TECNOLOGAS DEL ADN RECOMBINANTE

Durante mucho tiempo los cidos nucleicos resultaron incomprensibles: su increble tamao y su montona secuencia de bases parecan obstculos insuperables en el camino del anlisis molecular de los genes. Con la llegada de nuevos mtodos bioqumicos, esta situacin ha cambiado por completo: hoy en da los cidos nucleicos son ms sencillos de explorar que cualquier otra molcula compleja de las clulas. El motor de estos rpidos cambios es el desarrollo de nuevas tcnicas semiautomatizadas que permiten una identificacin segura, una multiplicacin rpida y una reestructuracin prcticamente arbitraria de los cidos nucleicos. La ampliacin y el perfeccionamiento del abanico de mtodos gentico-moleculares han renovado la investigacin en biomedicina. En este captulo queremos tratar los mtodos con los cuales se puedan reconocer, separar, multiplicar y modificar los cidos nucleicos. Las manipulaciones de la biologa molecular permiten la fabricacin de protenas recombinantes que actan de frmacos o vacunas sin apenas lmites. La transferencia gentica en los oocitos fecundados posibilita la obtencin de animales transgnicos; la delecin o la modificacin gentica dirigida permite crear modelos animales de enfermedades humanas. Tras un esfuerzo excepcional, en el ao 2001 se consigui presentar un primer diseo de la secuencia del genoma humano, que nos sirve como sistema de navegacin en el descubrimiento de nuevos genes, en la localizacin de defectos genticos y, cmo no, en el anlisis funcional de los productos genticos. Empezamos nuestra expedicin a travs de los mtodos y tcnicas de biologa molecular de rotura dirigida de los cidos nucleicos.

1. Las endonucleasas de restriccin rompen el DNA en lugares definidos: Las molculas de DNA pueden tener medidas extraordinarias; los cromosomas humanos contienen cadenas de DNA alineadas hasta bp. El genoma procaritico en forma de anillo es considerablemente menor, pero contiene aun unos bp. Por tanto, un paso decisivo al principio de un anlisis de DNA es el desmembramiento enzimtico de los cidos nucleicos en fragmentos manejables. Las endonucleasas que rompen DNA fragmentan la hebra de cidos nuclicos en muchos lugares. Por el contrario, las endonucleasas de restriccin, llamadas tambin enzimas de restriccin, rompen la doble hebra solo si reconocen una secuencia seleccionada: poseen pues una especifidad de rotura restrictiva. Las endonucleasas de restriccin son de origen bacteriano. Normalmente cortan la doble hebra de DNA en puntos caractersticos que a menudo presentan secuencias palindrmicas de cuatro, seis u ocho nucletidos de longitud. Segn la posicin del corte, las endonucleasas de restriccin producen extremos suaves o extremos sobresalientes de la doble hebra. El tamao de la secuencia de reconocimiento de una endonucleasa de restriccin define la secuencia de corte media: una enzima que reconoce una secuencia de cuatro pares de bases cortas estadsticamente con una frecuencia de 1 : 44, es decir, una media de una vez cada 256 nucletidos. Las enzimas de restriccin con preferencia por una secuencia de hexanucletidos cortan en cambio con una 6 frecuencia de 1 : 4 , es decir, una media de uno cada 4 096 nucletidos. Una aplicacin importante de estas enzimas es el digerido de restriccin del DNA. Una enzima de restriccin rompe un DNA aislado dependiendo de la cantidad de secuencias de reconocimiento en un nmero definido de fragmentos. Si, por ejemplo se dirige en DNA de un fago-lambda con la enzima Hind III , que reconoce la secuencia destino AAGCTT y que se encuentra siete veces en el

