http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioPruebasBioquimicas.htm http://es.scribd.

com/doc/5203044/Medios-de-Cultivo-y-Pruebas-Bioquimicas
http://www.danival.org/100%20biolomar/3600micromar/_madre_micromar.html

0802_Pruebas bioqumicas
Apartados de este ejercicio A. Introduccin B. Test de la catalasa C. Test de utilizacin de citrato D. Test de la coagulasa E. Test de la urea F. Test de fermentacin de carbohidratos G. Test de produccin de indol H. Test de la oxidasa

A. Introduccin
Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados( las llamadas pruebas bioqumicas convencionales), generalmente determinan la actividad de una va metablica de la bacteria (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Obviamente, en la identificacin bacteriana hay que partir de un cultivo puro obtenido en el aislamiento, subcultivando de una colonia bien aislada. Es aconsejable realizar un comprobacin efectuando una siembra en placa en la que crezcan nicamente colonias del mismo tipo.

B. Test de la catalasa
Se utiliza este test para identificar microorganismos que producen la enzima catalasa. El perxido de hidrgeno es una molcula altamente reactiva que provoca daos en los componentes celulares, puede producirse en los microorganismos por diferentes vas. Los organismos que producen la enzima catalasa son capaces de romper el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno gas.

Reaccin:

2H2O2

Catalasa

2H2O + O2 (gas)

El test de la catalasa se lleva a cabo de la siguiente forma: Se siembra en una placa el microorganismo que queremos analizar. Se aade una gota de agua oxigenada (perxido de hidrgeno) al 3% y se observa el resultado de la reaccin.

TEST DE LA CATALASA: RESULTADOS

la imagen para observar el resultado) La reaccin es catalasa positiva cuando se producen burbujas de oxgeno de forma inmediata al aadir el agua oxigenada. La ausencia de burbujas tras aadir el agua oxigenada se considera como resultado negativo.

(haga doble clic sobre

PRESENCIA DE CATALASA AUSENCIA DE

CATALASA C. Test de utilizacin de citrato

Se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para usar citrato como nica fuente de carbono. Esta reaccin es llevada a cabo por la encima citrasa. El citrato se produce tpicamente en el ciclo de Krebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como nica fuente de carbono si no hay carbohidratos fermentables presentes. cuando el citrato entra en la clula se hidroliza mediante la citrasa en cido oxalactico y cido actico. Este cido oxalactico se hidrolizar a su vez en cido pirvico y CO2 . Este ltimo dar lugar a la formacin de productos alcalinos.

Citrato Reaccin: cido oxalactico

Citrasa

cido oxalactico + cido actico cido pirvico + CO2

El test del citrato se lleva a cabo utilizando el "agar citrato de Simmons": El test del citrato se lleva a cabo de la siguiente forma: Se siembra con asa en un tubo con "agar citrato de Simmons". Se incuban los tubos durante 24 horas y se hace la lectura del test. Este agar contiene citrato sdico como nica fuente de carbono y in amonio como nica fuente de nitrgeno. Adems contiene azul de bromotimol como indicador de pH. El agar citrato de Simmons es inicialmente de color verde, si el microorganismo es capaz de crecer en este medio y utilizar el citrato se producirn productos alcalinos. El azul de bromotimol por encima de pH 7,6 produce un viraje del medio a azul.

TEST DEL CITRATO: RESULTADOS

La reaccin es citrato positiva cuando se producen un cambio de color del medio a azul La ausencia de cambio de color se considera como resultado negativo.

D. Test de la coagulasa
Se utiliza para detectar la capacidad de un microorganismo para coagular el plasma. El test de la coagulasa en tubo utiliza como sustrato plasma tratado con anticoagulantes para evitar la coagulacin espontanea. Los organismos coagulasa positivos activan los mecanismos de coagulacin con la enzima coagulasa y esto produce una coagulacin del plasma. Procedimiento del test de la coagulasa: El test de la coagulasa se lleva a cabo de la siguiente forma: Se aade una suspensin densa de bacterias a un tubo con plasma tratado. Se incuban los tubos a 37C, se observa la coagulacin entre las 4 y las 24 horas.

TEST DE LA COAGULASA: RESULTADOS

La reaccin es positiva cuando se observa coagulacin del plasma.

Si no se produce coagulasa la reaccin es negativa y el plasma se queda lquido.

