CAPTULO 2.7.3.

MICOPLASMOSIS AVIAR (Mycoplasma gallisepticum)

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: La micoplasmosis aviar est causada por varios micoplasmas patgenos de los cuales Mycoplasma gallisepticum (MG) es el ms importante y el nico que ocasiona una enfermedad de declaracin obligatoria segn la OIE. Descripcin de la enfermedad: MG es la causa de una enfermedad respiratoria crnica, especialmente cuando concurre un trato estresante y/o la presencia de otros patgenos respiratorios. La enfermedad se caracteriza por coriza, conjuntivitis, estornudos y sinusitis, particularmente en pavos y aves de caza. Puede originar prdida de produccin y disminucin en las aves para carne y en la prdida de la produccin de huevos. Las cepas de MG varan en infectividad y virulencia, y las infecciones pueden ser a veces asintomticas. Identificacin del agente: Se puede identificar MG por mtodos inmunolgicos despus de aislamiento en medio para micoplasmas o por la deteccin de su ADN en muestras de campo o en cultivos. Las muestras para el aislamiento pueden ser frotis de rganos o tejidos, exudados, homogenados tisulares diluidos, aspirados de los senos infraorbitales o de cavidades articulares, o material de la yema de huevo o de embriones. Los signos clnicos y las lesiones influirn en la seleccin de la muestra. Para el aislamiento se usan medios lquidos y slidos, pero normalmente es necesario obtener colonias de micoplasmas en medio slido antes de intentar la identificacin. En la clasificacin inicial de los aislamientos son tiles las pruebas bioqumicas, pero la identificacin final se hace por pruebas inmunolgicas, siendo la prueba de anticuerpos fluorescentes y la de la inmunoperoxidasa las ms satisfactorias. En laboratorios especializados se usan mtodos de deteccin de ADN, basados en la reaccin en cadena de la polimerasa, y existen preparados comerciales disponibles. Pruebas serolgicas: Para detectar anticuerpos contra MG se usan varias pruebas serolgicas, pero debido a variaciones en la especificidad y sensibilidad, resultan ms satisfactorias para la evaluacin de las poblaciones que para las pruebas en individuos. Generalmente, las ms usadas son la prueba rpida de aglutinacin srica (RSA), el enzimoinmunoensayo (ELISA) y la prueba de la inhibicin de la hemaglutinacin (IH). En la prueba RSA, se mezcla suero con antgeno MG marcado producido comercialmente, y los que reaccionan en 2 minutos se calientan a 56C durante 30 minutos y se vuelven a ensayar. Los sueros que an reaccionan, especialmente cuando se los diluye, se consideran positivos. Las pruebas ELISA o IH pueden usarse como confirmativas. Existen varios preparados comerciales ELISA con anticuerpo MG. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Aunque el mtodo preferido de control es el mantenimiento de las bandadas libres de MG, para pollos se usan tanto vacunas vivas como inactivadas. La vacunacin debe considerarse apropiada slo para sitios con aves de muchas edades donde la infeccin es inevitable. Se usa normalmente para evitar prdidas en la produccin de huevos por ponedoras comerciales, aunque las vacunas tambin pueden usarse para reducir la transmisin a travs de los huevos en ncleos de reproduccin o para favorecer la erradicacin de MG en sitios con aves de muchas edades. Es importante vacunar antes de que ocurra la aparicin del agente natural.

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Se dispone de vacunas vivas producidas a partir de la cepa F de MG, y, ms recientemente, de las cepas ts11 y 6/85, que son cepas no patgenas con propiedades de seguridad mejoradas. Es preferible la administracin de la cepa F por ruta intranasal o por gota en el ojo, aunque tambin puede administrarse por aerosol o en agua de bebida. Para ts11 se recomienda el mtodo de gota en el ojo, y para 6/85 una pulverizacin fina. Las pollas se suelen vacunar entre las 12 y 16 semanas de edad. Es suficiente una dosis y las aves vacunadas se convierten en portadoras permanentes. El uso a largo plazo de la cepa F en sitios con aves de varias edades ocasiona un desplazamiento de las cepas naturales. La cepa ts11 se ha usado para erradicar con xito la cepa F en ponedoras comerciales de varias edades. Las bacterinas contienen una suspensin concentrada de organismos MG en una emulsin de aceite. Se administran de modo parenteral a las pollas de 1216 semanas de edad, por lo general de modo subcutneo en el cuello. Son deseables dos dosis. Las bacterinas son eficaces para evitar prdidas en la produccin de huevos y la enfermedad respiratoria, pero no evitan la infeccin con MG natural.

A. INTRODUCCIN
Mycoplasma gallisepticum (MG) pertenece a la clase Mollicutes, orden Mycoplasmatales, familia Mycoplasmataceae. Sin embargo debe destacarse que M. synoviae (MS), M. meleagridis y M. iowae tambin pueden causar enfermedad en aves de corral, aunque se considera que MG es el ms importante de los micoplasmas patgenos y la OIE ha designado la enfermedad causada por MG como de declaracin obligatoria. MG tiene una distribucin mundial y es particularmente importante en pollos y pavos como una causa de enfermedad respiratoria y de descenso de produccin (3,15). Tambin puede originar una enfermedad del tracto respiratorio superior en aves de caza. Ms recientemente se ha advertido en Amrica del Norte que MG causa conjuntivitis en pinzones (16). En aves de corral la infeccin se transmite verticalmente a travs de los huevos infectados y horizontalmente por estrecho contacto; el cido nucleico de MG se ha identificado en muestras ambientales (18). Otros mtodos de dispersin estn peor documentados. Los signos clnicos en aves de corral infectadas pueden variar de asintomticos a sntomas respiratorios obvios como coriza, conjuntivitis, tos y estornudos. Puede ocurrir exudacin nasal, estertor traqueal y soplos a travs del pico parcialmente abierto. Tambin puede ser caracterstica una sinusitis uni o bilateral, particularmente en pavos y aves de caza, y los senos infraorbitales pueden presentarse tan hinchados que los prpados se cierran. La conjuntivitis con exudado ocular espumoso es tambin una caracterstica comn en pavos y aves de caza, y a veces en pollos. En los pavos, a menudo se manchan las plumas de las alas como resultado de los intentos de eliminar el exudado de los ojos. Los pinzones infectados pueden mostrar descargas nasales y oculares y los prpados hinchados adems de conjuntivitis. En algunas circunstancias, MG se puede asociar con enfermedades respiratorias agudas en pollos y pavos, especialmente en aves jvenes, siendo el pavo ms susceptible. La gravedad de la enfermedad est muy influenciada por el grado de infeccin secundaria con virus tales como el de la enfermedad de Newcastle y el de la bronquitis infecciosa, y/o con bacterias tales como Escherichia coli. En pavos existe sinergismo con la infeccin por neumovirus aviar. Puede ocurrir una forma ms crnica de enfermedad y originar descensos en la produccin de huevos en reproductoras y ponedoras. Las lesiones del tracto respiratorios se manifiestan al principio por un exudado mucoso excesivo y despus por exudacin catarral caseosa, que puede formar masas amorfas en los sacos areos. En pavos y aves de caza, los senos infraorbitales hinchados contienen una exudacin mucosa o caseosa. La enfermedad por MG en pollos puede parecer superficialmente una enfermedad respiratoria causada por otros patgenos como cepas de baja patogenicidad de la enfermedad de Newcastle (Captulo 2.1.15) y la bronquitis infecciosa aviar (Captulo 2.7.6). stas se pueden presentar en infecciones mixtas con MG. Tambin deberan descartarse infecciones con Haemophilus paragallinarum, Pasteurella multocida y MS. En pavos, MG se puede confundir con infecciones por neumovirus aviar y la presencia de sinusitis tambin puede sugerir infeccin con Pasteurella multocida, Chlamydia (Captulo 2.7.4) o MS.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
La presencia de MG se puede confirmar aislando el organismo en un medio sin clulas o detectando directamente su ADN en tejidos infectados o muestras de frotis. Cuando los resultados son equvocos, se

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pueden inocular embriones de pollo o pollos con el material sospechoso. Tambin se utilizan mucho pruebas serolgicas para diagnosis.

