MVZ-Crdoba 2003; 8:(2), 310-317

ORIGINAL

PRODUCCIN DE -AMILASA CON CLULAS LIBRES E INMOVILIZADAS DE Thermus sp.

Sarmiento VC, Vargas DH, Pedroza AM, Matiz A, Poutou RA.* Laboratorio de Biotecnologa Aplicada. Grupo de Biotecnologa Ambiental e Industrial. Departamento de Microbiologa. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot, D.C., Colombia. Correspondencia: rp000274@javeriana.edu.co

RESUMEN
Se compara la produccin de -amilasa termoestable a partir de almidn, empleando una cepa autctona de Thermus sp ., en cultivo discontinuo con clulas libres e inmovilizadas en 3% p/v de alginato de sodio. La produccin se llev a cabo en medio PAP2 modificado por la adicin de almidn de maz a 3.024g/l. Los resultados obtenidos en el fermentador, reportaron mayor eficiencia debido a la configuracin geomtrica; concentracin de la fuente de carbono, oxigenacin y temperatura; lo que permite mejor aprovechamiento del sustrato. La mxima produccin de alpha amilasa se obtuvo con clulas inmovilizadas en fermentador con 1l de caldo de cultivo (cultivo fluidizado), a las 24 horas de fermentacin (360.97UA/min l y 149.09 de actividad especfica), vs., 60.31UA/min l y 18.40 de actividad especfica, obtenida en fermentador con 10l de volumen de trabajo a las 14h. Es importante resaltar de este trabajo, que por primera vez en Colombia son utilizadas clulas inmovilizadas de Thermus sp ., para la produccin de alpha amilasa termoestable. P a l a b r a s c l a v e s : Thermus sp., fermentacin, amilasas, cultivo de clulas libres, cultivo de clulas inmovilizadas.

ABSTRACT
The thermostable -amylase production is compared, using a native strain of Thermus sp ., in batch culture and immobilized cells in 3% p/v of sodium alginate. The production was carried out in PAP2 broth modified by the addition of maize starch in a concentration of 3.024g/l. The results obtained in reactor, reported greater efficiency due to the geometric configuration; concentration of the carbon source, oxygenation and temperature; allowing better substrate assimilation. The maximum production of alpha amylase was obtained with immobilized cells in fermentor with 1l of culture broth (fluidized culture), at 24 hours of fermentation (360.97UA/min l and 149.09 of specific activity), vs., 60.31UA/min l and 18.40 of specific activity, obtained in reactor with 10l working volume at 14h. It is important to remark in this work, which is the first time that immobilized cells of Thermus sp ., are used for the production of thermostable alpha-amylase, in Colombia. K e y w o r d s : Thermus sp., fermentation, amylases, free cell culture, immobilized cell culture.

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INTRODUCCIN
Los microorganismos termoflicos han despertado inters entre los investigadores por las bondades que ofrecen en la realizacin de procesos biotecnolgicos; las enzimas que producen estos microorganismos son capaces de catalizar reacciones bioqumicas a elevadas temperaturas, siendo esto una ventaja frente a microorganismos mesfilos. Incrementar la temperatura de los procesos biotecnolgicos repercute disminuyendo la viscosidad y la tensin superficial del sistema, incrementa la velocidad de difusin, la solubilidad de compuestos no gaseosos, lo que disminuyen la contaminacin ambiental. Investigaciones realizadas (Brock 1967), demostraron el comportamiento adaptativo de estos microorganismos y algunos procesos metablicos involucrados en la utilizacin de diferentes fuentes de carbono como sustrato. De otro lado, la inmovilizacin de clulas con el objetivo de producir metabolitos primarios es un proceso que ofrece ventajas debido que los reactores empleados responden a diseos sencillos, se eliminan los pasos de centrifugacin, la posibilidad de establecer sistemas continuos de alimentacin de sustrato y extraccin de productos, la larga duracin de estos procesos, adicionalmente estos sistemas permiten un rpido control de pH y temperatura, permiten altas concentraciones de clulas y no requiere sistemas de agitacin. El objetivo de este trabajo fue el de estudiar la eficiencia en la produccin de -amilasa con clulas inmovilizadas de Thermus sp ., en cultivo discontinuo a partir de almidn como fuente de carbono.

