nº 23

Biotecnologías Las últimas cuatro décadas han visto la adaptación comercial

XIII Congreso
de cuatro generaciones de biotecnologías reproductivas, en particu-
lar con el ganado. Empezó con la inseminación artificial y la sincro-

reproductivas:
nización de celos y pasó a un segundo nivel cuando se recolectaron
y transfirieron embriones obtenidos in vivo. La tercera generación

Internacional
consistió en los embriones fecundados in vitro, la selección del sexo
de los espermatozoides, recogida de los embriones para la clonación

sincronización y, por último, estamos en una etapa en la que se usan para delec-
ciones y adiciones funcionales de genes específicos en el genoma

ANEMBE
celos yde
de los descendientes, mediante la transgénesis, en combinación con

de
técnicas de biología molecular potentes de ARNsi (ARN interferentes
pequeños) y el uso de vectores virales. Revisamos en estas páginas
algunas las biotecnologías reproductivas que se usan a nivel práctico.

Medicina Bovina
transferencia de APLICACIONES DE LAS BIOTECNOLOGÍAS REPRODUCTIVAS
EN GANADO VACUNO

embriones Inseminación artificial y congelación de semen

-eliminación y disminución de enfermedades sexuales
-uso intensivo de un macho de alto valor genético
-aumento de la eficiencia de la estimación del valor genético
Redacción (test de progenie)

Sincronización e inducción a la ovulación

-aumento de la eficiencia de la producción de terneros
-aumento de la eficiencia del manejo productivo y reproductivo

Superovulación, transferencia y congelación de embriones

-uso intensivo de la hembra de alto valor genético
-recuperación más eficaz de individuos exóticos y razas en peligro
de extinción
-formación de bancos de germoplasma
-importación y exportación de material genético

Micromanipulación de embriones para producir mellizos

homocigotos y quimeras
-aumento del número de animales nacidos por embrión
-aumento de la eficiencia del valor genético
-creación de modelos óptimos de experimentación

Determinación y selección del sexo de embriones y

espermatozoides
-producción de la descendencia con el sexo seleccionado

Producción in vitro de embriones

-uso de hembras que no responden a tratamientos superovulatorios
-producción de embriones con ovarios de matadero
-uso experimental

Clonación de animales por medio de transferencia nuclear

-eliminación de la variabilidad de genotipos individuales
-aumento de la eficiencia de la transgénesis

Sincronización de celos
Los resultados reproductivos de un rebaño dependen, básica-
mente, de tres factores:

