Fortalecimiento en la Enseanza de la Enfermedad de Chagas

Diagnstico de Laboratorio. II Estudios inmunoserolgicos

Dr. Edgardo Moretti Profesor, Servicio de Neonatologia, Ctedra de Pediatra y Neonatologa Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de Crdoba Jefe de Laboratorio, Coordinacin Nacional de Control de Vectores, Crdoba

INTRODUCCION. Aspectos epidemiolgicos. Ver: Beatriz Basso. Diagnstico de Laboratorio. I Estudios parasitolgicos

Estudios Inmunoserologicos La serologa es una disciplina basada en la deteccin de anticuerpos especficos contra un determinado microorganismo, en este caso el Trypanosoma cruzi. Debera llamarse con mayor propiedad Inmunodiagnstico, ya que serologa es un trmino antigo que alude a la utilizacin de suero como material biolgico en el cual se realiza el estudio. De todos modos, ambos trminos se consideran sinnimos. El concepto bsico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parsito y, por lo tanto, sus resultados nunca proporcionan certeza diagnstica y deben medirse en trminos de probabilidad. Para que las probabilidades de xito en el diagnstico serolgico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente el mtodo a emplear, el momento de la toma de muestra y, asimismo, interpretar adecuadamente los resultados. Existen algunos mitos que consideramos deben ser descartados. El primer mito, es que la serologa resuelve todos los problemas diagnsticos. Nada ms alejado de la realidad, que cualquier lector de las bases elementales de la inmunologa no puede desconocer. A diferencia de lo que ocurre en Qumica Clnica, en Serologa se buscan sustancias (anticuerpos o eventualmente antgenos) normalmente ausentes, por lo cual un resultado se expresa como Positivo o Negativo (Todo o nada), lo cual merece una interpretacin diferente. Por otro lado, los informes no se expresan en unidades concretas sino relativas (ttulo) y, asimismo, se establece un valor de corte arbitrario que puede no ser el mismo para distintas 1

regiones geogrficas, por la presencia en alguna de ellas de otros parsitos que puedan interferir en el diagnstico, dando reacciones cruzadas. Por estas razones, y otras cuya descripcin escapa al objetivo de este captulo, la serologa debe interpretarse siempre en trminos de probabilidad y en el contexto de la epidemiologa y la clnica.

Mtodos serolgicos Los mtodos actualmente validados son: ELISA Hemaglutinacin indirecta (HAI) Inmunofluorescencia (IF)

No existen actualmente otras pruebas validadas para diagnstico de infeccin chagsica. Un mtodo que fue de gran utilidad durante muchos aos, como la Fijacin de Complemento (Guerreiro-Machado) ha dejado de utilizarse por razones operativas, entre ellas la dificultad para conseguir los reactivos y su estandarizacin. Otras tcnica como la

aglutinacin de partculas de ltex sensibilizadas con antgeno de T. cruzi es desaconsejada por su baja confiabilidad (sensibilidad, especificidad y reproductividad). Por ltimo, reacciones como la Inmunocromatografa, que pueden ser muy tiles por la posibilidad de utilizarlas como mtodos de screening rpidos en terreno, no estn an disponibles en el mercado en nuestro pas (ver ms adelante).

Los parmetros para determinar la confiabilidad de un mtodo son: Sensibilidad (S), Especificidad (E) y Valor predictivo (VP).

S: capacidad de un mtodo de dar resultado positivo en presencia de infeccin E: capacidad de un mtodo de dar resultado negativo en ausencia de infeccin VP: probabilidad que un individuo con resultado positivo est realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado negativo sea realmente no infectado (VP-) Las dos primeras son intrnsecas del mtodo, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infeccin. As, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es ms alto que en una zona no endmica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor). (Stites, D; Abbas T., 2007)

Como ningn mtodo tiene 100% de E, las pautas para diagnstico de la infeccin chagsica (Manual para la atencin del paciente infectado con Tripanosoma cruzi.

