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6. DOSAGES DES COMPOSANTS DES DENREES ET VALEUR ENERGETIQUE 6.1 Dtermination de la teneur en eau des denres La teneur en eau est la proportion effective (totale, dosable) d'eau dans la denre. La teneur en eau peut tre dtermine comme suit: - par perte de poids la dessiccation - 103-105C l'tuve pendant x heures. Par cette mthode indirecte, on dose toutes les matires volatiles jusqu' 105C et on introduit une erreur plus ou moins importante selon la denre (ngligeable pour certaines denres pices, denres riches en sucre). En ralit, on ne dtermine pas la teneur en eau mais la teneur en matire sche. - par entranement et distillation avec un solvant organique non miscible l'eau, plus lger: tolune ou xylne ou cyclohexane ou plus lourd: CCl4, perchlor... L'eau est entrane par distillation avec les vapeurs du solvant et recueillie dans un tube gradu (voir figure de la page suivante). Bonne mthode pour les pices, pour lesquelles les teneurs importantes en huiles essentielles faussent trop les rsultats de la mthode par dessiccation. - par raction chimique - mthode selon Karl Fischer Le ractif de Karl Fischer est un mlange de mthanol, anhydride sulfureux, iode une base organique (pyridine lorigine) CH3OH + SO2 + RN (base) [RNH]SO3CH3 anion actif [RNH]SO4CH3 + 2[RNH]I et

H2O + I2 + [RNH]SO3CH3 + 2RN

- SO2 ragit avec l'alcool (mthanol) pour donner un ester qui est neutralis par la base RN - l'anion SO3CH3 est oxyd en SO4CH3 par l'iode, cette raction consomme de l'eau - la fin du titrage est dtermine visuellement (coloration brune persistante - critique) ou plus facilement par potentiomtrie (en ralit biampromtrie). On tablit une ddp constante entre 2 lectrodes de Pt, si I2 absent (car raction), pas de raction cathodique (I2 2I-) donc pas de courant, la fin de raction, prsence dun excs de I2 , par consquent raction cathodique et passage courant (30 A). Mthode prcise (trop ?), mais dlicate mettre en oeuvre (app. automatique).

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Appareil pour le dosage de leau par distillation azotropique (MSDA chapitre 38)

- par dtermination de la densit ou de l'indice de rfraction des liquides (solutions sucres, jus de fruits) dont on dduit (avec des tables) la teneur en matire sche et, par diffrence, la teneur en eau. Exemple: les miels La mthode est inexacte si les liquides contiennent d'autres composs que le sucre, elle ne peut tre applique qu' des matrices bien prcises comme les miels, mots de raisins. - par mesures de la conductivit (produits de la mouture) ou de la constante dilectrique: reproductibles mais ne correspondent pas toujours la teneur relle en eau.

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6.2. Dosage des lipides dans les denres

6.2.1

Dosage des lipides totaux (ou matire grasse totale)

Dosage base sur la dfinition des lipides : insolubles dans leau et solubles dans les solvants organiques. La quantit de lipides totaux trouve dans une denre diffre selon le procd utilis ( spcifier). Ce dosage est le plus gnralement effectu, soit:

- par extraction directe l'ther (ou ther de ptrole) par malaxage (produits solides), en ampoule dcanter (liquides) ou en continu (soxhlet); aprs vaporation du solvant d'extraction, le rsidu est sch et pes. D'autres solvants d'extraction peuvent tre utiliss directement ou aprs schage de l'chantillon l'tuve ou sur sulfate de sodium (par exemple hexane ou mlanges alcool-benzne, dioxane-ther de ptrole..). Cette extraction directe n'est pas totale lorsque des lipides sont retenus mcaniquement (parois cellulaires) ou par adsorption ou lis chimiquement d'autres composs (protines); dans ces cas, une dsagrgation est ncessaire avant l'extraction.