s0ERÓODODEESPERAVOLUNTARIO
s%FICIENCIAENLADETECCIØNDECELOS
s&ERTILIDADDELREBA×O
46

La sincronización del celo y la ovula-
ción se desarrolló en un primer momento
con el objetivo de acortar el anestro postpar-
to y la lactación, facilitando así el reinicio de
las hembras a la actividad reproductiva. Esta
IA a celo visto (2 - 5días)
parto PG
técnica estableció la base endocrina para el
desarrollo de los programas de superovula-
ción y transferencia de embriones. La sincro-
nización disminuye e incluso evita el tiempo
Biotecnologías reproductivas: sincronización de celos y transferencia de embriones
prepara al útero para la gestación, mantiene
la gestación e inhibe los signos de celo y la
ovulación). La prostaglandina F2! 0'&!)
es la hormona que induce la regresión del
cuerpo lúteo si no se produce la gestación.
IA a celo visto (2 - 5d)
12/14días PG si no ha detectado el celo
Tratamientos basados en prostaglan-
dinas
Como ya hemos dicho, se puede sin-
Tratamientos combinados de prosta-
glandinas con GnRH
La hormona liberadora de gonadotropi-
na induce un pico de hormona luteinizante
(LH) que causa la ovulación del folículo
dominante incluso en presencia de proges-
terona.
El programa Ovsynch consiste en la
APLICACIØN DE UNA INYECCIØN DE 'N2( 
DÓAS ANTES DE LA 0' A PARTIR DE LOS  DÓAS
postparto). Entre 36 y 48 horas después de
LA0'SEAPLICAOTRADOSISDE'N2(YSEINSE-
mina de 12-24 horas más tarde. La primera
DOSIS DE 'N2( INDUCE EL DESARROLLO DE UN
de detección de celo y permite el uso más CRONIZAR LOS CELOS SOLO MEDIANTE 0' PERO folículo dominante en condiciones de ovular,
efectivo de la inseminación artificial. deberemos tener en cuenta que: si regresa se producirá una nueva onda de
crecimiento folicular dentro de los 2 ó 3 días
En la actualidad existen varios tipos de
programas para la sincronización de celos:
1) los que únicamente usan prostaglandinas:
bien aplicadas en vacas que han superado su
periodo de espera voluntario y a las cuales
se les detecta por palpación un cuerpo lúteo
o utilizadas de forma programada cada 14
días (mucho más habitual), 2) programas que
-el cuerpo lúteo solo responde a la SIGUIENTES4RASLASEGUNDADOSISDE'N2(A
INYECCIØNDE0'ENTRELOSDÓASY falta de altas concentraciones de progeste-
del ciclo, lo que provocará un celo en RONA Y DESPUÏS DE QUE LA 0' LISE EL CUERPO
los 2-5 días siguientes. lúteo, se induce un pico preovulatorio de LH
-si un animal está en anestro o no ha y el folículo ovula en las siguientes 24-36
llegado a la pubertad no responderá horas. Si se detectan vacas en celo en cual-
ALAINYECCIØNDE0'&!. quier momento de la sincronización, éstas
-no sirve para programar la insemina- deberán ser inseminadas y las inyecciones de
COMBINAN 'N2( CON PROSTAGLANDINAS PARA
Parto GnRH 7días
inseminaciones programadas y 3) programas
que combinan el uso de progestágenos con
PROSTAGLANDINASYO'N2H
Para entender como funcionan los dife-
rentes procedimientos es importante cono-
cer la base fisiológica. En los rumiantes la
dinámica folicular ocurre de forma continúa
en oleadas. Habitualmente, las vacas lecheras
exhiben dos oleadas de crecimiento folicular,
sin embargo puede haber tres (animales
jóvenes) o más oleadas por ciclo. Cada olea-
da comienza con el crecimiento de un grupo
de folículos, uno de los cuales continúa su
crecimiento mientras los otros se atresian.
En función de si el cuerpo lúteo regresa o
no, el folículo dominante ovula o se atrofia

antes de retirarlo se aplica una dosis de


















ción artificial.
IA entre 12 - 24 horas
PG 36 - 48 horas GnRH
El método tradicional de utilización
de las prostaglandinas con el objetivo de
sincronización de celos, prevé la utilización
de dos dosis de hormona aplicada con un
intervalo de 12 a 14 días. Con la primera
aplicación 14 días antes del fin del periodo
de espera voluntario normalmente el efecto
luteolítico se da aproximadamente en el 60%
de las vacas y con la segunda aplicación
de prostaglandina se induce el estro en la
totalidad de los animales. A partir de las 48
horas de la segunda aplicación se comienza
a detectar celo y poder inseminar.
Una variante del procedimiento des-
crito anteriormente consiste en inseminar
las vacas que entran en celo después de la

horas
IA entre 56
0''N2(OAMBASDEBERÉNSERSUPRIMIDAS
Otro procedimiento más reciente es
el Presynch, que combina las dos dosis de
0' APLICADAS CON UN INTERVALO DE  DÓAS Y
10 ó 12 días más tarde se comienza con el
protocolo Ovsynch.
Tratamientos con progestágenos
Actualmente en el mercado se encuen-
tran disponibles dos tipos diferentes de dis-
positivos intravaginales los cuales contienen
concentraciones variadas de progesterona, el
PRID y el CIDR. Los progestágenos mantie-
nen los niveles de progesterona necesarios
para inhibir la ovulación. En lugar de que la
vaca muestre celo y ovule cuando el cuerpo
lúteo se atresia, el progestágeno adminis-
trado provocará un crecimiento continuado
del folículo e inhibirá la ovulación. Tras la
retirada del dispositivo las concentraciones
de progesterona bajarán y el animal ovulará.
El protocolo más habitual consiste en
colocar el dispositivo y mantenerlo aproxi-
madamente una semana (7-9 días), 24 horas









 




























retirada) y se puede inseminar a las 56 horas
(folículo anovulatorio). Tras la ovulación,
las diferentes células que forman el folículo
ovulatorio cambian su función y se transfor-
man en células luteínicas que constituyen
el cuerpo lúteo, cuya misión principal es la
producción de progesterona (esta hormona

