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Microbiologia Mdica 2006/2007

Aula Prtica n. 4 Mtodos de identificao e caracterizao: principais provas bioqumicas; sistemas automatizados. Outros mtodos de identificao e caracterizao de isolados: mtodos imunolgicos e de biologia molecular.
CULTURA DE MICRORGANISMOS - PROVAS BIOQUMICAS Conhecer princpios e procedimentos de diversas provas bioqumicas usadas na identificao de microrganismos. Analisar as provas bioqumicas realizadas (leituras directas e indirectas).

TEXTO DE APOIO:

Provas fermentativas Prova ONPG Prova de Kligler (agar Kligler) ou agar Triple Sugar Iron (TSI) Hidrlise do amido Prova do sulfureto de hidrognio (H2S) Hidrlise da gelatina Hidrlise da casena Prova IMViC o Prova do indol o Prova do vermelho de metilo o Prova de Voges-Proskauer o Prova da utilizao do citrato Descarboxilao da lisina Desaminao da fenilalanina Prova da reduo dos nitratos Prova da urease Prova das oxdases Prova da catlase Prova da coagulase

ACTIVIDADES BIOQUMICAS DOS MICRORGANISMOS Os microrganismos efectuam as suas variadas actividades bioqumicas utilizando nutrientes obtidos a partir do ambiente que os rodeia. Essas reaces bioqumicas que ocorrem dentro ou fora dos microrganismos so catalisadas por enzimas. No laboratrio, possvel demonstrar algumas das actividades bioqumicas atravs da observao da capacidade dos microrganismos usarem enzimas para degradar hidratos de carbono, lipidos, protenas e aminocidos. Geralmente, a metabolizao destas molculas orgnicas origina produtos finais cuja deteco pode ajudar na caracterizao e identificao dos microrganismos.

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HIDRATOS

DE CARBONO

Provas fermentativas As fermentaes so reaces bioqumicas produtoras de energia em que molculas orgnicas servem como aceitadores e dadores de electres. A capacidade dos microrganismos fermentarem hidratos de carbono e os tipos de produtos formados so teis na sua identificao. Um determinado hidrato de carbono pode ser fermentado originando diferentes produtos finais consoante o tipo de microrganismo envolvido. Estes produtos finais (lcoois, cidos, gases ou outras molculas orgnicas) so caractersticos dos microrganismos e podem ser usados para os identificar. Na fermentao, substratos como hidratos de carbono e lcoois sofrem uma desassimilao anaerbia, podendo ocorrer produo de compostos orgnicos cidos que podem ser acompanhados por gases, como hidrognio ou CO2. Os microrganismos anaerbios facultativos so geralmente os chamados fermentadores de hidratos de carbono. A degradao fermentativa faz-se habitualmente num meio lquido que contm nutrientes para suporte do crescimento do microrganismo, o hidrato de carbono especfico que serve de substrato para determinar a sua capacidade fermentativa e um indicador de pH (ex. vermelho de fenol ou prpura de bromocresol). Nesse caldo de fermentao existe tambm um tubo de Durham (pequeno tubo colocado em posio invertida dentro do meio de cultura lquido) que permite detectar a produo de gs. Aps incubao, a libertao de compostos cidos, resultantes da fermentao do hidrato de carbono, faz descer o pH o que conduz mudana da cor original do meio, pois est presente um indicador de pH (reaco positiva). Em alguns casos, a produo de cido acompanhada pela produo de gs (CO2) que visvel, pois o meio lquido que estava dentro do tubo de Durham substitudo por gs em forma de bolhas. Na fermentao alcolica ocorre produo de gs no tubo de Durham, mas o meio de cultura mantm a cor inicial. As culturas que no so capazes de fermentar o hidrato de carbono no conduzem mudana de cor do meio nem apresentam produo de gs (reaco negativa). O facto de no ter havido fermentao do hidrato de carbono no significa ausncia de crescimento, pois o microrganismo pode usar outros nutrientes do meio (ex. peptonas) como fonte de energia. Todas as culturas devem ser observadas s 24 a 48 h, uma vez que uma incubao prolongada pode mascarar a produo de cido, pois ocorre produo de substncias alcalinas resultantes da aco enzimtica sobre outros substratos. So exemplos de provas para identificao de microrganismos as fermentaes da glicose, lactose, sacarose, manose, inositol, sorbitol, arabinose, etc. Actividade da -galactosidase (Prova ONPG) Alguns microrganismos, como lactose como a sua nica fonte de metabolismo deste hidrato de carbono lactose, a galactose e glicose e uma a Escherichia coli, podem usar a carbono. As enzimas essenciais ao so a -galactosidase que hidrolisa a permease que transporta a lactose

