferos y aves, sobre los cuales actan como inhibidores del impulso nervioso, pero se conoce muy poco acerca del modo en que acta sobre otros organismos presentes en el ecosistema, como algas y zooplancton, en el cual las cianobacterias planctnicas suelen encontrarse.

Hay muy pocos trabajos publicados, sobre el efecto de las anatoxinas en organismos fotosintticos, reducindose los artculos publicados en revistas internacionales a dos trabajos principales ((Mitrovic y col., 2004) y (Kearns y Hunter 2001)). En el primero de ellos muestran que la anatoxina-a afecta a la fotosntesis de Lemna minor. Adems observan que afecta a otras actividades enzimticas como son la

223

Introduccin actividad peroxidasa y glutation-S-transfererasa implicadas en la detoxificacin, tanto de compuestos exgenos como en la respuesta a stress oxidativo. Este efecto se observ tanto en Lemna minor como en el microalga filamentosa Chladophora fracta. Un punto a tener en cuenta acerca de este trabajo, son las altas concentraciones de anatoxina necesarias para observar los efectos descritos, en el rango de mg L-1, concentraciones que los propios autores reconocen como muy elevadas y que no han sido descritas en los embalses y lagos en los que se ha detectado la presencia de este compuesto. El otro trabajo es ecolgicamente ms significativo al implicar a una alga verde, Chlamydomonas reinhardtii, que puede entrar en competencia directa con las cianobacterias, e indica que su movilidad se ve limitada por la anatoxina-a. Esta imposibilidad de moverse produce el asentamiento del cultivo, lo que podra resultar en una ventaja evolutiva para las cianobacterias productoras de este tipo de compuestos, al tener menor competencia por la luz y los nutrientes.

El efecto de la anatoxina-a sobre el zooplancton esta ms estudiado que su efecto sobre plantas y organismos fotosintticos acuticos. Esto podra ser debido a la idea que se tiene de este tipo los compuestos txicos producidos por las cianobacterias como mecanismo de defensa contra la depredacin ((Reinikainen y col., 2002); (Claska y Gilbert 1998); (Gilbert 1996a); (Gilbert 1996b) y (Gilbert 1994)). De cualquier manera los efectos que las anatoxinas presentan sobre los animales no han sido estudiados tan en profundidad como los de las microcistinas (ver Capitulo II).(Kearns y Hunter 2001)

Se ha analizado el efecto que esta toxina presenta sobre los tres grandes grupos de zooplancton. Los primeros organismos estudiados fueron los rotferos, que mostraron ser sensibles tanto a anatoxina-a soluble como a cianobacterias productoras pero no a filtrado de los cultivos (la anatoxina-a no se excreta, y se define como endotoxina) (Gilbert 1994), si bien las diferentes especies analizadas presentaron diferente sensibilidad como ocurre con el efecto de las microcistinas (ver Capitulo II). Tambin se ha estudiado el efecto de la anatoxina en cladceros (Daphnia pulex) (Claska y Gilbert 1998) y en coppodos (Reinikainen y col., 2002), a quienes afecta tanto a su capacidad de reproduccin como a su supervivencia.

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Introduccin Probablemente son los pjaros y los mamferos, los animales sobre los cuales los efectos de la anatoxina han sido mas evidentes, encontrndose muertes de mamferos (Edwards y col., 1992) y de aves despus de haber ingerido agua contaminada con estos compuestos. Por ejemplo, muerte masivas de flamencos asociadas a este tipo de compuestos se han publicado recientemente (Krienitz y col., 2003).

1.5. Legislacin.
El desconocimiento general que existe acerca de la importancia de la anatoxinaa en los ecosistemas de agua dulce, explica la falta de legislacin al respecto de su presencia en la mayor parte de los tanto en aguas de bao o de consumo. Hasta el momento slo un pas en el mundo, Nueva Zelanda, posee un valor gua provisional para esta toxina establecido para aguas de bebida de 6 g L-1 y de 2 g L-1 para homonatoxina-a (Kouzminov 2005). La legislacin neozelandesa tambin indica cul debera ser el mtodo de medida recomendado, en este caso HPLC-MS. En Espaa, como en el resto de pases, no existe ninguna legislacin que obligue a determinar la presencia de esta toxina ni su concentracin cuando hay cianobacterias productoras presentes.

Parte de los muestreos realizados en los embalses situados fuera de la comunidad de Madrid, as como el anlisis taxonmico de las cianobacterias que en ellos se encontraban han sido realizados por personal del Centro de estudios hidrogrficos del CEDEX.

225

Objetivos

2. Objetivos
Dada la elevada proporcin de muestras que presentan cianobacterias potencialmente productoras de anatoxina-a en embalses espaoles, los objetivos de este captulo son:

Analizar la presencia y prevalencia de anatoxinas en embalses espaoles, as como analizar las concentraciones a las que se presentan dichos compuestos Identificar cules son los posibles organismos productores de estos compuestos en cada embalse analizado. Identificar qu embalses dentro de los analizados, muestran una mayor probabilidad de presentar este tipo de compuestos. Establecer un periodo de mxima probabilidad de aparicin de estas toxinas en Espaa.

226

Materiales y Mtodos

3. Materiales y Mtodos.

3.1. Zona de Estudio.

La zona de estudio incluye los embalses de Lozoya, Ro Sequillo, El Velln, Santillana, Valmayor, San Juan y Picadas descritos ya en el captulo I. Adems se incluyeron otros tres situados en la Comunidad de Madrid en los cuales se realiz un estudio espordico, los embalses de El Atazar, del Villar y de Puentes Viejas y cinco embalses situados fuera de la regin de Madrid: los embalses de Arcos (situado en la cuenca del Guadalquivir), Zujar (cuenca del Guadiana), Cazalegas y Rosarito (Cuenca del Tajo) y Cuerda del Pozo (Cuenca del Duero).

3.1.1. Embalse de Arcos.

El embalse de Arcos se encuentra situado en la provincia de Cdiz, en el trmino municipal de Arcos de la Frontera (Figura IV.4). Recibe aguas del ro Guadalete, y su cuenca esta dominada por areniscas calcreas, encontrndose en la cuenca tambin una zona importante dominada por rocas metamrficas, concretamente gneiss.

Figura IV.4: Situacin del embalse de Arcos.

227

Materiales y Mtodos

En la Tabla IV.1 podemos ver algunas de las caractersticas principales de la presa. Entre las que podemos destacar su pequeo tamao, con un volumen embalsado de 14 hm3.

3.1.2. Embalse de Zujar.

El embalse de Zujar se encuentra situado en la provincia de Badajoz en los trminos municipales de Castuela y Esparragosa, y embalsa aguas del ro Zujar, afluente del Guadiana (Figura IV.5). Este embalse almacena 302 hm3 (Tabla IV.1) y presenta una profundidad media de casi 21 m. El embalse se encuentra construido en una zona donde geolgicamente dominan los conglomerados, las grawacas y las pizarras.

Figura IV.5: Situacin del embalse de Zujar.

3.1.3. Embalse de Cazalegas.

El embalse en Cazalegas pertenece a la cuenca hidrogrfica del Tajo y embalsa aguas de ro Alberche, afluente del Tajo. Este embalse est situado en la provincia de

228

Materiales y Mtodos Toledo, en los trminos municipales de Cazalegas y San Romn de los Montes (Figura IV.6). Cabe destacar que junto al embalse de Arcos, es el embalse ms pequeo analizado con un volumen mximo embalsado de 11 hm3 y una profundidad mxima de 15m (Tabla IV.1). Geolgicamente la cuenca del ro en la zona cercana a este embalse se encuentra dominada por rocas sedimentarias, en particular arenas, areniscas, y conglomerados.

Figura IV.6: Situacin del embalse de Cazalegas.

3.1.4. Embalse de Rosarito.

Situado tambin en la cuenca hidrogrfica del Tajo, este embalse de la provincia de Toledo que recibe aguas del ro Tietar, esta situado en los trminos municipales de Oropesa y Candeleda (Figura IV.7). La cuenca de este embalse se encuentra dominada fundamentalmente por rocas granticas. El embalse con una profundidad mxima de 33 m pero curiosamente presenta una gran rea inundada, de mas de 1400 ha, lo cual puede explicarse por la profundidad media que presenta, una de las ms bajas encontradas, de 6,9 m, similar a la encontrada en embalses mucho ms pequeos, como son los embalses de Arcos y de Cazalegas (Tabla IV.1). La geologa de la cuenca en la que se encuentra situado este embalse esta dominada por arenas, areniscas y conglomerados en la parte ms cercana al embalse y granitos en la parte superior. Tambin se encuentran pequeas zonas dominadas por reas y gneiss 229

Materiales y Mtodos

Figura IV.7: Situacin del embalse de Rosarito.

3.1.5. Embalse de Puentes Viejas.

El embalse de Puentes Viejas fue el embalse de cabecera del ro Lozoya, afluente del ro Tajo, hasta que se construy el embalse de Lozoya. Puentes Viejas se encuentra situado en la provincia de Madrid, en los municipios de Gandullas, Buitrago de Lozoya, Puentes Viejas y Paredes de Buitrago (Figura IV.8). Geolgicamente la cuenca de ro Lozoya ha sido descrita para los embalses de Lozoya y Ro Sequillo en el captulo I, en cuanto a la zona en la cual este embalse se encuentra construido, esta presenta una zona de gneiss, y en el lado derecho de la cuenca una zona dominada por areniscas y calizas. Algunos datos generales del embalse pueden verse en la Tabla IV.1. Como podemos observar, el hecho de que el embalse se encuentre situado en un valle escarpado hace que los datos de rea mxima y profundidad mxima se encuentren afectados.

230

Materiales y Mtodos

Figura IV.8: Situacin del embalse de Puentes Viejas.

3.1.6. Embalse de El Atazar.

El embalse de El Atazar tambin situado en la cuenca del ro Lozoya, se encuentra en los trminos municipales de Puentes Viejas, Robledilla de la Jara, Cervera de Buitrago, El Berrueco, El Atazar y Patones Puentes (Figura IV.9). Respecto a la geologa sobre la cual est construido, aparecen dos zonas diferenciadas. La parte anterior del embalse se encuentra dominada por granito, mientras que la mitad ms cercana al muro se halla dominada por grawacas y cuarcitas. Este embalse es el mayor de la Comunidad de Madrid y el mayor de los embalses analizados, embalsando 425 hm3 y presentando una profundidad media de casi 40 m (Tabla IV.1).

Figura IV.9: Situacin del embalse de Atazar.

231

Materiales y Mtodos 3.1.7. Embalse de Cuerda del Pozo. El embalse del Cuerda del Pozo se encuentra situado en la provincia de Soria en el municipio de Vinuesa, embalsa aguas del ro Duero, siendo ste el embalse de cabecera (Figura IV.10) Respecto a la geologa de la cuenca, nos encontramos con una regin dominada por rocas sedimentaras detrticas, siendo importantes en algunas zonas las rocas calizas. Algunos datos generales del embalse pueden verse en la Tabla IV.1.

Figura IV.10: Situacin del embalse de Cuerda del Pozo. V. max (hm3)
14 302 11 85 49 425 229

Embalse
Arcos Zujar Cazalegas Rosarito Puentes Viejas El Atazar Cuerda del Pozo

Area Max. (ha)

289 1449 159 1475 280 1070 2176

Prof. Max. (m)

12 47 15 33 56 115 45

Prof. Media (m)

4.8 20.8 6.9 5.8 17.5 39.7 10.5

Longitud/ Latitud
36 45 52 N 5 47 29 W 38 55 59 N 5 27 29 W 40 01 19 N 4 41 24 W 40 02 13 N 5 06 49 W 40 58 36 N 3 39 31 W 40 54 03 N 3 31 18 W 41 50 28 N 2 4304 W

Tabla IV.1: Caractersticas morfomtricas de los embalses de Arcos, Zujar, Cazalegas, Rosarito, Puentes Viejas, El Atazar y Cuerda del Pozo. V = Volumen, Prof. = profundidad y Max. = mxima. La profundidad media fue obtenida por medio del cociente del Volumen mximo entre el rea mxima.

232

Materiales y Mtodos

3.2. Toma de muestras.

Durante los aos 2002 al 2004 se analizaron todos los embalses objeto de estudio, durante el periodo tpico de aparicin de afloramientos txicos en los pases templados del hemisferio Norte, de junio a noviembre. Estos 14 embalses se muestrearon un mnimo de seis veces por ao, y al menos durante un ao, excepto El Atazar y Puentes Viejas que se muestrearon dos y tres veces respectivamente. Se tomaron muestras de la fraccin sestnica en todos los embalses estudiados. La metodologa de muestreo en los embalses de de Lozoya, Ro Sequillo, El Velln, Santillana, Valmayor, San Juan y Picadas, Puentes Viejas y El Atazar fue la misma que se ha descrito en el captulo II . En el resto de los embalses, excepto en el de Zujar, las muestras se tomaron en la columna de agua del embalse, con una botella hidrogrfica en el pico mximo de clorofila detectado con una sonda de fluorescencia sumergible, YSI 6025 (YSI incorporated, Estados Unidos) acoplada a la sonda multiparamtrica YSI 6920. En el caso del embalse de Zujar la muestra de agua fue tomada en una piscina artificial utilizada como zona de bao. Las muestras se guardaron a 4 C hasta su procesamiento, tpicamente antes de cuatro horas, en botes de polipropileno de boca ancha, lavados con cido clorhdrico.