E. Test de la urea
Se utiliza para diferenciar organismos capaces de hidrolizar la urea. La enzima responsable de esta hidrlisis es la ureasa. Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio, lo que producir un incremento del pH que puede detectarse con un indicador (rojo fenol). 2NH 3+ CO2

Urea

Ureasa

El test de la urea se lleva a cabo de la siguiente forma: Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona y urea al 2%. e incuban los tubos a 37C, se observa el viraje de color del medio a las 24 horas. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol el cual por encima de pH 8,4 vira de amarillo a rosa.

TEST DE LA UREA: RESULTADOS

El color rosa del medio indica hidrlisis de la ureasa. El resultado es positivo

Cuando no se produce la hidrlisis de urea en el medio no se observa cambio de color. El resultado es negativo.

F. Test de fermentacin de carbohidratos

Las bacterias anaerobias o anaerobias facultativas a menudo fermentan carbohidratos a cidos orgnicos y gas (H2 o CO2). Estos productos de la fermentacin pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH (que produce un cambio de color con la presencia de cido) y una campana Durham (donde queda retenido el gas producido). El test de fermentacin de carbohidratos se lleva a cabo de la siguiente forma: Se inocula la bacteria en un medio lquido conteniendo una pequea cantidad de peptona, un indicador de pH (prpura de bromocresol) y una fuente de carbono fermentable (por ejemplo glucosa) al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham. La campana Durham es un pequeo tubito de vidrio que se coloca invertido dentro del tubo, de esta forma si se produce gas puede verse perfectamente porque queda retenido en el interior de la campana Durham. El medio de cultivo es inicialmente de color morado. Se incuban los tubos a 37C, se observa el viraje de color del medio y la produccin de gas a las 24 horas.

TEST DE FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS: RESULTADOS

La reaccin es positiva cuando los tubos se vuelven de color amarillo (lo que indica una disminucin de pH por la produccin de cido) y se observa gas retenido en la campana Durham.

La reaccin es negativa cuando no se produce cambio de color del medio, ni se observa gas en la campana.

G. Test de produccin de indol

Se usa para identificar bacterias capaces de producir indol a partir del triptfano (son bacterias que producen la enzima triptofanasa) El aminocido triptfano puede ser convertido por las bacterias que contienen la enzima triptofanasa, a indol, amonio y cido pirvico. Triptofanasa

Triptfano

indol + NH3 + cido pirvico

La presencia del indol se visualiza con reactivo de Kovacs, que provoca la formacin de un anillo rojo en el tubo: El test del indol se lleva a cabo de la siguiente forma: La bacteria se inocula en un medio lquido que contiene triptfano (caldo de triptona). Este se incuba durante 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin, la presencia de indol se detecta aadiendo el reactivo de Kovacs (pdimetilaminobenzaldehdo). Al aadir unas gotas de reactivo de Kovacs (que es de color amarillo) este queda sobre la superficie del caldo de triptona (al ser menos denso el primero que el segundo) formando una especie de anillo. Si este anillo es de color rojo-morado la reaccin es positiva. Si este anillo es del color amarillo que inicialmente tiene el reactivo de Kovacs, es decir amarillo, quiere decir que la reaccin es negativa.

TEST DEL INDOL: RESULTADOS

La reaccin es positiva cuando aparece en la superficie del medio lquido un anillo rojo-morado tras aadir el reactivo de Kovacs

Si el anillo es de color amarillo la reaccin es negativa.

H. Test de la oxidasa
Se usa para identificar bacterias que tienen la enzima citocromo oxidasa. La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de transporte de electrones puede detectarse utilizando un aceptor de electrones artificial (pfenilendiamina).

El test de la oxidasa se lleva a cabo de la siguiente forma: Se utiliza como reactivo p-fenilendiamina al 1% en agua. Con este reactivo se impregna un papel de filtro , posteriormente, con un asa que no sea de hierro (dara lugar a falsos positivos), se coge una colonia de un cultivo de 24 horas y se extiende sobre el papel de filtro. La lectura se hace inmediatamente.

TEST DE LA OXIDASA: RESULTADOS

La reaccin es positiva cuando aparece un color azul en la zona de depsito de la bacteria.

Si no se produce ningn cambio la reaccin es negativa.

A. Introduccin
El agar hierro de Kligler (KIA: Kligler Iron Agar) y el agar hierro triple azcar (TSI: Triple Sugar Iron) son dos medios slidos diferenciales que se preparan en tubo inclinado y que se utilizan principalmente para la diferenciacin de enterobacterias. En el mismo tubo se determinan simultneamente: a) la fermentacin y utilizacin de los hidratos de carbono, b) la produccin de cido sulfhdrico (sulfuro de hidrgeno), y c) la produccin de gas. KIA contiene 2 carbohidratos: 1,0% de lactosa y 0,1% de glucosa. El TSI es similar al KIA, la nica diferencia es la adiccin de un tercer carbohidrato, la sacarosa al 1,0 %. Ambos medios llevan un indicador del cambio de pH: el rojo fenol. Cuando el pH es neutro, como en el medio sin inocular, el indicador da un color rojo al medio de cultivo. Cuando el pH es cido vira al amarillo y a pH alcalino toma un color rojo mas intenso (rojo cereza). Como tienen una funcin bastante similar, en el resto del ejercicio nos referiremos nicamente al Kligler o KIA.