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atravs da membrana celular, tornando-a disponvel para a -galactosidase intracelular. Os verdadeiros no fermentadores da lactose no possuem a -galactosidase. Nesta prova, em vez de lactose, o substrato natural desta enzima, utiliza-se o substrato artificial ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo). A -galactosidase catalisa a hidrlise do ONPG formando-se galactose e onitrofenol. O ONPG incolor, mas aps hidrlise origina o-nitrofenol, que amarelo numa soluo alcalina. Num tubo de ensaio contendo gua destilada inocula-se a bactria, aps esta ter sido semeada num meio com lactose, e um disco de ONPG e incuba-se a 37 C. Aps 20 minutos a 1 hora verifica-se se ocorreu mudana de cor de incolor para amarelo, caso contrrio a incubao deve continuar at s 24 horas. Assim, se o tubo ficar amarelo uma prova positiva para a actividade da -galactosidase. Prova de Kligler Iron Agar ou de Triple Sugar Iron Agar Esta prova , geralmente, usada para diferenciar os diferentes gneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta famlia de outros bacilos Gram negativo de origem intestinal. Esta diferenciao feita atendendo s diferenas na fermentao dos hidratos de carbono presentes no meio e produo de sulfureto de hidrognio (H2S). Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contm glicose em pequena concentrao (0,1%), lactose em concentrao superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produo de cidos resultantes da fermentao dos hidratos de carbono, tiossulfato de sdio, substrato para a produo de H2S, e sulfato de ferro para a deteco desse produto final. A diferena entre estes dois meios diferenciais que o TSI possui mais um acar, a sacarose, em concentrao igual da lactose (1%). Ambos os meios so inoculados por picada, no cilindro e por estria, na rampa. essencial que as culturas sejam observadas aps 18 a 24 h de incubao para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados e que ocorra degradao das peptonas, formando produtos finais alcalinos. na rampa que se faz a leitura da lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S. Aps incubao podem ser determinadas as actividades fermentativas, a produo de gs e a produo de H 2S, podendo ocorrer vrios resultados: Cilindro cido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha): S a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas como este substrato est presente em concentrao mnima, a quantidade de cido produzida limitada e rapidamente oxidada na superfcie da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio so tambm usadas na produo de substncias alcalinas. No cilindro, a reaco cida mantida devido tenso reduzida do oxignio e ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido persistncia da formao de cido no cilindro. Cilindro cido (amarelo) e rampa cida (amarela): Ocorreu a fermentao da lactose e/ou da sacarose, para alm da glicose. Como as duas primeiras substncias esto presentes em altas concentraes so substratos para a actividade fermentativa contnua com

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manuteno da reaco cida (cor amarela) em todo o meio (rampa e cilindro). Produo de gs: Nota-se pela ocorrncia de fracturas no meio de cultura. Produo de H2S: Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermdia do cilindro. Isto deve-se ao facto do microrganismo em estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrognio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolvel, precipita. Cilindro alcalino (vermelho) e rampa alcalina (vermelha) ou inalterado (tijolo): No ocorreu fermentao dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produo de gs ou de H2S. As peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condies anaerbias e/ou aerbias, resultando num pH alcalino devido produo de amnia. Se s ocorrer degradao aerbia das peptonas, a reaco alcalina s evidenciada na superfcie da rampa. Se houver degradao aerbia e anaerbia das peptonas, a reaco alcalina visvel em todo o meio. Hidrlise do amido As molculas de amido so constitudas por amilose e amilopectina que so rapidamente hidrolisadas por algumas bactrias, usando as suas amilases, originando dextrinas, glicose e maltose. Utiliza-se uma soluo de iodo para indicar a presena de amido. Quando o iodo contacta com o amido, forma um complexo azul acastanhado. O amido hidrolisado no produz alterao de cor. Se aparecer uma zona clara aps adio de iodo a um meio que contenha amido e crescimento bacteriano porque a amilase foi produzida pela bactria. Se no ocorrer uma zona clara, o amido no foi hidrolisado. PROTENAS,