3.3. Anlisis de especies cianobacterianas planctnicas presentes potencialmente txicas.

Las muestras se procesaron de dos formas diferentes: las de los embalses de Lozoya, Ro Sequillo, El Velln, Santillana, Valmayor, San Juan y Picadas, Puentes Viejas y El Atazar, se analizaron como se ha descrito en el capitulo I. En el resto de los embalses una submuestra de 100 mL se fij inmediatamente con Lugol cido. En el laboratorio las clulas presentes fueron sedimentadas y contadas en un microscopio invertido usando el mtodo Utermhl (Utermhl 1958). La identificacin de las especies cianobacterianas presentes se realiz segn los siguientes autores ((Geitler 1932), (Desikachary 1959), (Komarek y Anagnostidis 1989); (Komarek y Anagnostidis 1999) y (Komarek y Anagnostidis 1986)).

233

Materiales y Mtodos La diferencia entre los mtodos utilizados no permite la comparacin directa entre los diferentes embalses. Para homogeneizar los datos se realiz una clasificacin relativa agrupando la presencia de cianobacterias en dominantes (cuando representaron el 40% de la poblacin de las cianobacterias planctnicas), subdominantes (cuando representaron entre el 40 y el 10%) y raras (cuando su presencia fue inferior al 10%). Se consideraron especies potencialmente txicas todas aquellas especies pertenecientes a un gnero en el que se ha encontrado al menos una especie productora de anatoxina-a, estos han sido: Oscillatoria, Planktothrix, Anabaena, Aphanizomenon y Raphidiopsis.

3.4. Extraccin y anlisis de Anatoxina.

Las muestras para anlisis de anatoxina fueron conservadas a 4 C hasta que se filtraron a travs de filtros GF/F (Whatman, Gran Bretaa) de 47 mm de dimetro, con un valor nominal de tamao de partcula retenida de 0,7 m. Para la filtracin se utiliz una rampa de filtracin de aluminio (Pall corp., Estados Unidos) y una bomba de vaco Me 4P (Vacuubrand GMBH, Alemania) a baja presin, con el fin de de evitar la rotura celular. El volumen de filtracin fue de 300 a 1000 mL en funcin de la biomasa presente. Las muestras filtradas en campo (los embalses situados fuera de la provincia de Madrid) se mantuvieron en nieve carbnica (-50 C) hasta su llegada al laboratorio, momento en que se guardaron a -20 C. La extraccin de anatoxina se realiz en metanol puro (Grado analtico, Merck). El filtro fue introducido en un tubo de centrifuga, al que se aadieron 4 mL de la solucin de metanol 100%, despus se agit en un vortex Reax 2000 (Heidolph, Alemania) a mxima velocidad durante 2 min., a continuacin fue introducida en un bao de ultrasonidos Ultrasons (J.P.Selecta, Espaa) durante 10 minutos y posteriormente se guard a 4 C durante 1 hora. Finalmente fue centrifugada a 5000 rpm en una centrfuga Labofuge Ae, equipada con un rotor basculante (Heraeus Sepatech, Alemania) y se retir el sobrenadante. Este proceso fue repetido una vez ms aadiendo otros 3 mL de metanol 90%. Los dos sobrenadantes se conservaron a -20 C antes de concentrarse. 234

Materiales y Mtodos La concentracin de la muestra se realiz en dos pasos, en un primer paso la muestra se llev a sequedad con un rotavapor modelo R (Bchi, Suiza) a 40 C y se resuspendi en un volumen de 2 mL de metanol 100%, este volumen se introdujo en un eppendorf, que posteriormente se concentr en una centrifuga concentradora modelo Howe girovap GL (Girovap, Italia), tambin a 40 C. Finalmente se resuspendi en un volumen 400 L. Doscientos L del resuspendido final se pasaron a travs de un filtro de nylon y se introdujeron en un vial de HPLC (cromatografa lquida de alta resolucin) para su anlisis.

El anlisis de las muestras para detectar la presencia de anatoxina fue realizado con un HPLC modelo 2695 Alliance, con un inyector automtico y un detector con un conjunto de diodos modelo 996 (Waters, Estados Unidos). Para la separacin cromatogrfica se utiliz el gradiente descrito por Edwars y col. 1992 modificando la concentracin del aditivo TFA (cido trifluoro-actico) de 0,1% a 0,05% utilizando agua miliQ + 0,05% TFA y acetonitrilo + 0,05% TFA. La columna utilizada fue una Luna (2) (3 m) 4.6 mm x 100 mm (Phenomenex, Estados Unidos). La anatoxina-a se identific por su espectro de absorcin en UV y su tiempo de retencin comparndolo con la del patrn de anatoxina-a (Tocris, Inglaterra) (Fgura IV.11 y IV.12). La concentracin fue calculada relacionando el rea obtenida a 228 nm con la cantidad inyectada del patrn.

Figura IV.11. Ejemplo de inyeccin de patrones de anatoxina-a.

235

Materiales y Mtodos

Figura IV.12. Espectro de absorcin caracterstico de la anatoxina-a.

Aparte del anlisis por HPLC, para algunos de los picos con caractersticas similares a la anatoxina-a se realiz un anlisis por espectrometra de masas en el SIDI (Servicio Interdepartamental de Investigacin, UAM). Para ello se purific el pico de inters en el mismo sistema cromatogrfico utilizado para su anlisis y posteriormente se inyect en un espectrmetro de masas QSTAR (Applied Biosystems, Estados Unidos) con un interfaz por electroespray, con el fin de obtener el espectro de masas y compararlo con las variantes de anatoxina-a publicadas.

236

Resultados

4. Resultados.
Se han analizado tanto las especies cianobacterianas presentes en los 14 embalses objeto de estudio como la presencia de anatoxina-a en cada uno de ellos. La idea inicial era conocer la extensin e importancia que tienen las anatoxinas en los embalses espaoles. En principio se seleccionaron los embalses o bien por la actividad recreativa que tena lugar en ellos o bien por su utilizacin como fuentes de abastecimiento de agua potable. En cualquiera de estas dos formas es posible el contacto entre los seres humanos y este tipo de toxinas.

4.1. Presencia de cianobacterias potencialmente productoras de anatoxina-a en embalses espaoles.

Cuando analizamos las especies de cianobacterias en los 14 embalses objeto de estudio, podemos observar que en todos ellos se detectaron especies pertenecientes a alguno de los gneros para los cuales se ha detectado alguna especie productora. Cuando analizamos las diferentes muestras observamos que un gran porcentaje de las muestras (el 81% de las 248 muestras analizadas) presentaba especies potencialmente productoras de anatoxina-a. En general el 70% de las muestras de cada embalse presentaron gneros potencialmente productores de anatoxina, salvo en el embalse de Zujar en las que slo un 20% de las muestras presentaron especies potencialmente productoras. Estudiando ms detenidamente los valores encontrados observamos que fue comn encontrar ms de una especie potencialmente productora, la media de especies por muestreo fue de 1,9 lo que indica que en la mayor parte de ellos al menos coexistieron dos especies potencialmente productoras de anatoxina-a simultneamente, como puede apreciarse tras comparar los datos de nmero de veces que aparecen las diferentes especies de cianobacterias potencialmente productoras de anatoxina Tabla IV.2 frente al nmero de muestreos realizados.

Cuando analizamos los gneros cianobacterianos que se han encontrado en los cuerpos de agua en estudio, observamos que se han detectado cuatro gneros potencialmente productores, Aphanizomenon, Anabaena, Planktothrix y Raphidiopsis. La importancia de cada uno de los gneros en cuanto a su abundancia en los embalses espaoles ha sido muy variable.

237

Resultados De todos los gneros Aphanizomenon y Anabaena han sido los ms importantes, tanto por el nmero de especies detectadas, como por el nmero de muestras en las que estuvieron presentes. Adems alguna especie de uno de estos gneros ha estado presente siempre que se han detectado potenciales productores. Mientras los otros dos gneros pueden considerarse marginales al detectarse en 23 muestras (menos del 10% de las muestras) en el caso de gnero Planktothrix muestras). y en slo siete ocasiones el gnero Raphidiopsis (menos del 3% de las

A nivel de especie, hemos encontrado 14 especies potencialmente productoras (Tabla IV.2), a parte de las nombradas en el prrafo anterior, 2 del gnero Planktothrix y una del gnero Raphidiopsis. En nueve de las muestras no fue posible identificar a nivel de especie alguna de las Anabaena presente y en otra no fue posible identificar la especie de Planktothrix. De todas las especies encontradas las ms comunes fueron Aphanizomenon flosaquae que estuvo presente en 118 de las muestras, lo que representa el 47,9% de las muestras, despus muy alejados estuvieron el resto de las especies de Aphanizomenon que se encontraron entre el 1,6% de las muestras en el caso del Aphanizomenon menos representado (Aph. yezoenese) hasta el 6,8% de el segunda especie mas importante (Aph. flexuosum) (Tabla IV.2).

Cuando analizamos los gneros y especies que fueron dominantes, observamos que Anabaena fue el gnero de las cianobacterias planctnicas ms importante dentro de los embalses estudiados al encontrarse en conjunto en el mayor porcentaje de las muestras dominadas por un organismo potencialmente productor. 19% de las muestras estuvieron dominadas por Anabaena, mientras que el 14% de las muestras estuvieron dominadas por Aphanizomenon. La tres siguientes especies potencialmente productoras ms importantes fueron del gnero Anabaena: A. flos-aquae, A. planktonica y A. crassa que estuvieron en el 37,5 %, 22,2 % y 17,7 % respectivamente de las muestras. La cuarta de las especies de Anabaena identificada A. sigmoidea apareci en menos del 1% de las muestras totales (Tabla IV.2). Planktothrix se presenta en baja proporcin siendo ms importante la especie P. agardhii, presente en el 7,7 % de las muestras, que la especie P. rubescens que slo estuvo presente en el 1% de las muestras. Dentro del genero Raphidiopsis slo se encontr una especie R. mediterranea que siempre estuvo por debajo del 10% de abundancia y por lo tanto puede ser catalogada como rara.

238

Resultados % de muestras en las que se encontr 17,7 37,5 22,2 3,6 0,8 47,6 1,6 2,8 6,9 3,2 2,8 7,7 1,2 0,4 2,8

Especies Anabaena crassa (Lemmermann) Komark.-Legn. & Cronberg. Anabaena flos-aquae (Lyngbye) Brbisson ex Bornet & Flauhault. Anabaena planctonica Brunnthaler. Anabaena spp. Anabaena sigmoidea Nygaard. Aphanizomenon flos-aquae (Linnaeus) Ralfs ex Bornet & Flahault Aphanizomenon yezoense M. Watanabe Aphanizomenon gracile Lemmermann Aphanizomenon flexuosum J. Komrek & L. Kovcik Aphanizomenon ovalisporum Forti Aphanizomenon issatschenkoi (Usacev) Proshkina-Lavrenko Planktothrix agardhii (Gomont) Anagnostidis & Komrek Planktothrix rubescens (De Candolle ex Gomont) Anagnostidis & Komrek Planktothrix sp. Raphidiopsis mediterranea Skuja

Dominante 8 22 14 2 0 23 2 4 3 3 0 4 1 0 0

Subdominante 2 12 9 0 0 20 2 3 8 3 5 11 0 0 0

Rara 34 59 32 7 2 75 0 0 6 2 2 4 2 1 7

Tabla IV.2: Especies potencialmente productoras de anatoxina-a encontradas en los embalses objeto de estudio. Dominante, la especie presente representa al menos el 40% de la poblacin cianobacteriana planctnica total. Subdominante entre el 40% y el 10%. Rara, representa menos del 10%. 239

Resultados

4.2. Presencia de anatoxina-a en embalses espaoles.

De los 14 embalses analizados slo en uno de ellos, el embalse de Rosarito, se ha encontrado anatoxina-a. En otro de ellos, el de Santillana, se ha encontrado un compuesto similar en cuanto a tiempo de retencin en la separacin cromatogrfica y el espectro de absorcin que presenta. 4.2.1. Presencia de anatoxina en el embalse de Santillana.

Durante los muestreos realizados en el embalse de Santillana en los aos 2002 y 2003, como hemos podido observar en los captulos I y II, la presencia de cianobacterias potencialmente toxicas ha sido muy importante. Durante el ao 2002, entre los meses de septiembre y noviembre, tuvo lugar un periodo en el cual las cianobacterias potencialmente txicas fueron muy abundantes alcanzndose en varios momentos picos de clorofila por encima de los 100 g Clo a L-1 y concentraciones de microcistina tambin muy elevadas por encima de 10 g Mc L-1 (captulo II). Como ya hemos descrito en el captulo I, durante este periodo, la poblacin planctnica de cianobacterias estuvo dominada fundamentalmente por M. aeruginosa y por Aph. flos-aquae. Cuando se analizaron las muestras se detect un pico con un espectro muy similar (Figura IV.13) y un tiempo de retencin muy cercano al patrn de anatoxina-a (se alejaba 0,2 min) (Figura IV.14), tanto que debido a la variacin en el tiempo de retencin que el sistema presenta, el pico de la muestra tenia el mismo tiempo de retencin que los patrones pinchados en otros das (datos no mostrados).

