1. Explique la tcnica PCR (Reaccin en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina.

En una infeccin microbiolgica una estrategia de diagnostico empleando las tcnicas de la biologa molecular es la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La PCR hace posible monitorear infecciones bacterianas y virales. Detecta los patogenos difciles de cultivar como chlamidia trachomatis,legionella pneumophlia y mycoplasma pneumoniae. PCR Ciclo de amplificacin

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar. Inicio

Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.

Desnaturalizacin En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin. Alineamiento o unin del cebador A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. Extensin o elongacin de la cadena Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 3' 5', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos 00000000000000000000000000000000000000000 Elongacin final Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

 Conservacin Este paso se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

2. Explique la tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) directo y sus aplicaciones en medicina. ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado). ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. 3. Explique la tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) indirecto y sus aplicaciones en medicina.

ELISA indirecto. El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. 4. En qu consiste la tcnica de microarreglos y cules son sus aplicaciones La base de la tecnologa de microarrays o chips de ADN es la automatizacin y robotizacin de las tcnicas clsicas de biologa molecular siendo el fundamento de la tcnica la hibridacin de cidos nucleicos. La principal ventaja con respecto a las tcnicas clsicas es la posibilidad de inmovilizar en la superficie del microarray miles de sondas de ADN, permitiendo el anlisis de la presencia/ausencia o de la expresin de miles de genes, incluso de genomas completos, en un solo experimento. Un microarray de ADN se define como una serie de sondas de ADN unidas a una superficie slida en una disposicin regular y prefijada. La muestra problema se marca con un fluorocromo y puede ser, segn el tipo de

experimento, ADN: para estudios de bsqueda de secuencias especficas o de variaciones en las mismas; o ARN: para anlisis de perfiles de expresin. El soporte utilizado comnmente es el formato porta de vidrio de microscopa debido, sobre todo, a su baja fluorescencia basal y a que admite tratamientos de superficie para la unin covalente de las sondas de ADN. Un experimento tpico con microarrays de ADN sigue los siguientes pasos: fabricacin de array, preparacin de la muestra, hibridacin y anlisis de los datos. Existen dos tipos de microarrays en funcin de la naturaleza de la sonda: los microarrays de productos de PCR y los microarrays de oligonucletidos. APLICACIONES EN MICROBIOLOGA EN LAS QUE LA MUESTRA ES ARN 1. Perfiles de expresin gnica microbiana La primera y principal aplicacin para la que se han usado los microarrays de ADN ha sidola generacin de perfiles transcripcionales o de expresin gnica. Mediante esta aproximacin esposible medir la actividad transcripcional para cada gen o regin gnica de un microorganismo,crecido bajo determinadas condiciones ambientales, pudiendo comparar as los niveles deARNm en distintas condiciones de crecimiento. Gracias a este tipo de experimentos se hanpodido comprender mejor, las respuestas frente cambios ambientales y la expresin gnicaglobal de los microorganismos. As, en los ltimos aos, est ganando aceptacin el concepto de respuesta transcripcional global entendido como un fenotipo molecular que se expresa bajounas condiciones ambientales determinadas Hughes et al. (2000). Algunas aplicacionesderivadas de estos estudios son las siguientes: Estudios de patogenicidad Determinacin de respuestas del hospedador y de interacciones microorganismo hospedador en la infeccin. Farmacogenmica. APLICACIONES EN MICROBIOLOGA EN LAS QUE LA MUESTRA ES ADN 2. Microarrays en genmica comparativa, genotipado y filogenia microbianas La filogenia microbiana basada en el ARNr/DNAr es capaz de clasificar a losmicroorganismos con precisin hasta el nivel de especie. Sin embargo, el fenmeno de latransferencia lateral de genes es un mecanismo muy importante de evolucin en los procariotas,complicando los anlisis filogenticos que se basan en el estudio de unos pocos genes Lucchinniet al. (2001). La variabilidad gentica entre cepas adaptadas a un microambiente hospedadorespecfico,da como resultado diferencias fenotpicas entre