AMINOCIDOS E ENZIMAS

Prova do sulfureto de hidrognio (H2S) Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrognio (H2S) a partir de substratos como aminocidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgnicos. Muitas protenas so ricas em aminocidos sulfurados, como a cistena. Quando estas protenas esto presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminocidos que so utilizados como nutrientes. O aminocido cistena, na presena da enzima cistena desulfurase, perde o seu tomo de enxofre que por sua vez reduzido pela adio de hidrognio da gua para formar H2S. O H2S ento produzido pela hidrogenao (reduo) do enxofre orgnico presente no aminocido cistena. Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela reduo de compostos sulfurados inorgnicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contm tiossulfato de sdio alguns microrganismos tm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima

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tiossulfato redutase, com libertao de H2S. Os tomos de enxofre actuam como aceitadores de hidrognio durante a oxidao dos compostos inorgnicos. O meio de cultura agar SIM contm peptonas (a cistena um dos componentes) e tiossulfato de sdio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que actua como indicador da presena de H2S. Como o H2S incolor, e por conseguinte no visvel, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro combina-se com o H 2S formando sulfureto de ferro que um precipitado negro insolvel. A presena deste composto ocorre ao longo da linha de inoculao e indica que houve produo de sulfureto de hidrognio (reaco positiva). A ausncia do precipitado negro evidencia uma reaco negativa. O meio de SIM um meio semi-slido que tambm pode ser usado para detectar a presena ou ausncia de mobilidade nas bactrias e a produo de indol. Hidrlise da gelatina O objectivo desta prova determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidroltica extracelular capaz de degradar a gelatina (gelatinase). A gelatina uma protena produzida pela hidrlise do colagnio que abaixo dos 25 C mantm as suas propriedades de gel e slida, enquanto acima dos 25 C lquida. Determinados microrganismos tm capacidade para produzir a gelatinase, que actua hidrolisando a gelatina em aminocidos. Se a degradao ocorre no se consegue restaurar as caractersticas de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas (fica lquido). A hidrlise da gelatina uma caracterstica importante na diferenciao dos microrganismos e pode tambm ser usada para determinar a sua patogenicidade. A liquefaco da gelatina pode ser determinada inoculando-se por picada um meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de gelatina. Aps incubao a 37 C durante 24 a 48 h, as culturas so colocadas no frigorfico a 4 C durante 30 minutos ou num banho de gelo durante 3 a 5 minutos. Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantm-se lquido aps refrigerao (reaco positiva). Se o microrganismo no possui gelatinase, o meio resolidifica durante o perodo em que est no frigorfico (reaco negativa). Hidrlise da casena O objectivo desta prova determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidroltica extracelular capaz de degradar a casena. A casena a mais importante protena do leite, sendo uma macromolcula, composta por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas, incapaz de penetrar na membrana celular dos microrganismos. Para que a casena seja utilizada pelos microrganismos, tem de ser degradada em peptonas, polipeptdeos, dipeptdeos e finalmente em aminocidos. Este processo possvel porque os microrganismos produzem enzimas proteolticas (proteases) que catalisam a hidrlise da casena em aminocidos, os quais so depois assimilados e catabolizados pelas clulas.

