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Introdução
Cronologia do DNA
Gregor Mendel (1865) – descreve as leis
básicas da hereditariedade a partir de um estudo
sobre sucessivas gerações de ervilhas verdes e
amarelas. Concluiu que existiam elementos
autónomos que controlavam as características
hereditárias.
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O Gene
Gene
Unidade de informação biológica (de hereditariedade). A informação
genética serve de base para processos bioquímicos.
O gene é a sequência de ácidos nucleicos que transporta a informação
para uma dada proteína ou molécula de RNA com actividade funcional.
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Organização Genómica
1. Genes Descontínuos (Split genes) – a informação biológica
contida em alguns genes (de Eucariotas) é descontínua,
encontrando-se separada por sequências intervenientes ou
intrões de DNA.
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Material Genético
Ácidos Nucleicos
1. Contém informação acerca da estrutura das proteínas (DNA);
2. Participam na selecção e ligação dos aminoácidos necessários
para formar as proteínas (RNA);
3. Formam-se através de ligações fosfodiéster entre nucleótidos
sucessivos;
4. Para participar nessas ligações, na posição 3’ tem de haver –
OH. A formação desta ligação dá-se de 5’ para 3’.
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Código Genético:
Nucleótido:
Diferentes pentoses:
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DNA
A estrutura tridimensional do DNA – a dupla hélice – surge a partir das
características químicas e estruturais das suas duas cadeias polinucleotídicas.
Formação da
dupla hélice
Esqueleto Interior
hidrófilo hidrófobo
Desoxirriboses e
fosfatos virados Bases viradas
para o exterior para o interior
O emparelhamento
origina um minor groove
e um major groove (este
ideal para a ligação das
proteinas)
Há emparelhamento
específico A-T e C-G
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Propriedades do DNA:
Desnaturação e Annealing (Renaturação)
Desnaturação:
Renaturação:
Restabelecimento de pH ~7,0
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Conteúdo em GC
O aumento do conteúdo em GC aumento o valor de Tm
(temperatura à qual metade do DNA se encontra desnaturado).
Superenrolamentos (Supercoiling)
o Ocorre só em DNA “fechado” sem pontas livres/soltas
o O DNA “fechado” pode ser circular ou linear
o As pontas não têm liberdade rotacional
o Corresponde ao sobre enrolamento da dupla hélice de
DNA como resultado de uma tensão estrutural
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superenrolamento
positivo
na direcção da
hélice
DNA torcido
superenrolamento
negativo
na direcção oposta
à da hélice
bases mais
"frouxas"
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Eucariotas VS Procariotas
Eucariotas
Nos eucariotas as células têm compartimentos separados por
membranas, como o núcleo e o mitocôndrio. O genoma fica restringido ao
núcleo.
Procariotas
Nos procariotas, não existem compartimentos internos. O genoma não
está num compartimento específico.
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Empacotamento em Vírus
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Empacotamento em Procariotas
Nos procariotas, o genoma é normalmente constituído por um só
cromossoma circular.
Logo, o DNA enrolado aleatoriamente tem um volume 1000x superior
ao volume da célula. Repulsão entre cargas negativas dos fosfatos.
Nos Procariotas, o DNA acumula-se no nucleóide.
Empacotamento em Eucariotas
O empacotamento do material genético denomina-se cromatina, nos
eucariotas.
Dá-se o nome de cromatina ao complexo de DNA e proteínas (que
juntas denomina-se cromossoma) que se encontra dentro do núcleo celular nas
células eucariotas. As principais proteínas da cromatina são as histonas.
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Estrutura da cromatina
A fibra de 10 nm
A fibra de 10 nm, num estado parcialmente
"desenrolado", consiste num "rosário" em que as
"contas" são os nucleossomas (baixa concentração
salina).
A fibra de 30 nm
A fibra de 30 nm apresenta uma
estrutura "enrolada" – Condições fisiológicas.
Ampliação a 10 nm.