DNA del fago, se obtienen ocho fragmentos diferentes que se pueden examinar electroforticamente. Los cidos nucleicos tienen una elevada carga negativa debido a sus grupos fosfato: a pH fisiolgico estn disponibles como aniones, que en un campo elctrico corren en direccin al nodo. Si se usa un gel de agarosa poroso se pueden separar los cidos nucleicos por tamao, es decir, los fragmentos de DNA menores avanzan rpido y los cidos nucleicos grandes, despacio. Las bandas de DNA que se originan en la electroforesis no son visibles al principio; se revelan con bromuro de etidio, que se intercala entre los pares de bases de la doble hlice de la DNA y produce fluorescencia bajo luz UV. Si se realiza el digerido de restriccin de un DNA con dos enzimas como por ejemplo, Hind III y Bam HI, se consiguen patrones de fragmentos distintos. La aplicacin combinada de ambas enzimas al mismo tiempo Hind III y Bam HI da finalmente como resultado un tercer patrn de fragmentos que es ms complejo que los dos patrones individuales. Si se examinan los patrones de fragmentos por electroforesis en gel y se combinan los resultados, se puede reconstruir la secuencia relativa de los fragmentos individuales en el DNA original: este proceso se denomina mapeo de restriccin. En virus y bacterias como E. coli se usan mapas de restriccin para localizar rpidamente un corte del DNA en el genoma correspondiente y para utilizar los fragmentos de DNA correspondientes con fines concretos. Los mapas de restriccin son de una gran ayuda en el anlisis estructural de genes y en el aislamiento de cortes genticos de inters. Sin embargo, los mapas detallados requieren el uso de tres y ms enzimas de restriccin. 2. Las molculas de DNA pueden recombinarse: Muchas enzimas de restriccin generan extremos sobresalientes. Debido a que estos nuevos extremos pueden formar un apareamiento de bases con extremos complementarios de cualquier DNA que se hubiese cortado con la misma enzima, se denominan extremos cohesivos. De esta manera se pueden combinar dos fragmento de DNA que originalmente formaban parte de diferentes regiones genmicas; en tal caso se habla de DNA recombinante. La fabricacin de DNA recombinante abre nuevas posibilidades para producir nuevas protenas, as como para multiplicar secuencias de DNA concretas.

La insercin de un fragmento de DNA (en ingls, insert) en una molcula de DNA linearizada (el llamado vector) permite multiplicar determinados fragmentos de DNA en clulas husped: hablamos de la clonacin de un fragmento de DNA. Los vectores usados con mayor frecuencia son bacterifagos, es decir, virus de bacterias con DNA circular, as como plsmidos. Los plsmidos son molculas de DNA circulares presentes en la naturaleza con 100 kbp que poseen un origen de replicacin y pueden multiplicarse en las bacterias independientemente del genoma husped. Para la clonacin se linealiza el DNA del plsmido con la misma enzima de restriccin que se usa tambin para fabricar el fragmento de DNA de inters; a continuacin se mezclan ambos DNA. Los extremos cohesivos de los fragmentos de DNA hibridan con los extremos libres de DNA vector y cubren el hueco en el DNA del plsmido. El resultado es un DNA circular aumentado. Una DNA-ligasa precinta la rotura de la hebra. El plsmido recombinante se introduce en E. coli, donde puede multiplicarse. Este proceso se conoce como transformacin.

3. La reaccin en cadena de la polimerasa multiplica segmentos de DNA definido La clonacin del DNA, es deci Ia fabricacin de muchas copias exactas de un cido nucleico, ha revolucionad el estudio molecular de las clulas y los organismos. EI modo ms sencillo de multiplicar un segmento de DNA especifico se basa en la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR {del ingls, polymera se ghain yeaction) S. Una condicin previa es conocer, por lo menos, partes de la secuencia de DNA de inters. Con estas informaciones de secuencia del principio de la fluorescencia la posicin del gen buscado en el cromosoma correspondiente (fi gura 22.1 3). EI chromo - slmal painting asigna genes aislados o pequeos segmentos de DNA a los cromosomas individuales y posibilita con ello el mapeo de sus posiciones relativas dentro del cromosoma portador, as como la demos* traccin de translocaciones cromosmicas. Con la hibridacin in situ tambin se puede analizar ia distribucin de las molculas de RNA (generalmente nRNAI en una clula, un tejido 0 un organismo. Para ello se preparan delgados cortes de tejido, se fijan con cuidado sobre portaobjetos y se hibridan con sondas de DNA especficas. Bajo estas condiciones, el RNA presenta slo una hebra, mientras que el DNA cromosmic0 permanece en forma de doble hebra y, por lo tanto, no puede hibridarse. Si se usa un marcador fluorescente hablamos de una hibridacin in situ acoplada a fluorescencia, abreviadamente FISH. Con esta tcnica se puede, por ejemplo, seguir ya distribucin de un mRNA durante el desarrollo embrionario y extraer conclusiones acerca del papel de un gen individual en el proceso de diferenciacin. Con esto hemos visto las tcnicas ms importantes de fragmentacin, enlace, secuenciacin e identificacin del DNA. Les llega el turno ahora a las posibilidades de multiplicacin y modificacin del DNA.