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Nesta prova utiliza-se o agar Milk para demonstrar a actividade hidroltica das proteases. O meio composto por agar nutritivo suplementado com leite que contm a protena casena. Esta protena do leite uma suspenso coloidal que d ao meio a sua cor e opacidade. Aps incubao deste meio, os microrganismos que secretam proteases exibem uma zona de protelise, que aparece como uma rea clara rodeando a zona de crescimento bacteriano. Esta perda da opacidade resultante de uma reaco hidroltica com formao de aminocidos solveis e no coloidais e representa uma reaco positiva. Na ausncia de proteases, o meio que envolve o crescimento do microrganismo mantm-se opaco (reaco negativa). Provas IMViC (INDOLE, METHYL-RED, VOGES-PROSKAUER, CITRATE) Esta srie de provas permite diferenciar os principais grupos de Enterobacteriaceae, pois baseia-se nas suas propriedades bioqumicas e nas reaces enzimticas na presena de substratos especficos. Prova do indol O objectivo determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminocido triptofano (presente em quase todas as protenas) at indol. O triptofano um aminocido essencial que pode sofrer oxidao pelas actividades enzimticas de algumas bactrias. A converso do triptofano em produtos metablicos mediada pela enzima triptofanase. Como a capacidade de hidrolisar o triptofano com produo de indol (no utilizado e acumula-se no meio) no uma caracterstica de todos os microrganismos serve como marcador bioqumico. H microrganismos que no metabolizam o triptofano ou ento fazem metabolizao completa desse aminocido sem produzir indol. Utiliza-se um meio de cultura que contenha o aminocido triptofano por ex.: gua peptonada, para fazer a sementeira. Aps o crescimento pesquisa-se a presena de indol adicionando o reagente de Kovacs (amarelo) ao longo das paredes do tubo, de modo que no se misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfcie do meio aps adio do reagente so indol positivo. A persistncia da colorao amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano no foi hidrolisado a indol e indica uma reaco negativa. Prova do vermelho de metilo Tem como objectivo determinar a capacidade dos microrganismos para oxidar a glicose com produo e manuteno de concentraes altas de produtos finais cidos. Efectua-se no meio MR - VP (Methyl Red, Voges Proskauer). A glicose o mais importante substrato oxidado por todos os microrganismos intestinais para a produo de energia. No entanto, os produtos finais deste processo variam, dependendo do equipamento enzimtico presente na bactria. Apesar de todos os microrganismos intestinais fermentarem a glicose com produo inicial de cidos orgnicos, h uns (ex. Escherichia coli) que

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mantm um pH de 4 at ao fim da incubao, enquanto outros (ex. Enterobacter aerogenes) durante o ltimo perodo de incubao convertem esses cidos a produtos finais no cidos como o etanol e a acetona, resultando assim num pH mais elevado (pH 6) no final da incubao. Nesta prova o indicador de pH, vermelho de metilo, detecta a presena de grandes concentraes de produtos finais cidos, pois tem um ponto de viragem baixo. A pH 4, o vermelho de metilo vira para vermelho, o que indica uma reaco positiva. Quando o pH 6, apesar de ainda ser cido, como h menos ies hidrognio, o indicador muda para amarelo e uma prova negativa. Prova de Voges-Proskauer O objectivo determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais no cidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos cidos orgnicos que resultam da metabolizao da glicose. Efectua-se tambm no meio MR - VP (Methyl Red, Voges - Proskauer). A adio do reagente de Barritts (soluo 40% KOH e soluo de naftol em etanol absoluto) permite detectar a presena de acetilmetilcarbinol (acetona) que percursor da sntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formao de um complexo rosa/vermelho que d essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15 minutos aps a adio do reagente de Barritts representa uma prova positiva. A ausncia dessa cor uma prova negativa. Este tipo de fermentao da glicose caracterstico do E.aerogenes. Prova da utilizao do citrato Permite diferenciar microrganismos atendendo sua capacidade para usar o citrato como nica fonte de carbono. Efectua-se no meio de citrato ou meio de Simmons. Na ausncia de glicose ou lactose fermentveis, alguns microrganismos so capazes de usar o citrato como nica fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presena de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da clula o citrato degradado pela enzima citrase, produzindo cido oxalactico e acetato. Estes produtos so depois convertidos enzimaticamente em cido pirvico e CO2. O meio de Simmons contm citrato de sdio como nica fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova feita em tubos em rampa, uma vez que o O 2 necessrio para a utilizao do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertao de CO2. Durante esta reaco o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sdio (fornecido pelo citrato de sdio) e gua para formar carbonato de sdio, que um produto alcalino. A presena de carbonato de sdio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte. Aps incubao, as culturas citrato positivo so identificadas pela presena de crescimento, na superfcie da rampa, acompanhado de colorao azul no meio de cultura. Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantm-se verde e no apresentam crescimento no meio de cultura.