Figura IV.13: Espectros del Patrn de la anatoxina-a y de pico encontrado en Santillana en el ao 2002. A = espectro del patrn de Anatoxina-a, B = espectro de la muestra de Santillana. 240

Resultados

Figura IV.14: Cromatogramas de la anatoxina-a y del pico aparecido en el embalse de Santillana en el ao 2002. A = cromatograma del patrn de Anatoxina-a, B = cromatograma de la muestra de Santillana.

Al igual que se hizo con las variantes qumicas de microcistinas para las cuales no se dispona de patrn, se hizo un clculo de concentracin como equivalentes de anatoxina-a del cual si existe patrn comercial. Este compuesto apareci de forma repetida en los dos puntos opuestos del embalse de Santillana en tres muestreos entre el 3 de septiembre y el 20 del mismo mes, coincidiendo con un momento en que la presencia de Aphanizomenon flos-aquae era muy abundante en la poblacin, las relaciones entre este compuesto y la clorofila en estos tres muestreos pueden verse en la Tabla IV.3. Como podemos observar, se alcanzaron valores del 15% de la clorofila presente, lo que se considera una alta concentracin.

241

Resultados Fecha 3-9-2002 6-9-2002 12-9-2002 g ANA(eq) g Clo a-1 0,049 0,078 0,151 SD 0,005 (slo se muestreo el punto S2) 0,054

Tabla IV.3. Presencia del Compuesto similar a Anatoxina-a en el embalse de Santillana. ANA(eq) = anatoxina equivalente, SD = desviacin estndar de dos puntos opuestos del embalse. Debido a la similitud que presentaban estos picos se procedi al aislamiento del pico de inters a travs del mismo sistema cromatogrfico utilizado para el anlisis de anatoxina-a y la muestra obtenida se inyect en un espectrmetro de masas con el fin de determinar tanto su masa molecular, como su posible espectro de fragmentacin, para poder compararla con los datos existentes para las variantes qumicas de la homoanatoxina-a. El espectro de masas obtenido puede observarse en la Figura IV.15, en esta misma figura podemos observar el aspecto de la anatoxina-a del patrn sometida al mismo tratamiento que el pico de inters.

Figura IV.15. Espectro de masas de la anatoxina-a (A) y del pico encontrado en el embalse de Santillana (B).

242

Resultados Como podemos observar no existen similitudes entre la anatoxina-a y el pico encontrado en el embalse de Santillana, en el espectro de anatoxina-a podemos observar claramente un compuesto de masa ms uno de la anatoxina-a (la anatoxina-a protonada). Mientras que en el caso del compuesto desconocido no aparece ninguno de los fragmentos que debiramos esperar en caso de encontrarnos ante un compuesto perteneciente a la misma familia, lo que parece indicar que no pertenece a esta familia de toxinas.

4.2.2. Presencia de anatoxina-a en el embalse de Rosarito.

El embalse de Rosarito es el nico

de los 14 analizados que ha presentado

concentraciones de anatoxina-a por encima del lmite de deteccin (0,02 g L-1), esto se confirmo tanto por el tiempo de retencin y espectro, como realizando un spike con el estndar de anatoxina-a. Este embalse fue muestreado durante el ao 2003 en seis ocasiones entre los meses de julio y octubre.

La poblacin fitoplanctnica del embalse de Rosarito estuvo dominada por cianobacterias en todas las ocasiones (representaron al menos el 80% de la poblacin fitoplactnica total), salvo en el ltimo muestreo de octubre que solo representaron menos del 30% de la poblacin (). Dentro de la poblacin planctnica cianobacteriana las especies potencialmente productoras de anatoxina-a ms importantes fueron: Aph. gracile, P. agardhii y A. flos-aquae (figura IV.16), encontrndose adems R. mediterranea de manera constante a lo largo del periodo de muestreo pero en bajas concentraciones con una media de 66,7 81,4 mm3 m-3.

243

Resultados
Cianobacterias mayoritarias potencialmente productoras de anatoxina-a
25000 20000 15000 10000

Biovolumen (mm m )

-3

7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Jun

A. flos-aque Aph. gracile P. agardhii

Jul

Aug

Sep

Oct

Nov

Figura IV.16: Biovolumen de cianobacterias mayoritarias potencialmente productoras de anatoxina-a en el embalse de Rosarito.

Cuando analizamos la presencia de anatoxina-a en las muestras analizadas observamos que se detectaron en cuatro ocasiones (Tabla IV.4). La mayor concentracin encontrada (a finales de Septiembre) fue de 0,31 g L-1, el mnimo se encontr un mes antes siendo un orden de magnitud inferior, 0,04 g L-1. Las relaciones toxina/clorofila siguen tendencias similares con valores mximos del 0,3 %.

Fecha 28-7-2004 12-8-2004 26-8-2004 23-9-2004

g ANA L-1 0,23 0,17 0,04 0,31

g ANA g Clo a-1 4,210-3 3,110-3 4,410-4 3,410-3

Tabla IV.4. Concentraciones de anatoxina (ANA) encontradas en el embalse de Rosarito.

244

Discusin

5. Discusin
De los datos expuestos en este capitulo podemos observar que a pesar de lo comn que es la presencia de estirpes potenciales productoras de anatoxina-a en los embalses espaoles, la toxina en si misma puede considerarse rara, puesto que slo ha sido posible detectar su presencia en uno de los quince cuerpos de agua analizados.

Existen muy pocos trabajos acerca de la importancia que tienen las cianobacterias potencialmente toxicas en los cuerpos de agua mediterrneos, y en particular de los gneros que potencialmente son capaces de producir anatoxina-a u homoanatoxina-a (Cook y col., 2004). En ese trabajo, centrado casi exclusivamente en las potenciales productores de microcistinas, podemos observar que entre las especies dominantes en lagos griegos, es comn la presencia de organismos potencialmente productores de anatoxinas, principalmente especies pertenecientes a los gneros Aphanizomenon, Anabaena, siendo especialmente importantes dos especies en esta zona: Aph. flos-aquae, y A. flos-aquae, si bien no es posible aventurar que ocurra lo mismo en el resto de la regin mediterrnea. Cuando analizamos las especies potencialmente productoras de anatoxina ms comunes en Espaa, observamos que coinciden con las encontradas en Grecia, siendo las especies ms abundantes Aph. flos-aquae, y A. flos-aquae en ambos pases. Esta coincidencia y la gran distancia que separa a las dos zonas estudiadas, parece indicar que estas dos especies podran ser las potenciales productoras de anatoxinas ms importantes en toda la zona mediterrnea.

Cuando comparamos los datos de especies potencialmente productoras de anatoxinas encontrados en Espaa con los encontrados en el resto de Europa, observamos que los resultados obtenidos son ms homogneos que los encontrados respecto a las especies potencialmente productoras de microcistinas. Como ha sido publicado en diversas ocasiones, ((Carrasco y col., 2006) y (Willame y col., 2005)) parece existir un gradiente norte-sur en cuanto a cuales son los gneros cianobacterianos responsables de la produccin de microcistinas (Anabaena en Escandinavia, Planktothrix en Centro Europa, y Microcystis en la zona mediterrnea). No obstante, en cuanto a los potenciales productores de anatoxina este gradiente no parece existir. En este caso encontramos una distribucin bastante homognea de

245

Discusin los potenciales productores en toda Europa ((Sivonen y col., 1989); (Bumke-Vogt y col., 1999) y (Cook y col., 2004)), as pues son Anabaena y Aphanizomenon, los principales potenciales productores tanto en la zona mediterrnea, como en el resto de Europa, si bien no puede descartarse la importancia de Planktothrix en Europa central.

El embalse de Santillana en el ao 2002 present en tres ocasiones un compuesto con caractersticas cromatogrficas similares (tiempo de retencin, y espectro de absorcin) a la anatoxina-a. Sin embargo anlisis posteriores por espectrometra de masa, mostraron un espectro de masas completamente diferente a cualquier variante de anatoxina conocida (James y col., 2005), confirmando que no se trataba de la homoanatoxina-a como se sospech en un primer momento puesto que pareca ligeramente ms hidrofbica (posea un tiempo mayor en la separacin cromatogrfica), lo que sera coherente con el cambio de un grupo metilo por un grupo etilo que diferencia a las dos molculas. La existencia de estos picos con caractersticas cromatogrficas similares a la anatoxina-a dificultan la determinacin, al no disponer de manera comercial, de los compuestos derivados de anatoxina o sus variantes, como la homoanatoxina-a. Siendo necesario en este un anlisis de HPLC-MS mucho mas caro y difcil de realizar que el clsico anlisis por HPLC-PDA.

Mientras, en el embalse de Rosarito si fue posible detectar en cuatro ocasiones la presencia de un compuesto, identificado como anatoxina-a tanto por su tiempo de retencin como por sus caractersticas cromatogrficas. Adems, en los momentos de mayor concentracin de anatoxina-a se observ que la muestra era txica para Artemia salina, lo que ayudara a confirmar la presencia de esta toxina en las muestras analizadas (datos no mostrados). Cuando comparamos la presencia de este compuesto en nuestro trabajo con los datos publicados en otros pases de la zona mediterrnea observamos que slo se tienen datos de dos cuerpos de agua italianos ((Bruno y col., 1994a) y (Viaggiu y col., 2004a)), y no existe ningn anlisis a escala nacional, como ocurre en otros pases europeos y asiticos como Alemania (Bumke-Vogt y col., 1999), Corea (Park y col., 1998), Finlandia (Sivonen y col., 1989) e Irlanda (James y col., 1997), si bien en este ultimo pas solo se analizaron 5 lagos. Al comparar los datos, y a pesar de las diferentes metodologas, que al presentar diferentes limites de deteccin (desde 0,0002 g ANA L-1 en el caso de Alemania (Bumke-Vogt y col., 1999), y alrededor de 0,02 g ANA L-1 en el resto) dificultan la comparacin. Los datos

246

Discusin encontrados en la bibliografa se pueden dividir en dos grandes grupos, por un lado nos encontraramos un primer grupo que englobara a Alemania, Irlanda y Corea, que muestran una elevada presencia de anatoxina-a en sus cuerpos de agua, alrededor del 20% (o superiores, como es el caso de Irlanda, donde 3 de los 5 embalses analizados presentaban anatoxinas) de los mismos analizados presentaran este tipo de compuestos. Mientras en un segundo grupo nos encontraramos a Espaa y a Finlandia (aunque este ultimo no indica cual es el nmero de embalses que presentaron anatoxina, pero s indica el porcentaje de muestras que dieron positivas, el 5%) donde la presencia de anatoxinas es mucho menor. Este segundo grupo representara a los pases en los cuales la presencia de este tipo de compuestos puede calificarse como rara, de hecho en los embalses espaoles como hemos indicado en resultados slo el 7% de los embalses (slo el embalse de Rosarito), o expresado en funcin del nmero total de muestras analizadas el 2% presentaron anatoxinas. Estos valores tan alejados de los presentes en el primer grupo, nos hace creer que existe un gradiente en Europa, que se correlacionara con la presencia de cepas genticamente diferentes, puesto que como hemos indicado con anterioridad las especies productoras se encuentran bastante homogneamente distribuidas por toda Europa. As los extremos norte y sur del Continente (Escandinavia y la zona mediterrnea) presentaran una prevalencia de este tipo de toxinas muy baja, mientras que en Europa central y quizs en Asia, sin ser tan alta como en el caso de la microcistina ((Carrasco y col., 2006) y (Sivonen y Jones 1999)), si parecen ser abundantes en sus lagos y embalses y por lo tanto pueden considerarse como toxinas comunes.

Las diferencias existentes entre las diferentes zonas europeas, pueden explicarse como hemos indicado en el prrafo anterior en base a la existencia de diferentes cepas de las principales especies productoras, especialmente Anabaena flos-aquae. Como qued claro en el trabajo de (Kangatharalingam y Priscu 1993) en el que demostraron que slo un porcentaje muy bajo de los clones aislados en un momento puntual del lago Hegben, concretamente alrededor del 8,7%, eran capaces de producir anatoxina-a. Estos datos parecen indicar que en los pases centroeuropeos los genotipos productores de anatoxina-a son mucho ms frecuentes que en los pases mediterrneos como ocurre con la especie Anabaena circinalis y la produccin de saxitoxinas (Beltran y Neilan 2000), si bien la falta de estudios al respecto impiden confirmar esta hiptesis. Por otro lado, podra darse la posibilidad de la existencia de cepas productoras que son capaces de producir mayor cantidad de toxina, como ocurre en

247

Discusin cepas de la especie M. aeruginosa (Moreno y col., 2004), que influiran en la variacin de las concentraciones finales de toxina detectadas.

Estas diferencias se ven no slo en el nmero de embalses que presentan este tipo de toxinas, si no tambin en el porcentaje de muestras que las presentan, sin comparar los datos encontrados en Alemania (Bumke-Vogt y col., 1999), que presentaron un limite de deteccin un orden de magnitud inferior al sistema utilizado en este trabajo, y por lo tanto sus porcentajes no pueden ser comparados directamente, en los otros pases donde el mtodo presenta limites de deteccin similares al nuestro, las diferencias son importantes. En Corea, el 16% de las muestras fueron positivas y en Irlanda el 60% fueron positivas ((Park y col., 1998) y (James y col., 1997)).Si bien originalmente el numero de muestras analizadas en Irlanda fue muy bajo (solo 5 muestras analizadas), los datos de la importancia de estos compuestos fueron confirmados posteriormente en un estudio ms extenso, analizando 20 cuerpos de agua, sobre la presencia de la homoanatoxina-a (Furey y col., 2003) un compuesto considerado mas raro que la anatoxina-a y perteneciente a la misma familia qumica, el cual se encontr en el 20% de los embalses analizados. Este alto porcentaje de presencia de este compuesto indica que probablemente la anatoxina-a se encuentra en valores an superiores a los encontrados para la homoanatoxina, confirmando los datos de anatoxina, a pesar del bajo nmero de embalses estudiados.