22,13 Localizacin cromosmica. Tipicamente se usan cromosomas metafsicos cuyo DNA posee un alto grado de condensacin. El marcador fluoescente muestra aqu una coloracin en regiones especficas del par de cromosomas 22 humano. Mediante la aplicacin de diferentes fluorgenos se pueden localizar dos o ms genes al mismo tiempo. [Pi]

Con la hibridacin in situ tambin se puede analizar la distribucin de las molculas de RNA (generalmente nRNAI en una clula, un tejido 0 un organismo. Para ello se preparan delgados cortes de tejido, se fijan con cuidado sobre portaobjetos y se hibridan con sondas de DNA especficas. Bajo estas condiciones, el RNA presenta slo una hebra, mientras que el DNA cromosmic0 permanece en forma de doble hebra y, por lo tanto, no puede hibridarse. Si se usa un marcador fluorescente hablamos de una hibridacin in situ acoplada a fluorescencia, abreviadamente FISH. Con esta tcnica se puede, por ejemplo, seguir la distribucin de un mRNA durante el desarrollo embrionario y extraer conclusiones acerca del papel de un gen individual en el proceso de diferenciacin. Con esto hemos visto las tcnicas ms importantes de fragmentacin, enlace, secuenciacin e identificacin del DNA. Les llega el turno ahora a las posibilidades de multiplicacin y modificacin del DNA. Se sintetizan dos oligonucletidos de DNA con 15-20 restos cada uno, que hibridan cada uno en una de las dos hebras complementarias y limitan la regin de DNA exacta que debe ser amplificada (figura 22.14). Primero se calienta Ia mezcla de reaccin brevemente a 95 "C: desnaturalizacin. Con la posterior refrigeracin a unos 55 "C, los iniciadores se unen a Ia hebra individual complementaria (hibridacin; annealing) y actan de iniciadores para la reaccin de la DNA-polimerasa. La sntesis se realiza entonces en direccin 5'3' a lo largo de la hebra individual de la matriz: polimerizacin.

22.14 Reaccin inicial de la PCR. La mezcla de reaccin contiene los moldes de DNA (en ingls, template) de la DNApolimerasa, los dos iniciadores r una mezcla de diversos dNT?. La la taqpolimerasa utilizada habitualmente proviene de la bacteria thermophilus aquaticus, que vive en fuentes calientes , por tanto, produce una enzima termoestable que soporta temperaturas de 95 "C sin perder su actividad enzimtica.

La reaccin inicial se interrumpe mediante un breve calentamiento a 95 "C; con ello se desnaturalizan las dobles hebras recin formadas, Al bajar la temperatura

