Glucosinolatos en Maca Peruvian

BI OT E C N O L OG A Y M E T AB O LI T O S SE CU N D A R I O S E N peruvianum Chacn. MACA Angela Renee Arias Ramrez.
Derechos reservados conforme a Ley
Lepidium
CAPITULO III ANTECEDENTES

III.1.- DESCRIPCIN DE LA PLANTA.El gnero Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en prcticamente todos los continentes, excepto la Antrtida, siendo uno de los ms grandes dentro de las crucferas. Las especies de Amrica del Norte, Australia y Europa han sido estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las especies endmicas Andinas (Quiros 1999).
Gloria Chacn (1990) menciona que en el Per, de acuerdo a Ferreira (1986), existan 11 especies clasificadas del gnero Lepidium a la que agrega Lepidium peruvianum Chacn como una nueva especie. De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue domesticada hace cerca de 2000 aos en San Blas, Junn. Siendo, segn Bonnier (1986, citado por Chacn 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el Per.
La maca parece haber jugado un papel importante en la economa prehispnica, y durante los primeros cien aos de la colonia form parte de los tributos exigidos por el Encomendador (Chacn, 1990). III.1.1.- CLASIFICACIN TAXONMICA.
DIVISION CLASE SUBCLASE : :
ANGIOSPERMAE DICOTYLEDONEAE ARCHICHLAMYDEAE
Elaboracin y diseo en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM

Lepidium
ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE
: : : :
PAPAVERALES BRASSICACEAE Lepidium Lepidium peruvianum Chacn. Sp. Nov. Antes L. meyenii Walp.
NOMBRE COMUN
MACA, MACA-MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA, AYAC WILLKU, GINSENG PERUANO.
III.1. 2.- DESCRIPCIN BOTNICA La maca, segn Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal en la sierra alta, (no se tienen referencias respecto a su comportamiento en menores altitudes) siendo autgama, cleistgama, con una fase reproductiva de 5 meses con una floracin que dura dos meses. Las flores se abren en series sucesivas, presentando cuatro etapas: flor cerrada con anteras sin dehiscencia, flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor abierta con estructuras florales en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales entrando en senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de 8 meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el ensanchamiento de los hipoctilos. El cultivo de estas dos fases se da generalmente entre los meses de setiembre y junio en dos aos consecutivos (Aliaga, 1999).
La raz es napiforme (Beltrn y colb. Citado por Obregn, 1998), descrita como tubrculo hipocotleo por Pias (1994) recibiendo tambin el nombre de hipoctilo (Aliaga 1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), segn Len (1964), ste es un eje carnoso derivado del hipoctilo cuya parte superior

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termina en una superficie plana de la que brotan de 6 a 15 hojas; mientras la inferior es cnica y se alarga en una raz ancha y fuerte con dos reas irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.
Los colores de maca ms frecuentes son: amarillo, morado, medio morado (la parte superior morada y la inferior blanca) y negro (Len, 1964) pero se pueden encontrar tambin maca de color rosado, crema-morado, amarillonegro, plomo, y raras veces morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por los campesinos y el mercado es el color amarillo (Len, 1964 y Aliaga, 1999).
El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas, compuestas bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimrficas: En la fase vegetativa son grandes (10 15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm) en la fase reproductiva (Tello y colb. 1992 y Aliaga, 1999).
La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Pias 1994), con el eje floral corto. Las flores, pequeas y blancas, son perfectas, con cuatro spalos, cuatro ptalos, 2 estambres frtiles y cuatro estaminodios y un ovario spero bicarpelar y bilocular, con un vulo en cada lculo de placentacin axilar. Su frmula floral es: KC 4 1995).
4A2-4G2
(Len, 1964 y Aliaga,
El fruto es una silcula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides de 2-3 mm de ancho y 4 5 mm de largo (Beltrn y colb. Citado por Obregn, 1998) el color de las semillas vara del amarillo-naranja al marrn oscuro (Aliaga, 1999).

