Laboratorio

de Microbiologa Alimentos CURVA DE CRECIMIENTO

Objetivos Determinar el tiempo de generacin de un cultivo bacteriano. Materiales Aparatos: Termobao Mecheros Bunsen o Fisher Vortex Incubadora Contador de colonias Material de cristalera y otro: Pipetas estriles Cajas de petri estriles vacas (2 por alumno) Recipiente para disponer material contaminado Reactivos (por cada alumno) 3 a 8 tubos con 9 mL de diluyente de peptona o buffer de fosfatos 1 frasco con 50 ml de ACE fundido a 45 1 C Material biolgico Cultivo de E. coli en CST (0, 1, 2, 3, 4 ,5 , 6 , 7 y 12 hrs de incubacin a 35C) Procedimiento Parte 1 Preparacin de muestras. 1. Antes de iniciar esta prctica, observe y escuche cuidadosamente la demostracin que el profesor har al inicio de la prctica. 2. Rotular la base de las cajas estriles vacas con su nombre, fecha, medio de cultivo, microorganismo. Incluya el factor de dilucin y volumen a inocular (1 ml). 3. Dilucin de muestra. Diluir la muestra hasta la dilucin correspondiente, segn el tiempo de incubacin del cultivo, como se explic en el ejercicio 2. 4. Vaciado en placa.

a. Agitar en el vortex el tubo que contiene la dilucin indicada de la muestra y coloque en el centro de la base de la caja 1 mL de la dilucin utilizando una pipeta estril. No olvide flamear la boca del tubo al retirar y antes de volver a colocar el tapn b. Repetir utilizando las diluciones correspondientes. Recuerde utilizar una pipeta nueva en cada dilucin (Fig. 1).

Figura 1. Vaciado en placa c. Vaciar en cada una de las cajas con inculo, ACE previamente fundido y atemperado a 451C. Vace suficiente agar para cubrir 2/3 de la base de la caja (aprox. 15 mL). Tape la caja. d. Agitar suavemente las cajas sobre la mesa con un movimiento suave para mezclar el inculo con el medio de cultivo y distribuirlo de manera uniforme en la caja. Repita esto para cada dilucin. e. Esperar a que el agar se solidifique antes de mover o invertir las cajas. f. Invertir las cajas e incubar a 35C durante 24h. Diluciones a sembrar segn la edad del cultivo Tiempo de incubacin Diluciones Vaciado en placa -2 -3 0 hrs, 1 hrs 10 , 10 -3 -4 2 hrs, 3 hrs, 4 hrs 10 , 10 -4 -5 5 hrs, 6 hrs 10 , 10 -5 -6 7 hrs, 8 hrs, 9 hrs 10 , 10 -6 -7 10 hrs, 11 hrs 10 , 10 , -7 -8 12 hrs, 15 hrs, 18 hrs 10 , 10 -6 -7 21 hrs, 24 hrs 10 , 10

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Parte 2 Resultados e interpretacin 5. Examinar el crecimiento en cada una de las cajas. a. Contar las UFC/ml del cultivo original aplicando las reglas para conteo de colonias. Utilice un contador de colonias. Para reducir el error, marque las colonias ya contadas en la base de la caja utilizando un marcador. b. Anotar sus observaciones 6. En papel logartmico: a. Construir la curva de la poblacin bacteriana con el Log de clulas/mL en el eje de las ordenadas y el tiempo de incubacin en el eje de las abscisas. b. Utilizar una regla para dibujar la lnea que mejor ajuste los puntos graficados. La parte lineal de la curva de crecimiento corresponde a la fase logartmica de la curva. c. Calcular el tiempo de generacin para este cultivo por el mtodo directo (utilizando la frmula matemtica) y el mtodo indirecto (extrapolando dos puntos de la curva construda). N = (log10 CE Log10 C0)/ log102 N = Nmero de generaciones C0 = Nmero de clulas en el tiempo t0 CE = Nmero de clulas al final de un tiempo especificado tE TG=t/N Tiempo de generacin (TG) = tiempo especificado (t)/No. de generaciones (N) d. Mostrar los clculos y anotar el tiempo de generacin: i. Mtodo directo: ii. Mtodo indirecto: Actividades 1. Describa las fases que ocurren en una curva de crecimiento bacteriano. 2. Investigar qu es el tiempo de generacin y diferentes mtodos para determinar el tiempo de generacin.

3.

Explicar las razones por las que el tiempo de generacin puede variar entre diferentes especies de microorganismos, y dentro de la misma especie microbiana.

Bibliografa 1. Pouch Downes F. and Ito K., Ed. 2001. Compendium of methods for the th microbiological examination of foods. 4 . Ed. American Public Health Association. 2. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual Chapter 3. Aerobic Plate Count. Disponible en: http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/La boratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalMan ualBAM/ucm063346.htm Accesado: 14 Enero 2010.

No.

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