- par extraction aprs dsagrgation: - au moyen d'acide chlorhydrique 25% (mthode internationale). Dsagrgation par l'acide chaud de tous les composs autres que les lipides, qui ensuite sont spars du mlange par filtration puis extraits au soxhlet au moyen d'ther de ptrole. - au moyen d'ammoniaque et d'thanol = mthode de Rse-Gottlieb pour les laits. Aprs dsagrgation (ou plutt dissolution des protines et destruction de l'enveloppe des globules gras), la matire grasse est extraite l'ther et l'ther de ptrole. - enzymatique (amylases, protase) puis extraction des lipides au moyen du mlange mthanol-chloroforme (probablement la mthode la plus universelle).

- par centrifugation aprs dsagrgation chaud par l'acide sulfurique 65% = mthode acido-butyromtrique de Gerber pour les laits. Aprs dgradation des protines, ajout d'alcool isoamylique (meilleure sparation des couches) et centrifugation, le volume de graisse est mesur dans un butyromtre gradu.

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6.2.2. Distribution des acides gras et des strols (notamment le cholestrol) Distribution des acides gras : (rappel) denre grasse matire grasse

Principe:

extraction/ destruction acide

tri-glycrides (lipides totaux) saponification (NaOH/NaOMe/MeOH) acides gras (sels de Na) estrification (MeOH/[BF3]) esters mthyliques (FAME) GC [chromatogrammes : chapitre Lipides]. voir [transestrification]

Distribution des phytostrols et dosage du cholestrol : (rappel) - (extraction de la matire grasse [destruction HCl ...]) - saponification - extraction de l'insaponifiable avec un solvant organique - purification de la fraction des strols par chromatographie sur couche mince prparative - (prparation de drivs silyls) - chromatographie en phase gazeuse (capillaire) [chromatogrammes, voir chapitre Lipides]

Ces analyses ont pour but : - dune part de caractriser et dauthentifier les huiles et graisses et les denres riches en certaines matires grasses (voir chapitre Lipides ) ; - et dautre part, de prciser dans lindication de la valeur nutritionnelle des lipides, les teneurs des diffrentes sortes dacides gras et, ventuellement, la quantit de cholestrol prsente, en gnral sous la forme : - acides gras saturs - acides gras mono-insaturs - acides gras polyinsaturs - acides gras omga-6 - acides gras omga-3 - cholestrol.

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6.3 Dosage des protides dans les denres Gnralement dans le domaine de lanalyse des denres alimentaires, le dosage des protides se limite la mesure de la teneur en protines brutes, mais dans certains cas lanalyse dune protine particulire comme un enzyme ou le dosage des acides amins libres totaux ou le dosage de certains acides amins peuvent tre utiles.

6.3.1

Dosage des protines brutes (protines totales)

L'analyse des protines brutes dans les denres alimentaires consiste doser l'azote total selon Kjeldahl et multiplier la teneur en azote par un facteur conventionnel (Ntot x 6.25) - dosage de l'azote contenu dans la denre selon Kjeldahl. La matire organique est dtruite par oxydation, sous l'effet combin de l'acide sulfurique, de catalyseurs et ventuellement de substances destines lever le point d'bullition du mlange. Dans ces conditions l'azote des groupes amino, amido et imino est transform en sel d'ammonium. L'ammoniac libr de ce sel en mileu basique est entran par distillation et recueilli dans une solution acide de titre connu. - calcul de la teneur en protines brutes par multiplication de la teneur en azote trouve par un facteur de conversion (qui correspond l'inverse de la teneur en azote dans la protine). Comme la teneur en azote est variable (fonction des acides amins prsents et de leur proportions), un facteur de conversion diffrent devrait tre utilis pour chaque sorte de protine. Toutefois, lorsque la nature exacte de la protine n'est pas connue ou si l'on a affaire une denre alimentaire contenant plusieurs sortes de protines, on adopte le facteur conventionnel de 6,25 (correspondant un taux moyen d'azote de 16 %). Exemples de facteurs de conversion: albumine du lait (lait et produits laitiers) glatine crales (bl) graines olagineuses protines de - viandes - oeufs - lgumineuses - denres complexes Dans tous les cas, il faut indiquer dans le rapport d'analyse le facteur utilis pour le calcul. 6,25 6,38 5,55 5,70 5,30

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Le dosage des protines pures peut tre fait par prcipitation de ces protines par l'hydroxyde de cuivre (II) et traitement du prcipit comme dcrit ci-dessus. La diffrence entre l'azote total et l'azote des protines pures correspond l'azote rsiduel (azote des acides amins libres, peptides faible PM, bases puriques, alcalodes, sels ammoniacaux, nitrates...).