Determinacin de azcares reductores totales ( g / l ) . La concentracin de azcares reductores se determin a travs de la tcnica del Acido 3,5Dinitrosaliclico (DNS). Esta tcnica permiti elaborar una curva de calibracin empleando un patrn de glucosa de (5g/l); la reaccin fue leda en Multiskan (MCC/340) a 540nm de longitud de onda (Miller 1959). Determinacin de la concentracin de a l m i d n ( g / l ) . Se realiz una curva de calibracin empleando diluciones de un patrn de almidn 1g/ l; 1 ml de cada dilucin fue mezclado con 1ml de solucin de KI y I. La mezcla fue leda en un Multiskan (MCC/340) a 620nm de longitud de onda. Para la deteccin del consumo de almidn se emplearon los sobrenadantes de las diferentes horas de fermentacin (Paifer et al . 1994). Determinacin de actividad amiloltica (UA/ m i n l ) . Una unidad de actividad amiloltica es la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un mol de glucosa en minuto (UA/min), bajo condiciones constantes de experimentacin. La actividad enzimtica extracelular fue determinada a lo largo de las cinticas de fermentacin en el extracto crudo despus de centrifugacin a 10000 r.p.m. durante 10 minutos a 4C. Para esto se prepar una solucin 1% p/v de almidn en tampn fosfato 0.1M (Na 2 HPO 4 , NaH 2 P O 4, pH 7.0 +/-0.2) la cual se mezcl a partes iguales con las muestras de extracto crudo; posteriormente se incubaron a 65C durante 30 minutos. La mezcla fue centrifugada a 10000 r.p.m. 5 minutos a temperatura ambiente; el sobrenadante fue empleado para estimar la concentracin de azucares reductores (AR) por la tcnica del DNS. Como blanco en la determinacin se emple tampn fosfato (Berfeld 1995; Sugita e t al . 1997). A la concentracin en g/l de glucosa de cada muestra se sustrajo la concentracin en g/l de glucosa del blanco (para descartar hidrlisis por temperatura del almidn y/o regiones con carbnos anomricos) y se sustrajo la concentracin en g/l de glucosa residual de cada muestra (para descontar la glucosa que originalmente presentaba la muestra) (Vargas et al. 2001). A partir de la concentracin final en g/l de azcares reductores (glucosa) se calcul la concentracin en g/l de almidn empleando la frmula: UA/min l = (g/l glucosa * (1mol de glucosa/180g) * 10 6 )/ 30 min, (Berfeld 1995; Sugita et al . 1997). 311

MATERIALES Y MTODOS
C e p a e m p l e a d a . Thermus sp. , aislada de fuentes termales localizadas en el municipio de Iza departamento de Boyac; caracterizada y conservada en caldo PAP2 (170mg/l Ca(HCO)3 , 44mg/l CaCO3 , 1.41g/l CaCl, 528mg/l MgSO 4 7H 2 O, 0.15mg/l FeSO 4 , 2mg/l PO 4 , 12.5g/l NH 4 SO 4 , 74mg/l NaHPO4 , 1.8mg/l K 2 glucosa, 3g/l extracto de levadura, pH 6.9+/- 0.2 ajustado con H3 P 0 4 ) suplementado con 30% v/v de glicerol a -70C en el Laboratorio de Biotecnologa Aplicada, Grupo de Biotecnologa Ambiental e Industrial, Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana (Pedroza et al. 1997; Pedroza 2000).

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Determinacin de la concentracin de p r o t e n a s e x t r a c e l u l a r e s t o t a l e s . Se emple el mtodo de Bradford (Bradford 1976). D e t e r m i n a c i n d e a c t i v i d a d e s p e c f i c a . La actividad especfica se determin a partir de la diferencia entre la actividad amiloltica UA/min l y la concentracin de protenas totales mg/ml en el extracto crudo (Egas et al . 1998). D e t e r m i n a c i n d e p e s o s e c o ( g / l ) . Se determin a partir de la tara entre los pesasustancias conteniendo 1ml de cultivo, los cuales fueron secados previamente a 85C durante 1 hora y posteriormente colocados a igual temperatura con la respectiva muestra. Se realiz una curva de calibracin de Dop 540nm vs., Peso Seco (g/l); a partir de la cual por regresin lineal se obtuvieron los parmetros que caracterizaron la curva (Matiz A. 1999; Vargas DH, et al . 2001). Todos los extractos crudos fueron ensayados para concentracin de azcares reductores residual (g/l), concentracin de protenas extracelulares totales (mg/ml), concentracin de almidn (g/l), actividad amiloltica (UA/min l) y actividad especfica. Todos los experimentos cuentan al menos con tres rplicas. Ensayo de la concentracin de almidn, para la produccin de a-amilasa con clulas libres de T h e r m u s s p . Se realiz un pre-cultivo de Thermus sp .; se inocularon 5ml de pre-cultivo (10% v/v) en erlenmeyers de 250ml con 50 ml de las siguientes combinaciones: (a) caldo PAP2 modificado con 3.204 g/l de almidn de Maz; (b) PAP2 modificado con 6.408 g/l de almidn de maz; (c) PAP2 modificado con 7.369 g/l de almidn de maz y (d) PAP2 modificado con 9.612 g/l de almidn de maz. Los cultivos fueron incubados a 65C, 200 r.p.m., durante 24 horas. Se ensay el extracto crudo. Escalado preliminar para la produccin de clulas de Thermus sp ., en fermentador de 1 0 l . Thermus sp ., fue precultivada, durante 24 horas; se inocularon 20 ml de pre-cultivo (5% v/v) en erlenmeyers de 2l con 400 ml de caldo PAP2 modificado con 3.204 g/l de almidn de maz y se incubaron a 65C, 200 r.p.m., durante 50 horas. Verificada la pureza microbiana se aadieron los 400 ml de inculo (5% v/v) al fermentador de 10l con 7,6l del mismo caldo, para un volumen efectivo de 8l. Las condiciones de fermentacin se ajustaron a 65C, 350 r.p.m., 1v.v.m., pH variable, durante 25

