Laboratrio de Inspeo de Produtos de origem animal Faculdade de Veterinria- UFPel

Produo de enzimas por MOs utilizando resduos industriais como substrato

Brunele Weber Chaves Acadmica de Farmcia e Med.Veterinria UFSM

Resduos Industriais
Resduos indstria alimentos- fonte matria orgnica- muito poluente Minimizar, recuperar e aproveitar Polticas ambientais- substituir processos qumicos convencionais por enzimticos Lactase- catalisa degradao compostos fenlicos e aminas de efluentes da indstria txtil Resduos descartados- produtos alto valor agregado

Resduos industriais
Reaproveitar resduos slidos processos industriais MOs- agentes redutores de matria orgnicaeliminao/reduo compostos txicos Resduos indstrias de alimentos- fonte de matria orgnica, protenas, enzimas e leos essenciais MOs desenvolvem- consumo matria orgnica- diminui capacidade poluidora Bioconverso substrato residual em biomassa microbiana- extrao substncia produzidas no crescimento dos mos Aproveitamento protenas, lipdeos, enzimas, cidos nuclicos, cidos orgnicos

Enzimas
Catalisadores biolgicos Unidades funcionais metabolismo celular Natureza protica Aceleram transformao de molculas 1 mol enzima- catalisa 104 a 106 moles substrato/min Diminuem energia ativao Concentraes baixas pH e tC ideais Especificidade substrato/enzima- chave-fechadura

Enzimas
Brasil- consumo produtos importados Aumenta comercializao- diminui produo 90% produo- grandes empresas- Pfizer, Genencor Interesse tecnologias enzimticas- meios no convencionais Mercado mundial tecnologia enzimtica- cresce- interesse processos: Baixo custo Menor impacto ambiental Matrias-primas renovveis Reaproveitar subprodutos agroindstria

Enzimas- obteno
Fermentao resduos industriais Soro do leite * Lactase * Invertase * Carboximetilcelulase
-

Casca de coco verde * Protease * Pectinase * Xilanase * Celulase

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Soro queijo * Lactase

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Lactase
B- galactosidase Vegetais (ma, pssego) e rgos (crebro, placenta) Fungos filamentosos, bactrias (EC e Bacillus sp.) e leveduras Quebra a lactose em galactose e glicose 75% populao deficiente/no produz- alteraes intestinais Hidrlise lactose- acar mais doce, solvel e digervelintolerantes Mtodo enzimtico- menor temperatura e formao produtos indesejveis Diferentes procedncias- pH e temperaturas timos - fungos: pH 2,5-4,5 e 30C-40C

Protease
Quebram ligaes peptdicas entre aminocidos das protenas Clivagem proteoltica- ativao e inativao enzimtica

Xilanase
Degradao da xilana

Celulase
Degrada parede celular microorganismos e vegetais superiores

Pectinase
Catalisam hidrlise da celulose Produzidas fungos, bactrias e protozorios

Invertase
B-frutofuranosidase- sacarase Catalisa hidrlise sacarose- glicose+frutose Formao de xarope de acar invertido Obteno alto custo da frutose- enzima cara Prefervel utilizar glicose isomerase

Carboximetilcelulase
CMCase Degrada carboximetilcelulose- polmero solvel em gua q forma gis

Fermentao
MOs catalisam converso: substncia-produto mais simples Oxidao incompleta da glicose sem oxignio Gliclise e reduo do cido pirvico Produo de energia (2 ATPs) Formao de cidos, lcool e gs Base processos industriais Converso matrias primas (gros, acares, subprodutos)- produtos sintticos diferentes Cepas selecionadas mofos, leveduras, bactrias

Aspergillus niger

Aspergillus niger
Aerbios- ambientes ricos oxignio Necessitam de matria orgnica (fonte de C) Contaminam restos alimentos Saprfitos cosmopolitas Produo enzimas e biomolculas Fungo de fcil obteno Bom poder aminoltico em reaes fermentativas Tratamento de resduos

Soro Leite
Subproduto indstria laticnios Metade extrato seco leite (lactose, protenas solveis e sais) 80% volume leite p/ queijos= soro muito volume gerado carga poluidora- problemas ambiente (rios) Pequena quantidade para alimentao animal Atender legislaes ambientais: Aproveitamento soro- recuperao de nutrientes!!!! Aproveitado para sntese de enzimas

Casca coco verde

Alto consumo gua- muito rejeito (casca) Aproveita APENAS rejeito coco maduro Coco verde- casca- aproveitar resduo industrial e diminuir lixo urbano- lucro!! Muita celulose, hemicelulose, pectina- indutores produzir celulases, xilanases e pectinases (enzimas extracelulares) NO necessita muito suplemento

Soro queijo
Produto dessora cogulo de leite Mais importante subprodutos do queijo 94% gua Extrato seco= 80% lactose Descarte rios- alta DBO- mto poluente Descarte solo- compromete estrutura Alternativas- matri-prima produzir lactase, vitamina K, fosfatos do leite Produo soro em p, ricota, alimentao animal (sunos)

Experimentos- Soro do leite

Cepas Aspergillus niger cultivadas em gar batata dextrose Fermentaes- produo enzimtica- 48hs e crescimento celular- 96hs Medida pH meio aps fermentao Atividade enzimtica- concentrao no meio- formao acar redutor da hidrlise de CMC, lactose, sacarose Espectrofotometricamente- mtodo DNS unidade de atividade= gerao 1 micromol produto/min