1.

Identificacin del agente

Cultivo
Se toman muestras de aves vivas, de cadveres frescos o de cadveres de aves que fueron congelados cuando estaban frescos. Tambin se pueden recoger muestras de embriones muertos dentro del huevo o de pollos o aves que han roto la cscara pero no lograron salir del huevo. En aves vivas, se pueden tomar frotis de la hendidura coanal, orofaringe, esfago, trquea, cloaca y falo. En el caso de aves muertas, se pueden tomar muestras de la cavidad nasal, seno infraorbital, trquea o sacos areos. Los exudados se pueden aspirar de los senos infraorbitales y de las cavidades articulares. Las muestras tambin se pueden tomar de huevos embrionados, por ejemplo de la superficie interna de la membrana vitelina, y de la orofaringe y sacos areos. Todas las muestras deben examinarse tan pronto como sea posible despus de su recoleccin. Si es necesario el transporte, se deben poner pequeos trozos de tejido en medio lquido para micoplasmas, o se deben agitar vigorosamente los bastoncillos de algodn que contienen los frotis en 12 ml de medio lquido para micoplasmas y despus desecharlos. Alternativamente, los bastoncillos de muestreo se pueden mojar en medio lquido para micoplasmas antes de tomar las muestras (23) y despus colocarlos en los recipientes para el transporte. Debera incluirse un paquete con hielo o cualquier otro medio de refrigeracin. Pueden ser tiles diluciones seriadas de las muestras porque la presencia de anticuerpos, de antibiticos o de sustancias inhibidoras en los tejidos puede inhibir a menos que se diluyan, el crecimiento de los micoplasmas. Se han formulado varios medios de cultivo adecuados (7) y el medio apropiado para aislar micoplasmas aviares puede adquirirse de Mycoplasma Experience, Reigate, Surrey, United Kingdom. Los medios para micoplasmas contienen generalmente protena hidrolizada y una base de infusin de carne suplementada con suero o una fraccin srica, factores de extracto de levaduras, glucosa e inhibidores bacterianos. Es importante que cada nuevo lote de medio se ensaye con cultivos de MG de aislamiento reciente y bajo nmero de pases in vitro porque algunos componentes, especialmente el extracto de levadura y el suero pueden variar en cuanto a su capacidad para permitir el crecimiento. En EE.UU. y en otros pases es muy usado el medio desarrollado por Frey et al. para el aislamiento de MG (y de M. synoviae) (2,8). Para el cultivo de MG se puede omitir del medio la presencia de nicotinamida adenn dinucletido. Los siguientes medios lquidos y slidos resultan tambin satisfactorios para el crecimiento de MG: Parte A: Medio lquido base para organismos como el de la pleuroneumona (PPLO) sin cristal violeta (Difco) (14,7 g); agua destilada o desionizada (700 ml). Parte B: Suero porcino (calentado a 56C durante 1 hora) (150 ml); 25% (peso/volumen) de extracto de levadura fresco (100 ml); 10% (p/v) de solucin de glucosa (10 ml); 5% (p/v) de acetato talioso (10 ml); 200.000 Unidades Internacionales (UI)/ml de penicilina G (5 ml); y 0,1% (p/v) de solucin de rojo fenol (20 ml). El pH se ajusta a 7,8. El suero porcino puede ser reemplazado por suero de caballo, pero es importante comprobar que permite el crecimiento de MG.

La parte A se autoclava a 121C, a 1 atmsfera durante 15 minutos y, despus de enfriar, se aade la parte B, que ha sido esterilizada previamente por filtracin. Para el medio slido correspondiente, se aaden 10 g de agar purificado, que se sabe permite el crecimiento de MG, a la parte A antes indicada. La mezcla se autoclava como se ha dicho y se mantiene en un bao de agua a 56C. Los ingredientes de la parte B, omitiendo el rojo fenol, se mezclan separadamente y luego se incuban a 56C. Las partes A y B se mezclan con cuidado para evitar la produccin de burbujas y se distribuye el medio en placas de 50 mm usando 79 ml/placa. La excesiva humedad superficial puede evitarse con una corta incubacin a 37C. Las placas se almacenan en un recipiente hermtico a unos 4C durante un tiempo de hasta 2 semanas. El extracto de levadura fresco est comercialmente disponible, aunque es preferible prepararlo "en casa" tomando levadura activa de panadera seca (250 g) y suspendindola en aguas destilada (1 litro). Esto se calienta hasta ebullicin, se enfra y luego se centrifuga durante 20 minutos a 3.000 g. El sobrenadante lquido se decanta y se ajusta a pH 8,0 con 0,1 M NaOH. Esto se clarifica por filtracin o centrifugacin, y