a 55 "C, los iniciadores aadidos a grandes concentraciones pueden hibridar a su vez con dos hebras, concretamente la hebra parental y la hebra hija. Entonces, en Ia segunda ronda, la DNA-polimerasa sintetiza en total cuatro hebras hijas. Los tres pasos (desnaturalizacin, hibridacin, polimerizacin) se repiten una y otra vez (figura 22.15). Tras unos 20- 30 ciclos de reaccin el segmento de DNA. Definido por la posicin de los dos. Indicadores, es amplificado = de millones a miles de millones de veces. En principio es posible aumentar una nica molcula de DNA mediante PCR hasta tal punto que se convierte en el producto principal de la mezcla de reaccin. En la electroforesis en gel, el DNA amplificado se ve a menudo como una banda destacada. Sin embargo, en Ia fantstica sensibilidad de este mtodo radica tambin su problema: la tcnica de la PCR es extremadamente sensible a cualquier mnima contaminacin del DNA. El mtodo de La PCR tambin puede aplicarse al mRNA, si antes se reconvierte en DNA mediante la transciptasa inversa (RT); en este caso se habla de la RT-PCR.

22.15 Ciclos de la amplificacin con PCR. Tras algunos ciclos domina el producto predeterminado por la posicin de los dos iniciadores. La PCR se utiliza en muchas aplicaciones; gracias a su enorme potencial de amplificacin se ha convertido en el mtodo elegido para el diagnstico de virus, en la bsqueda de defectos genticos y en la analtica criminalista (medicina forense) mediante Ia realizacin de una "huella dactilar" gentica.

La tcnica se basa en que dos seres humanos tienen una gran parte de su secuencia de ADN en comn y para distinguir a dos individuos se puede explotar la repeticin de secuencias altamente variables llamadas minisatlites o satlites. Dos seres humanos no relacionados ser poco probable que tengan el mismo nmero de minisatlites en un determinado locus. En el SSR/STR de perfiles (que es distinto de impronta gentica) la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para obtener suficiente ADN que permita detectar el nmero de repeticiones en varios loci. Es posible establecer una seleccin que es muy poco probable que haya surgido por casualidad, salvo en el caso de gemelos idnticos, que tendrn idnticos perfiles genticos. La huella gentica se utiliza en la medicina forense para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. Tambin ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificacin de los restos humanos, las pruebas de paternidad, la compatibilidad en la donacin de rganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composicin de alimentos. Tambin se ha utilizado para generar hiptesis sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria. Los microsatlites muestran una mayor variacin que el resto del genoma ya que en ellos se encuentran unas secuencias en distinta repeticin y con diferente grado de recombinacin debido a la inestabilidad del locus.

22.16 Huella digital gentica. Aqu se han analizado dos regiones diferentes (loci) de dos personas. Los microsatlites de los cromosomas homlogos (alelos) de un individuo pueden tener un nmero diferente de copias segn el origen paterno o materno.

4. Las bibliotecas de DNA Permiten la identificacin de genes desconocidos La PCR permite la clonacin in vitro de fragmentos de DNA de 50 a 4000 bp de longitud procedentes del DNA de un organismo. No obstante, si se necesitan fragmentos mayores de DNA o falta la informacin necesaria de secuencia para ia sntesis de iniciadores, deben seguirse estrategias alternativas Una buena aproximacin es la creacin de bibliotecas genticas. Para ello se divide el DNA genmico de un organismo donante con una enzima de restriccin y se empaquetan los fragmentos individuales en un vector plasmdico que se multiplica fcilmente en bacterias y genera as un gran nmero de copias de los fragmentos de DNA incorporados (seccin 22-2) Junto a las instrucciones para la auto replicacin, el plsmido de DNA suele contener adems uno o ms genes de resistencia, que por ejemplo pueden codificar para una enzima destructora de ampicilina (seccin 23.8) Si se hacen crecer las bacterias tratadas sobre un medio de cultivo que contiene ampicilina, prosperan slo las bacterias transformadas que disponen del gen de resistencia del plsmido; por el contrario, las bacterias no transformadas mueren (figura 22.17)- idealmente, las bibliotecas genmicas expresan un extenso conjunto de vectores con fragmentos que expresan el DNA completo de un organismo. La totalidad de las bacterias transformadas constituye una biblioteca gentica, tambin denominada banco genmico. Los bancos de DNA de los mamferos suelen contener varios millones de plsmidos recombinantes diferentes. Cmo se puede extraer de esta enmaraada variedad un gen determinado? Para ello, las bacterias de un banco genmico se "siembran" en un medio de cultivo (figura 22'18) Durante la noche forman colonias. A continuacin se coloca un papel de filtro sobre el medio de cultivo y se hace un -"copia" denominada rplica o colony blof- del cultivo. Las bacterias que permanecen adheridas al filtro se lisan y el DNA del plsmido recombinante se analiza tras una desnaturalizacin alcalina con una sonda especfica en bsqueda de los fragmentos de DNA deseados; este mtodo se denomina hibridacin de colonias. La hibridacin de colonias es un mtodo clsico para aislar genes codificadores de protenas; se utiliza a menudo cuando se dispone de cantidades muy pequeas de protenas' Mediante la degradacin de Edman (seccin 7.i) o con el anlisis de espectrometra de masas (seccin 7'3) se consiguen secuencias parciales de unos 10-30 aminocidos de longitud' que a partir del cdigo gentico se retraducen en secuencias de oligonucletidos y proporcionan la informacin necesaria para la sntesis de oligonucletidos marcados debido a la degeneracin del cdigo gentico, se Utiliza una mezcla de indicadores degenerados" que posees diferentes bases en posiciones determinadas