B. Fermentacin y utilizacin de los hidratos de carbono: glucosa y lactosa

La fermentacin o utilizacin de los hidratos de carbono se produce tanto en condiciones anaerobias (fondo del tubo) como en condiciones aerobias (superficie inclinada). En la utilizacin de estos carbohidratos los microorganismos utilizan varias rutas metablicas (Embden-Meyerhof-Parnas y ciclo de Krebs) que producen varios metabolitos intermedios (cido pirvico, etc.) que son convertidos a productos finales como cido lctico, aldehidos, alcoholes, dixido de carbono e hidrgeno En condiciones anaerobias, como en el fondo del tubo, los productos finales producidos son ms estables como cido lctico u otros cidos orgnicos, aldehidos y alcoholes. -galactosidasa Ciclo de Krebs

Aerobiosis (superficie inclinada)

Lactosa Glucosa o galactosa

Glucosa + Galactosa C02 + H2O + energa cidos orgnicos aldehidos alcoholes CO2 + H2 energa

Anaerobiosis (fondo del tubo)

Glucosa

Embden-MeyerhofParnas

Algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono (glucosa y lactosa). Otros fermentan solo la glucosa (lactosa negativos) y otros no fermentan ni la glucosa ni la lactosa. Fermentacin nicamente de la glucosa Estos microorganismos despus de 18-24 hora de incubacin muestran un Kligler con reaccin alcalina en la superficie inclinada y reaccin cida en el fondo del tubo (alcalino / cido). La superficie inclinada es alcalina, indicando una degradacin aerbica de la glucosa. Despus de 18-24 horas de incubacin, la baja concentracin de glucosa (0.1 %) se agota y el microorganismo inicia la utilizacin de las peptonas (presentes en el medio) para sus necesidades nutritivas. El catabolismo de las peptonas libera amonio que produce un pH alcalino y el rojo fenol toma una coloracin roja ms intensa (rojo cereza) en la superficie inclinada del tubo. Por el contrario, el fondo del tubo tiene un color amarillo (pH cido) a causa de la degradacin anaerbica de la glucosa. La glucosa en el fondo del tubo es tambien degradada en las 18-24 horas de incubacin. Los productos finales cidos producidos en la fermentacin anaerbica producen un pH cido y el indicador vira a amarillo. Este pH cido (color amarillo) se mantiene en el fondo del tubo por la estabilidad de los productos finales y por la baja tensin de oxgeno. Fermentacin de lactosa y glucosa Algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono, produciendo un Kligler con reaccin

cida en la superficie del tubo y reaccin tambin cida en el fondo del tubo (cido / cido). La concentracin de lactosa (1.0 %) es diez veces mayor que la concentracin de la glucosa, por lo que no se agota al cabo de 18-24 horas y se mantiene el pH cido tanto en le fondo del tubo como en la superficie inclinada. Sin fermentacin de glucosa ni lactosa Ciertas bacterias, principalmente bacilos gram negativos no pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, no son capaces de fermentar ni la glucosa ni la lactosa. Dado que estas bacterias no pueden utilizar como nutrientes a estos carbohidratos, aprovechan las peptonas en el medio como nutrientes. Estos microorganismos pueden utilizar las peptonas tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas. Una reaccin alcalina en la superficie inclinada y no cambio en el fondo del tubo indica un microorganismo capaz de metabolizar las peptonas nicamente en condiciones aerbicas, y por ello solamente se se produce un cambio de color (rojo cereza) en la superficie inclinada del tubo. Por el contrario, cuando el microorganismo es capaz de utilizar las peptonas tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas se produce la alcalinidad tanto en la superficie inclinada como en el fondo del tubo. Cuando las peptonas son degradadas se produce un pH alcalino debido a la liberacin de amonio y el color del medio cambia a un rojo ms intenso (rojo cereza). aerobiosis Peptonas anaerobiosis amonio (NH3)

Por lo tanto, la reaccin de Kligler permite identificar cuatro patrones metablicos en las bacterias

1. 2. 3. 4.