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Descarboxilao da lisina A descarboxilao a remoo de um grupo carboxilo de uma molcula orgnica. As bactrias que crescem num meio lquido descarboxilam aminocidos mais activamente quando as condies so anaerbias e ligeiramente cidas. A descarboxilao de aminocidos, como a lisina, resulta na produo de uma amina e de dixido de carbono. As bactrias que produzem a enzima descarboxilase da lisina podem descarboxilar a lisina e usar as aminas como percursoras para a sntese de outras molculas. Adicionalmente, quando certas bactrias fazem fermentao so produzidos produtos cidos que tornam o meio cido e portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases so activadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos cidos dos aminocidos produzem aminas que aumentam o pH do meio que fica mais adequado. A descarboxilao da lisina pode ser detectada semeando a bactria num meio de cultura contendo esse aminocido, glicose e um indicador de pH (prpura de bromocresol). Antes da incubao deve ser colocado leo mineral no caldo para impedir o oxignio de atingir as bactrias e inibir a reaco. Os cidos produzidos pelas bactrias a partir da fermentao da glicose vo inicialmente baixar o pH do meio e causar a mudana de cor do indicador de pH de prpura para amarelo. O pH cido activa ento a enzima que causa descarboxilao da lisina a aminas e a subsequente neutralizao do meio que muda de amarelo para prpura outra vez. Desaminao da fenilalanina A desaminase da fenilalanina cataliza a remoo do grupo amina da fenilalanina. Os produtos resultantes incluem cidos orgnicos, gua e amnia. Algumas bactrias podem usar os cidos orgnicos em reaes de biosntese, alm de eliminarem as aminas formadas. Esta prova pode ser usada para distinguir bactrias, pois as que produzem a enzima desaminase da fenilalanina desaminam este aminocido produzindo cido fenilpirvico. Quando o reagente cloreto de ferro adicionado ao meio de cultura reage com o cido fenilpirvico, formando um composto verde. Nas culturas em que no ocorrer a desaminao da fenilalanina no h mudana de cor aps a adio do reagente. Prova da reduo dos nitratos A reduo dos nitratos por alguns microrganismos aerbios ou anaerbios facultativos ocorre na ausncia de oxignio. Nestes microrganismos a respirao anaerbia um processo oxidativo pelo que as clulas usam substncias inorgnicas como os nitratos (NO3-) ou os sulfatos (SO42-) para fornecer oxignio que so subsequentemente utilizados como aceitadores finais de electres durante a formao de energia. Nesse processo, os nitratos so reduzidos a nitritos (NO2-). Por outro lado, alguns desses microrganismos possuem capacidade enzimtica para actuarem sobre os nitritos reduzindo-os a amnia (NH 3+) ou a azoto molecular (N2). A capacidade de alguns microrganismos reduzirem os nitratos pode ser usada na sua identificao.