No slo existen grandes variaciones dentro del nmero de embalses y muestras que tienen anatoxina-a, tambin existen grandes diferencias en las concentraciones que presentan, de hecho las concentraciones encontradas en los pases centroeuropeos son de hasta tres rdenes de magnitud a las encontradas en Espaa, con concentraciones superiores a 10 g ANA L-1 en Alemania (Bumke-Vogt y col., 1999) y a 400 g ANA L-1 en Irlanda (James y Sherlock 1996). Aqu la mayor concentracin medida en el embalse de Rosarito fue de 0.31 g l-1. En los otros dos pases (Corea (Park y col., 1998) y Finlandia (Sivonen y col., 1989)), las concentraciones fueron calculadas por peso seco y no por litro, lo que impide compararlas directamente con las obtenidas en este trabajo.

248

Discusin Analizando en mayor profundidad el embalse de Rosarito, podemos apreciar que en todos los momentos en los que apareci la anatoxina-a existan al menos cuatro organismos que han sido descritos como potenciales productores de este compuesto. Esta presencia dificulta la identificacin del principal organismo productor, sobre todo porque no se realiz ningn aislamiento de las cianobacterias presentes en los momentos en los que apareci la anatoxina-a, este aislamiento hubiera permitido identificar el organismo productor. Esto nos obliga a conjeturar acerca del posible productor en funcin de las concentraciones de toxinas encontradas en cada momento y el biovolumen de los posibles productores. En el embalse de Rosarito como hemos indicado en Resultados se han encontrado 4 posibles productores de anatoxina-a en cada momento en que esta apareci: A. flos-aquae, Aph. gracile, P. agardii y R. mediterranea. Si bien la diferencia en el biovolumen que represent cada una de ellas fue muy grande y la nica que estuvo slo presente en todos los momentos en los que se detecto la toxina fue A. flos-aquae. Otros indicios acerca de que es este organismo el principal responsable de le produccin de anatoxina-a, son que las variaciones en la concentracin de esta toxina y de los biovolmenes de los posibles productores se ajustan mejor en el caso de la A. flos-aquae que con el resto de especies y finalmente que si expresamos la concentracin de anatoxina-a en funcin del biovolumen de las especies productoras, para Anabaena obtenemos valores en el rango de 0,2 1,1 g ANA mm-3, similares a los encontrados por (Bumke-Vogt y col., 1999) en el lago Langer, mientras que en el caso de los otros organismos obtenemos valores mucho ms alejados de los obtenidos en ese trabajo. A pesar de estos indicios no podemos descartar que existan otros posibles productores que coexistan especialmente R. mediterranea, descrita como productora y que por su bajo biovolumen podra ser responsable de un pequeo incremento de la toxina en los momentos en que se ha detectado. Mientras que Planktothrix y Aphanizomenon presentan elevados biovolmenes durante todo el tiempo, y por ello debera haberse detectado la presencia de anatoxina-a durante todo el periodo de muestreo, si bien la existencia de una pequea sub-poblacin productora dentro de estos grupos no puede descartarse.

249

CAPITULO V

CAPTULO V

250

Introduccin

Cilindrospermopsina en un embalse espaol: El embalse de Arcos.

1. Introduccin
Durante el desarrollo de esta tesis hemos hablado de la importancia de diversos compuestos txicos producidos por las cianobacterias. En este captulo trataremos de uno de los ltimos en identificarse: la cilindrospermopsina. Este compuesto merece atencin especial, puesto que junto con las microcistinas, son las nicas toxinas que han causado fenmenos masivos de intoxicacin en poblaciones humanas. Adems, hasta hace poco no se haba detectado una elevada presencia en aguas europeas, con lo que an en la actualidad se desconoce cual es la importancia que presenta esta toxina en los cuerpos de agua europeos, y si puede llegar a alcanzar concentraciones elevadas que puedan representar un riesgo para la poblacin y para los ecosistemas.

1.1. Estructura qumica de la cilindrospermopsina y biosntesis.

Qumicamente la cilindrospermopsina es un derivado guanidino combinado con un hidroximetiluracilo (Figura V.I), es una toxina alcaloidea de pequeo tamao, con un peso molecular de 415 Da, (Sivonen y Jones 1999). Se conocen dos variantes de esta molcula, una es la 7-epi-cilindrospermopsina que es un esteroismero en el grupo hidroxi del carbono 7, el que une el grupo guanidino con el hidroximetiluracilo. La otra variante de esta toxina, la deoxicilindrospermopsina, que se caracteriza por la sustitucin en su formula molecular de un grupo OH por un hidrgeno en el carbono numero 7, este ltimo compuesto no ha mostrado toxicidad (Norris y col., 1999).

251

Introduccin
OH H O3SO O O3SO H O H

H3C

N C H N
+

HN

NH

H3C

N C H N
+

HN

NH

Figura V.I. Estructura quimica de la cilidrospermopsina (A) y la deoxicilindrospermopsina (B).

Respecto a la sntesis de este tipo de compuestos, se han propuesto los posibles genes responsables de la sntesis de la cilindrospermopsina, as como una posible ruta de sntesis ((Schembri y col., 2001) (Shalev-Alon y col., 2002)). Son tres los genes que se han sido predichos como responsables de la sntesis de cilindrospermopsina AoaA, AoaB y AoaC, que codifican para una actividad amino tranferasa, un hbrido de pptido sintetasa y poliqutido sintasa y una poliqutido sintetasa respectivamente. La Figura V.II muestra la ruta hipottica de sntesis de este compuesto. En esta ruta la protena AoaA es una amidinotransferasa que cataliza la sntesis del acetato de guanidinio, unidad inicial de la sntesis de la cilindrospermopsina (Burgoyne y col., 2000). Este compuesto es reclutado por las otras dos enzimas AoaB y AoaC. La primera de ellas reconoce por medio del dominio de adenilacin al guanidinio, de hecho este parece ser el nico dominio de adenilacin que reconoce a este compuesto teniendo muy baja similitud con los otros dominios de adenilacin conocidos (menos del 40%). Esta protena junto con la enzima AoaC parecen ser los responsables de la ampliacin de la cadena poliquetidica mediante la incorporacin de malonil-CoA, hasta llegar finalmente a la sntesis de la cilindrospermopsina (Kellmann y col., 2006). Hasta el momento no se ha inactivado este opern en ninguna de las cepas productoras de cilindrospermopsina conocidas en la actualidad, con lo que falta la confirmacin final de que estos son los genes responsables de la sntesis de cilindrospermopsina, aunque estos genes se han encontrado en cepas de las especies productoras: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Aphanizomenon ovalisporum y Aphanizomenon flos-aquae ((Schembri y col., 2001); (Shalev-Alon y col., 2002); (Kellmann y col., 2006); (Preussel y col., 2006)).

252

Introduccin

Figura V.II. Posible reacciones bioqumicas que realizan las tres posibles enzimas implicadas en la sntesis de cilindrospermopsina. Extrado de Kellmann y col., 2006.

1.2. Organismos productores.

El hecho de que, a pesar de estos efectos, la cilindrospermopsina no haya sido objeto de demasiados estudios se debe principalmente a su, hasta la fecha, escasa distribucin geogrfica. En este sentido, las principales especies potencialmente productoras eran consideradas tropicales, y se haban considerado raras en el continente europeo, y se haban centrado en zonas ms clidas

En Oceana, la cilindrospermopsina se considera un agente txico merecedor de gran atencin desde los aos 80 al ser responsables de una intoxicacin masiva en Palm Island y mostrar que uno de sus principales productores C. raciborskii era comn en los 253

Introduccin cuerpos de agua utilizados como fuentes de agua potable (Griffiths y Saker 2003). En Israel, obtuvo protagonismo cuando se detect en la principal fuente de agua dulce del pas, el lago Kinneret, en los aos 90, donde se identific al otro gran productor de cilindrospermopsina Aph. ovalisporum (Banker y col., 1997). Otras especies productoras son Umezakia natans (Harada y col., 1994), Anabaena lapponica (Meriluoto y Spoof 2005), Raphidiopsis curvata (Li y col., 2001) y recientemente se ha publicado la produccin de esta toxina en una cepa de Aph. flos-aquae (Preussel y col., 2006), especie habitual en las aguas espaolas como hemos podido ver en el Capitulo I y Capitulo IV, y en Lyngbya wollei (Seifert y col., 2007).

Las dos especies productoras fundamentales, tanto por distribucin como por las elevadas concentraciones de toxina que se han encontrado asociadas a su presencia en los cuerpos de agua son C. raciborskii y Aph. ovalisporum. La primera de ellas podran estar comportndose como una especie invasora. Este supuesto se ha establecido en los ltimos aos, ya que parece que existe una paulatina expansin geogrfica hacia zonas ms templadas (Briand y col., 2004). Aunque en el caso de las cepas de C. raciborskii, parece que existira una segregacin en cuanto a que tipo de toxinas producen mayoritariamente en funcin del continente donde se encuentran; as en el caso de las cepas aisladas en Oceana, Asia y Norteamrica las cepas producen cilindrospermopsina como toxina ms importante ((Bernard y col., 2003); (Berger y col., 2006); (Chonudomkul y col., 2004) y (Neilan y col., 2003)), mientras que en Europa hasta la fecha no se ha conseguido aislar ninguna cepa de esta especie productora de dicha toxina, aunque su carcter txico se ha evidenciado en bioensayo de ratn, siendo el compuesto o compuestos txicos de naturaleza desconocida. ((Fastner y col., 2003); (Valerio y col., 2005); (Bernard y col., 2003) y (Saker y col., 2003)). En el caso de Aphanizomenon ovalisporum, tras haberse visto recluido a zonas muy concretas, durante los ltimos aos se ha observado un patrn de expansin similar al de C. raciborskii, presentndose en varios pases ((Banker y col., 1997); (Gkelis y col., 2005) y (Shaw y col., 1999)). De esta manera se aprecia como probable que las especies de este genero puedan ser las principales productoras de cilindrospermopsina en aguas europeas ((Preussel y col., 2006); (Fastner y col., 2007) y (Quesada y col., 2006)).

254

Introduccin

1.3. Toxicidad de la cilindrospermopsina.

Respecto a qu partes de la molcula son esenciales para la toxicidad, parece que el anillo de pirimidina es fundamental para la toxicidad, as como el OH situado en el carbono 7, puesto que como hemos indicado el tautmero deoxicilindrospermopsina carece de toxicidad conocida, lo que indica que este OH en la unin puente entre el uracilo o quizs el estatus ceto-enol del motivo uracilo es crtico en la toxicidad (Griffiths y Saker 2003).

La cilindrospermopsina fue inicialmente caracterizada como una hepatotoxina puesto que en estado puro se caracteriza por tener como rgano diana fundamentalmente el hgado, pero anlisis posteriores utilizando extractos de C. raciborskii independientemente de la forma en que este extracto entra en el organismo, inyectados o administracin oral se indujeron daos adems de en el hgado, en riones, pulmones, timo y corazn (Sivonen y Jones 1999), Estos daos en mltiples rganos hicieron que esta toxina se considere en la actualidad citotoxina. La DL50 disminuye de manera muy importante con el tiempo despus de una nica inyeccin, as despus de 24 horas es de 2000 g kg-1, disminuyendo a una dcima parte de este valor pasados de 5 a 6 das. No existen datos concluyentes acerca de cual es la principal causa bioqumica responsable de la toxicidad, pero esta disminucin en la DL50 a los 5 das parece indicar un modo lento de actuacin. Los estudios realizados indican dos mecanismos fundamentales (Falconer y Humpage 2006).

El primero de ellos es el efecto que este compuesto produce en las enzimas responsables de la sntesis de protenas. De hecho uno de los primeros efectos que se producen tras la inyeccin de cilindrospermopsina es que los ribosomas del hgado se disocian del retculo endoplsmico rugoso. Esta inhibicin de la sntesis fue confirmada posteriormente por medio del ensayo de la sntesis de la globina utilizando un sistema de reticulocito de conejo libre de clulas (Froscio y col., 2001). La entrada en las clulas es rpida, en una hora en sistemas in vitro con clulas de reticulocito se produce la inhibicin. Bioqumicamente la inhibicin ocurre en el ribosoma a nivel de la elongacin de la cadena peptdica (Froscio y col., 2001).

255

Introduccin El segundo gran efecto es la toxicidad que presentan los compuestos oxidados de la cilindrospermopsina, esta oxidacin es dependiente del citocromo P450, aunque esta no parece la ruta principal de toxicidad, que parece ser explicada de mejor manera por medio de la inhibicin de la sntesis proteica (Falconer y Humpage 2001).