0'&! (en razas de carne se aconseja la
primera aplicación de prostaglandina y sólo
los animales que no se detectaron en celo
reciben una segunda dosis de prostaglandina
y son inseminados cuando demuestran el
celo, que se da la mayoría de las veces entre
las 48 y 120 horas.
INYECCIØN DE 0-3' EN EL MOMENTO DE LA
de la retirada o bien antes si se detecta celo.
Los quistes y folículos persistentes pue-
DEN TRATARSE CON UNA INYECCIØN DE 'N2H
antes de la colocación del dispositivo intra-
vaginal. Posteriormente procederemos de la
misma forma.
47
 nº 23
Transferencia de
embriones in vivo
La superovulación y la transferencia de
embriones son biotecnologías que alcanzaron
su máximo desarrollo a comienzos de 1980.
En Europa el número total de embriones
producidos in vivo transferidos durante el
año 2007 ascendió a 97.292 (S. Merton, AETE,
PAU, Francia 2008). Por medio de tratamien-
tos hormonales que estimulan el desarrollo
supernumerario de los folículos ováricos,
destinados en condiciones naturales a la
atresia, se obtiene un número de embriones
transferibles que varía actualmente de 3 a 7.
Las principales ventajas de esta técnica
son:
s el incremento de la capacidad repro-
ductora,
s la disminución del intervalo genera-
cional (lo que acelera el progreso
genético),
sel bajo riesgo de transmisión de enfer-
medades,
s la posibilidad de reproducción para
algunos animales infértiles,
s constituye un método excelente para
transportar genética.
al esperado. El número de embriones trans-
feribles obtenido en cada lavado es bajo,
estabilizado en torno a 4,8. Además, existen
hembras que no responden a los tratamien-
tos para inducir una ovulación múltiple,
es necesario respetar periodos de descanso
entre dos recogidas consecutivas y es indis-
pensable que las donantes estén en perfectas
condiciones ginecológicas.
El criterio más importante en la trans-
ferencia de embriones es la selección de la
hembra donante, para ello tendremos en
cuenta varios factores entre ellos el índice
genético (lo que transmite a su descenden-
cia), el historial en producción y conforma-
ción de sus progenitores, su producción, su
conformación (que ha de ser excelente) y, por
supuesto, un buen historial reproductivo.
El momento óptimo para empezar el
tratamiento es entre los días 90 y 120 tras
el parto; antes los resultados no son buenos
y después alargaríamos el intervalo entre
partos. Tras un celo natural o inducido, se
inicia el tratamiento entre los días 8 y 12
(generalmente el 11) del ciclo estral, para
evitar la presencia de un folículo dominante
que eclipse el desarrollo de nuevos folículos.
Debemos confirmar la presencia de un cuer-
po lúteo activo.
El tratamiento de superovulación con-
siste en administrar FSH durante varios días
(4 ó 5) a dosis decrecientes, para inducir una
efectuar 3 I.A separadas 12 horas entre si
y aplicar más semen del habitual. Se puede
ADMINISTRAR 'N2( SIMULTÉNEAMENTE A LA Š
I.A para facilitar una ovulación sincronizada.
Otra alternativa es utilizar un dispositivo
intravaginal de progesterona que deberá ser
retirado al 4º día de tratamiento.
La recogida de los embriones se efectúa
entre el 6º y el 8º día después de la I.A. Antes
puede haber embriones en el oviducto que
no serían recuperados y después los embrio-
nes rompen la zona pelúcida y empieza la
implantación en el útero. La técnica usada de
forma habitual son varios lavados uterinos
con un medio especial. El líquido recogido
es filtrado para identificar y clasificar los
embriones que posteriormente se transfieren
en fresco, se conservan refrigerados (entre
0-4º C durante 24h) o se congelan. Los por-
centajes de gestación con embriones conge-
lados son menores, por lo que se recomienda
congelar sólo embriones de alta calidad y con
el grado de desarrollo adecuado para asegu-
rar la gestación (blastocisto).
Cuando utilizamos embriones congela-
dos, es necesario tener en cuenta el criopro-
tector utilizado (deshidratan el embrión par-
cial y progresivamente, evitando la formación
de cristales en el citoplasma y las fuertes
concentraciones salinas) para decidir como
descongelarlo. Si el crioprotector es glicerol,
el embrión se descongela en 4 pasos que
duran unos 20 minutos, con concentraciones
OVULACIØN MÞLTIPLE INYECTAR 0'&!, el día decrecientes de glicerol y crecientes de saca-
Sin embargo también existen inconve- 3 (1 ó 2 dosis), para provocar el celo a los rosa. Si se utilizó etilenglicol simplemente
nientes, el primero un rendimiento menor dos días, e inseminar (día 6). Es conveniente descongelamos la pajuela al baño maría.