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A descoberta do Nucleossoma
Nucleossoma
O nucleossoma é o nome dado à unidade fundamental da cromatina
e consiste numa unidade de DNA, dividida em duas espirais, que se enrolam
em torno de um disco proteico, constituído por quatro pares de proteínas
chamadas histonas.
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http://www.youtube.com/watch?v=Pj9cdVeIntY
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Nucleossomas em fase
Os nucleossomas têm um posicionamento
(ou faseamento) pré-determinado?
O posicionamento dos nucleossomas
colocaria um local de restrição em posição única,
relativamente ao DNA linker, reconhecido pela
nuclease de micrococcus, que hidrolisa os
monómeros de DNA. O fragmento de restrição
tinha sempre o mesmo tamanho, pelo que se
obtém uma única banda no gel de eletroforese.
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Transcrição
O que acontece aos nucleossomas?
O RNA polimerase tem um tamanho maior do que o nucleossoma,
o que lhe dificulta seguir o DNA à volta deste.
Quando o DNA está associado aos nucleossomas, o RNA
polimerase e os fatores de transcrição não têm acesso ao DNA.
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Experiência 1
Quando o DNA é exposto em simultâneo a
histonas e fatores basais de transcrição, as
histonas formam nucleossomas na TATA box
e bloqueiam o acesso aos fatores basais de
transcrição.
Experiência 2
Quando o DNA é exposto aos fatores basais
antes das histonas (passo 1), os fatores basais
associam-se à TATA box, deixando as
histonas de fora, quando posteriormente
adicionadas.
Experiência 3
Quando o DNA é exposto em
simultâneo a histonas, fatores basais e
ativadores, estes permitem a ligação
dos fatores à TATA box, bloqueando o
acesso das histonas.
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Acetilação de Histonas
A ativação da transcrição está associada com a
acetilação das histonas (adição de um grupo acetil –
COCH3) na região promotora.
As histonas possuem "caudas flexíveis" que podem
sair do nucleossoma e sofrer acetilações nos resíduos de
lisina.
Os enzimas que catalisam a acetilação das
histonas podem ser de dois tipos:
Histona acetiltransferases ou HATs – enzimas que promovem a
acetilação das histonas; que se dividem em:
o Grupo A – envolvidos na transcrição;
o Grupo B – atuam em histonas sintetizadas de novo no
citosol, estão também envolvidos na formação dos
nucleossomas;
Histona diacetilase ou HDACs – enzimas que promovem a
desacetilação das histonas, provocam a condensação da cromatina
e a inibição da transcrição. A tricostatina e o ácido butírico são
inibidores dos HDACs, e no laboratório podem ser utilizados como
ativadores de genes normalmente inativos ou pouco expressos.
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Replicação Semi-Conservativa
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Células de E.coli crescem em meio contendo apenas N (azoto
pesado – isótopo estável com 8 neutrões e 7 protões) durante várias gerações.
O DNA é extraído e centrifugado em gradiente de densidade.
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As células são lavadas e passam a crescer em meio com N (azoto
normal – 7 neutrões e 7 protões).
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A replicação
O DNA replicado é visualizado sob a forma dum "olho" flanqueado pelo
DNA ainda não replicado.
O "olho replicativo" forma uma estrutura em θ (theta) na replicação
duma molécula de DNA circular.
O replicão
É a unidade de replicação, ou seja, a porção de DNA que é replicado
pela mesma origem de replicação (Ori) e "entra em acção" apenas uma vez por
ciclo celular. Uma vez iniciada a replicação, esta só pára quando todo o
genoma da célula tiver sido replicado.
Nos procariotas existe apenas um replicão, enquanto nos eucariotas
existe grande número de replicões que têm de entrar em acção quase em
simultâneo para todo o genoma ter sido replicado antes da divisão celular.
As regiões Ori são ricas em timina e adenina – a natureza destas
ligações é mais fraca que as de guanina e citosina, o que facilita a abertura da
cadeia dupla, e são reconhecidas por um par de enzimas, os helicases.
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Garfos Replicativos
Os garfos replicativos estão organizados em focino núcleo. A
replicação do DNA a partir dos garfos de replicação é bidireccional.