6.3.2

Dosage des acides amins

- Dosage des acides amins libres totaux (indice de formol mthode de Srensen) Intrt : le dosage de petites quantits dacides amins libres dans les jus de fruits/boissons aux jus de fruits permet dapprcier la proportion de jus: indice de formol. R-CH(COO-)-NH3+ ---------------> R-CH(COOH)-N(CH2-OH)2 ------> titrage pH 8,5 2 H-CHO pH 8,5 pH 8,5 avec NaOH
La raction de la formaldhyde avec la fonction amino libre, par molcule d'acide amin, un ion H+, titrable par une base. La quantit de soude utilise dans le titrage, exprim en ml de solution 0,1 mol/l pour 100 ml de jus de fruits, reprsente l'indice de formol de l'chantillon analys.

- Sparation et dosage des acides diffrents amins des protines (dtermination de l'aminogramme) Les acides amins sont librs des protines par une hydrolyse acide (HCl 6 mol/l - 24 h); puis ils peuvent tre doss par diffrents mthodes chromatographiques (CCM, HPLC, autoanalyseur avec colonne d'change d'ion). La composition des acides amins "aminogramme" d'une ou d'un ensemble de protines sert principalement l'apprciation de la qualit de ces protines (le % de chaque acide amin essentiel prsent dans la protine teste est compar celui d'une protine de rfrence [celle de l'oeuf par exemple]; l'acide amin dont le % est le plus bas -facteur limitant n 1donne l'indice chimique selon Mitchell de cette protine). Exemple: mg/g d'a.a. ds la prot. teste ________________ LYS MET TRP 83,9 34,0 16,0 indice chimique = 61,6 Les techniques de sparation et de quantification des acides amins sont aussi applicables, si ncessaire, aux acides amins libres prsents dans les denres (jus de fruits [pour le contrle de leur authenticit], hydrolysats de protines).
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mg/g d'a.a. ds la prot. rf. (oeuf) ________________ 66,4 55,2 16,5

% ______ sup 100 61,6 97,0

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6.4. Dosage des sels minraux Les sels minraux sont essentiels l'organisme, notamment parce qu'ils : contrlent l'quilibre hydrique (pression osmotique) rglent l'quilibre acide-base (pH) font partie de certaines structures (os, dents) entrent dans la composition des enzymes, des hormones catalysent de nombreuses ractions du mtabolisme

Selon les quantits mises en jeu dans l'organisme, les sels minraux sont couramment (et arbitrairement) diviss en 2 groupes: - les lments principaux ou macrolments: Ca, P, K, Cl, Na, Mg - les lments traces ou oligolments: Fe, Zn, Cu, Mn, I, Mo, F, Si, Se, etc.

6.4.1

Dosage des matires minrales totales (ou cendres) par incinration

La teneur en cendres d'une denre s'obtient par incinration (ou combustion complte) dans un four 550 - 800C. L'adjonction de ractifs comme le nitrate de lanthane peut faciliter ou acclrer la combustion (cendres moins fusibles). Toutefois, la teneur en cendres ne correspond pas exactement la teneur en matires minrales de la denre (pertes de substances par volatilisation ou augmentation sensible de poids par formation de carbonates ou d'oxydes). Exemples : Bl : Lait : matires minrales cendres matires minrales cendres matires minrales cendres 2.16 % 1.90 % 0.69 % 0.80 % 0,17 % 0,25 %

pertes de S, Cl, ... augmentation due la formation de carbonates idem lait

jus de pommes:

Les cendres insolubles dans l'acide chlorhydrique sont principalement constitues de silice et silicates. Ce rsidu aussi appel "sable" est assimil de la terre et autres impurets d'origine minrale. Sa teneur est un indice de puret de certaines denres (pices, caf, cacao...) La dtermination de l'alcalinit des cendres (excs de la fraction basique sur la fraction acide mesur par titrage) permet parfois de dceler un traitement des denres examines: traitement du vin en cave, dsacidification ou dminralisation par changeurs d'ions...