X 1000 Normalmente como receptoras se uti-

60
lizan novillas, éstas pueden sincronizarse
CONPROGESTÉGENOSYAPLICANDO0'&! antes
de retirar el dispositivo intravaginal o con
50
542
538 541 0'&! en dos dosis separadas entre si 14
521 523
días. La última dosis debe darse 12 horas
487
antes que a la vaca donante. Se seleccionan
441
40 aquellas receptoras con el mejor cuerpo
433
lúteo, lo que asegurará elevados niveles de
progesterona. El embrión se deposita en el
30 cuerno uterino ipsilateral al cuerpo lúteo
activo.

20 La media obtenida por tratamiento es

la siguiente:

10 8-12 embriones recuperados

6-7 embriones transferibles

0

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 4-5 gestaciones.

Se considera que el 25% de las colectas

Embriones transferidos a nivel mundial entre los años
1998 - 2005 no produce ningún embrión viable y que el

48
 Biotecnologías reproductivas: sincronización de celos y transferencia de embriones

30% de las donantes producen el 70% de los
embriones viables. La tasa de fertilidad es de
un 65% para la transferencia en fresco y de
un 50-60% para embriones congelados.
Transferencia de
feridos 106.200, lo que representa el 14,2%
del total de los embriones transferidos.
Tal y como ocurre con la transferen-
cia de embriones in vivo, esta técnica ha
permitido demostrar sus numerosas aplica-
ciones, entre las que podemos destacar:
funcionales del tracto genital.
s)NCREMENTALAEFICACIADELOSPROCEDI
mientos de selección, mediante la aplicación
de técnicas de diagnóstico preimplanta-
cional para identificar variantes alélicas de
algunos genes de interés productivo.

embriones in vitro s 0ERMITE AUMENTAR EL RENDIMIENTO DE s&ACILITALAUTILIZACIØNDESEMEN

Este procedimiento se basa en la uti-
lización de ovocitos inmaduros, recogidos
directamente del ovario con independencia
de la edad y de la situación fisiológica de
la hembra. Esta técnica ofrece la posibilidad
de convertir a la hembra en productora de
gametos, equiparándola a los machos pro-
ductores de semen para la inseminación arti-
ficial, lo que supondría numerosas ventajas
en los programas de selección. Sin embargo,
existen varias diferencias fisiológicas entre
los machos y las hembras, que dificultan la
consecución de este objetivo: la población
de ovocitos presente en el ovario es limitada
y no se renueva, sino que disminuye progre-
los programas de producción de embriones a
partir de hembras de elevado valor genético,
ya que podemos obtener ovocitos en novil-
las de más de seis meses de edad y en vacas
durante el primer trimestre de gestación y a
partir de las 2-3 semanas del posparto. Esta
técnica no interfiere con los ciclos produc-
tivos o reproductivos de la hembra donante
y, además, evita la necesidad de utilizar
gonadotropinas.
s 0ERMITE PRODUCIR EMBRIONES A MUY
bajo coste, lo que facilita la transferencia
de embriones de razas cárnicas en vacas de
aptitud láctea no destinadas a la recría o
utilizarlos para tratar la infertilidad derivada
sexado.
Sin embargo, esta técnica es todavía
poco eficiente, lo que dificulta su aplicación
a gran escala. Los principales inconvenientes
son:
1. Sólo un limitado porcentaje de ovoc-
itos son capaces de transformarse en embri-
ones transferibles, entre el 30 y el 40%.
2. Los embriones producidos in vitro
son de menor calidad que los obtenidos in
vivo. Lo que ocasiona bajos porcentajes de
gestación (30 a 40%), y una escasa resisten-
cia a la criopreservación.