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Replicação em D-loops
Há uma origem de replicação diferente em cada uma das duas cadeias
(L e H):
1. Replicação da cadeia H inicia-se num "D loop" (com primer de
RNA).
2. Replicação da cadeia L inicia-se quando origem L fica exposta
pela passagem do garfo replicativo do D-loop.
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SOLUÇÕES:
Conversão da molécula linear em circular (fagos T4 e λ)
Formação duma estrutura especial, e.g., hairpin (Paramecia)
Extremidades de comprimento variável (eucariotas)
Presença duma proteína que permite a iniciação da síntese na própria
extremidade (adenovírus, vírus de RNA da poliomielite)
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Telómeros e Telomerase
Os extremos dos
cromossomas normais são constituídos
por estruturas denominadas telómeros
que impedem a união de cromossomas.
São estruturas constituídas por fileiras
repetitivas de proteínas e DNA não
codificante.
Os telómeros estão presentes principalmente em células eucarióticas,
visto que o DNA das células procarióticas forma cadeias circulares, logo não
tem locais de terminação, embora existam excepções como: bactérias com
DNA linear e que possuem telómeros.
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Em bactérias, a segregação
cromossómica pode necessitar de
recombinação em locais específicos.
Um cromossoma circular replica-se
produzindo duas moléculas-filhas
monoméricas que segregam com as
células-filhas
Replicação em Eucariotas
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As topoisomerases são
responsáveis por separar os
cromossomas no final da replicação
em E. coli, através do processo de
decatenação (processo em que se
desligam duas moléculas de DNA que
se encontram interligadas, é o oposto
de catenação)
Replicação do DNA
1. Abertura da dupla hélice
A replicação requer uma helicase para separar as cadeias da dupla
hélice de DNA usando energia à custa da hidrólise de ATP.
As SSBPs ("single-stranded binding proteins") são necessárias
para manter separadas as duas cadeias simples
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3. Elongação e Topoisomerases
A estrutura antiparalela das duas cadeias de DNA constitui um
problema para a replicação. Enquanto o garfo de replicação avança, ambas as
cadeias filhas devem ser sintetizadas enquanto as cadeias mãe se encontram
expostas. No entanto o garfo replicativo avança no sentido 5’-3’ numa cadeia e
no sentido 3’-5’ noutra, e os ácidos nucleicos são sintetizados apenas na
direção 5’-3’. Este problema é resolvido sintetizando a cadeia 3’-5’ numa série
de pequenos fragmentos que são formados no sentido 5’-3’.
Na cadeia líder, a síntese de DNA procede de forma continua na
direção 5’-3’, enquanto molécula de DNA é “desenrolada”. Na cadeia atrasada,
(uma parte do DNA original tem de estar exposto) formam-se segmentos na
direção oposta à do garfo replicativo. Estes fragmentos, denominados,
fragmentos de Okazaki vão se juntando, formando uma cadeia atrasada
completa.
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4. Terminação
Em E.coli, a replicação termina numa zona de repetições de 20 bp
(zonas de terminação de replicação = "ter")
As duas moléculas de DNA resultantes estão interligadas – catenanos
A separação (decatenação) é feita pela topoisomerase IV.
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Mecanismo de assemblagem:
1. O dímero β e o complexo γ
reconhecem o primer e formam um complexo
inicial. Nesta reação, o complexo γ hidrolisa o ATP
e transfere as subunidades β para o primer. O par
de subunidades β forma um clamp que se liga à
volta do DNA e assegura a processividade. A
hidrolise do ATP permite a ligação da subunidade β
ao DNA.
2. A ligação ao DNA altera a
conformação da subunidade β na ligação ao
complexo γ, aumentando a afinidade da subunidade
β para o centro ativo do polimerase. Esta alteração conformacional é o que vai
permitir que o centro ativo se ligue ao DNA.
3. O dímero τ liga-se ao centro ativo do polimerase promovendo a
dimerização através da ligação de dois centros ativos. O holoenzima é
assimétrico porque apenas tem um complexo γ.
