El calibrado y el anlisis cuantitativo instrumental

http://jmj-qa.blogspot.mx/2009/08/el-calibrado-y-el-analisisquantitativo.html Cuando un qumico analtico se enfrenta a una muestra, ste tiene, desde un punto de vista muy general, dos tareas fundamentales: conocer que sustancias forman parte de la materia (anlisis cualitativo) y conocer en qu cantidad aparecen dichas sustancias (anlisis cuantitativo). Centrndonos en esta ltima, los mtodos analticos empleados pueden ser clsicos, donde se obtiene la cantidad de analito que reacciona estequiomtricamente con un reactivo que se aade en cantidad perfectamente conocida a una porcin de muestra, o instrumentales donde se mide una propiedad (utilizando un instrumento) que est directamente relacionada con la presencia de analito y cuya intensidad depende de la cantidad del mismo. Es aqu donde debemos introducir el concepto de calibrado. El calibrado en un mtodo instrumental es el proceso mediante el que se obtiene una relacin matemtica (funcin analtica) entre la seal del analito y su concentracin mediante la comparacin con uno o ms patrones. Generalmente se trabaja en disolucin, con lo que se entiende por patrn a una disolucin de analito de concentracin perfectamente conocida. Utilizando esta funcin analtica se puede calcular la concentracin de analito en la muestra a partir de la seal medida. La expresin de esta funcin analtica se corresponde con la ecuacin de una curva (curva de calibrado). Siempre que sea posible se busca que la relacin entre la seal analtica y la concentracin del analito en los patrones sea lineal, obteniendo la lnea de mejor ajuste a los datos experimentales obtenidos para los patrones mediante el mtodo de mnimos cuadrados. La IUPAC ofrece guas sobre este tema, para uno (1) o mltiples (2) componentes, siendo recomendable su lectura para profundizar en el tema. Aqu simplemente nombraremos los tipos de calibrado que se suelen emplear en el anlisis qumico dando unas breves indicaciones de cmo y cuando se utilizan. -Calibrado externo Se lleva a cabo la comparacin de seal de analito en la muestra con las obtenidas al medir una serie de patrones preparados. Los patrones suelen ser acuosos (es decir, se disuelve el analito en agua) pero tambin puede ser recomendable usar una matriz parecida a la de la muestra. Por ejemplo, para la determinacin de metales en muestras slidas, previamente digeridas con cidos, se suele usar una disolucin acuosa con la misma proporcin de cidos que la muestra tratada. En este tipo de calibrado se representa la seal de los patrones frente a su concentracin y se obtiene la ecuacin de la recta de mejor ajuste. Una vez hecho esto, para calcular la concentracin de analito en una muestra se sustituye la seal medida para dicha muestra en la ecuacin de la recta y se despeja la correspondiente concentracin. Hay que asegurarse de que el valor de seal de la muestra se encuentre entre el mnimo y el mximo

de las seales de los patrones (se debe interpolar, no extrapolar) y, si no es as, tratar de diluir la muestra o los patrones, segn sea necesario, para que se cumpla este requisito.

Se debe comprobar la presencia de efecto matriz (errores proporcionales, que varan con el nivel de concentracin). En caso de existir, hace necesario el uso del mtodo de adicin patrn.

- Calibrado por adicin patrn Se realiza aadiendo cantidades conocidas y crecientes de analito a distintas porciones de muestra para construir la curva de calibrado (se debe incluir la muestra sin adicin). Se representa la seal obtenida para cada porcin frente a la concentracin o cantidad aadida a dicha porcin. La concentracin de la muestra se obtiene como el punto de corte de la prolongacin de la recta en el eje de abscisas. Matemticamente se iguala la seal a cero y se despeja la concentracin (cambiando de signo).

Se aplica cuando se observa efecto matriz. Pero, cmo se detecta dicho efecto matriz? Se puede comprobar de forma sencilla representando los datos del calibrado externo y los de adicin patrn en el mismo grfico. Si las rectas

son paralelas, es decir, tienen la misma pendiente, no existir efecto matriz. En caso contrario si habr efecto matriz.