Las sondas marcadas se utilizan entonces para la hibridacin. Ya que aqu el flujo de informacin va de las protenas al gen, se habla tambin de gentica inversa. Los plsmidos pueden absorber DNA forneo hasta una media de unos kbp; por lo tanto, para la elaboracin de bibliotecas genmicas se suele utilizar fagos lambda, como vectores, que pueden absorber DNA forneo hasta 20 kbp Los csmidos es decir hbridos de fagos? y plsmidos, y los vectores BAC pueden incorporar fragmentos de DNA an mayores de hasta 50 kbp y 1000 kbp; son especialmente apropiados para el "recorrido" por el cromosoma. Pueden crearse bancos genmicos de casi cualquier tipo de clula de un organismo. La desventaja es que los vectores recombinantes llevan una gran parte (> 98 %) de secuencias no codificadoras; los exones codificadores de protenas suman por ejemplo, un mximo de un 1,4 % del genoma humano (figura 23.32). Este problema puede evitarse elegantemente, mediante la construccin de los denominados bancos de cDNA. Para ello se asla el nRNA completo de celulas cultivadas, de un tejido o de un rgano, y se traduce una copia de cDNA (del ingls, copy) mediante una transcriptasa inversa (RT) (figura 22:20). EI resultado es un heterodplex; tras la tiigestin enzimtica de la hebra de RNA, la enzima multifuncional RT se encarga tambin de la sntesis de la cadena complementaria de DNA. En los extremos del cDNA se ligan oligonucletidos de conexin (en ingls, linker) que contienen mltiples puntos de rotura de restriccin. Tras la rotura con una endonucleasa de restriccin adecuada, se une el cDNA con un DNA vector linealizado.

22.19 Estrategia en el recorrido cromosmico. Al igual que en las hibridacin de colonias, el recorrido crornosmico es importante cuando an no se conoce por completo el genoma de una especie.

Para buscar un gen determinado en una biblioteca de cDNA se usan de nuevo las tcnicas de hibridacin de colonias (figura 22.18) y la tcnica de la PCR. Puesto que las clulas se diferencian a menudo drsticamente es su expresin, los bancos de cDNA son -a diferencia de los bancos genmicos- especfico para el tipo de clula, tejido u rgano del cual procede el mRNA. Debido a la reducida complejidad de los bancos de cDNA resulta mucho ms sencillo aislar el rea codificada del gen buscado en un banco de cDNA' Si se sabe en qu clula o tejido se expresa "mayoritaritariamente el gen buscado, la eleccin del banco de cDNA, correcto facilita notablemente la bsqueda. Para aislar el gen completo, incluidas las reas no codificables, se usa el cDNA marcado como sonda para la bsqueda en las bibliotecas genmicas o los bancos de datos correspondientes. 5. Los polimorfismos de longitud en los fragmentos de restriccin posibilitan la identificacin de genes relevantes en enfermedades.