Ministerio de Salud de la Nacin. 2005) determinan que, para que un individuo sea considerado chagsico, deben dar positivos al menos dos mtodos serolgicos diferentes (ELISA + HAI, ELISA + IF o HAI + IF) Otro mito es que la IF es el mtodo de referencia. Sin dudas se trata de una buena metodologa, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no est al alcance de pequeos laboratorios y no es una tcnica adecuada para procesar elevado nmero de muestras. Actualmente, la reaccin ms sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotmetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad. Permite procesar elevado nmero de muestras y, adems, es la que mejores resultados permite obtener en muestras de sangre entera (sangre con glicerina, papel de filtro) o con otros fluidos biolgicos como el trasudado mucoso oral (Basso y col, 1987; Moretti y col, 2004) La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulacin del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y tambin es adecuada para procesamiento de elevado nmero de muestras.

EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL

Teniendo en cuenta lo expresado ms arriba, la realizacin de dos o ms pruebas serolgicas no garantiza que el resultado obtenido sea unvoco. Por ello, pueden presentarse situaciones que es necesario conocer y resolver:

Primer dilema Resultados discordantes

Se llama discordancia serolgica cuando en un mismo paciente dos pruebas dan distinto resultado 3

Es una situacin frecuente en pacientes tratados y en embarazadas Resultado posible en un agudo

Ejemplos de resultados y su interpretacin

ELISA HAI Interpretacin

+ +
Positivo

Negativo

+ Discordante

+
Discordante

Qu hacer ante un resultado discordante ? El Bioqumico Repetir el estudio con la misma muestra Realizar una tercera reaccin Solicitar nueva muestra, en lo posible no inmediata

El Mdico NO CONSIDERAR COMO INFECTADO SI AL MENOS DOS METODOS NO DAN RESULTADO + Entender y explicarle al paciente que los mtodos de laboratorio, tienen alcances y limitaciones y que deben valorarse en el contexto clnico y epidemiolgico

Otra situacin que suele presentarse en mtodos con lectura espectrofotomtrica, como es el caso de ELISA, es que los valores de Densidad Optica (DO) se siten muy cerca del valor de corte ( 10% ), en cuyo caso el resultado no debe considerarse positivo ni negativo, sino indeterminado

Segundo dilema Resultados indeterminados:

Cuando en una reaccin con lectura espectrofotomtrica se obtiene una densidad ptica dentro de la denominada zona gris ( 10% del nivel de corte del kit utilizado) Ejemplo: Nivel de Corte: DO 200 Zona gris : 180 - 220

Qu hacer con un resultado indeterminado? Seguir el mismo criterio que para las Discordantes No debe considerarse Positivo o Negativo

Objetivos de las pruebas inmunoserolgicas

Para la interpretacin de los resultados es fundamental conocer el objetivo de las pruebas, que pueden ser varios (diagnstico, control de tratamiento, seleccin de dadores de sangre, etc). Simplificando, desde un punto de vista epidemiolgico y clnico la serologa se puede utilizar para: Screening Confirmacin diagnstica

Para el primer caso se necesita una elevada sensibilidad, mientras que la confirmacin requiere alta especificidad. En nuestra experiencia en estudios

epidemiolgicos la reaccin de ELISA es la ms adecuada si se realiza una sola tcnica, (no recomendado en las pautas que recomiendan siempre dos tcnicas) ya que presenta una sensibilidad muy elevada. Para la confirmacin, como se ha dicho ms arriba, es imprescindible la positividad de al menos dos mtodos.

Metodologa diagnstica a emplear segn el perodo de la infeccin (Fig 1)

Pruebas segn el momento de la infeccin
Sensibilidad en los diferentes perodos
100 Parasitologa S% 50 Serologa

Latencia

Agudo

Crnico

Fig. 1: Sensibilidad de los mtodos parasitolgicos en el perodo de latencia, agudo y crnico

Como se puede deducir de la figura, durante el perodo de latencia o ventana, que dura desde el momento de la infeccin aproximadamente 10-15 das, no existe ninguna prueba que deba realizarse, ya que seguramente se obtendrn resultados falsos negativos. En el perodo agudo, hasta aproximadamente los 30 das, parasitolgicas, que tienen una muy elevada sensibilidad, son de eleccin las pruebas mientras que en el perodo

indeterminado o crnico los parsitos circulantes son escasos y difcilmente detectables, por lo cual deben utilizarse las pruebas serolgicas.