Concentrao celular- MS (centrifugao + secagem em estufa do meio) Yx/s = (X-Xo)/(So-S) X e Xo= Concentraes celulares S e So= Concentraes de substrato Yx/s= fator estequiomtrico de converso de substrato em produto

Resultados
Tabela 1: Valores das atividades enzimticas. Cepa A B C D E F CMCase 192.328999 311.589466 189.309746 181.761616 225.540774 408.205540 LAC 251.204419 477.648344 195.348251 294.983578 432.359559 557.658530 INV Yx/S (g/L) 233.088905 0.133637 462.552082 0.133637 193.838625 0.133637 204.406008 0.133637 319.137597 0.133637 512.369746 0.133637

## As diferentes cepas do fungo cresceram de forma satisfatria no meio do soro produzindo as enzimas em quantidades considerveis!!!!

Resultados
Tabela 2: Valores das medidas de pH. Cepa A B C D E F pH 4,74 5,11 3,35 3,90 3,22 5,11

## Valores de pH do meio aps a fermentao= evidente diferena entre os metabolismos das diferentes cepas do fungo!!!

Resultados
Figura 1: Concentrao celular aps 96hs de fermentao

## Cepas de Aspergillus niger crescem forma satisfatria no soro do leite sem adio de suplementos de nutrientes no meio!!!

Experimentos- Concluses
Foi comprovada experimentalmente a produo de enzimas e o crescimento de Aspergillus niger em soro de leite!! Processos promissores e de interesse ambiental Necessrios ensaios para avaliar cintica de crescimento celular

Experimentos- soro do queijo

Aspergillus niger e Aspergillus oryzae Nutrientes- extrato de levedura, peptona bacteriolgica, fosfato monobsico de potssio, sulfato de amnio e casena Influncia suplementao Diferentes concentraes de lactose e nutrientes- diferente crescimento celular Testes massa celular, acar redutor, atividade enzimtica (sntese lactase) Lactase- produo intracelular- rompimento por autlise (esmagamento e solventes) - isolamento- extrato livre de clulas-

Experimentos- soro do queijo

Mtodo cido Dinitrossaliclico- avalia quantidade acares redutores- espectrofotmetro (curva) Teste enzimtico colorimtrico- determina glicose- atividade enzimtica - Unidade atividade= unidade glicose produzida/min Crescimento celular- Sobrenadante- evapora- peso final e inicial Meio para fermentao- soro do queijo e nutrientes Tratar soro- retira frao protica- acidificao e aquecimentoprecipita protenas e filtra Ajuste pH com cido ltico Amostras cada 24hs- concentrao celular, acares totais, atividade enzimtica

Aspergillus oryzae apresentou concentrao mxima em menor tempo que Aspergillus niger!!!!

Concentrao de acares no meio decresce mais rapidamente para o Aspergillus oryzae!!!

Considervel maior crescimento celular com adio de nutrientes!!

Experimentos- Concluses
Importante retirar protenas soro- no interferir precipitao clulas Presena nutrientes meio- influncia crescimento celular Meio- soro com lactose como fonte de CADEQUADO crescimento fungos Aspergillus oryzae consumo lactose menor tempo Necessria adio extrato de levedura- bom crescimento Sulfato de amnio no adicionar- menor crescimento

Experimentos- casca coco verde

Fermentao semi-slida casca Casca desidratada e moda 3 granulometrias (1, 2 e 3) Aspergillus niger isolado do solo Soluo nutrientes- sulfato amnio, fosfato de potssio (fonte N, S e P) Objetivo: melhor granulometria crescer fungo e produzir enzimas Verificar influncia microbiota natural casca- substrato no autoclavado e no inoculado

Resultados
-

Diferentes granulometrias- diferentes enzimas com picos de produo distintos Diferentes aplicaes- escolher granulometria mais adequada Diminui produo enzimas- ao proteoltica/ instabilidade molculas Atividade enzima- unidade/mL extrato enzimtico Influncia microbiota natural- cresce meios no estreis- MO matria prima ou do ambientemorfologia diferente meios inoculados

Experimentos- Concluses
Validada hiptese aproveitar casca coco para produo enzimas TODAS enzimas produo mxima 24-96hs- tempo produo industrial corrente 7 dias- produo enzimas meio no esterilizadomicroorganismos nativos Necessrio esterilizar meio- influncia MOs naturais indesejada MO nativo- uso diminui custos, prejudica controle processo e qualidade produto final e no garante mesma linhagem fngica cada batelada

Referncias Bibliogrficas
COELHO, Maria Alice Zarur et. Al. Aproveitamento de resduos agroindustriais: produo de enzimas a partir da casca de coco verde. B.CEEPPA, Curitiba, v.19, n.1, p 33-42, 2001. BARBOSA, Mariana Ricken et. Al. Estudo da produo da enzima Lactase utilizando soro de queijo e fungo filamentoso Aspergillus niger. CARDOSO, Izabela Cortes et. Al. Fermentao do soro do leite por Aspergillus niger para produo enzimtica. 5 Semana Acadmica. Universidade Federal de Uberlndia.