Anlisis de RFLP en la anemia falciforme. Se presenta el lugar de corte de la endonucleasa de restriccin Mst II en el gen de la -globina en individuos sanos y enfermos (arriba). El patrn de fragmentacin se presenta esquemticamente A S para 1) individuos no afectados con el gen de la -globina intacto ( ), 2) A A portadores heterocigotos ( ) y 3) portadores homozigotos con las S S mutaciones ( ).

Hemos visto cmo detectar genes de los cuales se dispone al menos de parte de la informacin en el plano del DNA o las protenas. Cmo se puede, sin embargo, clonar genes completamente desconocidos que provocan en el ser humano enfermedades serias, como por ejemplo la distrofia muscular de Duchenne (seccin 9.7) o la fibrosis qustica? Clsicamente se utilizaba la

tcnica de clonacin posicional para encontrar nuevos genes de los cuales slo se conoce una localizacin cromosmica aproximada. La clonacin posicional se basa en el conocimiento de polimorfismos de longitud en los fragmentos de restriccin (RFLP) del DNA de individuos sanos y enfermos de familias afectadas. Para ello se aprovecha que las endonucleasas de restriccin cortan secuencias especficas del DNA genmico y generan un patrn caracterstico de fragmentos de DNA. Las variaciones secuenciales individuales pueden eliminar puntos de rotura para las enzimas de restriccin o generar nuevos puntos. Si estas mutaciones se encuentran en (o cerca de) genes asociados a la enfermedad, mediante Southern blot pueden encontrarse sondas de DNA de diferentes patrones de restriccin en personas enfermas y sanas. En la anemia falciforme causada por el cambio de un solo nucletido de AT en el gen de la -globina, las personas afectadas pueden presentar la falta de un lugar de corte singular para la enzima de restriccin Mst II (5CCTNAGG-3); por tanto, en el digerido de restriccin de DNA de portadores del gen de las clulas calciformes, Mst II genera un fragmento mayor que en el DNA de los sanos (figura 22.21). Con una sonda del gen -globina, se puede entonces determinar si el individuo lleva la mutacin en el alelo (portador heterozigoto), en ambos alelos (portador heterozigoto), o en ninguno de los alelos (sano). Los RFLP se heredan segn reglas de Mendel y, por tanto, son apropiados para un diagnstico.

Clonacin posicional del gen de la fibrosis qustica. Mediante dos RFLP se pudo limitar la posicin del gen a un rea de 106 bp (1). Esta regin se pudo secuenciar completamente por recorrido cromosmico (2). Las secuencias de ADN obtenidas se hibridaron con bancos de c ADN de tejido glandular para identificar regiones codificadas (3). La asociacin de F508 con la fibrosis qustica manifestada permite la identificacin clara del gen mutado (4).

Vamos a tomar el ejemplo de la fibrosis qustica para explicar el camino de la clonacin posicional de un gen relevante para la enfermedad (figura 22.22). En los anlisis de RFLP realizados en familias afectadas se observaba que en los padres sanos heterozigticos hibridaba una sonda de DNA (D7S15) con dos fragmentos, mientras que en los nios enfermos homocigticos slo se marcaba un fragmento de la sonda. La hibridacin in situ con D7S15 localiz el gen en el cromosoma 7. Con otros marcadores de RFLP se pudo delimitar el rea genmica para el gen de la fibrosis qustica en un segmento de 2*10 6 bp, que entonces se mapeo y secuenci mediante recorrido cromosmico (digresin 22.5). Con las sondas de DNA as generadas se busc entonces en bancos de cDNA de tejidos de glndulas (en los que se manifiesta principalmente la fibrosis qustica) la presencia de reas codificando fibrosis qustica, y con ello se determinaron los genes candidatos. Entre estos candidatos se identific el gen de la fibrosis qustica, de un tamao de 230 kb y con 24 axones, que codifica para un canal de iones cloruro (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR) de 1480 aminocidos situado en la membrana plasmtica de las clulas de glndulas con doce segmentos hidrofbicos (digresin 26.4). Alrededor de un 70% de los pacientes de fibrosis qustica son portadores de una deleccin de un codn completo que provoca la prdida del aminocido fenilalanina en la posicin 508 (F508) de la secuencia de CFTR y con ello un canal de iones cloruro disfuncional. Con la descodificacin completa del genoma humano no se dispone por fin de mtodos alternativos (basados en los polimorfismos de nucletidos singulares (SNP) para seguir los genes relevantes en las enfermedades.