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DNA polimerases
DNA polimerase I: reparação de DNA; remove os primers de
RNA nos fragmentos de Okazaki e substitui-os por DNA
DNA polimerase II: reparação de DNA; função não muito bem
esclarecida
DNA polimerase III: sintetiza cadeias de DNA. Faz parte dum
grande complexo, o holoenzima do DNA polimerase III. Uma das
subunidades deste holoenzima é a subunidade β, que mantém
a polimerase III associada ao DNA.
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Transcrição e Replicação
Semelhanças:
O mecanismo fundamental da reacção é semelhante;
A transcrição dá-se de 5’ → 3’;
Ambas necessitam dum molde para a síntese do DNA/RNA;
Os processos dividem-se em três fases: iniciação, elongação e
terminação.
Diferenças:
A transcrição é selectiva – apenas um gene ou um grupo
específico de genes é transcrito de cada vez;
Na transcrição, apenas uma das cadeias é transcrita;
A transcrição não necessita de um iniciador (primer);
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Unidade Transcricional
Uma unidade transcricional é uma porção de DNA transcrita numa
única molécula de RNA (transcrito primário), começando no promotor e
acabando no terminador.
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A “bolha” Transcricional
Durante a transcrição, a
"bolha" transcricional é
mantida no interior do
RNA polimerase.
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As fases da transcrição:
1. Pré-iniciação – reconhecimento do DNA molde.
2. Iniciação – início da síntese da cadeia de RNA pela adição dos
primeiros 2-9 ribonucleótidos.
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A transcrição em Procariotas
O alinhamento de múltiplos promotores evidencia a conservação de
nucleótidos em determinadas posições a montante do local de início da
transcrição.
O promotor é uma sequência específica no DNA à qual os RNA
polimerases se ligam.
O Promotor
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Promotores em Procariotas
Um promotor típico possui 3 componentes:
1. a sequência a –35;
2. a sequência a –10;
3. o início da transcrição (“startpoint”).
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O Papel da Subunidade σ
A subunidade σ é primeiramente responsável pelo
reconhecimento do promotor.
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Alterações de conformação em
certos módulos flexíveis do enzima
controlam a entrada nucleótidos no
centro activo.
O reconhecimento de diferentes
promotores é feito mediante o uso de
diferentes subunidades σ.
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Inicialmente, o RNA
polimerase contacta com
a região entre -55 e +20.
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Elongação da Transcrição
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Reinício da Transcrição
Um RNA polimerase parada pode reiniciar a transcrição por uma
reacção de hidrólise na extremidade 3’.
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Transcrição e Tradução
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Anti-Terminação
Pode ser usado um mecanismo de anti-terminação para controlar a
transcrição. Os factores de anti-terminação atuam como subunidades do RNA
polimerase que ignoram (fazem o readthrough) os sinais de terminação.
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Fatores auxiliares
Fatores Basais - são necessários ao início da transcrição em todos os
promotores. Formam um complexo com a RNA polimerase em torno do início
da transcrição (IT).
Fatores a Montante (“Upstream Factors”) – são proteínas que se ligam
ao DNA a montante do IT. São ubiquitários e a sua atividade não é regulada.
Fatores Indutíveis - atuam como os fatores a montante, mas possuem
atividade reguladora. Ligam-se a elementos de resposta.
Fator de Transcrição Qualquer proteína necessária para o início da
transcrição, mas que não seja parte integrante da RNA polimerase.
Enhancers Sequências que estimulam a transcrição, mas que se
situam a uma distância considerável do IT (a montante ou a jusante) e em
qualquer orientação.
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RNA polimerases
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Iniciação de transcrição
Elementos "upstream" e os fatores que a eles se ligam aumentam a
frequência da iniciação
Papel do TFIIH
O TFIIH funciona como local de ancoragem de um complexo de
enzimas envolvidos na reparação do DNA
Mutações no "domínio XPD" do TFIIH são causadoras de
doenças
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Procariotas
O gene 1 é um gene constitutivo (ou de “housekeeping”).