-Calibrado con patrn interno En algunas ocasiones, debido a la forma de introducir una muestra en el sistema de medida o a un tratamiento previo de la misma, sta puede sufrir prdidas de analito. El problema surge cuando al repetir el mismo proceso una y otra vez las prdidas de analito son diferentes, con lo que estaremos ante un problema en la repetitividad del mtodo. Por poner un ejemplo, imaginemos que en el tratamiento de muestra acuosa se realiza una extraccin con un volumen X de disolvente orgnico. Ese volumen X se lleva a un volumen final Y y se mide la propiedad proporcional a la cantidad de analito. Quien ha realizado una extraccin lquido-lquido sabe que es prcticamente imposible recuperar todo el volumen X en cada extraccin. Si en vez de recuperar X recupero X-1 y lo llevamos al mismo volumen final Y, la concentracin de analito depender del volumen que he recuperado. Este es un caso en el que es aconsejable el uso de un patrn interno. La filosofa de un calibrado con patrn interno es introducir en todas y cada una de las muestras, as como en los patrones, una sustancia en concentracin constante (la misma en todas las muestras y patrones) y perfectamente conocida, un patrn interno, que sufra prdidas de manera anloga al analito. Entre las caractersticas bsicas de un patrn interno debe estar que sea lo ms parecido posible al analito, qumica y fsicamente, y por supuesto, que no sea una especie que ya est contenida en la muestra originalmente. Ni que decir tiene que debe ser de elevada pureza y estabilidad. El calibrado se realiza representando el cociente entre la seal obtenida para el analito y la obtenida para el patrn interno frente al cociente de sus concentraciones. Se calculan los parmetros de la recta de calibrado y se sustituye el cociente de seales obtenido para la muestra, obteniendo as el cociente de concentraciones en la muestra. Como conocemos la cantidad de patrn interno aadida, es sencillo calcular la concentracin de analito.

Lecturas recomendadas 1) K. Danzer, L. A. Currie. Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part 1. Fundamentals and single component calibration. Pure Appl. Chem. 70 (1998) 993-1014) K. Danzer, M. Otto, L. A. Currie. Guidelines for calibration in analytical chemistry. Part 2: Multicomponent calibration (IUPAC Technical Report). Pure Appl.

El efecto matriz
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El efecto matriz en Qumica Analtica se define, de acuerdo con la IUPAC, como el efecto de todos los componentes de la muestra distintos al analito en la medida de una cantidad (de analito). A la hora de aplicar un mtodo analtico, el efecto matriz se traduce en una diferencia de sensibilidad del mismo cuando se prepara un calibrado en un disolvente frente a uno preparado en el mismo entorno de la muestra. La sensibilidad debe entenderse como la variacin de la seal analtica frente a la concentracin de la especie a determinar, id est la pendiente de la curva de calibrado. Por lo tanto, la diferencia entre las pendientes de calibrado en un disolvente determinado (calibrado externo) y en la matriz de la muestra (ya sea simulada o mediante el mtodo de adicin patrn), indica la presencia de efecto matriz, como se apuntaba en un post anterior. Cabe destacar que el efecto matriz es un efecto indeterminado de las especies que rodean a la muestra que afectan a la sensibilidad, cuando el efecto de una especie es determinado (y aditivo) se habla de interferencia. En este post vamos a repasar el procedimiento para detectar la presencia de efecto matriz a partir de la comparacin entre calibrado externo y calibrado de adicin patrn. Por lo tanto el primer paso es preparar una serie de patrones en el disolvente mayoritario de la muestra (agua o el que sea) y un calibrado en la propia muestra aadiendo cantidades conocidas de analito. Como sabemos, procuramos trabajar en un rango de concentraciones en el que la relacin seal-concentracin sea lineal. Se obtienen las ecuaciones de ambas rectas de calibrado y comparamos las pendientes de las mismas. Si existe efecto matriz, habr una diferencia significativa entre las pendientes, lo que implica que deberemos trabajar en una matriz simulada o mediante adicin patrn.

Centrmonos ahora en llevar a cabo esta comparacin de forma estadsticamente correcta. Para ello es preciso conocer el valor de la pendiente de calibrado externo (bCE) y de adicin patrn (bAP) adems de sus respectivas varianzas (el cuadrado de sus desviaciones estndar). A partir de ah se calcula la relacin entre las pendientes, R (Ecuacin 1) y la varianza

combinada correspondiente a esa relacin (Ecuacin 2). Con eso se calcula un valor de t de Student (Ecuacin 3).

Lgicamente, se trata de comparar la relacin entre ambas pendientes con la unidad. Si dicha relacin no difiere de 1, no habr efecto matriz significativo. Este valor de t calculado se debe comparar con un valor tabulado para los grados de libertad de la varianza combinada. Para conocer estos se debera obtener el nmero de grados de libertad efectivos de esta combinacin. Ser preciso emplear la frmula de Welch-Satterthwaite donde para una varianza combinada (Ecuacin 4) se obtienen los grados de libertad efectivos aplicando la Ecuacin 5.

En nuestro caso se obtiene la Ecuacin 6:

Donde n se refiere al nmero de puntos del calibrado externo (CE) o de adicin patrn (AP). Este clculo es un tanto engorroso, pero una vez realizada una hoja de clculo de Excel y convenientemente validada, es muy sencillo hacer este tipo de comparaciones. No obstante, muchos autores recomiendan la comparacin del t calculado con un factor de cobertura k=2 para un 95% de nivel de confianza. Vase Gonzlez y Herrador (2007). Para que entendamos esta eleccin, el valor tabulado del estadstico de Student para un nmero infinito de grados de libertad es de 1.96 para p=0.05 (95% de nivel de confianza). De ah que se tome un valor de k=2. Esta aproximacin puede resultar incluso ms restrictiva que el uso del t tabulado para los grados de libertad efectivos