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luego se esteriliza por filtracin. El extracto se guarda a 20C. La glucosa de grado reactivo (10 g) se disuelve en agua destilada o desionizada (100 ml) y se ajusta a pH 7,88,0 con 0,1 M NaOH. Se esteriliza por filtracin y se guarda a 4C. El acetato talioso de grado reactivo se disuelve (5 g) en agua destilada o 6 desionizada (100 ml), se esteriliza por filtracin y se guarda a 20C. La solucin de penicilina (10 UI de benzilpenicilina en 5 ml de agua destilada) se mantiene a 4C y tiene una vida en almacenamiento de 1 semana. En aislamientos a partir de muestras muy contaminadas, se puede aumentar la concentracin de penicilina a 2.000 unidades/ml o se puede utilizar alternativamente ampicilina 0,51,0 mg/ml. El rojo fenol (0,1 g) se pulveriza en 0,1 M NaOH (2,8 ml) y luego se lleva a 100 ml con agua destilada estril y se autoclava a 115C a 1 atmsfera durante 30 minutos. Se guarda a 4C. (Nota: el acetato talioso es muy txico y se deben tomar precauciones, en especial cuando se prepara la solucin stock). Las muestras se inoculan en medio slido y lquido para micoplasmas. El medio slido ayuda a detectar colonias de micoplasmas de crecimiento lento, que pueden pasar desapercibidas en medio lquido por 3 saprofitos. Puede ser necesario hacer diluciones de hasta 10 para tener xito en el aislamiento. Las placas inoculadas se incuban a 37C en recipientes sellados. Se ha descrito que una atmsfera con humedad y una tensin parcial de CO2 creciente aumenta el crecimiento; estas condiciones se pueden establecer incluyendo un papel o lana de algodn hmedo e inyectando en el contenedor 510% de CO2 en nitrgeno, colocando una vela encendida en el contenedor, o usando un incubador con CO2 o un sistema adecuado de generacin de gas. Los tapones de los recipientes del medio lquido deben estar fuertemente apretados antes de la incubacin a 37C para evitar cambios indeseables de pH. Durante los primeros das, las placas se examinan diariamente para aparicin de colonias con un microscopio estereoscpico; despus se examinan con menor frecuencia. Los cultivos con material de campo no se deben considerar como negativos durante al menos 20 das. El medio lquido debe examinarse diariamente en cuanto a acidez, indicada por un cambio de rojo a anaranjado o amarillo en el indicador. Cualquier crecimiento observado debe subcultivarse inmediatamente a medio slido. Incluso si no existe cambio de color, se debe subcultivar a medio slido despus de 710 das o antes ya que la presencia de especies de micoplasmas que hidrolizan la arginina (productoras de lcali) puede enmascarar el cambio de color al cido producido por MG. Las colonias de micoplasmas en medio slido se pueden reconocer generalmente, aunque pueden no presentar la tpica apariencia de "huevo frito". Pueden aparecer colonias bacterianas en la primera siembra , pero a menudo son ms pigmentadas y no se pueden resembrar en medios para micoplasmas. Las reacciones bioqumicas (como la fermentacin de glucosa y la incapacidad de hidrolizar arginina) pueden ayudar en la identificacin, aunque no son especficas de MG y hacen necesaria la purificacin del cultivo por clonacin. Para identificar los aislamientos de micoplasmas se pueden usar mtodos inmunolgicos y de deteccin de ADN. stos incluyen la prueba de la inmunoflorescencia indirecta con anticuerpos (IFI) y de la inmunoperoxidasa (IP), que son simples, sensibles, especficas y rpidas de realizar; la inhibicin del crecimiento (GI); y la inhibicin del metabolismo (MI). Para las pruebas GI y MI se necesitan cultivos purificados (clonados), pero no para las pruebas IFI o IP. stas ltimas pueden detectar la presencia de ms de una especie de micoplasma, ya que las colonias especficas reaccionarn frente al antisuero mientras que las otras no lo harn. No obstante, M. imitans, una especie de micoplasma que est relacionada serolgicamente con MG y que presenta propiedades bioqumicas similares se ha aislado en algunos pases de patos, gansos y a veces de otras especies aviares no domsticas. Se puede diferenciar de MG usando un mtodo PCRRFLP (reaccin en cadena de la polimerasa/polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin), como describe Kempf (10). Alternativamente, las colonias del aislamiento se pueden examinar por inmunofluoerescencia usando diluciones seriadas de antisueros para MG y M. imitans en paralelo. El antisuero homlogo debera tener un ttulo considerablemente ms alto. Los mtodos de deteccin de ADN para identificar directamente MG en tejidos o para identificar aislamientos en el laboratorio se presentan ms adelante y normalmente se basan en la tcnica de PCR. En circunstancias en que los mtodos anteriores no son concluyentes, puede ser apropiada la inoculacin de embriones de pollo o bioensayos en pollos vivos. Sin embargo, estas tcnicas son costosas y de larga duracin y tienden a ser reemplazadas por la tecnologa de la PCR, aunque an constituyen una herramienta til en investigacin. Las muestras requeridas para la inoculacin de embriones de pollo son las mismas que las usadas en la inoculacin de medios artificiales. Se preparan en medio lquido omitiendo el cido talioso, se incuban a 37C durante 3060 minutos, y luego se inoculan alcuotas de 0,050,1 ml en el saco vitelnico de varios embriones de pollo de 68 das de edad de bandadas que estn libres de MG. Los huevos se examinan al trasluz diariamente y los embriones que mueren a las 24 horas de la inoculacin se desechan. Cualquier embrin muerto posteriormente se mantiene refrigerado hasta el cultivo y los que

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sobreviven ms de 5 das se colocan a 4C durante 4 horas para matarlos y para reducir las hemorragias al abrirlos. La yema se subcultiva en medio lquido y en medio slido. Los lpidos de la yema tienden a oscurecer las colonias de modo que resulta esencial sembrar la yema de modo muy fino o, con preferencia, diluirla primero en medio lquido para micoplasmas. Los bioensayos se pueden llevar a cabo por inoculacin de un homogeneizado de material sospechoso en al menos cuatro pollos susceptibles de 810 semanas de edad que estn libres de micoplasmas. La diagnosis se confirma mediante la recuperacin de MG de estas aves, la demostracin de ADN de MG y/o la demostracin de anticuerpos especficos (17). Un procedimiento adecuado es el siguiente: Muestras tales como los cornetes nasales, los senos infraorbitales, la trquea, los pulmones, los sacos areos, el oviducto, o el fluido articular se homogenizan con 5 a 10 volmenes de medio de cultivo lquido, y se inoculan de inmediato en al menos cuatro aves. Cada ave se inocula intranasalmente, supra conjuntivalmente, intratraquealmente, en el seno infraorbital y en los sacos areos. Los pollos se mantienen aislados. Otras dos aves de control se inoculan por las mismas rutas pero solo con medio lquido y se mantienen aisladas separadamente. Un procedimiento alternativo que se ha mostrado adecuado es colocar pavos libres de micoplasmas en contacto con aves de una bandada sospechosa en una instalacin aislada como centinelas "en contacto". Despus de la inoculacin, los sueros de todas las aves se ensayan a intervalos para presencia de anticuerpos contra MG por la prueba de la aglutinacin srica rpida (RSA). Cualquier pavo que muestre signos respiratorios se cultiva para MG a partir de los sacos areos y de los pulmones. Despus de una sangra final a los 35 das de la inoculacin, se matan todas las aves y se examinan para lesiones visibles y microscpicas. Los tejidos, en especial aquellos que muestran lesiones visibles, se cultivan para presencia de micoplasmas. Las muestras originales se consideran positivas para MG si se detecta el organismo o su ADN en los pollos inoculados con el homogenado o en los pavos "en contacto", o si presentan ttulos en RSA de 1/4 o ms. Ttulos menores que ste se consideran como dudosos. Debera realizarse una prueba de enzimoinmunoensayo (ELISA) o una prueba de inhibicin de la hemaglutinacin. El organismo o su ADN no se deberan detectar en las aves control, ni stos deberan desarrollar ningn ttulo en la prueba RSA. No debera existir reaccin RSA para M. synoviae en ningn grupo de aves.

Mtodos inmunolgicos
Los procedimientos de inmunofluorescencia y de IP para diagnosis se aplican generalmente a los aislamientos sospechosos en el laboratorio ms bien que directamente a los exudados o tejidos infectados. Esto se debe a que los organismos son demasiado pequeos para reconocerlos de modo concluyente bajo microscopa ptica y a que es improbable poder disponer de los correspondientes controles negativos y positivos de exudado/tejido.

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo

La tcnica recomendada para la prueba IFI (19) requiere un cultivo del aislamiento desconocido en medio slido, que contenga numerosas colonias pequeas y diferenciadas, un cultivo conocido de MG como control positivo, y un cultivo de otra especie de micoplasma, como M. synoviae o M. gallinarum como control negativo. Tambin se necesita un suero policlonal antiMG de conejo, un suero normal de conejo y un suero fluorocromoconjugado con antiinmunoglobulina de conejo. Los sueros se pueden preparar en especies que no sean conejos, pero no se deben usar anticuerpos monoclonales (MAbs) porque MG muestra una expresin variable de sus epitopos superficiales y un Mab puede no reconocer al organismo. Las diluciones de trabajo adecuadas en solucin salina estril tamponada con fosfato (PBS; 0,01 M, pH 7,2) del suero antiMG, y del conjugado se determinan primero por titulacin cruzada, y se seleccionan para uso diluciones dos a cuatro veces inferiores a los puntos finales reales. stas se aplican a las colonias de micoplasmas que se van a identificar y que se han crecido previamente en placas con agar como se indica a continuacin. i) ii) Procedimiento de la prueba De placas con medio slido que contengan colonias se cortan bloques de aproximadamente 1,0 x 0,5 cm y se colocan en portas para microscopa con las colonias hacia arriba. Para permitir despus la orientacin, se corta la esquina inferior derecha del bloque. En cada porta se pone un bloque con el aislamiento desconocido, un bloque con cultivo conocido de MG y un bloque con un micoplasma diferente, pero conocido. En otro porta, se coloca otro bloque del aislamiento desconocido. A cada bloque del primer porta se aade una gota de antisuero contra MG adecuadamente diluido y se aade suero normal de conejo al bloque aislado del segundo porta.