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Eucariotas
1. Genes de plantas que respondem à luz;
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Regulação Transcricional
Regulação Negativa
Na regulação negativa, um repressor liga-se ao operador evitando que
um gene seja expresso.
Exemplo: operões repressíveis que são controlados negativamente
pelo produto final da via biossintética a que pertencem.
Regulação Positiva
Na regulação positiva, é necessário um factor de transcrição ligar-se ao
promotor a fim de permitir que o RNA polimerase inicie a transcrição.
Exemplo: operões indutíveis que são controlados positivamente pelo
substrato da respectiva via metabólica.
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Operão da Lactose
Operão indutível em procariotas, requerido para o transporte e o
metabolismo da lactose em Escherichia coli e outras bactérias.
O operão lac é regulado por diversos factores, em particular a
disponibilidade de glicose e lactose no meio extracelular.
A regulação genética do operão lac foi o primeiro mecanismo complexo
de regulação génica a ser elucidado e é um dos principais exemplos de
regulação genética em procariotas.
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Operão do Triptofano
A regulação da transcrição do operão do triptofano pode ser
generalizada para os restantes aminoácidos e é uma regulação por
repressão do produto final pois, ao contrário do operão da lactose que está
sempre silenciado na ausência do substrato, o operão do triptofano está
sempre activo, sendo reprimido apenas quando este aminoácido abunda na
célula.
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Mecanismo de Atenuação
A regulação por atenuação é exclusiva dos procariotas pois implica
que a transcrição e a tradução ocorram em simultâneo, o que não se verifica
em organismos eucariotas.
A atenuação da transcrição age impedindo o alongamento a partir de
determinados sítios, que não são mais do que sequências específicas.
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A região à qual os fatores se ligam não fica muito longe da região que
vão ativar. Podem localizar-se tanto nos promotores como nos enhancers. A
ligação do ativador ao elemento de resposta é necessária para que o RNA
polimerase inicie a transcrição. Um ativador pode apenas estar ativo em
determinadas condições e são essas condições que vão determinar quando o
gene vai ser expresso.
O gene da metalotioneína é um exemplo de como um gene pode ser
regulado por vários fatores. Este gene está ativo, mas é induzido por elevadas
concentrações de metais pesados (como o cádmio) ou por glucocorticoides.
A TATA e a GC box estão localizadas perto da região de
iniciação. Para a expressão basal são também necessários dois elementos
basais, BLE – basal level elements, que se encaixam na categoria de
enhancers. Estes elementos, embora perto do local de iniciação, podem ser
movidos para outro sitio sem perder a sua atividade.
Ativação da transcrição
Ativadores: determinam a frequência da transcrição.
Repressores: proteínas que inibem a expressão dum gene.
o Podem atuar evitando que ocorra a transcrição ligando-se
a um operador no DNA ou prevenindo a tradução ligando-
se ao RNA.
Epigenética: inclui alterações que influenciam o fenótipo sem
alteração do genótipo.
o Estas consistem em alterações nas propriedades da
célula que são herdadas, mas que não representam uma
alteração da informação genética.
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Capping
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Poliadenilação
A sequência AAUAAA é
necessária para a clivagem e
poliadenilação da extremidade 3’.
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A poliadenilação do mRNA:
Ocorre em 2/3 dos mRNAs de Eucariotas ausente nas histonas);
É um acontecimento precoce na biossíntese do mRNA: ~1 min
após a polimerase passar AAUAAA;
O tamanho da cauda é ~200 A;
A adição da cauda é catalisada pelo enzima poli(A) polimerase
(PAP). A sua actividade é distributiva (liga-se e dissocia-se para cada base
ligada), para a síntese dos primeiros ~20 A;
A actividade da PAP torna-se processiva (uma cadeia
polimerizada durante uma associação), para a síntese dos restantes ~200 A,
quando mediada pelo CPSF (cleavage poliadenylation specificity factor) e do
seu cofactor CstF, e em presença da PABP (poly(A) binding protein);
Para cada espécie de mRNA, apenas 70% possui cauda;
A presença da cauda poli(A) está relacionada com estabilidade e
com o transporte núcleo-citoplasma;
Principal consequência prática: isolamento de mRNA.