horas. Las clulas obtenidas se emplearon para el escalado de la produccin con clulas inmovilizadas. Produccin de -amilasa en columna con c l u l a s i n m o v i l i z a d a s d e T h e r m u s s p . Las clulas obtenidas durante el proceso de fermentacin (8l) fueron lavadas con solucin salina (0.85% p/v NaCl) estril y resuspendidas en una solucin de Alginato de Sodio al 3% p/v en H 2 O destilada estril a razn de 0,1g de biomasa hmeda/ml de mezcla de inmovilizacin; mezcla que fue goteada en una solucin 0,5M de CaCl 2 (Thonart et al . 1984). Posteriormente fue armada la columna para lograr determinar el tiempo de retencin terico. Se colectaron muestras cada 2 horas durante 24 horas para la deteccin de la actividad amiloltica. El experimento se realiz a dos temperaturas diferentes 50 y 65C. Produccin de -amilasa en fermentador con c l u l a s i n m o v i l i z a d a s d e T h e r m u s s p . La biomasa obtenida durante la fermentacin fue inmovilizada en condiciones iguales a las expuestas en el experimento de inmovilizacin en columna (Thonart et al . 1984). Posteriormente se realiz el montaje del fermentador, el cual fue inoculado con 140 ml de perlas en 700 ml de medio PAP2 modificado con 3.204 g/l de almidn de maz, como una simulacin de un sistema fluido.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Ensayo de la concentracin de almidn, para la produccin de a-amilasa con clulas libres de T h e r m u s s p . Al emplear 3.204g/l de almidn de maz, se obtuvo 46.48 UA/min l y Act. Esp., de 35.29 a las 22h de fermentacin; mientras que al emplear 6.408g/l, se obtuvo 24.90UA/min l y 6.55 de Act. Esp., a las 2h; al utilizar 7.369g/l se logr 43.16UA/min l, 16.70 de Act. Esp., a las 22h, y al suplementar con 9.612g/l de almidn de maz se obtuvieron 46.48 UA/min l y 8.40 de Act. Esp., demostrando que la menor concentracin de almidn de maz genera mejor actividad especfica; siendo 4.98 veces mayor la actividad al comparar estos resultados con los obtenidos por Pedroza (2000), donde se produjeron 9.33UA/min l y 21.74 de Act. Esp., a las 27h en fermentador de 1l a 150 r.p.m., y 1 v.v.m., utilizando como fuente de carbono 1% p/v de almidn hidrosoluble. El aumento en la produccin de enzima se debe probablemente a la mayor afinidad de la cepa de Thermus sp ., por el

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almidn de maz empleado como fuente de carbono; lo que sugiere que el almidn hidrosoluble 100% puro podra generar inhibicin por sustrato; por otra parte el almidn de maz en forma de maizena que fue empleado contiene CaCl 2 y se conoce que algunas enzimas como la -amilasa de Thermus sp ., requiere como cofactor el Ca2+; los resultados confirman los hallazgos de Pedroza (2000) quien sugiri mayor afinidad de esta cepa (cepa 8), por el almidn de maz (presentacin maizena) con un consumo del 83% del almidn suministrado (10g/l) y una actividad amiloltica de 8.9 UA/min l vs., actividades de 6.5UA/min l y 1.2UA/min l en almidn de papa y de yuca respectivamente (Pedroza et al. 1997).