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III.1.3.- NMERO DE CROMOSOMAS
Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8 con 54 56 cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en clulas madres de plantas en floracin, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la maca es un poliploide dismico del nmero cromosmico bsico del gnero: n = 8, siendo as un octoploide: 2n x 8 = 64 cromosomas. III.1.4.- DISTRIBUCIN GEOGRFICA
A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e inclusive en regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden sobrevivir, altitudes que se encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes (National Research Council. 1989); el cultivo de la maca (luego de la colonia), estuvo restringido a los departamentos de Junn y Pasco, en las regiones suni y puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de Junn; a altitudes de 4100 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras localidades de estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.
Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la distribucin del cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el rea de cultivo de la planta disminuy progresivamente hasta que entre 1777 y 1778, Hiplito Ruiz lo circunscribe la regin de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta tendencia se mantuvo hasta la dcada de los ochenta, en la que el rea de cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999). En la dcada de los 90 esta tendencia se revirti al crecer la demanda de la planta, y su cultivo se extendi a otros departamentos del Per, de tal manera que actualmente la maca se est cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Hunuco y Apurmac (Aliaga, 1999).

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III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL
La maca es la nica especie del gnero Lepidium cuya raz es utilizada como alimento, aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras (National Research Council. 1989), adems, dentro de los tubrculos y races andinos, es una de las especies con mayor valor alimenticio; con un alto contenido de aminocidos esenciales, comparables con los recomendados por la FAO OMS, siendo altos sus valores de lisina, tirosina y fenilalanina. La fraccin grasa es rica en cido linoleico utilizado por el organismo para la biosntesis de cidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de minerales de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver apndice) III.2.- METABOLITOS SECUNDARIOS.
Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no tienen una funcin reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiolgicos fundamentales de los organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).
Entre las funciones que cumplen estos metabolitos estn: proteger la planta d e l o s d e p r e d a d o r e s , c o m p e t i r v entajosamente con otras plantas, atraer polinizadores y simbiontes y brindarles proteccin contra diferentes tipos de estrs a los que se vean sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991). Las evidencias de una estricta regulacin metablica de estos productos nos indicara que cumplen un rol importante en la sobrevivencia de las plantas

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III.2.1.- GLUCOSINOLATOS.
Los glucosinolatos son una clase tioglucsidos
restringidos a las
dicotiledneas limitados a pocas familias y en algunos casos a ciertos gneros y especies (Kjaer, 1973), los que son almacenados en diferentes tejidos de la planta, siendo una fuente significativa del contenido de azufre y minerales de la planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981), se encuentran en muchos cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la mirosinasa, conforman un sistema que define fitoqumicamente al orden de las Capparales (Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en m u c h a s b r a s s i c a c e a s e conmicamente importantes, como la mostaza, calabazas, brcoli, nabo, etc. El dao mecnico, infecciones o ataque de pestes produce, como una respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular que exponen los glucosinolatos almacenados a la accin de las enzimas que los degradan, las mirosinasas, produciendo isotiocianatos, nitrilos,
cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros factores (Fig 1) (Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad de las hojas para herbvoros no especficos como aves y babosas, pero aumenta la susceptibilidad del tejido a insectos especficos como los escarabajos alados, (Mithen y col. 1995)
La primera revisin de la presencia de glucosinolatos en varias especies fue hecha por Kjaer en 1960, con actualizaciones peridicas (Xenophon y colb., 1981), en 1973, Kjaer puntualiz: entre el vasto nmero de productos secundarios vegetales, aquellos que presentan una distribucin discontinua junto con un llamado inmediato a los sentidos humanos (olor, sabor, color) han adquirido, por razones obvias, una posicin prominente en discusiones acerca de los mritos de tales productos para propsitos de clasificacin y, ms fundamentalmente, consideraciones filogenticas. Los glucosinolatos ........