iii)

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iv) v)

Se incuban todos los bloques 30 minutos a temperatura ambiente en una atmsfera hmeda. Cada bloque se coloca en un tubo marcado que contiene PBS, pH 7,2, y se lava durante 10 minutos en un agitador rotatorio, luego se vuelve a lavar de modo similar, y finalmente se devuelven los bloques a los portas originales para microscopa. Se absorbe el exceso de humedad de los lados de los bloques. A cada bloque se aade una gota del conjugado diluido, y se incuba y lava como antes. Se devuelven los bloques a sus portas originales, y se examinan las colonias mediante luz incidente usando microscopa de fluorescencia.

vi) vii)

La interpretacin de los resultados es subjetiva y requiere alguna experiencia; las comparaciones con los controles son esenciales, y deben presentar las reacciones correctas. Algunos laboratorios usan antisuero conjugado con fluorescena en una prueba de inmunofluorescencia directa (IMF directa). Una tcnica muy usada para IMF directa es aquella en la que los reactivos se aplican sucesivamente dentro de anillos de acero inoxidable que se colocan en las placas originales con el medio slido para los micoplasmas. Aunque esto es rpido y fcil de realizar, los resultados obtenidos son menos especficos que mediante el uso del mtodo indirecto, que es, por tanto, el preferido.

b)

Prueba indirecta de la inmunoperoxidasa

Se basa en un principio similar al de la prueba IFI pero la unin de los anticuerpos especficos a las colonias se detecta in situ aadiendo una inmunoglobulina anticonejo que est conjugada con el enzima peroxidasa. Luego se desarrolla una reaccin positiva aadiendo el substrato apropiado que, por oxidacin, produce colonias coloreadas. Tambin se puede usar un procedimiento de inmunounin en que las colonias ensayadas se transfieren a nitrocelulosa (12) y despus reaccionan de una manera similar. Para el serotipado de aislamientos por IP, como por IFI, se deben usar anticuerpos policlonales. La ventaja de la prueba IP sobre la de inmunofluorescencia es que la prueba IP no necesita un costoso microscopio de fluorescencia.

c)

Prueba de inhibicin del crecimiento

En la prueba GI, se inhibe el crecimiento de los micoplasamas por antisuero especfico, lo que posibilita la identificacin de especies. Es una prueba relativamente poco sensible y los sueros deben tener ttulos muy altos, ser monoespecficos y proceder de mamferos, ya que los sueros de aves no inhiben el crecimiento de los micoplasmas de modo eficaz. El organismo ensayado tiene que estar en cultivo puro (clonado) y se deben probar varias diluciones; una concentracin de 104 unidades formadoras de colonias (CFU/ml) es ptima. La velocidad de crecimiento del organismo puede influir en la inhibicin, y es adecuado retardar al principio el crecimiento mediante incubacin a 27C durante 24 horas, y despus seguir con incubacin a 37C. Los detalles sobre esta prueba y su interpretacin se han publicado en otro lugar (5).

Mtodos de reconocimiento de cido nucleico

El uso de mtodos de deteccin de ADN especfico es una alternativa al cultivo e identificacin convencionales. Se puede detectar MG por hibridacin con sondas de ADN, pero en la actualidad es mucho ms comn usar la PCR para amplificar porciones especficas del ADN en el material analizado. Una prueba comercializada de ADN de MG usa directamente PCR sobre el material extrado de frotis. Si el producto amplificado est presente se detecta utilizando una sonda no marcada radioactivamente. Se dispone dos versiones; una que detecta cepas de campo de MG y otra que identifica la cepa vacunal F. Se han publicado tambin varias pruebas "caseras" basadas en PCR incluyendo una PCR mltiple, diseada para detectar los cuatro micoplasmas aviares patgenos (21), pero que no ha sido validada con muestras clnicas. Se han citado varios mtodos por Kempf (10) y, adems, un manual publicado por Lauerman (13) contiene una prueba de PCR validada para MG y otros micoplasmas aviares. Este mtodo se presenta ms adelante.

a)

Aislamiento de ADN
El ADN se extrae de muestras de frotis (se pueden juntar de tres a cinco) por suspensin en 1 ml de PBS de grado para PCR depositado en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con tapn a presin. La suspensin se centrifuga 30 minutos a 14.000 g y 4C. El sobrenadante se recoge cuidadosamente con una pipeta Pasteur y el precipitado se suspende en 25 l de agua de grado para PCR. El tubo con su contenido se hierve durante 10 minutos y luego se coloca en hielo durante 10 minutos antes de centrifugar a 14.000 g durante 5 minutos. El ADN se encuentra en el sobrenadante.

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b)

Cebadores
Los cebadores para MG son las siguientes secuencias. MG14F: 5GAGCTAATCTGTAAAGTTGGTC3 MG13R: 5 GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC3

c)

Reaccin en cadena de la polimerasa

Las mezclas de reaccin deben prepararse en un rea limpia separada, usando un juego de pipetas dedicadas a tal fin. Para una reaccin de PCR de 50 l la mezcla es la siguiente: H2O ultrapura 10 x Tampn para PCR dNTP (10 mM) Cebador F (20 pmoles/l) Cebador R (20 pmoles/l) Taq (5 U/l) MgCl2 (50 mM) 35,75 l 5,00 l 1,00 l 0,50 l 0,50 l 0,25 l 2,00 l

En cada tubo de PCR se disponen 45 l de la mezcla de reaccin. La mezcla de reaccin se debe tapar con unas gotas de aceite mineral ligero a menos que el termociclador est equipado con tapadera caliente. Los tubos se llevan luego a otro rea limpia donde se aade la muestra de ADN apropiada (5 l) a cada tubo. Se deben usar controles negativos y positivos en cada serie. Los tubos se colocan luego en un termociclador para los siguientes ciclos: 40 ciclos: 94C durante 30 segundos, 55C durante 30 segundos, 72C durante 60 segundos; 1 ciclo (extensin final): 72C durante 5 minutos y colocar a 4C.

d)

Electroforesis
Los productos de la PCR se detectan en electroforesis convencional en gel de agarosa, incorporando marcadores adecuados de tamao, y examinando con luz UV. El producto de la PCR para MG tiene 185 pb. La visualizacin de los productos de la PCR debe realizarse en un rea del laboratorio distinta, bien separada de donde se llevan a cabo todos los otros pasos del procedimiento. En la actualidad las pruebas PCR suelen efectuarse en laboratorios especializados y probablemente deban considerarse como auxiliares tiles de los mtodos actuales de diagnstico hasta que se haya establecido claramente su validacin. Se debe tener gran cuidado en evitar la contaminacin de las muestras con ADN de MG de laboratorios de cultivo cercanos o de amplificaciones positivas de reacciones PCR anteriores. Sin embargo, la preparacin comercial referida anteriormente tiene licencia como mtodo diagnstico por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y su uso est aprobado por el Plan Nacional de Mejora Aviar (NPIP). Tambin hay mtodos moleculares disponibles para diferenciar las cepas de MG (10), pero en la actualidad su uso est restringido a laboratorios especializados.