Fabricacin de un vector de expresin recombinante. El vector posee un lugar de clonacin mltiple detrs de un fuerte promotor. Tras la insercin de ADN forneo, las clulas husped se transforman con el vector y se pone en marcha la sntesis en masa de la protena deseada. Para la seleccin, el vector R contiene un gen resistente a la penicilina (Amp ).

6. El uso teraputico de las protenas recombinantes expresadas

22.24 Construccin de protenas de fusin. La fusin de una protena que se pretende analizar con una secuencia de bandera facilita la purificacin, la determinacin e incluso el plegado correcto de la protena de inters. Asimismo, la secuencia bandera se puede separar selectivamente mediante rotura proteoltica dirigida; lo que queda entonces es la protena autentica.

A menudo se desconoce o slo se entiende en parte la funcin fisiolgica o el mecanismo molecular de una protena, a pesar de conocer su secuencia. Los mtodos bioqumicos o de gentica molecular aportan las herramientas para responder algunas preguntas pendientes. El primer paso para ello es la fabricacin de cantidades suficientes de protena. Si se dispone del correspondiente cDNA se puede insertar un vector de transcripcin bajo la influencia de un potente promotor. La RNA*polimerasa transfiere entonces grandes cantidades de mRNA correspondiente, que se traduce en la protena deseada. Llamamos a esta combinacin transcripcin/traduccin in vitro (digresin 18.3). En una estrategia frecuente aplicada se clona el cDNA con un vector de expresin que se transforma en clulas bacterianas, de levadura o de mamferos (figura 22.23). Mediante las polimerasas propias de la clula, el cDNA recombinante se reescribe a mRNA y se traduce a protenas. Dado que los vectores de expresin en general llevan un fuerte promotor que promueve la expresin del gen extrao, las clulas husped producen la protena deseada en grandes cantidades, de modo que se agrega formando corpsculos de inclusin (en ingles, inclusin bodies). Otros vectores de expresin provocan en sus clulas husped que la protena expresada se separe

en el medio de cultivo; a continuacin puede aislarse fcilmente del sobrenadante celular. A menudo la protena de inters se fusiona tambin con un tag (del ingls etiqueta), una secuencia de protena apropiada como bandera en su extremo amino o carboxilo (figura 22.24). Para ello se utilizaban los vectores de expresin que llevan la informacin de la secuencia bandera deseada. Tras la insercin de la secuencia de cDNA de la protena de inters, las clulas husped sintetizan una protena de fusin quimrica.

22.25 Mutagnesis dirigida. Una hebra individual de M13, que se genera en una cepa especial de E. coli (dut ung ) y que se ha incorporado U(en lugar de T), se hibrida in vitro con un oligonucletido sinttico que lleva la mutacin deseada. La ADN-polimerasa completa con la hebra filial que contiene T. Tras la + + transformacin del tipo salvaje de E.coli (dut ung ) se degrada selectivamente la hebra matriz que contiene U; en cambio, se replica en gran cantidad de la hebra filial mutada que contiene T. (PI)