Escalado preliminar para la produccin de clulas de Thermus sp , en fermentador de 10l. Las condiciones de temperatura, pH, agitacin y fuente de carbono, beneficiaron el proceso de fermentacin, logrando una produccin de -amilasa de 60.31 UA/min l y actividad especfica de 18.4 a la hora 14. Asimismo, la alta afinidad por el sustrato permiti incrementar la produccin de biomasa (1.8 g/l), la cual fue utilizada en el escalado de la inmovilizacin (Tabla 1).

Tabla 1 Resultados obtenidos en la fermentacin de 10L para produccin de biomasa de Thermus sp.

pH

Az. g/l 0.31 0.30 0.34 0.62 0.58 0.62 0.53 0.48 0.47 0.44 0.36 0.40 0.31 0.30 0.29

Prot mg/ml 0.27 0.32 4.43 3.28 3.01 2.51 2.28 2.78 2.78 2.36 2.36 2.17 2.22 2.17 2.23

UA/min l

Act. Espec. 58.55 90.26 6.08 18.40 14.70 20.55 15.11 13.86 17.24 19.69 17.35 21.68 16.84 20.49 14.29

Almidn g/l 3.126 3.126 3.126 1.357 1.252 1.468 1.494 1.127 0.919 0.706 0.566 0.417 0.305 0.175 0.137

Biom. g/l

0 1 2 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

6.5 6.0 6.5 6.0 6.0 6.0 5.5 5.5 5.5 5.5 5.9 6.3 5.9 5.9 5.7

15.68 28.77 26.93 60.31 44.26 51.64 42.60 38.55 47.95 46.48 40.94 47.03 37.81 44.45 31.91

0.000 0.000 0.000 0.090 0.221 0.489 0.896 1.303 1.571 1.702 1.757 1.779 1.787 1.790 1.791

Biom g/l: LN(Biomasa g/l/ Biomasa*0g/l), Az: azcares reductores totales g/l.

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Se demuestra que el crecimiento celular es lento, con una fase de adaptacin (lag) de 14h, lo que sugiere que el consumo de almidn es empleado prioritariamente en la produccin de la enzima. Las oscilaciones en la actividad amiloltica y en la actividad especfica se deben a la produccin de proteasas, aspecto caracterstico de este tipo de microorganismos; las UP/min l oscilaron entre 1.45 y 1.525 (datos no mostrados) (Vargas et al . 2001).

En cuanto a la produccin de la a-amilasa, a la hora 22 se obtuvo la mayor actividad especfica (21.68) con una actividad amiloltica de 47.03UA/min l. Por otra parte, el almidn por su rpido consumo se agot en el medio de cultivo a las 19h, obligando a las clulas a utilizar como fuente de carbono la glucosa, producto de la hidrlisis del almidn, lo que pudo contribuir a las oscilaciones la actividad amiloltica.

Tabla 2. Produccin de -amilasa con clulas inmovilizadas de Thermus sp, en columna a 50 y 65C.

50 o C H 0 4 8 12 16 20 24 28 Glucosa g/l 0.148 0.420 0.478 0.676 1.029 1.314 1.234 1.179 Protenas mg/ml 8.498 5.212 2.141 2.801 5.069 4.664 3.235 3.330 UA/min l 1.63 36.32 32.88 63.69 86.75 126.62 86.32 1.63 Act. Especfica 0.19 6.97 15.36 22.74 17.11 27.15 26.68 0.49 Almidn g/l 3.313 3.397 1.622 2.788 1.723 1.729 1.690 0.020

65 o C H Glucosa g/l 0.012 0.048 0.101 0.509 1.277 Protenas mg/ml 0.916 1.534 3.082 1.594 1.903 UA/min l Act. Especfica 2.48 5.84 6.05 59.16 124.27 Almidn g/l

0 4 8 12 15

2.28 8.96 18.65 94.29 236.52

3.261 2.232 2.001 1.587 0.585

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Si se comparan los resultados de Pedroza (2000) quien trabaj con la misma cepa en fermentador de 1l a 1v.v.m., pH variable, 150 r.p.m. 65 oC y 1% de almidn hidrosoluble y obtuvo 9.33UA/min/ l y 21.7448 de Act. Esp., a las 27h, y los resultados obtenidos en fermentador de 8l, 1v.v.m., pH variable, 350 r.p.m. y 65C donde se lograron 60.31UA/min l a las 14h, se aprecia que un aumento de 7 veces en el volumen gener un incremento en la produccin de enzima de 6.46 veces, como consecuencias del cambio de geometra y de las condiciones de aireacin y concentracin de almidn, de manera tal que podra considerarse un escalado.