biotipos comensales no patgenos ybiotipos virulentos. La comparacin de cepas mediante la hibridacin del DNA genmico conmicroarrays(genotipado) es una nueva aproximacin frente a la secuenciacin completa dedocenas de cepas. Las comparaciones genmicas entre cepas de la misma especie con diferentegrado de patogenicidad informan sobre los genes necesarios para la virulencia o la adaptacin aun nicho hospedador-especfico; ste el caso de las islas de patogenicidad, que codificanfactores de virulencia. La comparacin mediante microarrays de ADN de genomas secuenciados completamente ygenomas no secuenciados, pero prximos filogenticamente, proporciona valiosa informacinsobre la diversidad y la evolucin de patgenos y comensales Ochman y Moran (2001). 3. Microarrays como herramienta de diagnstico y deteccin de microorganismos Una de las aplicaciones ms importantes para la Microbiologa Mdica y Veterinaria de losmicroarrays de ADN es su potencialidad como herramienta de diagnstico y deteccin depatgenos. Se espera que en el futuro esta tecnologa sustituya a los mtodos tradicionales dedeteccin de patgenos en los laboratorios, tanto de microbiologa clnica como de control decalidad de la industria, principalmente la alimentaria. En la actualidad, muchos grupos trabajanen el diseo de microarrays que permitan la deteccin e identificacin de una elevada cantidadde microorganismos con una sola hibridacin, es decir, poder realizar el diagnstico diferencialde enfermedades infecciosas con un solo microarray. Un ejemplo es el diseo de un array deoligonucletidos panmicrobiano para el diagnstico de enfermedades infecciosas que incluye29455 sondas de 60 oligonucletidos para virus, bacterias, hongos y parsitos.

5. Marcadores celulares: protena verde fluorescente. La protena verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en ingls, green fluorescent protein) es una protena producida por la medusa Aequorea victoria, que emite bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. El gen que codifica esta protena est aislado y se utiliza habitualmente en biologa molecular comomarcador. Osamu Shimomura, en los inicios de la dcada de 1960, fue la primera persona en aislar la GFP a partir de la Aequorea victoria e identificar qu parte era responsable de la fluorescencia. Junto a Frank Johnson, de la Universidad de Washington, aisl una protena bioluminiscente dependiente del calcio, a la que llam aequorina, nombre derivado de la medusa con la que trabajaban. Esta protena emite fluorescencia en la zona azul del espectro. Durante dicho

procedimiento, se identific otra protena que emita fluorescencia verdosa al ser iluminada por luz ultravioleta, por lo que le fue dado el nombre de "protena verde fluorescente". Durante los aos siguientes se verific que, para emitir fluorescencia, la medusa libera iones de calcio que activan la emisin de luz azul por parte de la aequorina. La GFP, por su parte, absorbe la luz liberada por la primera y produce su caracterstica luz verde. Sin embargo, el potencial de la GFP como marcador no fue reconocido hasta 1987 por Douglas Prasher. Recientemente se han identificado otras protenas fluorescentes: entre otras, la protena amarilla fluorescente (conocida por su abreviatura en ingls YFP) o la roja (RFP) entre otras. Adems, estas protenas originales han sido modificadas para mejorar su funcionamiento. Uno de los resultados de estas mejoras es la protena verde fluorescente mejorada (o EGFP, por sus siglas en ingls, "enhanced green florescent protein"). Estructura y espectro de emisin La estructura de la protena verde fluorescente se determin en 1996. Est constituida por 238 aminocidos, que forman once cadenas beta, cuyo conjunto forma un cilindro, en el centro del cual se encuentra una hlice alfa. La GFP original de la medusa posee dos picos de excitacin: uno menor, a 475 nm, y uno mayor, a 395nm. Su pico de emisin est a 509 nm, en la zona verde del espectro. Utilizacin Las protenas fluorescentes, entre las cuales se encuentra la GFP, son muy verstiles y se utilizan en diversos campos como la microbiologa, ingeniera gentica y fisiologa. Permiten ver procesos previamente invisibles, como el desarrollo de neuronas, cmo se diseminan las clulas cancerosas, el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, el crecimiento de bacterias patognicas, la proliferacin del virus del SIDA, entre otros.