2.

Pruebas serolgicas

Las pruebas serolgicas de uso corriente pueden carecer de especificidad y/o sensibilidad; se aconseja su uso para controlar bandadas ms que para ensayar en aves individuales. Quienes deseen usar dichas pruebas para diagnstico deben tener en cuenta que han de establecer el ensayo de sensibilidad y especificidad (Captulo I.1.3) bajo las condiciones propias de su laboratorio. Debera tambin resaltarse que estas pruebas no han sido validadas para ser usadas con sueros de aves de caza. Las pruebas ms usadas normalmente son RSA, ELISA y HI, aunque se han descrito otras como el radioinmunoensayo, la microinmunofluorescencia y la prueba IP. El nmero de sueros a ensayar dentro de una bandada depende del nivel de deteccin y de los lmites de confianza que se requieran. Los requisitos mnimos pueden ser pasados por alto en el comercio internacional y la frecuencia de los ensayos puede tambin estipularse como, por ejemplo, en la Directiva 90/539/EEC del Consejo de la Comunidad Europea. Los requisitos mnimos y las pruebas aprobadas han sido tambin expuestas por miembros del NPIP de EE.UU. Las compaas granjeras que usan las tcnicas ELISA para analizar gran nmero de sueros en cuanto a anticuerpos contra virus pueden encontrar adecuado este tipo de ensayo para analizar micoplasmas. Las tcnicas ELISA no se describen aqu en detalle porque estn disponibles comercialmente varios sistemas para

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

anlisis de MG. En su lugar, se aportan detalles de la prueba HI ya que los reactivos necesarios para esta prueba no tienen una comercializacin amplia.

a)

Prueba rpida de aglutinacin srica

Se recogen sueros de una muestra de la bandada y, si no se ensayan inmediatamente, se mantienen a 4C sin congelar. La prueba debe realizarse a temperatura ambiente (2025C) dentro de las 72 horas de la recogida del suero y los reactivos tambin deben estar a temperatura ambiente. Una centrifugacin previa reducir las reacciones inespecficas. Los antgenos para RSA estn disponibles comercialmente, pero pueden variar en especificidad y sensibilidad entre diferentes fabricantes y de lote a lote. Pueden almacenarse siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Tambin se pueden preparar antgenos adecuados coloreados para RSA de modo "casero" siguiendo los mtodos de cultivo descritos en la Seccin B.1.; stos se tien luego con el colorante cristal violeta. Los estndares de control de calidad para antgenos de micoplasma en pruebas serolgicas se describen a continuacin. i) Procedimiento de la prueba Poner un volumen de suero (aproximadamente 0,02 ml) encima de una baldosa limpia blanca o en una placa de cristal, y a continuacin poner un volumen de antgeno MG coloreado. No permitir que el suero se seque antes de la adicin del antgeno. Es importante agitar el recipiente del antgeno vigorosamente y con frecuencia durante el uso para mantener en suspensin la cantidad correcta de antgeno. Usando una varilla de vidrio, extender la mezcla sobre un rea circular de aproximadamente 1,5 cm de dimetro. Balancear la baldosa o el cristal durante 2 minutos. La aglutinacin se advierte por la floculacin del antgeno en 2 minutos. Incluir en la prueba controles positivos y negativos conocidos. Volver a probar diluciones seriadas de cualquier suero aglutinante despus de calentamiento a 56C durante 30 minutos. Si todava reaccionan fuertemente, se consideran positivos, en especial si lo hacen diluidos (a 1/4 o ms).

ii)

iii) iv)

En EE.UU. se pueden obtener antisueros positivos de referencia del USDA National Veterinary Services 1 Laboratories (NVSL), y en Europa de la AFFSA en Ploufragan , Francia. Los sueros producidos en pollos o pavos se pueden comprar con varios rangos de titulacin. Tambin se pueden comprar preparaciones de antisueros en el Departamento de Medicina Aviar de la Universidad de Georgia, dependiendo de las disponibilidades. Estas preparaciones se producen mediante infeccin por contacto en pollos infectados con la cepa virulenta R de MG. No hay estndares internacionales para interpretar estas pruebas, pero una proporcin alta de sueros positivos en una bandada (10% o ms) indica infeccin por MG, en especial si se confirma por la prueba HI o por ELISA. Para ms confirmacin, la misma poblacin debera de volver a ser analizada en un mes. Resultados poco concluyentes hacen necesario el aislamiento del organismo o la demostracin de la presencia de su ADN. Los resultados dudosos deben investigarse mediante pruebas con antgeno de M. synoviae, ya que la infeccin con este organismo causa a veces reacciones cruzadas. Las pruebas se pueden realizar en la yema o vitelo as como en los sueros, aunque la yema debe ser primero diluida o extrada.

b)

Prueba de la inhibicin de la hemaglutinacin

MG es capaz de hemaglutinar los hemates aviares (RBCs), y la presencia de anticuerpos especficos en los sueros causa inhibicin. Se debe seleccionar una cepa que crezca bien y que hemaglutine con seguridad. La prueba HI requiere un antgeno de MG que sea satisfactoriamente hemaglutinante, hemates frescos lavados de pollo o pavo, segn proceda, y el suero a ensayar. El antgeno puede ser un cultivo fresco en medio lquido o una suspensin lavada y concentrada de MG en PBS. Puede resultar difcil mantener un suministro de altos ttulos de antgeno por cultivo en medio lquido; sin embargo, el uso de antgeno concentrado (que normalmente contiene 2550% de glicerol y se guarda a 70C) incrementa la probabilidad de reacciones inespecficas. En EE.UU., se puede comprar antgeno para hemaglutinacin de MG en los NVSL.

Agence franaise de scurit sanitaire des aliments (AFFSA) Ploufragan, Mycoplasmology Bacteriology Unit, 22440 Ploufragan, France.

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

La prueba HI sigue procedimientos bien conocidos (1). Se determina primero el ttulo HA del antgeno en diluciones de base doble sucesivas, definindose la unidad HA como la menor cantidad de antgeno que produce una completa HA en el sistema de prueba ensayado. La prueba HI debera realizarse usando 4 unidades HA por el mtodo siguiente o por un mtodo que tenga una sensibilidad equivalente determinada por pruebas con sueros positivos conocidos. Todas las titulaciones HA y las pruebas HI se realizan mejor en placas de plstico con multipocillos de fondo en forma de V y usando volmenes constantes de 50 l. En cada prueba se incluye un suero control positivo y otro negativo. Se necesita una fila de ocho pocillos para cada suero analizado. i) ii) iii) Procedimiento de la prueba Aadir 50 l de PBS al primer pocillo de cada fila Aadir 8 unidades HA de antgeno en volmenes de 50 l al segundo pocillo de cada fila y aadir 50 l de 4 unidades HA de antgeno a cada uno de los pocillos del 3 al 8. Aadir 50 l de una dilucin 1/5 preparada previamente del suero ensayado al primer pocillo, mezclar y transferir 50 l al segundo pocillo, y as sucesivamente, y desechar 50 l del ltimo pocillo. El primer pocillo es el control del suero. Se necesitan seis pocillos para el control de antgeno. Aadir 50 l de PBS a los pocillos 2 a 6, inclusive, y aadir 8 unidades HA de antgeno a los pocillos 1 y 2. Mezclar el contenido del pocillo 2 y transferir 50 l al pocillo 3, mezclar y repetir hasta el pocillo 6, y eliminar 50 l. Se requieren dos pocillos para el control de hemates. Aadir 50 l de PBS a cada uno de stos. Aadir 50 l de una suspensin al 0,5% de hemates (clulas de pollo para suero de pollo, y de pavo para suero de pavo) a todos los pocillos. Agitar ligeramente la placa para asegurar que se mezcla bien el contenido de los pocillos, y evaluar despus de dejar que repose aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente o cuando la titulacin del antgeno seale 4 unidades HA. Para la lectura de resultados, la placa debera inclinarse y solo aquellos pocillos en los que los hemates "se deslicen" al mismo tiempo que en los pocillos del control de hemates se considera que presentan inhibicin. El control de suero debera mostrar un claro botn de hemates y los controles positivos y negativos deberan reaccionar segn lo esperado. El ttulo IH es la dilucin ms alta del suero que manifiesta una inhibicin completa de HA.