4.2 Dosage spar des lments minraux Le dosage d'lments tels que Na, Mg, Fe, I... sert plutt l'apprciation de certains aliments dittiques (denres pauvres ou sans sodium, denres avec supplmentation en oligolments, produits pour nourrissons..) ou la recherche de falsification (par exemple : dosage de K et P dans les jus de fruits [dilution]).

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Ces dosages sont effectus par les mthodes classiques de la chimie analytique (gravimtrie pour P, S, Cl, Si ..., titrimtrie pour S, Cl, Ca, Mg ..., colorimtrie pour P, Cl, Si, Fe) ou par absorption atomique (Na, K, Fe ...), en gnral aprs minralisation.

Exemples: - dosage de Na et K par photomtrie de flamme - dosage de Ca et Mg ou du fer, par spectrophotomtrie d'absorption atomique - dosage du chlorure par titrimtrie selon Mohr ou Vollard ou par potentiomtrie - dosage du phosphore par colorimtrie :
la teneur en phosphate est mesure sur la base de la teneur en bleu de molybdne ( 720 nm), obtenu par raction avec du molybdate d'ammonium et rduction subsquente (par l'acide ascorbique par exemple).

6.5. Dosage des glucides Il n'existe pas de mthode d'analyse globale des sucres comme il en existe pour les lipides, les protides (protines), les matires minrales (cendres), etc. Dans le domaine des glucides, les dosages globaux que l'on peut effectuer concernent: - les sucres rducteurs (y compris le dosage du saccharose) - les fibres alimentaires, composes principalement de polysaccharides non assimilables. La mesure de la quantit totale de glucides (ou hydrates de carbone assimilables) d'une denre est gnralement faite par calcul (diffrence avec les autres nutriments). 6.5.1 Dosage chimique des sucres fonds sur leur pouvoir rducteur

En milieu alcalin, tous les monosaccharides ainsi que les disaccharides rducteurs (lactose, maltose..) rduisent les combinaisons complexes du cuivre (II) en oxyde de cuivre (I). Le dosage des sucres directement rducteurs suit le schma suivant: - dfcation des solutions Les hydrates de carbone doser se trouvent gnralement mlanges d'autres substances en solution ou en suspension comme eux et pouvant empcher ou fausser le dosage des sucres. Ces substances trangres doivent tre limines sans que la teneur en hydrates de carbone s'en trouve modifie; cette clarification est obtenue en provoquant la formation d'un prcipit dans le liquide, opration appele dfcation . Les agents de dfcation ou clarification doivent donc avoir une action slective. Certains, tel l'actate de plomb, agissent par prcipitation (sel de plomb) et partiellement par adsorption. Les ractifs de Carrez (hexacyanoferrate II de K et sulfate de Zn) agissent uniquement par adsorption. Ils provoquent la formation d'un prcipit "ltat naissant" entranant les substances trangres par "occlusion".

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- rduction d'une solution de cuivre (II) rduction chaud d'une solution plus ou moins alcaline de sulfate de cuivre - dtermination de la teneur en sucres rducteur: - en mesurant la quantit d'oxyde de cuivre (I) forme, par complexomtrie (Potterat et Eschmann) ou par gravimtrie (Fehling) ou par iodomtrie (von Fellenberg) - ou en mesurant par iodomtrie la quantit de cuivre (II) qui n'a pas ragi (Luff et Schoorl) Le dosage du saccharose (non rducteur) suit le schma suivant: - dosage des sucres directement rducteurs (avant inversion), comme dcrit ci-dessus - hydrolyse (inversion) du saccharose en milieu acide chlorhydrique - dosage des sucres rducteurs aprs inversion La teneur en saccharose est calcule partir de la diffrence entre les rsultats du dosage des sucres rducteurs avant et aprs l'inversion. 6.5.2 Analyse des diffrents mono- et disaccharides prsents dans les denres