Otros efectos secundarios de esta toxina en las clulas son la reduccin de la cantidad de GSH lo cual ocurra en cualquier efecto txico, por ejemplo en el caso de la toxicosis debida a la microcistina LR, y que no implica un incremento en el estrs oxidativo por lo que no seria importante en la toxicidad (Falconer y Humpage 2001). Respecto al posible efecto carcinognico de esta toxina, el hecho de que presente un potencial grupo guanidina y grupos sulfatos sugieren que la esta toxina tambin podra tener efectos directos sobre el ADN o ARN. Esta posible interaccin se ha confirmando encontrando que un tratamiento con cilindrospermopsina produce unin covalente al ADN del compuesto, acompaado de roturas en la doble cadena de ADN (Humpage y col., 2000). Para que se produzca esta genotoxicidad parece ser necesaria la modificacin de la cilindrospermopsina por parte del citocromo P450 (Humpage y col., 2005). Esto datos parecen apoyar el carcter carcinognico de esta toxina.

1.4. Cilindrospermopsina en el ecosistema.

Los datos acerca del efecto que tiene esta toxina sobre otros organismos que pueden coexistir con su presencia son muy escasos. De hecho los datos existentes sobre el efecto de esta toxina o de organismos productores es menor que los existentes para la anatoxina (Captulo V). Hasta la fecha slo se conoce como se comportan dos organismos acuticos ante la presencia de organismos productores de

cilindrospermopsina, por ejemplo el ciliado Paramecium cf. caudatum (Fabbro y col., 2001) y Daphnia magna ((Nogueira y col., 2006; Nogueira y col., 2004)). Mientras que el primero fue capaz de alimentarse de un organismo productor de cilindrospermopsina, el segundo fue sensible a una cepa de C. raciborskii productor de cilindrospermopsina. La falta de datos impide hacerse una idea de cual es el efecto que este tipo de toxinas tiene en el ecosistema. Aunque esta toxina se ha mostrado que puede persistir en el

256

Introduccin ecosistema sin degradarse durante periodos elevados de tiempo, alcanzando valores elevados de concentracin al acumularse la toxina producida por los organismos al no degradarse (2006).

Una caracterstica que diferencia a esta toxina del resto de las toxinas definidas en este trabajo anatoxina y microcistina, es que no puede considerarse una endotoxina, puesto que es altamente soluble y puede encontrarse tanto en el interior celular como en el medio en el que viven las clulas [Norris, Eaglesham, y col., 2001 #900], aunque no se conocen datos de cual es el porcentaje de la toxina que se encuentra en el interior celular, y cual es la proporcin de ella que se encuentra en el medio extracelular.

1.5. Legislacin.
Hasta el momento, como en el caso de las anatoxinas la Organizacin Mundial de la Salud no ha publicado ningn valor gua acerca de la cilindrospermopsina, ni para ninguna de sus variantes qumicas. Sin embargo, [Humpage & Falconer 2003 #640] han propuesto un valor gua igual al que existe para la microcistina de 1 g L-1 (Humpage y Falconer 2003). Hasta el momento solo en una legislacin nacional nombra esta toxina, esta es, como en el caso de anatoxina, Nueva Zelanda que establece un lmite

provisional para la cilindrospermopsina igual al valor gua propuesto (Kouzminov 2005)., En la legislacin del estado de Queensland (Australia), donde su servicio de salud obliga a la determinacin de esta toxina cuando la concentracin de Aph. ovalisporum es superior a 15000 cel mL-1, y Brasil recomienda que esta toxina no supere los 15 g L-1, aunque no es de carcter obligatorio (Chorus 2005). El resto de los pases entre ellos Espaa carece de legislacin al respecto.

Los datos de parmetros fsico-qumicos, de nutrientes, especies algales presentes cianobacterias y concentraciones de clorofila, as como algunos de los muestreos realizados en este embalse fueron realizados por miembros del CEDEX.

257

Objetivos

2. Objetivos
Dado la falta de datos acerca de la presencia de cilindrospermopsina y sus productores en Espaa y en Europa, los objetivos de este capitulo son:

Analizar la poblacin de cianobacterias en el embalse estudiado e identificar posibles productores de cilindrospermopsina.

Analizar por medio de bioensayos con Artemia salina las muestras con el fin de detectar posibles episodios txicos.

Analizar por medio de HPLC las muestras sestnicas con el fin de detectar la presencia de cilindrospermopsina.

Determinar la proporcin de cilindrospermopsina intra y extracelular que presenta un cultivo de Aph. ovalisporum, y como le afectan los factores ambientales.

258

Materiales y Mtodos

3. Materiales y Mtodos.

3.1. Zona de Estudio.

La zona de estudio incluye el embalse de Arcos descrito ya en el captulo IV.

3.2. Toma de muestras.

La toma de muestras fue realizada como se ha descrito en el capitulo IV .

3.3. Determinacin de parmetros qumicos.

El anlisis de las caractersticas qumicas fue realizada in situ mediante un laboratorio portatil Lange (Germany). Se analizaron las siguientes variables: amonio, que fue analizado utilizando el mtodo Spectroquant 14752 que se basa en el mtodo del azul 2,2-isopropil 5,5-methil-indofenol blue; Nitrato que fue determinado por medio del mtodo Spectroquant 14773 basado en la reaccin del nitrato en presencia de sulfrico con el nitrospectral; Nitritos, Spectroquant 1477 basado en el mtodo del cido sulfanlico y del N-(1-naftyl) etilen-diamonio; Fsforo reactivo soluble que fue medido por el mtodo del cido ascrbico.

3.4. Determinacin de parmetros qumicos.

Los parmetros fisico-qumicos, temperatura, conductividad, oxigeno disuelto, turbidez y pH, fueron medidos in situ por medio de una sonda multiparamtrica YSI modelo 6920 (EEUU) calibrada con anterioridad: la sonda se sumergi permitiendo que los sensores de oxgeno disuelto y pH se estabilizaran antes de comenzar la toma de datos, el descenso en la columna de agua se realiz despacio para obtener un mayor nmero de datos de la columna de agua, ya que la sonda toma un dato cada 4 s. 259

Materiales y Mtodos

3.5. Anlisis biolgicos.

La concentracin de clorofila a fue calculada a partir de las partculas retenidas en filtros GF/F utilizando la formula de Parsons y Strickland 1963, extrayendo los pigmentos con 90% acetona-agua a 4C durante 24 h El anlisis de las especies de cianobacterianas presentes fue realizado como se ha descrito en el Capitulo IV.

3.6. Ensayo de toxicidad.

La toxicidad de las muestras fue realizada por medio de un bioensayo con Artemia salina ((Campbell y col., 1994) y (Metcalf y col., 2002)). El bioensayo fue realizado con nauplios obtenidos despus de exponer quistes de comerciales (Marinemix, Wimex. Alemania) durante 48 h en agua marina artificial. El bioensayo fue realizado en plagas multipocillos de 90 aadiendo a cada pocillo 10 nauplios a cada pocillo y completando el volumen hasta 300 L. Extractos metanlicos de filtros fueron obtenidos igual que para el anlisis de microcistinas (captulo II), pero despus de la evaporacin del extracto en el Girovap fue resuspendido en 1250 L de agua marina artificial. Despus de 24 y 48 h de exposicin a los extractos, las Artemia se observaron bajo lupa binocular (Leica MZ7.5m, Reino Unido) y los nauplios inmoviles fueron considerados muertos y se anot su nmero. Despus de contar los muertos a 48 h, se aadieron 100 L de formaldehido a cada pocillo y se confirm el nmero total de nauplios en cada pocillo. De esos datos se obtuvo una grafica de dosis/mortalidad, que se ajust a una funcin sigmoidea y con ella se calcul la LC50 como g de clorofila a necesarios para matar al 50% de los nauplios. Otro parmetro de toxicidad, el VL50 fue definido como el volumen de agua que contiene las partculas (clulas) necesaria para matar al 50% de los individuos del bioensayo.

3.7. Extraccin y anlisis de cilindrospermopsina.

Las muestras para el anlisis de cilindrospermopsina fueron conservadas a 4 C hasta que se filtraron a travs de filtros GF/F (Whatman, Gran Bretaa) de 47 mm de

260

Materiales y Mtodos dimetro, con un valor nominal de tamao de partcula retenida de 0,7 m. Para la filtracin se utiliz una rampa de filtracin de aluminio (Pall corp., Estados Unidos) y una bomba de vaco Me 4P (Vacuubrand GMBH, Alemania), a baja presin, con el fin de de evitar la rotura celular. El volumen de filtracin fue de 300 a 1000 mL en funcin de la biomasa presente. Las muestras filtradas se mantuvieron en nieve carbnica (-50 C) hasta su llegada al laboratorio, momento en que se guardaron a -20 C. Para la extraccin de cilindrospermopsina, el filtro fue introducido en un tubo de centrifuga, al que se aadieron 2 mL de solucin salina (0,9% NaCl) con 2% de cido frmico (Grado analtico, Merck), esta mezcla fue sometida a ultrasonicacin mediante un sonicador de pistn VibraSonic en su rango de energa media, se le dieron tres pulsos de 30 s manteniendo la muestra a 4C. Posteriormente fue centrifugada a 5000 rpm y se retir el sobrenadante. El sobrenadante fue finalmente pasado a travs de un filtro de peso molecular (10 KDa, Micro VectaSpin, Whatman. Reino Unido) mediante centrifugacin. El contenido en cilindrospermopsina en dicho sobrenadante fue

analizado por HPLC.

El anlisis de las muestras para detectar la presencia de anatoxina fue realizado con un HPLC modelo 2695 Alliance, con un inyector automtico y un detector con un conjunto de diodos modelo 996 (Waters, Estados Unidos). Para la separacin cromatogrfica se utiliz el gradiente descrito por (Torokne y col., 2004). Brevemente se utilizo realizo una carrera isocrtica utilizando como fase mvil 5% metanol-agua (milliQ) utilizando como modificador 0.05% TBAHS tetrabutilamonio sulfato concentrado (Fluka, Alemania). La columna utilizada fue una Spherisorb S5 ODS2 (4.6 x 250 mm) (Waters, Reino Unido). La cilindrospermopsina se identific por su espectro de absorcin en UV y su tiempo de retencin comparndolo con la el patrn de cilindrospermopsina purificada y cuantificada por el Prof. S. Carmeli (Universidad de TelAviv, Israel) como fue descrito en (Banker y col., 1997). La concentracin fue calculada relacionando el rea obtenida a 264 nm con la cantidad inyectada del patrn (Figura V.3 y Figura V.4).

261

Materiales y Mtodos

Figura V.3. Ejemplo de inyeccin de patrones de cilindrospermopsina.

Figura V.4. Espectro de absorcin caracterstico de la cilindrospermopsina.

3.8. Relacin entre cilindrospermopsina intracelular y extracelular y como afectan los factores ambientales.
Una cepa de Aph. ovalisporum aislada del lago Kinneret se creci en medio BG11 tamponado con HEPES (25 mM) hasta alcanzar la fase estacionaria, momento en que fue recogida por centrifugacin (Sorvall RC-5C, Francia) utilizando un tubo DRYSPIN de sorvall de polipropileno de 500 ml en un rotor GS3 a 7000 rpm, a temperatura ambiente, lavando en tres ocasiones y resuspendido finalmente en BG11 sin tamponar. De este cultivo se tomaron 3 alcuotas que se pusieron en medio BG11 (Hepes 25 mM,

262

Materiales y Mtodos pH = 7, Temp. = 25 C, Luz = 22 E) condiciones control, que eran las mismas en las que se encontraba la cepa creciendo antes de recuperarla. Luego se pusieron 2 alcuotas, para el resto de los casos analizados (Tabla V.1), estos cultivos se analizaron a tiempo 0 h, 24 h, 48h y 72 h. A cada uno de estos tiempos de tomaron dos muestras de 35 mL que se filtraron a travs de filtros pre-tarados de policarbonato de 1 m de tamao de poro (Osmonic INC., EEUU). Posteriormente se congelaron a -80C, se liofilizaron y se pesaron antes de extraer y analizar las toxinas presentes como ha sido descrito en el apartado anterior, y se utilizaron para calcular la toxina intracelular. Adems se tomaron 50 mL que se congelaron a -80 C y se liofilizaron, la biomasa recuperada fue resuspendida en 2 mL de solucin salina (0,9% NaCl) con 2% de cido frmico (Grado analtico, Merck), y la toxina presente se extrajo y analiz en las mismas condiciones utilizadas en el apartado anterior.

Caso Control pH 5,5 pH 8,5 15C 20C 30C Alta luz

pH (tampon mM) 7 (Hepes 25 mM) 5,5 (MES 25 mM) 8,5 (Tris-ClH 25 mM) 7 (Hepes 25 mM) 7 (Hepes 25 mM) 7 (Hepes 25 mM) 7 (Hepes 25 mM)

Temperatura (C) 25 25 25 15 20 30 25

Luz (E) 22 22 22 22 22 22 115

Tabla V.1: Condiciones ambientales utilizadas.

263

Resultados

4. Resultados.
El embalse de Arcos se sita en el extremo sur de la Pennsula Ibrica. Este embalse se caracteriza por presentar aguas con una elevada conductividad, y por ser el primero en el cual se ha detectado en grandes cantidades el potencial productor de cilindrospermopsina Aph. ovalisporum, un organismo que parece haber empezado a tener una importancia creciente en la zona mediterrnea.