iv)

v) vi) vii)

Los sueros que dan HA inespecfica deben adsorberse para extraer todas las hemaglutininas inespecficas de modo que se obtenga un claro botn en el pocillo control sin antgeno HA. La adsorcin se realiza incubando 1 ml de dilucin srica con 68 gotas de de hemates de pollo o pavo lavados y compactados. Las clulas se eliminan despus de incubar a 37C durante 10 minutos, y el sobrenedante se ensaya para actividad hemaglutinante. No hay definicin oficial de resultados negativos o positivos para el comercio internacional pero el NPIP expresa que ttulos de 1/80 o superiores se consideran positivos y ttulos de 1/40 son altamente sospechosos.

c)

Enzimoinmunoensayo
Se encuentran en el mercado algunas preparaciones comercializadas de ELISA para anticuerpos frente a MG. La sensibilidad viene determinada en cierto modo por las recomendaciones de los fabricantes en cuanto a los niveles de corte para considerar las reacciones positivas y sospechosas. A veces la sensibilidad puede estar "amortiguada", para evitar las bien conocidas reacciones cruzadas entre MG y Mycoplasma synoviae. Una tcnica ELISA usa un anticuerpo monoclonal (MAb) que reconoce un eptopo de un polipptido de 56 kDa de MG (6). En este sistema, las placas de ELISA estn recubiertas con antgeno de clulas enteras de MG y los sueros ensayados se aaden como en el mtodo convencional indirecto de ELISA, pero la reaccin se basa en la medida del bloqueo que ocurre cuando se aade el MAb conjugado. Una ventaja de este sistema es que puede usarse para sueros de cualquier especie aviar sin adaptacin. i) Control de calidad de antgenos de Mycoplasma gallisepticum y M. synoviae. Antgenos de Mycoplasma gallisepticum Los antgenos se suelen preparar de la cepa S6 o de la cepa A5969. Tambin se pueden usar antgenos de otras cepas cuando sea necesario. Antgeno MG para la prueba RSA: Los mtodos de control de calidad que se describen ms abajo solo se aplican a suspensiones de MG teidas con un colorante apropiado, que contienen conservante y

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

que estn dirigidas a ser usadas con suero en la prueba de aglutinacin rpida en placa. Tales antgenos estn comercialmente disponibles. Por examen microscpico, el antgeno debe aparecer como una suspensin homognea sin flculos o precipitados y el medio lquido de suspensin debe estar libre de colorante residual. Debe estar exento de contaminacin por bacterias y hongos. El pH debe estar entre 6,5 y 7. Debe mantenerse a 5+3C y calentarse a temperatura ambiente antes de usarse. La sensibilidad y especificidad del antgeno se determina respecto a su reaccin con sueros positivos conocidos de alto y bajo ttulo y con sueros negativos conocidos. Una reaccin positiva se reconoce por la formacin de flculos coloreados y el aclaramiento del medio de suspensin. Los criterios antes descritos son vlidos hasta la fecha de expiracin declarada por el fabricante. Antgeno MG para la prueba HI: La prueba se realiza con preferencia con cultivos vivos en crecimiento activo: El antgeno debe estar libre de contaminacin por bacterias y hongos. Antgeno MG para ELISA: Puede ser difcil preparar un antgeno satisfactorio para uso en la tcnica indirecta de ELISA sin una considerable experimentacin previa y la confirmacin de la sensibilidad y la especificidad. El uso de una preparacin comercial fiable es probablemente el mejor mtodo en la mayor parte de los laboratorios de diagnstico. Algunas preparaciones tienen ahora licencia del USDA y su uso est aprobado por el NPIP en USA. ii) Antgenos de Mycoplasma synoviae Los antgenos se preparan de la cepa WVU 1853 o de otras cepas adecuadas. Antgeno de Mycoplasma synoviae para la prueba RSA: Las especificaciones son las mismas que para el antgeno MG en la prueba RSA. Antgeno de Mycoplasma synoviae para la prueba HI: Las especificaciones son las mismas que para el antgeno MG en la prueba HI. iii) Comentarios adicionales Los sueros que dan reacciones inespecficas en la prueba RSA no suelen dar una reaccin positiva en la prueba IH usando antgeno HA vivo. Las reacciones RSA positivas se pueden confirmar por la prueba HI con sueros tomados en las 23 primeras semanas despus de la infeccin (el tiempo que tardan en aparecer los anticuerpos HI). Sin embargo, la prueba HI suele ser especfica de cepa (11) y por tanto puede carecer de sensibilidad. La tcnica ELISA puede ser una alternativa til. En las pruebas RSA no se deben congelar las muestras de suero antes de usarlas. Deben carecer de hemlisis y de contaminacin para evitar reacciones inespecficas. El empleo de vacunas inactivadas para otras enfermedades puede originar reacciones inespecficas. Las muestras deben ser ensayadas tan pronto como sea posible (dentro de 72 horas) debido a que los anticuerpos frente a micoplasmas se pueden deteriorar con el tiempo de almacenamiento. Los sueros se pueden inactivar en un bao con agua a 56C durante 30 minutos.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

El mejor mtodo de control es mantener las poblaciones libres de MG. La vacunacin se debe contemplar solo en situaciones donde la exposicin resulte inevitable, como en granjas con aves de distintas edades. Tambin hay que considerar la posible exposicin de bandadas de aves de corral vecinas. Para el control de MG existen dos tipos de vacunas. stas son cepas suaves o avirulentas de MG que se usan como vacunas vivas o bacterinas inactivadas en emulsiones de aceite. El tema de la vacunacin ha sido revisado por Whithear (22). Aunque entre las cepas de MG existe variacin antignica, se piensa que la vacunacin con una sola cepa resulta suficiente. En el Captulo I.1.7 se recogen algunas directrices para la produccin de vacunas veterinarias. Las indicadas aqu y en el Captulo I.1.7 intentan ser de carcter general y pueden ser suplementadas con requisitos nacionales y regionales.

Vacunas vivas: mtodos de uso

El uso de vacunas vivas equivale a una "exposicin controlada". La finalidad es infectar la bandada con una cepa inmunognica de MG suave a una edad en la que ocurra poco o ningn dao. Dicha exposicin origina resistencia frente a una infeccin posterior en la vida, como en granjas comerciales con aves de distinta edad. Las aves vacunadas son resistentes a la enfermedad respiratoria, saculitis, y a descensos en la produccin de huevos causados por MG. La vacunacin tambin origina un nivel reducido de la transmisin por huevos en las reproductoras.