Las ventajas de una secuencia bandera como, por ejemplo, la hemoaglutinina (HA), son la posibilidad de utilizar de forma universal anticuerpos contra la pareja de fusin HA: tras la lisis de la clula husped, la portena relevante se puede determinar especficamente mediante Western blot en el lisado celular. Adems los anticuerpos contra HA permiten una inmunoprecipitacin de la protena de fusin (digresin 33.5). Si se utiliza secuencia hexahistidinil (His6) como bandera, la protena de fusin resultante se puede purificar mediante cromatografa de afinidad de quelantes de Ni2+. Fusionndola con la protena de fluorescencia verde (GFP) de las medusas Aequorea victoria, sus derivados emiten una fluorescencia verde bajo la luz, y se pueden determinar fcilmente la localizacin (sub) celular de la protena pareja, examinar su asociacin con otras protenas y observar su propio movimiento en la clula. Las protenas recombinantes son de especial relevancia para la fabricacin de medicamentos. As, por ejemplo,en fallos del desarrollo de los eritrocitos

(eritropoyesis) debidos a enfermedades renales se administra eritropoyetina producida por recombinacin. Otros productos de la tecnologa de DNA recombinante son la hormona de crecimiento humana, la insulina y el activador plasmingeno tisular.

7. La mutagnesis dirigida ayuda a aclarar las funciones de las protenas. Un mtodo importante para el anlisis funcional de las protenas es la mutagnesis dirigida de su DNA (figura22.15). Para ello se mutan un nucletido o un tipo de nucletidos de forma selectiva, de modo que en el plano proteico se modifique, se elimine o se inserte un aminocido o un segmento escogido de la estructura primaria. La expresin de la protena mutada permite entonces analizar las consecuencias estructurales y funcionales de estos cambios y extraer conclusiones sobre el significado del segmento mutado. Para cambiar con exactitud el ADN se clona la secuencia meta de un vector de doble hebra y a continuacin se separan las dos hebras de DNA. Entonces, un oligonucletido sinttico de unos 20 nucletidos de longitud, que presenta en su interior un apareamiento errneo concreto (mutacin, delecin o insercin) puede hibridar con sus consecuencias intactas en la hebra individual de ADN del vector. A partir de este iniciador, la ADN-polimerasa y la ligasa completan in vitro la doble hebra circular. En la replicacin de este dplex se originan dos tipos de plsmidos cuyo ADN lleva la mutacin deseada o bien no se ha modificado. Con un sencillo truco se puede seleccionar el vector deseado. Para ello se usa el vector M13 de una hebra, que se ha reproducido en una cepa especial de E.coli, y al que le afectan los genes de las enzimas dUTPasa (dut-) y uracil-N-glicosidasa (ung-). La dUTPasa se ocupa de la rpida degradacin de dUTP a dUTP, puesto que si se acumula dUTP se instala en ste lugar de dTTP en el ADN. La uracil-Nglicolasa es una enzima de reparticin que normalmente separa U del ADN. Por tanto, una cepa dut-/ung- instala uridina en lugar de timina en la hebra original M13. Si entonces se transforma el vector M13 de doble hebra mutado en una cepa nativa de E.coli (dut+/ung+), la uracil-N-glicosilasa reconce y elimina la hebra matriz que contiene U, mientras que la hebra de ADN sintetizada in vitro que contiene T con la mutacin deseada se replica masivamente. Con este plsmido de ADN se puede expresar la variante proteica deseada. Una estrategia importante para el anlisis funcional de productos genticos es la produccin de mutantes negativo-dominantes. En ellos, el producto del gen mutado bloqueala funcin del producto gentico normal. Ya hemos visto un ejemplo presente en la naturaleza para uno de estos tipos de mutantes negativodominantes en el caso de la enfermedad de los huesos de cristal, osteognesis imperfecta. El cambio de una de las tres cadenas en la triple hlice provoca una prdida grave de funcin del colgeno en los pacientes afectados. Puede ser especialmente constructivo introducir uno de estos mutantes en el genoma de un animal modelo, en el cual se puede probar el efecto de uno de estos mutantes

negativo-dominantes en el contexto fisiolgico. Retomaremos este tema al hablar de los modelos animales transgnicos. Con esto hemos visto los mtodos y tcnicas ms importantes con que se pueden caracterizar y manipular in vitro los cidos nucleicos. Les llega el turno a los procesos fundamentales para la modificacin in vitro de la informacin gentica.