4.1. Caractersticas Ambientales.

El embalse de Arcos fue muestreado en 7 ocasiones a lo largo del ao 2004. Las muestras fueron tomadas a la profundidad a la que se determin la mxima concentracin de clorofila mediante sonda fluoromtrica. Las caractersticas ambientales encontradas en ese punto se resumen en la Tabla V.2. La concentracin de clorofila a se encontr en un rango entre 4,5 y 52,3 g l-1, obtenindose los valores mas elevados entre finales del mes de agosto y finales del mes de septiembre, lo que parece indicar que las altas concentraciones clorofila podran haberse mantenido a lo largo de todo el mes. El agua muestra valores elevados de conductividad, por encima de 1200 S cm-1, alcanzado valores superiores a 1700 S cm-1 en le mes de julio. El pH puede considerarse alcalino encontrndose valores entre 7,5 y 8,3. La temperatura del agua fue alta con valores mximos superiores a 27 C y durante la mayor parte del ao la temperatura fue superior a 25 C. El oxigeno disuelto se encontr entre el 80% y el 105% de saturacin. Finalmente las concentraciones de nutrientes, presentan importantes diferencias cuando comparamos los valores de nitrgeno inorgnico soluble (NID) y el fsforo reactivo soluble. El NID present concentraciones elevadas con valores superiores a 1 mg L-1. Mientras que el fosfato, salvo en el mes de mayo, estuvo siempre por debajo del limite de deteccin. Cabe destacar los cambios en temperatura y en conductividad que ocurrieron entre el 21 de julio y el 19 de agosto, entre los cuales la temperatura baj dos grados y la conductividad casi 500 S cm-1, lo que podra indicar una entrada de agua hipolimnetica desde el embalse de Bornos situado aguas arriba del embalse analizado.

264

Resultados
Dia de muestreo Clo a g l-1 pH Cond. S cm-1 Temp. C O2 Dis. mg/l (%sat) N-NH4+ g l-1 N- (NO3-+NO2-) g l-1 P-PO43g l-1

19/05/2004 22/06/2004 21/07/2004 10/08/2004 24/08/2004 21/09/2004 07/10/2004

5.3 4.5 22.7 14.2 52.3 28.8 14.0

7.5 8.0 8.0 8.0 7.7 8.3

1460 1473 1756 1277 1312 1586

19.9 25.9 27.2 25.6 25.9 24.3

9.9 (105) 6.7 (80) 8.0 (100) 8.2 (95) 8.8 (105) 6.2 (80)

24 20 94 69 70 99 44

1277 493 502 166 224 100 113

30 <10 <10 <10 <10 <10 <10

Tabla V.2: Caractersticas ambientales del embalse de Arcos.

4.2. Estructura de la comunidad fitoplanctnica.

El fitoplancton en el embalse muestra una marcada sucesin ecolgica durante el periodo de estudio. Las cianobacterias solo llegan a ser relevantes en la poblacin a partir de mediados de julio (Figura V.5). Con anterioridad la comunidad estuvo dominada por dinoflagelados (Ceratium furcoides) y por algas verdes (Closterium aciculare). Los dinoflagelados estuvieron presentes en la poblacin fitoplanctnica durante todo el periodo de muestreo, pero disminuyeron cuando las cianobacterias pasaron a dominar la comunidad. Otros grupos no representados en la Figura V.5 y que si estuvieron presentes en el embalse fueron Rafidofitas, Crisofitas, Xantofitas y Euglenofitas, pero en ningn caso su biovolumen super los 140 mm3 m-3 y representaron como mximo el 3,3% del biovolumen total, con la excepcin de Vacuolaria sp. (Rafidiofitas) que domin la poblacin en mayo an apareciendo a muy bajas concentraciones. Cuando analizamos las especies de cianobacterias que estuvieron presentes durante el periodo analizado, encontramos 8 gneros diferentes, de stos, 4 tuvieron una importancia marginal en la poblacin: Pseudanabaena sp., Synechococcus sp., Woronichinia naegeliana y Microcystis aeruginosa que nunca alcanzaron valores superiores a las 600 cel. mL-1, y solo representaron un mximo del 0.57% del biovolumen cianobacteriano total (datos no mostrados). Las otras cuatro especies que si

265

Resultados mostraron abundancias relevantes en la poblacin fueron: Aphanizomenon ovalisporum, Aphanocapsa sp., Merismopedia sp. y Planktothrix cf. agardhii (Figura V.6).

Planktothrix cf. agardhii fue la cianobacteria dominante en el mes de julio, alcanzando el 95.3% de la biomasa cinoabacteriana expresada como biovolumen, si bien en el resto de los momentos en los que las cianobacterias fueron importantes en la poblacin esta especie fue subdominante. Su lugar como especie cianobacteriana ms importante fue ocupada a partir de entonces por Aphanizomenon ovalisporum que domin la poblacin hasta el mes de septiembre, alcanzando valores de 2709 mm3 m-3. En mes de octubre las cianobacterias dejaron de ser importantes en el biovolumen total y la comunidad volvi a ser dominada por los dinoflagelados.

6000 Cianobacterias Criptofitas Dinoflagelados Diatomeas Clorofitas

5000

Biovolumen (mm3 m-3)

4000

3000

2000

1000

0 19-may 22-jun 21-jul 10-ago 24-ago 21-sep 7-oct

Figura V.5: Biovolumen de los grupos algales principales en el embalse de Arcos.

266

Resultados

1,2e+5 Aphanizomenon ovalisporum Aphanocapsa sp. Merismopedia sp. Planktothrix cf. agardhii

1,0e+5

Nmero de clulas ml

-1

8,0e+4

6,0e+4

4,0e+4

2,0e+4

0,0 19-may 22-jun 21-jul 10-ago 24-ago 21-sep 7-oct

Figura V.6: Nmero de clulas de las cuatro especies cianobacterianas dominantes en el embalse de Arcos.

4.3. Toxicidad de las muestras.

Los resultados obtenidos en este embalse muestran que el 43% de las muestras analizadas fueron txicas en el bioensayo utilizado (Figura V.7), aunque una de ellas fue menos txica de lo que se necesitara para calcular la LC50 bajo nuestras condiciones de anlisis. A esta muestra con el objetivo de visualizar la presencia de esa toxicidad se le ha asignado un valor de toxicidad 10 veces inferior a la menor toxicidad encontrada en este trabajo. En el resto de los casos los valores de toxicidad fueron similares, situando los valores de LC50 entre 2.8 y 3.4 g Clo a mL-1. Cuando estos valores fueron expresados como VL50 observamos que era necesario filtrar 220 mL y 340 mL

267

Resultados respectivamente en agosto y septiembre para conseguir matar al 50% de los nauplios de Artemia del bioensayo. Esto nos permite obtener un valor de toxicidad en volumen de agua del embalse lo que puede resultar muy til para la gestin del recurso. La toxicidad y las concentraciones de cilindrospermopsina estuvieron correlacionadas con el biovolumen del principal posible productor de este compuesto en el embalse Aph. ovalisporum, y no directamente relacionados con la abundancia de P. agardhii la otra cianobacteria presente potencialmente txica.

3000 Aphanizomenon ovalisporum Planktothrix cf. agardhii Toxicidad

0,4

2500

Biovolumen (mm3m-3)

0,3 Toxicidad (1/LC50) 2000

1500

0,2

1000 0,1 500

0 19-may 22-jun 21-jul 10-ago 24-ago 21-sep 7-oct

0,0

Figura V.7: Toxicidad y biovolumen de las dos especies potencialmente toxicas mayoritarias en el embalse de Arcos.

4.4. Concentraciones de cilindrospermopsina.

La nica cianotoxina que ha sido posible detectar en el embalse de Arcos fue la cilindrospermopsina, aunque tambin se analiz la presencia tanto de anatoxina, como microcistina. La presencia de las otras dos toxinas analizadas, si es que estuvieron presentes, debi encontrarse por debajo del nivel necesario para poder ser detectadas por

268

Resultados medio del bioensayo utilizado. Las concentraciones de cilindrospermopsina detectadas alcanzaron valores de 9,4 g L-1, estando en ocasiones por debajo del lmite de deteccin. La concentracin total pudo ser mayor debido a que esta toxina puede encontrarse en la fraccin disuelta y esta fue analizada en una sola ocasin encontrandose el da 24 de agosto una concentracin de cilindropermopsina de 3,17 (L. Wrmer, comunicacin personal). Si asumimos que esta toxina fue nicamente producida por es Aph. ovalisporum, la concentracin en trminos de biomasa presentara una media de 0.16 pg CYN cel-1, 4.7 g CYN mm-3 o 5.5 pg CYN por filamento.

4.5. Relacin entre cilindrospermopsina intracelular y extracelular y como afectan los factores ambientales .

Con el fin de determinar cual era la capacidad que posea esta toxina para atravesar la membrana y cual era su dinmica procedimos a realizar un experimento de laboratorio con una cepa del mismo organismo Aph. ovalisporum aislada del lago Kinneret (Israel). Se determin el crecimiento y la produccin de cilindrospermopsina bajo diferentes condiciones de pH, temperatura y luz.

Cuando analizamos como vari el peso seco (Figura V.8), observamos que el caso del tratamiento pH = 8,5, el resto de los tratamientos no existen diferencias importantes entre los diferentes tratamientos, aunque el pH =5,5 parece que tuvo una carga de biomasa inferior al resto de tratamientos, la curva mantuvo un comportamiento similar. En cuanto a como se comport la relacin entre el peso seco y la concentracin total de cilindrospermopsina (intra y extracelular) (Figura V.10), podemos observa que como en el caso del peso seco, solo en el tratamiento pH = 8,5 se comport de manera diferente especialmente coincidiendo con la bajada en el peso seco del cultivo. En el resto de los casos la relacin se mantuvo constante a lo largo del tiempo (salvo una

269

Resultados pequea subida no significativa en el caso de control a las 72 horas) lo que indicara que el cambio de medio, no modificola produccin de cilindrospermopsina.

Cuando analizamos como se comport la relacin de cilindrospermopsina (Figura V.10) entre la fraccin extracelular e intracelular vemos que en las condiciones control, que eran las condiciones en la que el organismo haba sido crecido desde su aislamiento, la concentracin de cilindrospermopsina se reparti en partes iguales entre la fraccin extracelular e intracelular al cabo de 48 horas (50% extracelular y 50% intracelular) mantenindose estable hasta la 72 horas, siguiendo una curva de saturacin tpica. Cuando analizamos como los diferentes factores afectaban a este porcentaje observamos que la temperatura no afecta a la relacin de toxina intra y extracelular, observamos que el comportamiento es muy similar al encontrado en el tratamiento control, la nica diferencia apreciable consista en un ligero retraso del cultivo crecido a 15 C, que no alcanz el 50% de la toxina extracelular hasta las 72 horas. Los otros dos factores el pH y la luz, sin embargo si presentaron un efecto sobre la cantidad de toxina que encontramos en el medio. El pH aumenta la cantidad de toxina extracelular, siendo esta mucho ms evidente en el caso del pH = 8,5, donde despus de 72 horas toda la toxina encontrada era extracelular, aunque en este caso esto se debi a la toxicidad que presento el tampn utilizado y que produjo la lisis del cultivo, lo que puede observarse al ver que el peso seco (Figura V.9), en ella podemos observar que en este caso se produce una brusca cada en el peso seco ya a las 24 horas cayendo a la mitad. Cuando analizamos el resto de los casos podemos observar que casi no hubo crecimiento a lo largo del tiempo. Se observa un efecto lineal a lo largo del tiempo, alcanzando un valor extracelular de aproximadamente el 80% de la toxina en el medio. Cuando ponemos el cultivo en alta luz, lo que podemos observar es que desde la primera medida a 24 horas la concentracin extracelular es ligeramente mas elevada que en el tratamiento control, y que se mantiene as a lo largo de todo el experimento sin que parezca entrar en la fase de saturacin, para alcanzar un valor cercano al 80%, como en el caso del pH = 5.

270

Resultados
Efecto de pH
1,2 1,2

Efecto de Temperatura
Peso seco (mg PS mL )
-1

Peso seco (mg PS mL )

-1

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 Control pH 5,5 pH 8,5

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 Control 15C 20C 30C

Tiempo (horas)

Tiempo (horas)

Efecto de Luz
1,2

Peso seco (mg PS mL-1)

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 Control Alta luz

Tiempo (horas)

Figura V.8: Efecto del pH, temperatura y luz sobre le el peso seco.
Efecto de pH
0,5 0,8 Control pH 5,5 pH 8,5 0,4

Efecto de Temperatura

g CIL mg PS-1

0,6 0,4 0,2 0,0 0 20 40

g CIL mg PS

-1

0,3 0,2 0,1 0,0 Control 15C 20C 30C 0 20 40 60 80

60

80

Tiempo (horas)

Tiempo (horas)

Efecto de Luz
0,5 0,4

g CIL mg PS-1

0,3 0,2 0,1 0,0 0 20 40 60 80 Control Alta luz

Tiempo (horas)

Figura V.9: Efecto del pH, temperatura y luz sobre le relacin g CIL total mg PS.

271

Resultados
Efecto de pH
Porcentage Cil. extracelular Porcentage Cil. extracelular
100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Control pH 5,5 pH 8,5 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Control 15C 20C 30C

Efecto de Temperatura

Tiempo (horas)

Tiempo (horas)

Efecto de Luz
100

Porcentage Cil. extracelular

80 60 40 20 0 0

Control Alta luz

20

40

60

80

Tiempo (horas)

Figura V.10: Efecto del pH, temperatura y luz sobre le porcentaje de cilindrospermopsina extracelular sobre la microcistina total.