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

La cepa ms usada en las vacunas es la cepa F de MG (4). Es una cepa natural con virulencia moderada o dbil en pollos, pero virulenta en pavos. De ordinario se extiende de ave a ave lentamente. Cuando se administra a pollos sanos a travs del tracto respiratorio, no se observa reaccin respiratoria o es escasa. Sin embargo, cuando se administra mediante aerosol o en presencia de otros agentes de enfermedades respiratorias, como el virus de la enfermedad de Newcastle o el de la bronquitis infecciosa, se pueden presentar sntomas respiratorios y saculitis. Los pollos vacunados son portadores permanentes, de modo que una dosis nica es suficiente. El uso de vacuna con la cepa F en cada renovacin de bandadas en una granja resulta a largo plazo en el desplazamiento de la cepa natural por la cepa vacunal. Las cepas ts11 y 6/85 son avirulentos y no ocurre su extensin a aves no vacunadas o lo hace muy escasamente cuando las aves estn en muy estrecho contacto (14). Los pollos comerciales se vacunan normalmente entre las 12 y 16 semanas, pero se permite la vacunacin de aves ms jvenes o ms viejas. Es esencial realizar la vacunacin antes de que la bandada se infecte naturalmente. En casos de probable infeccin natural inicial se pueden vacunar aves tan jvenes como de 24 semanas. Para la cepa F, es preferible la administracin nasal o por gota en el ojo. A menos que se realice adecuadamente, la administracin mediante el agua de bebida puede originar que algunas aves no resulten vacunadas. La administracin por aerosol tambin debe realizarse de forma cuidadosa, de modo que todas las aves resulten expuestas. A los 57 das de la vacunacin es de esperar una reaccin respiratoria si se administr por aerosol. Las poblaciones vacunadas deben ensayarse con la prueba de la aglutinacin unas 34 semanas despus de la vacunacin para asegurarse de que todas las aves fueron expuestas de modo adecuado. Es deseable vacunar las aves a una edad en la que no reaccionen a otras vacunas respiratorias. La cepa ts11 debe administrarse por gota en el ojo, y la 6/85 mediante un fino pulverizador. La vacuna con ts11 produce una respuesta serolgica baja pero reconocible por aglutinacin srica en placa, HI y ELISA, pero la vacuna con 6/85 no origina de ordinario respuesta serologica. Tanto con 6/85 como con ts11 no se deben observar reacciones postvacunales. Las poblaciones vacunadas con la cepa F o ts11 son positivas para cultivos durante la vida de la bandada, pero en cambio la cepa 6/85 puede ser difcil de recuperar despus de las 46 semanas de vacunacin. Las vacunas vivas comercializadas deben usarse en 12 horas despus de su reconstitucin. Las vacunas liofilizadas deben guardarse a 4C. Algunos fabricantes suministran la vacuna congelada. Tales vacunas deben mantenerse en nitrgeno lquido, en hielo seco, o a 70C o ms fro. La vacuna viva para MG no es estable a las temperaturas de los congeladores ordinarios por largos perodos. Debe evitarse el almacenamiento a 20C ms all de unos pocos das. Las cepas ts11 y 6/85 son ms seguras que la cepa F, aunque su nivel de proteccin puede ser algo menor y pueden resultar tiles como vacunas primarias en una granja o como una "vacuna de segunda generacin" en sitios en que previamente se ha usado la vacuna con la cepa F. Tambin pueden preferirse en situaciones en que la exposicin inadvertida de poblaciones de aves cercanas pueda resultar preocupante. La cepa F desplaza la cepa natural de MG con ms eficacia que la ts11 o la 6/85, pero la ts11 se ha usado para erradicar la cepa F de MG en una granja de produccin comercial de huevos (20). Los lugares en los que se usa repetidamente 6/85 a menudo dan pruebas negativas para MG, lo que sugiere que desplaza a la cepa natural. Las vacunas vivas tambin se han usado en algunos pases en el caso de productoras de pollos. En Australia, se est extendiendo el uso de la vacuna viva ts11 en pollas de produccin de pollos y en ponedoras comerciales. Durante varios aos, en algunos pases de Amrica Latina la vacuna con cepa F se ha usado en pollas productoras de pollos bajo condiciones de granja; ms recientemente ha habido un uso limitado de las cepas ts 11 y 6/85. Las evidencias anecdticas y la experiencia personal sobre el rendimiento de las productoras y la enfermedad respiratoria en su descendencia indican que tales vacunas han sido tiles y eficaces cuando se aplicaron convenientemente. En EE.UU. ha habido un uso restringido de la cepa 6/85 como vacuna para pavos comerciales, pero no existen buenos datos sobre su eficacia. Generalmente, no se recomienda la vacunacin de pavos con vacunas vivas, y la vacunacin de pollos con vacunas vivas o inactivadas no ha tenido xito.

Vacunas inactivadas: mtodo de uso

Las bacterinas de MG se preparan a partir de una suspensin concentrada de clulas enteras que se emulsiona en un adyuvante lipdico. Es esencial que haya un elevado contenido antignico. Las bacterinas se usan normalmente en pollas comerciales para dar proteccin frente al descenso de produccin de huevos que ocurre en las granjas despus de la exposicin a MG (9). Tambin se pueden usar en ponedoras para reducir el nivel de transmisin a travs de los huevos. El uso de bacterinas en pollos se reduce por el hecho de que los vacunados antes de 12 semanas no quedan protegidos. Aunque las bacterinas pueden conferir proteccin contra sntomas respiratorios, saculitis y prdida de produccin de huevos, las bandadas vacunadas se infectan. No se conoce la duracin de la inmunidad, pero la mayor parte de las poblaciones estn expuestas entre 12 meses despus de la vacunacin.

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

La administracin es intramuscular o subcutnea, con una dosis normal de 0,5 ml por ave. Existe el riesgo de que una reaccin persistente en el lugar de la aplicacin de la vacuna haga necesario el retoque de las carcasas de las aves vacunadas por va intramuscular, de modo que la ruta subcutnea de administracin en la parte dorsal del cuello es la ms usada. Son preferibles dos dosis pero el coste y el trabajo pueden aconsejar una dosis simple, normalmente entre las 16 y 18 semanas en los pollos comerciales. Se puede usar una jeringa multidosis. Todo el equipo debe limpiarse y esterilizarse entre tratamientos de bandadas, y los vacunadores deben llevar a cabo mtodos de seguridad cuando se desplazan entre bandadas. Las vacunas deben guardarse a 28C hasta su uso. No deben congelarse ni exponerse a la luz fuerte.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Vacunas vivas

La cepa vacunal debe ser inmunognica, con capacidad de colonizar el tracto respiratorio superior y causar el mnimo dao al sistema respiratorio. Una fuerte respuesta de anticuerpos no se correlaciona necesariamente con la inmunidad. Los inculos de cultivo deben estar libres de agentes extraos. El cultivo debe ser clonado para asegurar su pureza. Si se desea, se pueden desarrollar los perfiles de ADN del micoplasma con endonucleasas de restriccin en geles de agarosa para confirmar la identidad y pureza de la cepa. Los inculos de siembra deben ser estables y sin tendencia a la reversin de la virulencia. Esto se puede confirmar mediante diez pases en pollos susceptibles. Se pueden introducir pollos de contacto a intervalos semanales. Si es necesario, se pueden tomar frotis traqueales de pollos infectados e insertarlos luego en la trquea de los pollos de contacto. Debe demostrarse la transmisin del organismo. El aislamiento que resulte puede ser usado a continuacin para infectar pollos susceptibles. Vacunas muertas

Las caractersticas ms importantes de las vacunas muertas son alto rendimiento y buena antigenicidad. Se supone, aunque no est probado, que son mejores las cepas virulentas. Los inculos de cultivo deben estar libres de organismos contaminantes.