- Mthodes chromatographiques Aprs dfcation avec les ractifs de Carrez (voir chapitre Glucides), si ncessaire, il est possible de sparer et doser les sucres: - par CCM (mthode sur papier pratiquement abandonne), dtection au nitrate d'Ag ammoniacal, ou dtection la diphnylamine et dosage au moyen d'un densitomtre (ou par HPCCM) - par GC (dtecteur FID), aprs transformation des sucres en leurs oximes (C=NOH) et drivs sylils (C-O-Si-) - colonne OV 17 par HPLC : exemple

min. phase: gel de silice modifie par des groupes amino (ex. Lichrospher-NH2), luant: actonitrile - eau (ex. 80/20 v/v 1,0 ml/min), dtecteur indice de rfraction (RI) 1. xylose, 2. fructose, 3. glucose, 4. saccharose
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- Mthodes enzymatiques Les dosages enzymatiques peuvent tre effectus pour les sucres suivants: glucose, fructose, saccharose, lactose, galactose (amidon aprs hydrolyse) Exemple: dosage enzymatique du saccharose (mthode Boehringer) - fructosidase saccharose + H2O ----------------------------glucose + ATP G-6P + NADP hexokinase ----------------------------G-6P dhydrognase -----------------------------

glucose + fructose G-6P + ADP gluconate-6P + NADPH + H+

la teneur en NADPH form (directement proportionnel la teneur en saccharose) est mesure par adsorption dans lUV 340 nm. 6.5.3 Dosage des fibres alimentaires (mthode enzymatico-gravimtrique)

Anciennement, le dosage des fibres se limitait au dosage de la cellulose par des mthodes rudimentaires dont le rsultat ne rpond pas la dfinition des fibres. Il existe plusieurs mthodes de dosage des fibres alimentaires, toutes bases sur l'un ou l'autre des deux principes suivants: - les mthodes gravimtriques qui procdent par limination de substances "non fibres" (protines, amidon, lipides..) par voie chimique ou enzymatique suivie de la pese du rsidu - les mthodes chimiques ou directes dosant individuellement les diffrents constituants des fibres. La mthode actuellement reconnue comme la plus valable (proche de notre processus de digestion) est une mthode gravimtrique dans laquelle l'limination des protines et des amidons de l'chantillon est faite par voie enzymatique. Le schma de cette mthode est le suivant: chantillon, dgraiss si ncessaire glatinisation (enzyme thermamyl) hydrolyse contrle des protines (protase) hydrolyse de l'amidon (amyloglucosidase) insolubilisation des fibres solubles (dans lthanol 70%)

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filtration des fibres totales (insolubles et solubles) lavage, schage, pese du rsidu dtermination dans le rsidu des: - protines restantes (Kjeldahl) - cendres (incinration) Rsidu - protines restantes - cendres = fibres alimentaires

6.5.4

Dosage des sucres totaux par diffrence

Lorsqu'il n'est pas ncessaire de connatre les diffrents sucres prsents dans une denre, on peut se contenter de calculer la teneur globale en glucides (ou hydrates de carbone assimilables) par diffrence avec les autres constituants: glucides = total - eau + lipides + protides + matires minrales (cendres) + fibres alimentaires, vtl

6.6. Dosage des vitamines Les mthodes d'analyse mises en jeu sont soit des mthodes chimiques et physicochimiques soit des mthodes microbiologiques soit des mthodes biologiques: 6.6.1 Mthodes chimiques et physico-chimiques: - par colorimtrie ou photomtrie: vit.A (mthode Carr-Price), -carotne... - par fluorimtrie: B1 aprs oxydation en thiochrome, B2... - par HPLC presque toutes les vitamines peuvent tre analyses par HPLC; un exemple classique est la sparation des tocophrols (vit. E) d'une huile de germe de bl (voir chromatogramme page suivante). 6.6.2 Mthodes microbiologiques

un microorganisme dont le mtabolisme et la croissance dpendent de la prsence et de la concentration de la vitamine recherche est mis en prsence d'un extrait de la denre examiner. L'intensit du rendement mtabolique ou de la croissance est mesure (titrimtrie, gravimtrie ou turbidimtrie) et compare avec celle obtenue une srie de standards de concentrations diffrentes. mthodes trs sensibles et trs spcifiques, principalement utilises pour les vitamines du groupe B, mais fastidieuses. Exemples: vit. B2 avec Lactobacillus casei - mesure par titrage du lactate form, vit. B6 avec Neurospora sitophila - mesure par gravimtrie du myclium form ou Saccharomyces