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Splicing
O splicing depende apenas do reconhecimento de pares de junções de
splicing – as junções de splicing são lidas aos pares.
Todos os locais de splicing 5′ são funcionalmente equivalentes, assim
como todos os locais de splicing 3′.
Outras sequências adicionais conservadas, quer a 5′ quer a 3′ dos
locais de splicing, definem estes últimos como funcionais entre os numerosos
potenciais locais presentes no pré-mRNA.
Na figura seguinte mostra-se a remoção de 3 intrões por splicing
correto através do reconhecimento de pares de junções de splicing.
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snRNP’s e snRNAs
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Composição do Spliceossoma
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Intrões do grupo I
Os intrões do grupo I levam a cabo "self-splicing" por
transesterificação.
Os únicos fatores necessários para o auto-splicing (ou "selfsplicing") in
vitro pelos intrões do grupo I são dois iões metálicos e um nucleótido de
guanosina.
Os genes para dois rRNAs têm uma
organização normal, sendo que são expressos
da mesma unidade de transcrição. O produto é
um RNA 35S que é precursor do small rRNA na
extremidade 5’, e um RNA 26S que é
precursor do large rRNA na extremidade 3’.
Nalgumas espécies a sequencia que
codifica para o 26S pode estar interrompida por
um pequeno intrão. Quando o precursor do 35S
é incubado in vitro, o splicing ocorre como uma
reação autónoma. O intrão é removido do precursor e acumula-se na forma
linear, que é depois transformado numa forma circular. O splicing do rRNA
percursor 35S de pode ser seguido por eletroforese em gel de agarose.
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que circulariza quando a sua extremidade 3′–OH ataca a ligação numa das
duas posições internas. Este intrão excisado tem atividade catalítica.
Splicings alternativos
Diferentes modos de splicing alternativo podem originar diferentes
produtos proteicos a partir dum mesmo gene:
Editing de mRNAs
RNA Editing - altera a sequência dum RNA (mRNA), pela inserção de
novos nucleótidos, ou pela remoção dos já existentes.
Este processo foi descoberto em 1986 em estudos dos genes
mitocondriais de Trypanosoma brucei.
Este mecanismo, juntamente com o splicing contraria o dogma central
da Biologia Molecular, segundo o qual uma sequência de mRNA pode apenas
representar o que está codificado no DNA
Mecanismo
O RNA guia proporciona o molde (template) para a adição (mais
raramente, a deleção) de uridinas.
O RNA editing é catalizado no editossoma, em complexo que contém
atividades de:
Endonuclease
Exonuclease
Terminal uridiltransferase
RNA ligase.
RNA de Eucariotas
Degradação do mRNA
Em Procariotas
A degradação de mRNAs em
Procariotas ocorre durante a tradução e:
Envolve vários enzimas;
Inicia-se pela remoção de
pirofosfato da extremidade 5′;
Os mRNAs monofosforilados são
depois degradados em ciclos de 2 passos:
1. Clivagem endonucleolítica
2. Digestão 3′ → 5′ dos
fragmentos resultantes
Em Levedura
A degradação de mRNAs em levedura requer:
1. Desadenilação: remoção da cauda poli-A 3’ (a PABP
protege contra o decapping 5’: com a desadenilação este efeito é
abolido);
2. "Decapping" (remoção do "cap" a 5’)
3. Clivagem por um endonuclease.
Exemplos:
Degradação do mRNA da Ferritina
O Ribossoma
As duas subunidades em Procariotas tem coeficientes de
sedimentação 30S e 50S (combinado 70S), sendo S a unidade Svedberg, ou
seja, o coeficiente de sedimentação
O Ribossoma 70S
Ribossoma eucariota
Maiores e mais complexos: 82 proteínas; 4 rRNAs
Diâmetro 23 nm e coeficiente de sedimentação 80S
Síntese de rRNA
Os RNA ribossomais em Eucariotas são sintetizados no nucléolo sob a
forma de um único precursor (45S em eucariotas superiores, 35S em
leveduras) que é depois clivado.