alcalino / cido : nicamente utilizacin de la glucosa cido /cido : glucosa y lactosa utilizadas alcalino / alcalino : ni glucosa ni lactosa atacadas; peptonas utilizadas aerbica y anaerbicamente alcalino / no cambio : ni glucosa ni lactosa usadas; peptonas utilizadas nicamente en condiciones aerobias Glucosa y Lactosa cido / cido

Fermentacin Patrn de la reaccin Superficie inclinada / Fondo tubo Color Superficie inclinada / Fondo tubo

Glucosa slo

Ni glucosa ni lactosa Alcalino / No cambio

Alcalino / cido

Alcalino /Alcalino

Rojo / Amarillo

Amarillo / Amarillo

Rojo / Rojo

Rojo / Rojo Glucosa no fermentada Lactosa no fermentada Peptonas utilizadas en : aerobiosis nicamente

Glucosa fermentada En superficie inclinada: Peptonas utilizadas

Glucosa no fermentada Lactosa no Glucosa fermentada fermentada Peptonas Lactosa fermentada utilizadas en : aerobiosis y anaerobiosis

Posibles resultados Sin inocular Fermentacin de glucosa slo Fermentacin de Lactosa y Glucosa Ni lactosa ni glucosa fermentada

No cambio/No cambio

Alcalino/cido

cido/cido Varias especies de:

Alcalino/Alcalino Pseudomonas aeruginosa

Alcalino/No cambio Pseudomonas aeruginosa Varias especies de: Acinetobacter Alcaligenes Ver listado completo

Algunas especies que pueden dar ese resultado. Ver listado completo

Salmonella Shigella Proteus Serratia Yersinia Ver listado completo

Escherichia coli Enterobacter aerogenes Citrobacter spp. Enterobacter cloacae Klebsiella oxytoca Enterobacter Ver listado completo

Varias especies de: Acinetobacter Alcaligenes Ver listado completo

C. Produccin de gas
En los tubos de Kligler no slo se observa la fermentacin de la lactosa y la glucosa, sino tambin la produccin de gas (CO2 y O2) como producto final del metabolismo de los carbohidratos. Las bacterias productoras de gas se denominan aerognicas y se evidencian por la aparicin de burbujas, grietas en el medio, desplazamiento del fondo del tubo, etc Algunas imgenes con evidencia de la produccin de gas Fondo del tubo desplazando el medio hacia arriba Grietas o roturas del medio Burbujas en el medio Una simple burbuja de gas

D. Produccin de sulfhdrico
Otra caracterstica que se determina en el medio de Kligler es la produccin de cido sulfhdrico (sulfuro de hierro). El sulfuro de hierro generado reacciona con el hierro que contiene el medio (en forma de sales de hierro) formado sulfuro de hierro, insoluble y de color negro. El sulfuro de hierro se puede presentar como un precipitado negro en el fondo del tubo, como un ennegrecimiento de todo el fondo del tubo enmascarando la acidez, o como un anillo cerca de la superficie. Algunas imgenes con evidencia de produccin de sulfhdrico Precipitado negro en el fondo del tubo Ennegrecimiento de todo el fondo enmascarando acidez Anillo negro en parte superior del fondo

Alcalino / cido, SH2 +

Alcalino / cido, SH2 +

Alcalino / cido, SH2 +

E. Tcnica de siembra
Toma de muestra de colonia aislada

Con el asa flameada y dejada enfriar, se toma la muestra de una colonia aislada

Siembra por picadura en el fondo del tubo

Sembrar la muestra de la colonia primero en el fondo del tubo, introduciendo el asa, por picadura, en el centro del tubo y hasta el fondo del mismo

Siembra por estra en la superficie inclinada

Realizar adems, una estra recta, al salir sobre la superficie inclinada del medio

Incubacin a 37 C

Incubar los tubos a 37 C durante 18-24 horas

F. Lectura de los resultados

En la lectura de los resultados tenga en cuenta que debe observar las tres caracteristicas: 1. Fermentacin de carbohidratos 2. Produccin de gas 3. Produccin de sulfhdrico y que todas las combinaciones son posibles. Existen varias formas de anotar en el laboratorio los resultados del Kligler, una normal y otras abreviadas Anotacin normal cido / cido Anotaciones abreviadas A/A Utilizacin de lactosa y glucosa Significado

cido / cido, gas cido / cido, H2S Alcalino / cido Alcalino / cido, gas Alcalino / cido, gas, H2S Alcalino / cido, H2S Alcalino / alcalino Alcalino / no cambio No ca