Diagnstico de la infeccin congnita o del primer ao de vida.

Existen situaciones que requieren un tratamiento especial, como la infeccin congnita. Nuestro grupo de trabajo desarroll un algoritmo diagnstico que permite la identificacin de los hijos de madres chagsicas que se infectaron durante el embarazo (Moretti y col, 2007; Moya y col, 1985; 1989; 1997; 2005) Es muy importante tener en cuenta que la incidencia de transmisin congnita es de 2 a 8% segn la mayora de los autores. En nuestro grupo alcanza al 2,4 %. Ello tiene un doble significado. Por un lado, es imprescindible el tratamiento de los nios que nacen infectados, pues ello permite una curacin definitiva. Por el otro, se debe evitar el tratamiento innecesario en los hijos de madres chagsicas no infectados, pues las drogas utilizadas no estn exentas de efectos secundarios ( Moya y col, 1985; 1997 ) 6

Segn el Consenso de Cochabamba ( Carlier y col, 2003), se define infeccin congnita cuando a) el nio nace de una madre serolgicamente positiva (y ocasionalmente parasitolgicamente positiva )( Moretti y col, 2005). b) Se encuentran parsitos en sangre de cordn o sangre del neonato al nacer o durante los primeros meses, siempre que no haya recibido transfusiones o viva en zona con transmisin vectorial activa c) Se detecten anticuerpos contra el Tripanosoma cruzi cuando hayan desaparecido los anticuerpos maternos de circulacin, lo cual actualmente se acepta que ocurre entre los 9 y 12 meses de vida.

La deteccin del parsito asegura el diagnstico, mientras que la deteccin de anticuerpos sufre la interferencia de los anticuerpos maternos. Como la deteccin de IgM no ha demostrado ser eficaz para el diagnstico de infeccin chagsica, es necesario recurrir a las curvas serolgicas, que miden los niveles de IgG srica del hijo de madre chagsica. Es importante destacar que el recin nacido hijo de madre chagsica siempre es serolgicamente positivo. La nica excepcin es que la madre tenga niveles de anticuerpos muy bajas, en el lmite de sensibilidad de las tcnicas empleadas y, debido a las oscilaciones propias del mtodo, la pruebas en el nio caigan debajo de ese lmite. Esto es claramente una excepcin, al contrario de lo expresado por algunos autores Existen bsicamente dos tipos de curvas serolgicas, como se muestra en la Fig. 2, segn el nio nazca infectado, en cuyo caso mantendr o incrementar sus niveles de anticuerpos durante el primer ao de vida, o que por el contrario su positividad se deba a la presencia de anticuerpos maternos. En este ltimo caso, los ttulos de anticuerpos caern hasta negativizarse, siguiendo el catabolismo de la IgG materna. La negativizacin puede ocurrir entre los 6 y 12 meses de vida.

Evolucin serolgica en hijos de madres chagsicas durante el primer ao de vida

300 250 200

35%

Ttulo

150 100 50 0 0 3 6 9 12

95 97 %

Meses

Fig.2: Curvas serolgicas tpicas de neonatos infectados (---------) o simplemente com pasaje transplacentario de anticuerpos maternos (---------)

A los fines acadmicos y epidemiolgicos, se puede distinguir si la infeccin de un nio durante el primer ao de vida se debe a transmisin materna o por otra va (vectorial, transfusional), de acuerdo al siguiente esquema

Diagnstico de la infeccin chagsica por el laboratorio durante el primer ao de vida en hijos de madres chagsicas

Grupo

Parasitologa RN * + 1er ao --------RN + +

Serologa 3-6 m + + 9-12 m + +

Interpretacin Diagnstica

Infeccin congnita

Infeccin de origen no confirmado* (Vectorial?, transfusional?, digestiva?)