Além da ação das endonucleases e exonucleases, o processamento
dos rRNAs envolve pequenas moléculas de RNA – snoRNAs (small nucleolar
RNAs).
Os snoRNAs conduzem uma série de pequenas alterações que
constituem a maturação dos rRNAs.
1. Síntese do rRNA
2. O rRNA tem estrutura secundária determinada por
emparelhamento de bases ao longo da molécula de rRNA
3. O rRNA associa-se com proteínas para formar as subunidades
ribossomais
4. As duas subunidades formam o ribossoma; Os contactos entre as
subunidades ribossomais são principalmente entre moléculas de RNA, no
entanto, também há contactos entre proteínas ribossomais.
Polissomas
Múltiplos ribossomas progridem ao longo duma molécula de mRNA,
formando um "poli-ribossoma" ou polissoma.
Quanto maior a molécula de RNA mensageiro a ser traduzida, mais
ribossomas se ligam à molécula.
RNA de transferência
Exemplos de tRNAs
Aminoacil-tRNA-sintetases: Proofreading
Os enzimas fazem proofreading para corrigir erros na selecção dos 2
substratos – tRNA e aminoácidos.
Há mais erros na selecção de aminoácidos (1/10-4) do que na selecção
dos tRNAs (1/10-6).
Os tRNAs são moléculas maiores, com mais características únicas.
Existem 2 mecanismos de proofreading:
1.Cinético: O enzima possui maior afinidade para o "seu" tRNA
correcto, sendo que a reacção de aminoacilação dum tRNA incorrecto é muito
lenta;
2.Especifico: O enzima pode reconhecer erros ou quando um
aminoácido errado entra ou já depois da ligação do aminoácido errado ao
tRNA.
A Reação de Formilação
Em bactérias e em organelos eucariotas, o tRNA iniciador contém um
resíduo de metionina que foi formilado no seu grupo amina, formando a
molécula N-formil-metionil-tRNA. Este tRNA é conhecido como tRNAfMet e o
nome deste aminoaceil-tRNA é abreviado para fMet-tRNAf.
O tRNA iniciador fica com o seu aminoácido alterado numa reação de
dois passos:
1.É carregado com o
aminoácido formando Met-tRNAf;
2.Formilação do NH2
livre, bloqueando o aminoácido.
Este aminácido bloqueado embora
impeça que o iniciador participe na
elongação da cadeia, não interfere
na sua habilidade para iniciar a
proteína.
Este tRNA só é utilizado na
iniciação. Apenas reconhece os
codões AUG e GUG (e por vezes o UUG).
Processamento do 1º aminoácido
As proteínas recém-sintetizadas em bactérias possuem formil-
metionina (fMet) como primeiro aminoácido, mas o grupo formilo, e por vezes
também a metionina, são removidos durante a síntese proteica.
Translocação e Ribossoma
A Degenerescência do Código
Vários aminoácidos são representados por mais do que um codão.
Codões com o mesmo significado designam-se por codões sinónimos.
Codões sinónimos diferem frequentemente apenas na 3ª base.
Tal facto, conjuntamente com uma tendência para aminoácidos
semelhantes serem codificados por codões também semelhantes, minimiza o
efeito das mutações silenciosas.
O Conceito de Wobble
Cada codão necessita dum tRNA específico ou pode o mesmo tRNA
emparelhar com 2 ou mais codões duma mesma família?
Frequentemente, cada tRNA reconhece mais do que um codão,
pois a 1ª base do anticodão consegue emparelhar com
diferentes bases na correspondente 3ª posição do codão.
Wobbles
Emparelhamentos G-U (U e G podem reconhecer 2 bases: A/G e C/U)
tRNAs Supressores
As mutações "nonsense" podem ser suprimidas por um tRNA com um
anti-codão mutante. Que também suprimem os codões STOP "naturais",
sintetizando assim proteínas mais longas do que as wild-type.