b)

Mtodo de cultivo
El inculo de cultivo se puede propagar en un medio similar al descrito antes (Seccin B.1.). Para las vacunas vivas el cultivo lquido se liofiliza o congela a 70C o a ms fro. Para las bacterinas, el cultivo se debe concentrar y resuspender en un pequeo volumen de solucin salina o PBS antes de preparar la emulsin.

c)

Validacin como vacuna

Antes de la produccin de la vacuna en masa se deben obtener datos sobre la eficacia. Los pollos se deben vacunar por la misma ruta que la usada en condiciones de campo. Las aves vacunadas deben ser expuestas y su proteccin determinada en cuanto a sntomas respiratorios, descargas nasales, y/o saculitis. Idealmente, se debe de evaluar la proteccin respecto a la prdida de produccin de huevos, pero tales intentos son caros e incmodos de realizar. Eficacia de la prueba: Grupos de 20 pollos libres del patgeno especfico (SPF) o al menos libres de micoplasmas, de 2 semanas de edad o mayores, se vacunan por gota en el ojo u otra ruta de administracin con una dosis de campo de la vacuna viva, o subcutnea o intramuscularmente con una dosis de bacterina (normalmente 0,5 ml). Se mantiene aislado un grupo similar de pollos no vacunados como control. Todos los pollos se exponen a un cultivo lquido de 24 horas de una cepa virulenta de MG, a las 23 semanas despus de la vacunacin. Un mtodo simple de exposicin es la inoculacin de 0,1 ml de un cultivo de descarga en el saco areo torcico posterior. Despus de 710 das del desafo se hace la necropsia a todos las aves y se anotan las lesiones en los sacos areos. Otros mtodos alternativos son la prueba por inoculacin de 0,1 ml en el seno infraorbital y examinar la descarga nasal en las aves despus de un perodo de entre 7 y 14 das o descargar mediante aerosol y medir el grosor de la mucosa traqueal en secciones microscpicas de cuatro o seis puntos equidistantes predeterminados (22).

2.

Mtodo de produccin

La vacuna debe producirse en ambientes limpios y seguros, bien separados de los servicios de diagnstico o de la produccin comercial. Debe tenerse especial cuidado en evitar la contaminacin por MG de otros productos producidos en los mismos servicios.

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

La produccin de la vacuna debe ser mediante un sistema de siembra por lotes, con una cepa adecuada de MG de origen, historia de cultivo y pureza conocidas. El medio de cultivo es similar al indicado anteriormente. El suero empleado en el medio de crecimiento debe inactivarse a 56C durante 1 hora para evitar la contaminacin con algn micoplasma presente, y ser esterilizado por filtracin. Es aconsejable una fuente de suero SPF. Se inocula el medio lquido con un inculo de crecimiento rpido a una relacin de aproximadamente el 5% (v/v). Se incuba a 37C. La produccin puede ser discontinua, usando grandes contenedores o en un fermentador. En los cultivos discontinuos se recogen despus de aproximadamente 24 horas de incubacin. Las vacunas vivas se conservan mediante liofilizacin o por congelacin a 70C en nitrgeno lquido o en hielo seco. Para produccin de bacterinas, se debe concentrar el antgeno, normalmente por centrifugacin, ultrafiltracin u otro mtodo adecuado. Las bacterinas se presentan como emulsiones de agua en aceite, por lo normal con 80 de aceite mineral, 20% de fase acuosa, y con un agente emulsionante apropiado.

3.

Control interno

Contenido antignico: El ttulo debera ser de 108 a 109 CFU/ml al tiempo de recogerse. La concentracin antignica de las bacterinas es difcil de estandarizar pero se puede basar en el volumen celular comprimido, que es tpicamente de un 1% (v/v) de clulas comprimidas en el producto final. Inactivacin de vacunas muertas: con frecuencia la inactivacin se hace con betapropiolactona o formaldehdo. El agente inactivador y el proceso de inactivacin bajo las condiciones de produccin de vacunas debe lograr la inactivacin del organismo vacunal y de contaminantes potenciales. Antes de la inactivacin, se debe procurar una suspensin homognea exenta de partculas que puedan resultar impenetrables para el agente inactivante. Debe realizarse una prueba de inactivacin por cultivo en medio lquido para micoplasmas de cada lote tanto del producto recogido en masa como del producto final. No debera observarse crecimiento de micoplasmas. Esterilidad de las vacunas muertas: El aceite usado en las vacunas debe esterilizarse calentano 1 hora a 160C o por filtracin, y el proceso debe ser eficaz. Las pruebas adecuadas para vacunas en emulsin de aceite se realizan en cada lote de las vacunas finales como se indica, por ejemplo, en la British Pharmacopoeia (Veterinary) 1985.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas de esterilidad y ausencia de contaminantes de materiales biolgicos se encuentran en el Captulo I.1.5.

b)

Inocuidad
Prueba de seguridad para vacunas vivas

Las aves vacunadas en la prueba de eficacia dada arriba se pueden usar para evaluar la seguridad de la vacuna. Prueba de seguridad para vacunas muertas

Las aves vacunadas en la prueba de eficacia dada arriba se pueden observar para efectos locales adversos o efectos sistmicos.

c)

Potencia
Las pruebas de potencia para vacunas vivas y muertas se pueden hacer por los procedimientos considerados anteriormente para la prueba de eficacia. El ttulo de las vacunas vivas debe ser suficiente para inducir una infeccin por la ruta recomendada; en la administracin por gota en ojo de la vacuna viva 5 7.7 con la cepa F son suficientes 10 CFU/dosis. La dosis recomendada de ts11 es > 10 unidades de cambio de color (CCU)/dosis, y para 6/85, una dosis de 107108 CFU result eficaz en ensayos de infeccin por descarga.

d)

Duracin de la inmunidad (vacuna muerta)

Como las poblaciones se exponen generalmente a los 12 meses despus de la vacunacin, la duracin de la inmunidad no es una consideracin importante. Despus de la estimulacin en condiciones naturales, se considera que la resistencia es permanente.

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

e)

Estabilidad
En tres lotes de vacunas se debe evidenciar que la vacuna supera la prueba de estabilidad 3 meses mas all de la duracin requerida.

f)

Conservantes
Normalmente se requieren conservantes para la conservacin de la vacuna en recipientes multidosis. La concentracin del conservante en la vacuna final y su persistencia a lo largo de la validez de la vacuna debe controlarse. Se debera utilizar un conservante adecuado que haya sido utilizado para tales fines. Los micoplasmas son sensibles a muchos antimicrobianos excepto a las penicilinas; tales antibiticos no deberan incluirse como conservantes.

g)

Precauciones (riesgos)
Las vacunas con emulsiones de aceite causan grave dao al vacunador si se inyectan accidentalmente en la mano u otros tejidos. En caso de dicho accidente, la persona debe ir de inmediato a un hospital, tomando consigo el paquete de vacuna. Cada botella y embalaje de vacuna debe estar marcado con una advertencia de las serias consecuencias de autoinyeccin accidental. Tales heridas deben ser tratadas por el doctor como una "lesin por disparo de grasa". El personal implicado en la vacunacin de aves con vacunas vivas por aerosol debe llevar ropas de proteccin y mascarillas.

5.
a)

Pruebas del producto final

Seguridad
Ver Seccin C.4.b.

b)

Potencia
Ver Seccin C.4.b.

REFERENCIAS
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2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

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Captulo 2.7.3. Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)

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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum) (vase Cuadro de la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la pgina Web de la OIE para conseguir la relacin ms actualizada: www.oie.int).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

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