272

Discusin

5. Discusin
Durante los ltimos aos ha existido un creciente inters en la presencia de cilindrospermopsina en los cuerpos de agua europeos, especialmente debido a la que durante estos aos se ha tenido constancia de la mayor importancia que va teniendo uno de sus productores principales en nuestros cuerpos de nuestro continente C. raciborskii (Briand y col., 2004), aunque como veremos con posterioridad las cepas de esta especie encontrados en nuestro continente parecen no ser capaces de producir esta toxina. Menor importancia se ha dado a otros posibles productores, especialmente a Aph. ovalisporum puesto que hasta hace poco se consideraba una especie rara, y no se conoca la aparicin de afloramientos de esta especie en Europa.

Los resultados que se muestran en este captulo suponen el primer afloramiento de Aph. ovalisporum en un cuerpo de agua dulce Europeo, aunque la especie se ha encontrado en Grecia, Italia y Turqua ((Gkelis y col., 2005) (Kouzminov 2005) y (Cirik y col., 1992)). La dominancia de esta especie de cianobacterias en el mes de agosto del 2004 parece estar asociada con una entrada de agua fra hipolimntica desde el embalse de Bornos situado aguas arriba. Nosotros especulamos que esta agua pudo traer el inculo inicial de esta especie en forma de acinetos, aunque sera necesario un estudio ms en profundidad para poder confirmar esto. Esta entrada de agua contribuy a disminuir a un tercio las formas oxidadas de nitrgeno inorganico (nitrato y nitrito). Esta deficiencia de nitrgeno podra haber disparado la sucesin ecolgica favoreciendo a una especie fijadora de nitrgeno como puede ser Aph. ovalisporum.

Aph. ovalisporum es una conocida cianobacteria que empez a atraer una especial atencin cuando fue descrita en 1994 como una especie invasora, que fue capaz de producir afloramientos en el lago Kinneret, la principal fuente de agua potable de Israel (Zohary 2004), siendo descrita poco despus como especie productora de cilindrospermopsina (Banker y col., 1997). Esta especie ha sido encontrada tambin en varios embalses de nueva construccin en Australia (Shaw y col., 1999). Aparte de en estas localizaciones, esta especie solo ha sido descrita en Europa, en Grecia (Gkelis y

273

Discusin col., 2005) y en Italia (Bazzichelli y Abdelahad 1994), aunque su presencia en Amrica parece confirmada (Komarek 1984).

El afloramiento de Aph. ovalisporum del embalse de Arcos alcanz sus concentraciones mximas entre los meses de agosto y septiembre, con una concentracin mxima de 3834 filamentos mL-1, cuando la temperatura del agua fue superior a 25 C y la conductividad se encontr en valores alrededor de 1500 S cm-1. Estas condiciones fueron similares a las encontradas en el lago Kinneret y en los embalses donde se encontr en Australia ((Hadas y col., 2002; Pollingher y col., 1998) y (Shaw y col., 1999)). Mientras que la poblacin de Aphanizomenon fue similar a la encontrada en el lago Kinneret, con un mximo de varios millares de filamentos por mL, en los embalses australianos fue bastante superior llegado a formar un gran acumulo superficial. Esta diferencia puede deberse a una menor carga de nutrientes, o a las diferentes condiciones meteorolgicas o hidrolgicas (Walsby y col., 2003).

Tras la aparicin del afloramiento de Aph. ovalisporum en el lago Kinneret, (Banker y col., 1997) consiguieron aislar la toxina cilindrospermopsina de cultivos de laboratorio obtenidos de las muestras del lago. Como es habitual entre los productores de cianotoxinas, la produccin no depende de la especie encontrada sino de la cepa concreta, por ejemplo en Portugal y Alemania se han aislado varias cepas de C. raciborskii, especie que es conocida por su capacidad de producir cilindrospermopsina en Australia y Amrica , que se han caracterizado por presentar toxicidad pero no debida a la cilindrospermopsina ((Saker y col., 2003) y (Fastner y col., 2003)).

En los ltimos aos se han utilizado varios ensayos de toxicidad con diversos organismos modelos que han mostrado el efecto de las cilindrospermopsina ((Nogueira y col., 2004; Kiss y col., 2002) y (Metcalf y col., 2002)). En este trabajo hemos utilizado un bioensayo con Artemia salina para identificar la toxicidad en afloramientos de cianobacterias. Este test muestra que las muestras de seston recogidas del embalse de Arcos a final de agosto y septiembre fueron txicas. Cuando analizamos esta toxicidad en funcin de que especie de cianobacteria est presente observamos que esta toxicidad se corresponda mejor con la presencia de Aph. ovalisporum que con la presencia de P.

274

Discusin agardhii el cual lleg a presentar biomasas de 4590 clulas por mililitro el da 21 de julio, sin embargo la biomasa obtenida ese da bioensayo de Artemia. no present efectos txicos en el

Para asegurar que el efecto de toxicidad se deba a la cilindrospermopsina, se analizaron las muestras en busca de los otros dos tipos de cianotoxinas ms habituales: microcistinas y anatoxinas. Sin embargo, ninguna toxina de estos tipos pudo ser encontrada. Estos son los primeros datos de concentraciones elevadas de cilindrospermopsina en cuerpos de agua europeos. Dicha toxina ha sido tambin encontrada en Alemania ((Fastner y col., 2007) y (Fastner y col., 2003)), en este pas las concentraciones ms elevadas detectadas fueron de 0,2 g L-1, aunque la metodologa utilizada impidi conocer las concentraciones de cilindrospermopsina en g L-1, aunque comparando los datos de cilindrospermopsina (CIL) en g CIL g PS-1, parecen indicar que las concentraciones encontradas estuvieron en el mismo rango en ambos trabajos, lo que indicara que estos estuvieron por debajo de los encontrados en el embalse de Arcos cerca de 2 rdenes de magnitud. Las concentraciones de cilindrospermopsina encontradas en nuestro trabajo son similares a las encontradas en el lago Kinneret, donde el contenido de cilindrospermopsina por peso seco estuvo en un rango entre 1 y 3 g mg PS-1 (A. Sukenik comunicacin personal) de peso seco, dos rdenes de magnitud superiores a los encontrados en Alemania. Sin embargo estos datos fueron muy inferiores a los publicados en Australia [(Shaw y col., 1999).

El anlisis de cilindrospermopsina fue realizado sobre filtros, este hecho impide conocer cual era la concentracin de cilindrospermopsina total, puesto que esta toxina es capaz de atravesar la membrana plasmtica y encontrarse tanto en el interior celular como en el medio que las rodea (Norris y col., 2001), aunque no existen datos publicados en revistas internacionales que indiquen cual es la importancia que esta fraccin tiene sobre el total, datos encontrados por nuestro grupo de investigacin (Wormer 2006) muestran que esta toxina puede presentarse en concentraciones similares en el medio que en la fraccin datos que estaran de acuerdo con los valores obtenidos en el experimento realizado que muestra que, al menos en la cepa de cianobacteria utilizada el 50% de la toxina encontrada aparece en el medio extracelular, y que esta parece ser

275

Discusin capaz de atravesar la membrana. Los experimentos realizados con la cepa aislada del lago Kinneret muestran que en tan solo 72 horas la concentracin de toxina extracelular parece alcanzar el equilibrio con la intracelular, encontrndonos la mitad de la toxina dentro de las clulas y la otra mitad en el medio que las rodea. En cuanto a los factores ambientales ensayados en los experimentos de laboratorio, parecen indicar que la temperatura no influye en la cantidad de toxina presente. sin embargo, pH e irradiancia si influyen. Esto puede deberse a que ambos producen lisis de las clulas, y de esta manera incrementan la cantidad de toxina extracelular. Por otro lado esta prdida de toxina intracelular no parece que afecte a su produccin a corto plazo, de manera que parece que al menos en 72 horas la prdida de toxina intracelular no aument su produccin. Estos valores de toxina extracelular convierten a esta cianotoxina en un compuesto que puede tener especial relevancia a la hora de considerar los cuerpos de agua con usos recreativos, ante la aparicin de este tipo de toxinas. El que dicha toxina sea soluble y extracelular incrementara su efecto sobre los organismos que entren en contacto con ella, en comparacin por ejemplo a la microcistina que es una endotoxina y es necesaria la lisis celular para que pueda ponerse en contacto con los seres humanos, si no existe una ingestin accidental de biomasa que presente microcistinas.

Esta es la primera vez en que este compuesto, la cilindrospermopsina y el organismo productor, Aph. ovalisporum fue detectado en aguas espaolas, aunque con posterioridad ha sido detectado en otros cuerpos de agua espaoles (Wormer 2006). Esto, junto con la deteccin en ms de la mitad de los cuerpos de agua analizados en Alemania (Fastner y col., 2007), parecen indicar que sera importante desarrollar un valor gua para este tipo de toxinas que no ha sido establecido en la legislacin europea. En Australia y Nueva Zelanda donde la presencia de este tipo de organismos y de toxina esta regulado, aunque no existe en el caso del primero de ellos un valor gua en cuanto a su concentracin ((Chorus 2005) y (Kouzminov 2005)). El efecto de la cilindrospermopsina sobre humanos cuando el contacto es por va recreativa es desconocida, sin embargo el hecho de que una importante parte de la toxina pueda ser extracelular (Shaw y col., 1999) y su toxicidad podra hacer que su presencia en un cuerpo de agua representara una limitacin de sus usos recreativos.

276

Discusin

DISCUSIN

277

Discusin

Espaa como pas que posee un clima Mediterrneo, presenta escasez de agua que puede considerarse crnica. Esta falta de agua a llevado a que seamos uno de los pases europeos que presenta una mayor utilizacin de las aguas superficiales para usos de abastecimiento de la poblacin. En parte debido al gran nmero de embalses de los que dispone, mas de mil embalses construidos. Esta gran dependencia que gran parte de la poblacin espaola tiene del agua embalsada para su consumo, hace apropiado dedicar especial atencin a su calidad general, y a la presencia de cianobacterias toxicas y sus toxinas en particular.

Como ya hemos indicado con anterioridad se han analizado en total 14 embalses en varias cuencas hidrogrficas espaolas, y slo uno de los cuerpos de agua analizados no ha presentado cianobacterias potencialmente toxicas. Esto parece indicar que la presencia de organismos potencialmente txicos es comn en Espaa, lo que confirma los datos publicados recientemente y que ya mostraban que salvo en las cuencas del Jcar y el Segura, las cianobacterias planctnicas potencialmente toxicas son comunes en nuestros embalses, llegando en mltiples ocasiones a dominar la poblacin fitoplanctnica. De esta manera los afloramientos de cianobacterias potencialmente txicas puede llegar a ser un hecho bastante usual en nuestros embalses.

En cuanto cuales podran ser en cuestin de probabilidad los gneros de cianobacterias potencialmente txicas ms comunes en nuestro pas, parece claro que los tres gneros mas comunes son Microcystis, Aphanizomenon y Anabaena tal y como en otras zonas Mediterrneas. Estos 3 gneros junto con Planktothrix son los las cuatro gneros mas comunes en todo el mundo. Esto indicara que nos encontramos ante un fenmeno global y no exclusivo de una zona especfica. En cuanto a las especies ms comunes en nuestro pas, habra posiblemente cuatro que sobresaldran sobre el resto, que seran: M. aeruginosa, M, flos-aquae, Aph. flos-aquae y A. flos-aquae y que fueron no slo las mas comunes en la Comunidad de Madrid, sino en toda Espaa segn los datos de nuestros estudios no recogidos en esta Tesis Doctoral.

Cuando unimos la presencia de toxinas a las especies que aparecen en los embalses espaoles, parece claro que M. aeruginosa destaca sobre el resto en cuanto a

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Discusin la posibilidad de presentar toxicidad. Si existe un tipo de toxina que destaca sobre el resto en cuanto a prevalencia, ste es el grupo de las microcistinas. Siendo precisamente M. aeruginosa la que est relacionada con esta toxicidad, aunque en este trabajo no hemos podido correlacionar la concentracin de toxina con su abundancia relativa, y hemos encontrado que existe una capacidad de produccin de toxinas muy diferente en las diferentes cepas de esta especie que se han encontrado en los embalses.

En cuanto a Anabaena, es la especie que presenta la mayor diversidad en cuanto a la capacidad de producir toxinas, se conocen cepas dentro de este gnero que son capaces de producir las principales toxinas de cianobacterias, hepatotoxinas, neurotoxinas y citotoxinas. Pero en el caso de los embalses espaoles parece claro que existe un bajo numero de cepas capaces de producir toxinas, solo en una ocasin se ha podido asociar la presencia de toxicidad a una un organismo perteneciente a este genero: la produccin de anatoxina en el embalse de Rosarito, presentando concentraciones muy bajas, menores a las encontradas en otros pases europeos.

Una consideracin aparte merece el gnero Aphanizomemon, esta claro que su capacidad de producir neurotoxinas es muy bajo, y no se ha confirmado que sean capaces de producir hepatotoxinas, pero parece que pueden ser el principal productor de cilindrospermopsina en Europa, y la falta de datos acerca de esta capacidad se debe fundamentalmente a que hasta hace muy poco tiempo los trabajos acerca de esta toxina se haban centrado en su principal productor en Asia y Oceana, Cylindrospermopsis. raciborkii.