EMBRIONES RECOLECTADOS Y TRANSFERIBLES EN LOS AÑOS 1991 Y 2004

EN 8 PAÍSES DE LA U.E. (AETE, 1992-2005)

Embriones
PAÍS Recolectados Transferibles

(!) Por cada vaca Por cada vaca

1991 2004 1991 2004 1991 2004
Alemania 37.948 32.193 9,1 11,5 5,4 6,6
Bélgica 17.767 7.570 8,2 6,9 4,9 4,5
España 2.145 3.561 7,0 10,6 2,9 5,0
Francia 63.049 53.421 8,0 9,7 4,5 5,6
Holanda 31.875 5,8
Irlanda 7.332 2.085 7,5 8,4 4,8 5,3
Italia 9.431 14.227 8,9 13,9 5,8 6,8
República Checa 11.376 12.150 7,5 10,3 4,1 5,4
Total/promedio 149.048 159.086 8,0 8,9 4,7 5,6
Calidad (%) 57,5% 62,9%

EUROPEAN EMBRYO TRANSFER ASSOCIATION. http://www.aete.eu/

sivamente con la edad como consecuencia
de la atresia, los ovocitos no son liberados
al exterior, siendo preciso extraerlos del
oviducto o de la corteza ovárica y, por otra
parte, la población de ovocitos es muy het-
erogénea en cuanto a su calidad y grado de
madurez.
Por ejemplo, según datos publica-
dos por la IETS (INTERNATIONAL EMBRYO
TRANSFER SOCIETY http://www.iets.org)
durante el año 2003 se obtuvieron 330.000
embriones bovinos a nivel mundial mediante
fecundación in vitro, de los que fueron trans-
de problemas de ovulación, fecundación o
mortalidad embrionaria precoz.
s 0ERMITE OBTENER DESCENDIENTES DE
hembras de elevada calidad genética que
deban ser sacrificadas por padecer enferme-
dades, infertilidad, por su avanzada edad o
durante los programas de erradicación de
enfermedades infecciosas.
s 0ERMITE EL APROVECHAMIENTO DE ANI-
males con determinadas formas de infer-
tilidad: machos con oligospermias severas,
hembras con alteraciones estructurales o
3. Existe un incremento de la mor-
talidad embrionaria (10-12%), de los abor-
tos, y de los problemas gestacionales como
el hidroalantoides y el alargamiento de la
gestación.
4. Está relacionado con el nacimiento de
terneros muy voluminosos (lo que ocasiona
un aumento del porcentaje de distocias), con
anomalías estructurales y funcionales, cono-
cido con el nombre de síndrome de exceso de
volumen fetal, que disminuyen el vigor de los
animales en el momento de su nacimiento y
provocan una mayor mortalidad perinatal.
49
 nº 23

TABLA 20: Actividad de transferencia de embriones en 2007

PAIS: ESPAÑA
A.E.T.E 2008
Datos recogidos por: Dr. Julio de la Fuente

Número total de trabajos de transferencia de embriones aprobados en el pais.

Número de equipos de suministro de datos.

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES
Donaciones hechas A 467 B / A= 9.6
IN VIVO Embriones recolectados B 4484 C / A= 4.3
Embriones trasnferidos C 2014 C / B= 45.0 %
IN VITRO Nb de óvulos donantes 3
(OPU) Nb de OPU sesiones 16
Nb de embriones transferidos 7
D
IN VITRO Nb de embriones transferidos
E
(embriones muertos)
F 7 = (D+E)
Total embriones IN VITRO
Número total de embriones transferidos G 2021 = (C+F)
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
IN VIVO Fresco H 456
IN VIVO Congelado I 1437 75.9 % Congelados

IN VITRO Fresco J 6
IN VITRO Congelado K 1 16.7 % Congelados
Total de embriones transferidos L 1900 H+I+J+K
Número de embriones congelados guardados M 1814
% de embriones in vitro transferidos N 0.4 % (J + K) / L=
% de embriones congelados transferidos O 75.7% (I + K) / L=

Número de becerros nacidos por transferencia de embriones (2007)

Número de becerros nacidos de embriones superovulados 690

Número de becerros nacidos de embriones in vitro. 2
Total 692

Fuente: 24th Annual Metting A.E.T.E. - PAU, Francia 2008.

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