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constituyen un grupo con algunas de las caractersticas anteriores........ La complejidad sistemtica de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por ejemplo dentro de Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la posicin biolgica e importancia de este grupo de constituyentes vegetales qumicamente bien definido y en constante crecimiento.
Hace ya varias dcadas, se ha deseado reducir el c ontenido de tioglucsidos en Brassicceas mediante mtodos de cultivo, pues la presencia de algunos de ellos son indeseables por algunos efectos txicos de los productos de su degradacin (Josefsson, 1967), tales como nitrilos, isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas (Bones y Rossiter, 1996), as como por su sabor; mientras que otros vienen siendo estudiados por sus propiedades teraputicas. Actualmente, la concentracin de glucosinolatos puede ser manipulada genticamente, disminuyndola para mejorar la palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o, aumentndola como se trata de hacer en brcoli con el glucosinolato glu co ra f a n ina , que a l h id ro liza rse f orm a su lf u rof an o con a ct ivid a d anticancergena (Quiros, 1999). Las especies del gnero Lepidium son usualmente ricas en bencil isotiocianatos (Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs (1981), sugiere que las propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los productos de los glucosinolatos de maca, los isotiocianatos aromticos, bencilisotiocianato y el p-metoxibencil isotiocianato, el ltimo de los cuales tambin se encuentra en mashua.
Qumicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen el mismo ncleo el cual consiste en un tioglucsido unido al carbn de una oxima sulfonada y un grupo funcional R que deriva de aminocidos siendo ste

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el carcter variable (Bones y Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la actividad biolgica del glucosinolato al determinar la naturaleza de los productos resultantes del dao de los tejidos de la planta, (Mithen y colb., 1 995). La naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los glucosinolatos aromticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los alifticos (bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades cidas, por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por un catin, la glucosa y sus formas aninicas, los hacen compuestos no voltiles e hidroflicos, se han identificado ms de 100 glucosinolatos; todos ellos se diferencian slo en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran nmero de glucosinolatos, se usan nombres semisistemticos, en los que el nombre de la cadena R es seguido por el sufijo glucosinolato, Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los - aminocidos, Valina, Alanina, Leucina, Isoleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer, 1973), en una serie de reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el carbn se transforma en el carbn central del glucosinolato (Larsen, 1981), aunque solo siete corresponden a aminocidos proteicos (antes mencionados), los restantes derivan de modificaciones de la cadena lateral, que probablemente a nivel de glucosinolato o derivan de aminocidos no proteicos (Chapple, y colb., 1994 y Larsen, 1981).
Para el aislamiento y anlisis de los glucosinolatos se han desarrollado muchas tcnicas, como la cromatografa en papel Kjaer 1970, cromatografa de capa fina, cromatografa de gases, adems de procesos que involucra el estudio de los productos de la degradacin enzimtica, aunque la gran variabilidad de los productos de la degradacin enzimtica pueden causar resultados errneos, (Larsen, 1981).

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El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la produccin de -D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que nuevamente pueden ser descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)
Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en vacuolas celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes ricas en glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas an no se ha definido su localizacin celular (Rodman, 1981).
Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificacin de crucferas de Argelia, de acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el gnero Isatis y reubicando el gnero Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el valor taxonmico de estos compuestos. III.2.1.1.- EL SISTEMA MIROSINASA GLUCOSINOLATO Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas estn invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer, 1973), as, sin excepcin conocida, los glucosinolatos estn acompaados en la planta por esta enzima. Las mirosinasas se encuentran en idioblastos especializados ricos en protenas llamados clulas de mirosina (Rodman, 1981) que se encuentran en el tejido parenquimtico (Bonnes y Rossiter, 1996), stos se tien de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn, 1979; citado por Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran separados hasta que se produce dao tisular o autolisis, generando durante la masticacin los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).
Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza, (Kjaer, 1968) posteriormente fue encontrado en todas las Brassicceas, y en la

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familias Caparaceae, Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se ha encontrado en los hongos Aspergillus sydowi y Aspergillus niger , en la bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de mamferos y en los fidos que atacan crucferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae. Pero estas enzimas parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones y Rossiter, 1996). S Glu RC NOSO3 H2O R C mirosinasa S + NOSO3 D - Glu
Isotiocianatos
nitrilos
cianoepitioalcanos
tiocianato
FIG. 1.- Hidrlisis de los glucosinolatos por la mirosinasa. (Fuente: Bonnes y Rossiter. 1996. The Myrosinase Glucosinolate System, its Organization and Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208 )
La degradacin de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede producir: a) isocianatos, cuando la hidrlisis se produce en un pH normal; b) nitrilos, cuando la hidrlisis ocurre a pH cido; c) cianoepitioalcanos, cuando la mirosinasa se presenta con una pequea protena conocida como protena epitioespecificadora; d) tiocianatos, que son producidos solo por tres de los glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl, bencil, y 4 (metiltio)butilglucosinolatos.