+ +

+ +/

Infeccin de origen no confirmado*

Ausencia de infeccin

* El diagnstico parasitolgico puede realizarse en el momento del nacimiento, o durante el primer ao de vida. Para confirmar infeccin congnita debe detectarse el parsito y descartar cualquier otra posible va de infeccin

De todos modos, desde un punto de vista teraputico,

cualquiera sea la va de

infeccin el tratamiento es efectivo mientras ms temprano se realice, en nuestra experiencia antes de los tres aos de vida, por lo cual es importante realizar el diagnstico lo ms precozmente posible

Actualmente, existe una Ley Nacional ( No.26281) que obliga a la investigacin de infeccin chagsica en toda mujer embarazada. (ARTICULO 4 - Es obligatoria la realizacion y la
notificacion de las pruebas diagnosticas establecidas segun Normas Tecnicas del Ministerio de Salud, en toda mujer embarazada, en los recien nacidos, hijos de madres infectadas, hasta el primer ao de vida y en el resto de los hijos, menores de CATORCE (14) aos de las mismas madres)

Para la implementacin de esta ley se deben seguir los siguientes pasos:

1- Deteccin de la gestante chagsica: se debe realizar el control serolgico a todas las embarazadas con por lo menos dos reacciones serolgicas normatizadas, HAI, ELISA y/o IF (de acuerdo a la disponibilidad de cada centro). 2- Se deben estudiar todos los hijos de madre chagsica de acuerdo al algoritmo

establecido y que se muestra ms abajo a) Serologa: HAI y ELISA o IF (HAI y IF tituladas) b) Parasitologa: Nuestro grupo recomienda el micro Strout en tubos cnicos plsticos tipo Eppendorf (ver Basso B. Diagnstico de Laboratorio. I. Estudios parasitolgicos) 3- Si el examen parasitolgico es positivo, se debe iniciar inmediatamente el tratamiento. De lo contrario, debern controlarse mediante serologa titulada, durante el 1 ao de vida, realizndose un control (opcional y de acuerdo a la necesidad clnica) entre los 4- 6 meses de vida y otro (esencial) al ao. 4- Todos los nios que no hayan sido estudiados para Chagas, al cumplir el primer ao de vida, se les deber realizar serologa convencional en los centros de salud respectivos. Esto ser posible cuando asistan para ser inmunizados con la vacuna triple viral, (algunas jurisdicciones superan el 80% de cobertura en este grupo etreo). Se deber tener en cuenta que debido a la transferencia pasiva de anticuerpos de tipo IgG de la madre al nio, antes de los 9-12 meses de edad, es necesario demostrar la presencia 9

del parsito para realizar el diagnstico de infeccin. Despus de los 12 meses la sola reactividad serolgica confirma la infeccin. Todos los nios con infeccin confirmada sern tratados de acuerdo a las Normas Nacionales de Atencin al Infectado Chagsico.

EL DIAGNOSTICO DE INFECCION CONGENITA SE REALIZA POR METODOS PARASITOLOGICOS A PARTIR DEL NACIMIENTO Y DURANTE LOS PRIMEROS MESES DE VIDA Y POR METODOS SEROLOGICOS A PARTIR DE LOS 9-12 MESES

Algoritmo para el diagnstico y el tratamiento del hijo de madre chagsica durante el primer ao de vida

RN

3 meses ( Opcional)

9 12 meses

Parasitologa Serologa + + +

Tratamiento Seguimiento

+ +

+ +

Tratamiento Tratamiento Fin del estudio Seguimiento

+ +

Tratamiento Tratamiento

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Perspectivas de nuevas metodologas