Finalmente, indicar que se han detectado los tres tipos de toxinas ms habituales en los embalses espaoles, aunque las concentraciones de anatoxina-a pueden considerarse bajos. Las concentraciones de los otros dos compuestos sin embargo han mostrado concentraciones elevadas en el rango de g L-1, especialmente en el caso de la microcistinas donde hemos detectado concentraciones superiores a los 50 g Mc L-1, lo que es un valor elevado considerando que hemos evitado la recogida de muestras en acumulaciones de cianobacterias

279

Conclusiones

CONCLUSIONES

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Conclusiones

Los resultados obtenidos en este trabajo han permitido obtener las siguientes conclusiones:

Las cianobacterias potencialmente txicas son muy comunes en la Comunidad de Madrid, siendo los gneros ms importantes Microcystis, Aphanizomenon y Anabaena.

Los afloramientos producidos por estos organismos son comunes y llegan a alcanzar elevadas concentraciones de clorofila a. aunque la falta de una definicin que defina lo que es afloramiento dificulta su comparacin.

Los dos especies ms comunes de cianobacterias potencialmente txicas Aph. flos-aquae y M. aeruginosa aparecen juntas, lo que indica que poseen similares caractersticas ecolgicas.

Nuestros datos han permitido definir el nivel de afloramiento en la Comunidad de Madrid cuando la concentracin de clorofila a supera los 50 g de clorofila a por litro.

La microcistina es el tipo de cianotoxina ms comn en la Comunidad de Madrid, pudindose encontrar en todos los embalses analizados (7) y alcanzando concentraciones superiores a 50 g Mc L-1, en la columna de agua, evitando las acumulaciones superficiales La principal especie responsable de su produccin es M. aeruginosa.

Los meses de septiembre y octubre son los que presentan mayor probabilidad de encontrar microcistinas en los embalses de la Comunidad de Madrid. Este rango temporal coincide tambin con el que abundan los afloramientos.

Existe una gran variabilidad en cuanto a las concentraciones de microcistinas observadas en los embalses de la Comunidad de Madrid, destacando el embalse de Santillana por las elevadas concentraciones de microcistinas que presenta. 281

Conclusiones

En el embalse de Santillana se ha encontrado un cambio en las estirpes de M. aeruginosa, definidas por una variacin en el gen mcyB. Esta variacin conduce a un cambio en el patrn de toxinas observadas. La variacin genotpica puede responder a una variacin de las condiciones ecolgicas.

La tcnica de espectrometra de masas, Maldi-TOF, ha permitido identificar diferentes quimiotipos de cianobacterias txicas que se podran asimilar a diferentes genotipos. Esta tcnica ha mostrado una elevada diversidad quimiotpica en un nico afloramiento aunque la biomasa de dicho afloramiento est dominada por slo dos quimiotipos

Los potenciales productores de anatoxina-a son comunes en los embalses espaoles, pero eso no se refleja en la importancia de esta toxina en nuestro pas donde puede considerarse una toxina rara. El principal productor conocido A. flos-aquae parece compuesta en nuestro pas por estirpes no productoras de este tipo de compuestos, con una nica excepcin en el embalse de Rosarito.

Se ha detectado un afloramiento de Aph. ovalisporum en el embalse de Arcos, siendo esta la primera ocasin en que un afloramiento as ha sido descrito en Espaa y una de las primeras veces que en que este organismo es descrito en Europa.

Por primera vez se ha encontrado cilindrospermopsina en Espaa. Las concentraciones encontradas son muy elevadas, dos ordenes de magnitud superiores a las publicadas hasta la fecha en Europa.

Los hallazgos de nuestros trabajos hacen recomendable monitorizar de manera regular los cuerpos de agua que se usen para consumo humano y que presenten cianobacterias potencialmente productoras de toxinas en algn momento del ao.

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300

Anexo

ANEXO I

Anexo I

Da 5-9-2002 8-10-2003 15-10-2003

NID g N L-1 Total (NO2-,NO3-,NH4+) 160,0 (ND, ND, 160,0) 220,4 (6,4, 47,3, 166,7) 139,1 (ND, 22,4, 116,7)

Fsforo g P L-1 Total, Soluble 113, nd 97,2, 26 62, 36

Relacin DIN/Ptot 1,4 2,3 2,2

Tabla 1. Nutrientes encontrados en el punto L2 en los aos 2002/2003. ND = no detectado, nd = no determinado.

Temp. (C) Da

Turbidez (NTU)

Conductivida d S cm-1 100 1 85 0,2 84 0,2

Oxigeno disuelto (mg L-1) 11,9 0,1 8,19 0,5 8,71 0,2 pH

5-9-2002 8-10-2003 15-10-2003

20,2 0,5 16,7 0,2 17,2 0,1

18,6 0 12,8 12 17,9 1

9,95 0,0 7,34 0,4 8,71 0,2

Tabla 2. Variables fisco-qumicos en el punto L2. Temp. = temperatura, NTU (unidades nefolomtricas de turbidez).
Conc. Clo a Da % de algas verdes % de cianobacteri as 100 91,2 57,4 0 0 21,4 % de diatomeas % de criptofitas

g L-1

5-9-2002 8-10-2003 15-10-2003

96,8 6,5 14,99 0,13 15,64 0

0 8,8 19,0

0 0 0

Tabla 3. Concentracin de clorofila a y porcentaje de cada grupo algal en el punto L2. Conc = concentracin. Los porcentajes de cada alga se han determinado por tcnicas fluoromtricas.

II

Anexo I

Da 1-9-2002 6-9-2002 12-9-2002 7-10-2002

NID g N L-1 Total (NO2-,NO3-,NH4+) 70 (ND, ND, 70) 396 (ND, ND, 396) 93 (ND, ND, 93) 197 (ND, 53, 116,7)

Fsforo g P L-1 Total, Soluble 162, nd 114, nd 218, nd 144, nd

Relacin NID/Ptot 0,43 3,4 0,43 1,18

Tabla 4. Nutrientes encontrados en el punto S2 en el ao 2002. ND = No detectado, nd = no determinado.

Da

Temp. (C)

Turbidez (NTU) 8,6 2,6 17,4 1,8 31,1 1,5 14,89 1,4

Conductivida d S cm-1 100 1 100 1 110 0 90 1

Oxigeno disuelto (mg L-1) 6,05 0,01 5,25 0,16 10,36 0,0 8,94 0,07 pH

1-9-2002 6-9-2002 12-9-2002 7-10-2002

21,5 0,2 19,6 0,1 19,7 0,0 17,4 0,3

8,7 0,0 7,3 0,0 8,9 0,0 8,28 0,0

Tabla 5. Datos fisico-qumicos encontrados en el punto S2 en el ao 2002 en el embalse de Santillana. Temp. = temperatura, NTU (unidades nefelomtricas de turbidez)

III

Anexo I
S2 2003
30 25 20 15 10 5 0 100 90

S2 2003
80

Temperatura del agua (C)

Turvidez (NTU) jul ago sep oct nov dic

70 60 50 40 30 20 10 0

jun

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

S2 2003
130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 14 12

S2 2003
Oxigeno disuelto (mg L )

Conductividad (mS cm-1)

-1

10 8 6 4 2 0

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

S2 2003

pH

6 4 2 0

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura 6. Variables fisico-qumicas analizadas en el embalse de Santillana. Se muestran la temperatura del agua, turbidez, conductividad, oxigeno disuelto y pH para el ao 2002 y 2003.

IV

Anexo I
S2 2003
1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

S2 2003
400 350

Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)

Fosforo (g P L-1)

Amonio Nitrato Nitrito

Fosfato soluble Fosforo total

300 250 200 150 100 50 0

jun

jul

ago
20 18

sep

oct

nov

jun

jul

ago

sep

oct

nov

S2 2003
16 14 12 10 8 6 4 2 0

NID/Ptot (g N g P )
-1

jun

jul

ago

sep

oct

nov

Figura 7. Concentraciones de nutrientes del punto S2 en el embalse de Santillana. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot y fosfato soluble para el ao 2003.

Conc. Clo a Da

g L

-1

% de algas verdes

% de cianobacteri as 98,8 1,6 77,2 8,2 ND 0,4 0,7

% de diatomeas

% de criptofitas

1-9-2002 6-9-2002 12-9-2002 7-10-2002

83,8 5,1 59,0 3,8 116,6 2,6 79,30 1,32

2,2 0,01 22,8 8,2 ND 34,8 3,7

00 00 ND 00

00 00 ND 64,8 2,9

Tabla 8. Concentracin de clorofila a y porcentaje de cada grupo algal en el punto L2. Conc = concentracin. ND = No Determinado

Anexo I

S2 2003
60 50 100 80 60 30 20 10 0 jun 40 20 0 jul ago sep oct nov dic

40

Figura 1. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el punto S2 del embalse de Santillana en el ao 2003. Se muestran las concentraciones de clorofila determinadas mediante extraccin metanlica y % de esa clorofila que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo)) determinada por mtodos fluoromtricos en barras.

S1 2003
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
11 -6 -0 3 4703 11 -7 -0 3 16 -7 -0 3 23 -7 -0 3 20 -8 -0 3 27 -8 -0 3 810 -0 3 15 -1 003
M. aeruginosa M. flos-aquae M. wesenbergii A. planktonica A. crassa A. flos-aque Anabaena sp. Aph. Flos-aque

% de grupos algales

Clo a g L-1

W. naegliana

Figura 2. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el punto S2 en el ao 2003.

VI

Anexo I

Da 12-7-2002 27-7-2002 6-8-2002

NID g N L-1 Total (NO2-,NO3-,NH4+) 50 (ND, ND, 50) 60 (ND, ND, 60) 43 (ND, ND, 43)

Fsforo g P L-1 Total, Soluble nd, nd nd, nd 93,7, nd

Relacin NID/Ptot nd nd 0,45

Tabla 9. Nutrientes encontrados en el punto V2 en el ao 2002. ND = No detectado, nd = no determinado.

V1 2003
Nitrgeno Inorgnico Disuelto (g N L-1)
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 200

V1 2003
Fosfato soluble Fosforo total

Fosforo (g P L-1)

Amonio Nitrato Nitrito

150

100

50

jun

jul

ago
-1

sep DIN - Relacin Fosforo Total (g N g P )

10

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

V1 2003
8

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura 3. Concentraciones de nutrientes del punto V2 en el embalse de Valmayor. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot y de fosfato soluble para el ao 2003.

VII

Anexo I

Da

Temp. (C)

Turbidez (NTU) 10,3 2,8 12,4 1,5 9,8 1,8

Conductivida d S cm-1 120 0 140 0 120 0

Oxigeno disuelto (mg L-1) 10,02 0,1 10,5 0,35 8,53 0,15 pH

12-7-2002 27-7-2002 6-8-2002

22,8 0,3 21,3 0,2 22,6 0,2

9,8 0,0 10,4 0,0 10,13 0,0

Tabla 10. Datos fsico-qumicos encontrados en el punto V2 en el ao 2002 en el embalse de Santillana. Temp. = temperatura, NTU (unidades nefolomtricas de turbidez).
V2 2003
30 25 20 15 10 5 0 40 35 30

V2 2003

Temperatura del agua (C)

Turvidez (NTU) jul ago sep oct nov dic

25 20 15 10 5 0

jun

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

V2 2003
200 180 14 12 160 140 120 100 80 60 40 20 0

V2 2003
Oxigeno disuelto (mg L-1)

Conductividad (mS cm )

-1

10 8 6 4 2 0

jun
12 10 8

jul

ago

sep

oct

nov

dic

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

V2 2003

pH

6 4 2 0

jun

jul

ago

sep

oct

nov

dic

Figura 4. Concentraciones de nutrientes del punto V1 en el embalse de Valmayor. Se muestran las concentraciones de nitrato, nitrito, amonio, fsforo total y relacin NID/Ptot y de fosfato soluble para el ao 2003. VIII

Anexo I

Conc. Clo a Da

g L-1

% de algas verdes

% de cianobacteri as 43,3 1,8 28,0 0,3 41,2 0,1

% de diatomeas

% de criptofitas

12-7-2002 27-7-2002 6-8-2002

83,8 5,1 59,0 3,8 116,6 2,6

56,1 1,6 71,9 0,3 58,8 0,1

00 00 00

00 00 00

Tabla I.11. Concentracin de clorofila a y porcentaje de cada grupo algal en el en el embalse de Valmayor en el punto V2. Conc = concentracin.

V2 2003
60 50 100 80 60 30 40 20 10 0 may 20 0 jun jul ago sep oct nov dic

40

Figura 5. Concentraciones de clorofila a y porcentaje de grupos algales en el punto V2 del embalse de Valmayor en el ao 2003. Se muestran las concentraciones de clorofila determinadas mediante extraccin metanlica y % de esa clorofila que pertenece a cada uno de los cuatro grupos algales (algas verdes (verde), cianobacterias (azul), diatomeas (marrn) y criptofitas (rojo)) determinada por mtodos fluoromtricos.

% de grupos algales
IX

Clo a g L-1

Anexo I

V2 2003
Distribucion relativa
6 5 4 3 2 1 0
15 -1 003 24 -1 003
Anabaena sp. Aph. Flos-aque

24 -9 -0

M. aeruginosa M. flos-aquae

M. wesenbergii A. planktonica

910 -0

11 -9 -0

18 -9 -0

A. crassa A. flos-aque

W. naegliana

Figura 6. Distribucin relativa de cianobacterias planctnicas presentes en el punto V2 en el ao 2003.