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A reduo dos nitratos pode ser determinada semeando-se o microrganismo num caldo de nitratos. Este meio um caldo nutritivo suplementado com 0,5% de nitrato de potssio (KNO 3) como fonte de nitratos. Por outro lado, este meio pode ter 0,1% de agar o que lhe permite ser semi-slido de modo a impedir a difuso do oxignio para o meio e assim favorecer um ambiente anaerbio necessrio para a reduo dos nitratos. Aps incubao (24 a 48 h a 37 C), a cultura examinada para a presena de ies nitrito no meio. A capacidade do microrganismo para reduzir os nitratos a nitritos determinada pela adio de dois reagentes: soluo A - c. sulfanlico e soluo B - -naftilamina. Os nitritos presentes no meio vo reagir com esses reagentes produzindo uma mudana de cor imediata para vermelho. No entanto, se a cultura no mudar de cor existem duas possibilidades: o microrganismo possui enzimas que reduziram os nitratos a nitritos e estes a amnia ou a azoto molecular ou os nitratos no foram reduzidos pelo microrganismo. Para determinar se os nitratos foram ou no reduzidos a nitritos, adiciona-se uma pequena quantidade de zinco em p cultura incolor que j contm os reagentes. Uma vez que o zinco reduz os nitratos a nitritos, o aparecimento de uma cor vermelha aps a sua adio revela que os nitratos no foram reduzidos a nitritos pelo microrganismo (reaco negativa). Por outro lado, se a adio de zinco no produzir uma mudana de cor indica que os nitratos j tinham sido reduzidos a nitritos e este a amnia ou a azoto (reaco positiva). Prova da urease O objectivo desta prova determinar a capacidade do microrganismo para desdobrar a ureia atravs da enzima urease. A urease uma enzima produzida por alguns microrganismos, mas especialmente importante para identificar espcies de Proteus relativamente a bactrias entricas lactose negativas. A urease uma enzima hidroltica que ataca a ligao entre o azoto e o carbono em compostos como a ureia, formando o produto final alcalino, amnia, alm de CO2 e H2O. A presena de urease detecta-se quando o microrganismo cresce num meio com ureia (meio de ureia de Christensen) que contm tambm o indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a ureia desdobrada pela urease, a amnia acumula-se no meio tornando-o alcalino. Este aumento de pH faz com que o indicador de pH passe de amarelo a rosa, sendo uma reaco positiva para a presena de urease. A ausncia da colorao rosa indica uma reaco negativa. No entanto, basta que ocorra o aparecimento de uma zona do meio rosa para se considerar a reaco positiva; apenas os microrganismos que produzem precocemente urease tm capacidade para modificar a cor de todo o meio para rosa forte. Prova das oxdases Esta prova permite distinguir grupos de microrganismos tendo como base a actividade da enzima citocromo oxdase.

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As oxdases tm um papel importante no sistema de transporte de electres durante a respirao aerbia. A citocromo oxdase catalisa a oxidao de um citocromo reduzido pelo oxignio molecular, resultando na formao de H2O e de um citocromo oxidado. As bactrias aerbias e algumas anaerbias facultativas e microaerfilas exibem actividade da oxdase. Esta prova importante para distinguir grupos de bacilos Gram negativo patognicos. A capacidade das bactrias produzirem esta enzima pode ser determinada pela adio do reagente das oxdases (dihidrocloreto de tetrametil p-fenilenodiamina). Este reagente de cor rosa age como um substrato artificial, fornecendo electres e consequentemente ficando oxidado, tornando-se um composto escuro (castanho-negro) na presena de oxdase e de oxignio livre. Aps a adio do reagente o desenvolvimento da colorao rosa depois castanha e finalmente negra na superfcie das colnias indicativo da produo de citocromo oxdase e representa uma prova positiva. Se no houver mudana de cor ou se as colnias apresentarem uma colorao rosa ligeira indicativo da ausncia de actividade da oxdase e uma prova negativa. Prova da catlase O objectivo desta prova determinar a capacidade dos microrganismos de produzir a enzima catalase para degradar o perxido de hidrognio. Durante a respirao aerbia, os microrganismos produzem perxido de hidrognio (H2O2) e, em alguns casos, o io superxido (O2-). A acumulao destas substncias leva morte das clulas, a no ser que aquelas possam ser enzimaticamente degradadas. Essas substncias so produzidas quando aerbios, anaerbios facultativos e microaerfilos usam o oxignio como receptor final de electres. Os microrganismos com capacidade para produzir catlase ou peroxidase degradam o perxido de hidrognio a gua e oxignio. A superxido dismutase a enzima responsvel pela degradao dos ies superxido nos microrganismos catlase negativo. A incapacidade dos microrganismos anaerbios para sintetizar catlase, peroxidase ou superxido dismutase que os torna intolerantes ao oxignio. A produo de catlase pode ser determinada adicionando o substrato H2O2 a uma cultura, em meio em rampa, incubada previamente. Se a catlase foi produzida pelo microrganismo ocorre libertao de bolhas de gs (oxignio livre) e a prova positiva. A ausncia de formao de bolhas de gs uma prova negativa. Um procedimento alternativo consiste em determinar a produo de catlase adicionando uma poro de bactrias, previamente colocadas numa lmina, umas gotas de perxido de hidrognio. Se a bactria produzir esta enzima (catlase positiva) ocorre o desdobramento do perxido de hidrognio com libertao imediata de bolhas de gs (oxignio); a ausncia deste borbulhar uma prova negativa.