Fin del estudio

El material antignico que se emplea en los mtodos serolgicos convencionales es, o el parsito completo (IF) fijado o componentes solubles crudos del parsito obtenidos por diferentes procedimientos (ELISA, HAI). Se han utilizado asimismo fracciones antignicas semipurificadas (Cervetta y col, 1988; Moretti y col, 1998), fundamentalmente para tratar de encontrar marcadores de eficacia teraputica o indicadores pronsticos. Ms recientemente se estn utilizando antgenos recombinantes o pptidos sintticos (Silveira y col, 2001; Girones y col, 2001). De hecho, ya se encuentran disponibles en el mercado kits diagnsticos preparados con antgenos recombinantes. La idea original de utilizar un antgeno o un pptido para optimizar la especificidad no proporcion los resultados esperados, por lo cual actualmente se utilizan mezclas de recombinantes, que incrementan la sensibilidad sin resentir la especificidad. Se ha preconizado la estrategia de emplear mtodos con antgenos totales en las reacciones de screenning y metodologa recombinante para la confirmacin, aunque esta estrategia todava no est protocolizada. Respecto a nuevos mtodos, se ha estandarizado la inmunocromatografa (Luquetti y col, 2003), mtodo simple que puede realizarse con sangre entera y requiere pocos minutos y entrenamiento mnimo del personal. Su ventaja esencial es que permite ser realizada en terreno, detectar los positivos y all mismo tomarles muestra de suero, que siempre es el material biolgico para confirmacin diagnstica, evitando nuevos viajes y la toma de segundas muestras

Materiales biolgicos Por definicin, el material biolgico de eleccin es el suero. Sin embargo, en el trabajo de campo requiere un instrumental no siempre disponible, por lo cual los mtodos que utilizan sangre capilar son de eleccin. En este sentido, en Brasil se utiliza sangre recolectada en papel de filtro y en Argentina el Ministerio de Salud distribuye equipos que contienen frascos con glicerina como conservante (Serokits). En nuestra experiencia, el screening utilizando ambos materiales brinda resultados similares (Basso y col, 1987). En nuestro laboratorio, se ha estudiado la performance del Trasudado mucoso oral como material biolgico (Moretti y col, 2004). Este material se obtiene con un dispositivo sencillo, que consta de una almohadilla embebida en una solucin hipertnica que se coloca 2 minutos entre la enca y la mejilla. El material que se obtiene es un trasudado, cuya concentracin de inmunoglobulinas permite realizar serologa, principalmente empleando la tcnica de ELISA, con sensibilidad similar a la obtenida con suero o sangre conservada en papel de filtro o glicerina. La gran ventaja es que se trata de un mtodo no invasivo, de gran aceptacin entre los nios y que mejora las condiciones de bioseguridad en terreno, al no manipular sangre ni elementos punzantes. Este dispositivo no est an disponible en el mercado en nuestro pas, por lo cual no se puede utilizar a gran escala.

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Para screenings puede emplearse sangre entera recolectada en papel de filtro o glicerina, as como Trasudado mucoso oral LA CONFIRMACIN DIAGNOSTICA DEBE REALIZARSE UNICAMENTE EN SUERO Y CON DOS MTODOS SEROLGICOS

En conclusin, es importante destacar que las pruebas serolgicas para infeccin chagsica pueden realizarse en laboratorios de baja o mediana complejidad y que el diagnstico precoz es esencial para la prevencin de la patologa. Se debe remarcar que slo es necesario conocer el momento indicado para realizar el estudio, las pruebas a realizar, que deben estar sometidas a estrictos controles de calidad, y su interpretacin, que debe ser interdisciplinaria y tener en cuenta el contexto clnico-epidemiolgico

El diagnstico de la infeccin chagsica est protocolizado, no requiere equipamiento sofisticado y su correcta realizacin e interpretacin es de invalorable utilidad clnica y epidemiolgica. Un diagnstico correcto y oportuno ayuda a mejorar la calidad de vida del elevado nmero de personas infectadas o en riesgo de infeccin en los pases del rea endmica y tambin en aquellas regiones tradicionalmente no endmicas y en las cuales la infeccin chagsica est comenzando a hacerse presente por la transmisin interhumana

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