A / A, gas - A / A, G A / A, H2S Alc / A - K / A Alc / A, gas - K / A, G Alc / A, gas, H2S - K / A, G, H2S Alc / A, H2S - K / A, H2S Alc / Alc - K / K Alc / no cambio - K / NC

Utilizacin de lactosa y glucosa, produccin de gas Utilizacin de lactosa y glucosa, produccin de sulfhdrico Utilizacin de glucosa Utilizacin de glucosa, produccin de gas Utilizacin de glucosa, produccin de gas, produccin de sulfhdrico Utilizacin de glucosa, produccin de sulfhdrico Ni lactosa ni glucosa fermentada; utilizacin de peptonas Ni lactosa ni glucosa fermentada; utilizacin de peptonas en aerobiosis

0804_Batera de pruebas API20E

La batera de pruebas API20E es un sistema de identificacin rpida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram (-). Bsicamente consta de 21 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta. Los microtubos se inoculan con una suspensin de microorganismos, en agua o solucin salina, que rehidrata los medios. Las tiras o galeras se incuban a 37C y por efecto del metabolismo bacteriano se producen cambios de color espontneos o bien por la adiccin de reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparacin con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reaccin segn el color aparecido.

A. Batera de pruebas incluidas y tablas de lectura con coloraciones positivas y negativas

Pueba ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO Reaccin / Enzimas beta-galactosidasa arginina deshidrolasa lisina descarboxilasa ornitina descarboxilasa utilizacin del citrato produccin de H2S ureasa triptfano desaminasa produccin de indol produccin de acetona (Voges-Proskauer) gelatinasa fermentacin/oxidacin de glucosa fermentacin/oxidacin de manitol fermentacin/oxidacin de inositol Negativo sin color amarillo amarillo amarillo verde sin precipitado negro amarillo amarillo amarillo sin color sin difusin azul o verde azul o verde azul o verde Positivo amarillo rojo o naranja rojo o naranja rojo o naranja azul oscuro o turquesa precipitado negro rojo o naranja marrn-rojo color rosa o anillo rosarojo rosa-rojo difusin de pigmento amarillo amarillo amarillo

SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

fermentacin/oxidacin de sorbitol fermentacin/oxidacin de ramnosa fermentacin/oxidacin de sacarosa fermentacin/oxidacin de melobiosa fermentacin/oxidacin de amigdalina fermentacin/oxidacin de arabinosa citocromo oxidasa

azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde

amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo

B. Etapas del procedimiento

Preparacin de la suspensin bacteriana

Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogneamente en 5 mL de solucin salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estril.

Siembra de la galera API Cada pocillo tiene un tubo y una cpula (parte aerobia).

Llenar con la suspensin de bacterias los tubos, no la cpula, de todos los pocillos.

Llenar la cpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensin de bacterias.

Tapar con parafina lquida

Llenar con parafina las cpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.

Poner la galera en su propia cmara hmeda de incubacin

Poner la tira en su propia cmara hmeda de incubacin. Previamente poner agua en los alvolos de la cmara para proporcionar una atmsfera hmeda durante la incubacin.

Incubacin en estufa

Incubar a 37 C durante 18-24 h.

Anotar los resultados inmediatos

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura. Ver tabla de lectura (colores en imagen) en otra pantalla Ver tabla de lectura (colores en texto) en otra pantalla Y anotando el resultado como positivo o negativo

Revelado de pruebas que requieren reactivos (Ver vdeo revelado y lectura API20E) Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:

Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que aadir reactivos. Cuando sto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales. Si la glucosa es positiva y/o 3 o ms tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:

TDA
Aadir una gota de FeCl3 10 %. Positivo = color marrn oscuro.

VP
Aadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH). Positivo = color rosa fuerte o rojo en 5-10 minutos.

IND
Aadir una gota de reactivo de Kovacs (1) o de Dimetilamino-cinamaldehido (2). Dependiendo del reactivo utilizado pueden darse las posibilidades siguientes: (1)Positivo = aparece un anillo rosarojo (2)Positivo =color de rosa a morado en todo el pocillo

Oxidasa Aadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recin preparado. Positivo = color azul que aparece inmediatamente

Anotar el resto de resultados

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura. Ver tabla de lectura (colores en imagen) en otra pantalla Ver tabla de lectura (colores en texto) en otra pantalla Y anotando el resultado como positivo o negativo

Perfil numrico e identificacin Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numrico de 7 cifras. Los pocillos estn separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test nmero 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4. o Si la reaccin es negativa se pone 0. o Si la reaccin es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es el tercero. o Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un cdigo de 7 cifras. o Con este cdigo se busca en la tabla de identificacin la especie de que se trata.