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Prova da coagulase As coagulases so enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguneo atravs de um mecanismo similar ao da coagulao normal. A actividade da coagulase utilizada para distinguir espcies patognicas de Staphylococcus de espcies no patognicas, sendo um bom indicador da patogenicidade do S.aureus. A prova da coagulase em tubo consiste em juntar num tubo de ensaio contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo oxalato, citrato, heparina) uma suspenso de microrganismos (caldo de cultura) ou colnias provenientes de um meio slido e incubar a 37 C. A formao de cogulos s 2 h, s 6 h ou s 24 h de incubao interpretada como uma prova positiva. A ausncia de coagulao aps 24 horas de incubao uma prova negativa. Esta prova pode ser realizada de um modo mais rpido (prova em lmina) colocando-se duas pores de bactrias da espcie em estudo nos extremos de uma lmina, fazendo-se de seguida uma pequena suspenso, sendo depois adicionado a uma delas uma gota de gua destilada (controlo) e outra uma gota de plasma. Homogeneiza-se bem e observa-se, ao fim de uns minutos. Se o aspecto idntico a prova negativa ou se ocorreu formao de pequenos agregados resultantes do facto das bactrias ficarem aprisionadas na rede de fibrina ento formada a prova positiva. PROVAS BIOQUMICAS SISTEMAS MINIATURIZADOS

EM

Para se proceder realizao de provas laboratoriais baseadas em diferenas nas actividades bioqumicas dos microrganismos podem ser usados sistemas miniaturizados de multitestes (kits comerciais de provas bioqumicas) que permitem identificar a espcie. So usadas microtcnicas que incorporam um conjunto de meios numa nica unidade. Dois destes sistemas disponveis comercialmente so: 1. Sistema API (Analytical Profile Index) 20 E O sistema API 20 E uma verso miniaturizada das provas bioqumicas convencionais usado para identificao das Enterobacteriae e outros bacilos Gram negativo. um sistema de mictotubos pronto a usar que permite realizar 22 provas e culturas puras isoladas apropriadamente num meio de cultura. Consiste numa tira de plstico composta por 20 microtubos individuais, cada um dos quais contendo um meio desidratado. Os meios ficam hidratados aquando da inoculao da suspenso do microrganismo a ser ensaiado, sendo depois a tira de plstico incubada num tabuleiro tambm de plstico com cobertura para evitar a evaporao. Aps incubao (1824h a 35-37 C), a identificao do microrganismo feita pelo mtodo tradicional de verificar a mudana de cor nos microtubos, aps o sistema indicador ter sido alterado pelos metabolitos ou pelos reagentes. A identificao da bactria desconhecida consiste na determinao de um cdigo de 7 dgitos (profile index number) e na consulta do API 20 E Profile Index Booklet ou de um sistema de computador designado API 20 E PRS (profile recognition system).

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2. Sistema de multitestes Enterotube II Consiste num tubo contendo 12 compartimentos com meios de cultura slidos e um fio recto de inoculao. Este fio recto toca numa colnia isolada e depois de uma s vez os microrganismos so arrastados atravs dos 12 compartimentos, de modo que todos os meios fiquem inoculados. Desta maneira so realizadas 15 provas bioqumicas com uma s sementeira. Aps incubao, a mudana de cor de cada compartimento interpretada de acordo com as instrues do fabricante para identificar o microrganismo. A partir dos resultados e consultando um manual obtm-se um cdigo de 5 dgitos que permite identificar a bactria. Este mtodo tornou-se mais eficiente permitindo a identificao das Enterobacteriaceae por meio de um sistema de computador designado ENCISE (Enterobacteriaceae numerical coding and identification system for enterotube).

Sistemas automatizados. Outros mtodos de identificao e caracterizao de isolados: mtodos imunolgicos e de biologia molecular.
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