Os tRNAs supressores também suprimem codões "missense". A
supressão de mutações "missense" ocorre quando o tRNA reconhece um
codão diferente do usual, de tal forma que um aminoácido é substituído por
outro.
Factores de Terminação
Folding de Proteínas
O folding de proteínas é o processe pelo qual as proteínas adquirem a
estrutura terciária que lhes é termodinamicamente mais favorável.
Consiste num processo por etapas em que as ligações mais
adequadas vão sendo estabelecidas e a proteína adquire a sua estrutura
(conformação) funcional.
Essas ligações que se estabelecem são de natureza covalente.
Ligações intra-moleculares:
Ligações de hidrogénio
Ligações hidrófobas
Ligações de van der Waals
Ligações iónicas
Ligações perssulfureto
Folding e energia
As proteínas adquirem a conformação que lhes é mais favorável do
ponto de vista energético – existem as hipóteses cinética e termodinâmica
do folding de proteínas.
Chaperones moleculares
Os chaperones moleculares assistem
ao folding correcto das proteínas in vivo.
Estes não são componentes das
proteínas funcionais e não possuem qualquer
informação espacial para o folding.
O Sistema GroEL-GroES
Este sistema entra em “acção”, uma vez que há proteínas que não
cabem dentro das chaperoninas – por terem grandes dimensões. O mecanismo
em detalhe é explicado mais à frente. De seguida mostra-se apenas um
resumo.
Alzheimer
As moléculas de APP na membrana celular e em vesículas
intracelulares (endossomas) são clivadas pela β-secretase (BACE) e pelo
complexo presenilina–γ-secretase (PS–γ) libertando a região Aβ.
Uma porção dos péptidos Aβ pode oligomerizar, inicialmente
intravesicularmente, sendo depois libertados para o fluido intersticial do
cérebro, onde os oligómeros solúveis se difundem para as fendas sinápticas
interferindo com a sua função por mecanismos desconhecidos.
Proteínas Rab
Rab’s: são proteínas que se ligam ao GTP,
"small GTPase"s (activas na forma ligada) e que
influenciam determinados passos do transporte de
proteínas na via secretora.
Fibrose Quística
É a doença autossómica
recessiva letal mais comum em
Caucasianos, ou seja, afecta os
autossomas e só tem a doença
quem possui a mutação nos dois
alelos.
A causa de morte pode
ser a falta de ar.
Diagnóstico
Fisiopatologia
Doença Respiratória
A Cascata da Patogénese da CF
Novas Terapias
DNA footprinting
Esta técnica tem ser aplicada num gel de alta resolução, como o gel de
acrilamida que apresenta resolução de 1 nucleótido.
Após a amplificação do DNA em estudo, adiciona-se uma proteína de
interesse que se vai ligar a uma zona especifica deste DNA, impedindo a sua
clivagem por um enzima de restrição. Comparando o gel de eletroforese obtido
ao adicionar esta proteína e o gel sem a adicionar verifica-se que no caso da
adição há uma zona que não foi clivada por não aparecer no gel. É assim
possível determinar a zona a que a proteína se liga no DNA em estudo.
Sistema “Tet-off”
Permite desativar irreversivelmente o promotor. A presença de
tetraciclina impede a transcrição.
Sistema “Tet-on”
O promotor é ativado na presença de tetraciclina.
Mecanismo:
A. Passo precursor. Longos precursores de
dsRNA e miRNA são processados em
siRNA/miRNA duplexes pelo enzima DICER
(uma RNase-III-like). Provavelmente ocorre um
passo de amplificação.
B. Passo efetor. Estes dsRNAs são depois
desenrolados e incorporados em complexo
nucleásicos efetores, designados RISCs (RNA-
induced silencing complexes) que atuam
induzindo a clivagem dos mRNAs, a repressão
da tradução ou a modificação da cromatina.
Microscopia de High-Throughput