A temperatura de 65C, se presenta la mayor produccin de la enzima y actividad especfica; resultados que corroboran los hallazgos de Pedroza (2000) donde la temperatura ptima fue tambin de 65C. Estos resultados pueden ser tiles para sugerir el flujo de comienzo del sistema continuo, dividiendo el volumen total de fermentacin trabajado entre el tiempo en minutos donde se obtuvo la mayor actividad amiloltica; siendo este 0.15 ml de medio/minutos, despus de 15 horas de retenido el medio en la columna. Produccin de -amilasa en fermentador con clulas inmovilizadas de Thermus sp . Los cambios fuertes de temperatura a los cuales son sometidas las clulas, desde la temperatura de conservacin a 4C hasta la temperatura del proceso de fermentacin a 65C, lo que probablemente causan un grado de estrs considerable ocasiona una disminucin en la produccin de la enzima (Tabla 3).

Produccin de -amilasa en columna con clulas inmovilizadas de Thermus sp. La produccin de la enzima a fue comparada a dos temperaturas 50C y 65C. El experimento a 65C mostr actividad especfica 4 veces mayor en 5 horas menos de fermentacin lo cual indic un consumo ms rpido del almidn, ya que a la hora 15 a 65C el sustrato habia disminuido en un 82.3% (Tabla 2).

Tabla 3: Produccin de -amilasa con clulas inmovilizadas de Thermus sp en fermentador a 65C.

H 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

DNS 0.052 0.030 0.185 0.301 0.308 0.496 0.943 1.650 2.196 2.373 2.687 2.999 0.295

Prot. 6.241 3.163 4.210 4.424 3.882 4.602 2.775 3.034 2.374 2.481 2.207 3.382 3.213

UA/min l 2.71 5.23 18.76 25.34 31.21 45.59 100.87 178.12 245.57 238.89 320.45 266.47 360.97

Act. Esp. 1.46 1.53 5.66 5.83 7.45 11.11 39.02 75.02 122.35 113.70 152.34 74.65 149.09

Alm. 3.566 4.978 2.921 2.560 2.028 1.958 1.781 0.992 0.664 0.605 0.501 0.587 0.286

H: Hora de fermentacin; DNS: Glucosa g/l; Prot.: Protena mg/ml; Alm.: Almidn g/l; Act. Esp.: Actividad Especfica

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Al Comparar los resultados obtenidos en columna y fermentador con clulas inmovilizadas, se demuestra que el cambio de geometra es determinante para la produccin de la enzima an cuando las condiciones de fermentacin fueron homogneas en cada uno de los experimentos. El fermentador mostr una produccin mxima de enzima a la hora 24 cuyo valor fue de 360.97 UA/ min l y 149.09 de actividad especfica; produccin mayor en comparacin con la columna a las 15 horas donde se obtuvo 236.52 UA/min l y actividad especfica de 124.27, sugiriendo que la produccin de enzima se debe probablemente a la combinacin de geometra, concentracin de sustrato, la inmovilizacin de clulas, temperatura y condiciones de oxigenacin. Frillingos et al. (2000) expresaron la a-amilasa de Pyrococcus woesei en la bacteria halfila moderada Halomonas elongata obteniendo valores de actividad entre 0.65 y 2.5, UA/min l entre 3.9 y 15, y un mximo de protenas totales de 6mg/ml, la fermentacin se desarroll en cultivo discontinuo a 37C, aerbicamente, en medio salino SW-3 con 3% p/v de sales totales y 0.5% p/v de extracto de levadura. Comparando con los resultados arrojados en el presente trabajo super en 4.02 veces las UA/

min l en fermentador de 8l con clulas libres, en 15.768 veces las UA/min l en colunma con clulas inmovilizadas y en 24.06 veces las UA/min l en fermentador con clulas inmovilizadas (Frillingos e t al . 2000). Por ser la a-amilasa la segunda enzima en comercializarse a nivel industrial, se ha recurrido a diferentes clases de microorganismos con el fin de lograr una produccin mayor y a bajo costo, por requerir condiciones simples de nutricin, por poseer habilidad para crecer rpidamente en condiciones extremas ya sea de temperatura o salinidad lo cual permite proteger a los microorganismos utilizados para dicho fin contra agentes contaminantes (Paifer et al . 1994). Finalmente, despus de revisar la literatura en el campo de la biotecnologa se destaca por primera vez la utilizacin de clulas inmovilizadas para la produccin de a-amilasa termoestable, en lo que respecta a la investigacin en Colombia. Con estos resultados satisfactorios en cuanto a la alta produccin de la enzima en relacin a datos obtenidos con clulas libres, permite abrir un nuevo camino para el avance en futuras investigaciones biotecnolgicas.

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