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carlsbergensis - mesure par turbidimtrie, de mme pour la vit. B12 avec Poteriochromonas stipitata ou Lactobacillus leichmanii... 6.6.3 Mthodes biologiques

Ces mthodes de tests sur animaux ne sont plus actuellement utilises que pour les vitamines difficilement extractibles comme celles du groupe D. Dans ce cas, on donne des rats rachitiques des doses diffrentes de da prparation tester et on observe l'effet sur la sant des rats (mesure par rayons X des piphyses du tibia); test qui ncessite beaucoup de temps (plusieurs semaines) et d'animaux, et, qui, de plus, est peu prcis.

Maintenant la HPLC a largement remplac ce type de test. Exemple: Dosage des tocophrols dans les huiles et graisses par HPLC

Chromatogramme en HPLC dune huile de germe de bl (MSDA chapitre 62) 1 -tocophrol actate; 2 -tocophrol; 3 -tocotrinol; 4 -tocophrol 5 -tocophrol; 6 -tocophrol. Les pics des - et -tocophrols ont t augments par un ajout de ces isomres. En outre, l -tocophrol actate qui ne se trouve pas dans lhuile de germe de bl, a t ajout. Conditions: colonne LiChrosorb Si 60, 7 m luant: n-hexane/dioxane (97 + 3) dtecteur de fluorescence

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6.7 Dosages particuliers - Dosage de lalcool : par distillation et densitomtrie (au moyen dun frquence-mtre). - Dosage de lacide actique : par distillation et titration acide-base. - Dosage des sucres-alcool (polyols) : par HPLC. 6.8. Calcul de la valeur nergtique des denres alimentaires Deux principes sont la base le lvaluation de la valeur nutritive calorique (ou nergtique) dune denre: - Toute partie digestible d'un aliment fournit, aprs son assimilation dans l'organisme, un nombre de calories en rapport avec la quantit ingre. - Les constituants principaux des aliments (protines, graisses, hydrates de carbone) peuvent gnralement se substituer les uns aux autres (loi de l'isodynamie) il s'ensuit que le nombre total de calories d'une denre s'obtient directement par addition des valeurs caloriques des diffrents nutriments. Le pouvoir nergtique calorifique des diffrents nutriments a t mesur exprimentalement dans les meilleures conditions. A partir de ces valeurs exprimentales, des valeurs moyennes ont t fixes pour chaque nutriment. Valeurs caloriques moyennes protines lipides glucides (assimilables) polyols (sucres alcools) alcool (thanol) acides organiques polydextroses, inuline 4 kcal/g (17 kJ) 9 kcal/g (37 kJ) 4 kcal/g (17 kJ) 2,4 kcal/g (10 kJ) 7 kcal/g (29 kJ) 3 kcal/l (13 kJ) 1 kcal/g (4 kJ/g)

Calcul de la valeur nergtique d'une denre - Dterminer les teneurs en: - eau [ou indirectement matire sche (dessiccation)] - protines brutes (protides) - matire grasse totale (lipides) - cendres - ventuellement, fibres alimentaires - ventuellement, acides organiques, alcool et polyols - Calculer la teneur en glucides par diffrence: glucides = 100 - (eau, lipides, protines, cendres, vtl. fibres polyols, acides et alcool) - Calcul de la valeur nergtique multiplier les teneurs de chaque composants (en g) par les valeurs caloriques moyennes (en kcal ou kJ) et faire la somme. La valeur nutritive calorique (ou nergtique) est donne en kcal/100 g ou 100 ml de denres ou en kJ/100 g ou 100 ml.
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