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MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel separando varias isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de Rhoeadales, cada especie tenia un patrn diferente con 1 a 4 bandas. Tambin encontraron que este patrn variaba de acuerdo a la parte de la planta de la cual se hicieran los extractos.
Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrn de estas enzimas puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino tambin de acuerdo al rgano y edad de la planta, pero se sabe poco de la razn fisiolgica de esta diferencia.(Bonnes y Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas particulares corresponden a condiciones endgenas encontradas en las plantas, o al organismo blanco o a los glucosinolatos que predominan en el tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996). III.2.2.- ALCALOIDES Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos secundarios de molculas no relacionadas entre s, siendo de gran importancia econmica debido a sus propiedades farmacolgicas, las mismas que han sido usadas desde la prehistoria hasta la actualidad. Son los metabolitos mas frecuentes en el reino vegetal, habindose encontrado cerca de 10,000 alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con f lores, principalmente dicotiledneas herbceas (Hopkins, 1999).
Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias bsicas con uno o ms tomos de nitrgeno en su sistema cclico, que manifiestan actividad farmacolgica (Lock, 1994)
La mayora de los alcaloides provienen del metabolismo de los aminocidos, principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque

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algunos alcaloides se encuentran en varios gneros o an en una familia, la mayora de las especies presentan un patrn nico, genticamente determinado. Por otro lado su distribucin est restringida a determinados rganos de la planta, como races, hojas o frutos jvenes (Hopkins, 1999).
No se ha determinado an cual es la funcin de los alcaloides en la planta, aunque se le asignan rol defensivo, debido a que la mayora son amargos, lo cual es considerado universalmente como un carcter repelente. Todos son biolgicamente activos, muchos significativamente txicos y otros con propiedades antibiticas. Frecuentemente los tejidos que acumulan alcaloides son los ms vulnerables, o son tejidos perifricos que pueden ser atacados por herbvoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de las plantas no contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los organismos vivientes (Lock, 1994).
Para la extraccin de alcaloides se aprovecha su carcter bsico, utilizando soluciones acuosas o alcohlicas ligeramente cidas, para obtener el extracto crudo de alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de amoniaco y carbonato de sodio, para extraerlos luego con solventes orgnicos.(Lock, 1994)
Las tcnicas de separacin de alcaloides ms comunes son la cromatografa de capa fina o delgada aunque en los noventa se generaliz el uso de Sephadex LH-20 por elucin y la cromatografa lquida de alta perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son muy variado s y el agente revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya aplicacin produce manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).
La Dra. Gloria Chacn, (1961, 1990) demostr la presencia de alcaloides


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en Lepidium peruvianum, para demostrar la accin fecundadora del extracto alcaloideo de maca, lo inocul en ratas obteniendo una marcada estimulacin de la maduracin los folculos de Graaf y engrosamiento del endometrio. Posteriormente Yllesca, (1994), en un estudio fitoqumico de la planta encontr 3 alcaloides en los extractos metanlico y butanlico de maca de los ecotipos amarillo, rojo y negro. En 1993, Garr y col. obtuvieron cuatro fracciones de alcaloides por cromatografa de capa fina. Por otro lado Dini y colb., (1994), detectaron por cromatografa de capa fina de un extracto alcalino de polvo de maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff. Sin embargo la presencia de alcaloides en maca an es discutida y no se ha determinado su estructura. III.3.- CULTIVO DE TEJIDOS
El cultivo de tejidos como tcnica consiste en aislar una porcin de planta y proporcionarle las condiciones apropiadas para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas tcnicas mediante las cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se cultiva aspticamente en un medio de composicin definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. (Roca y Mroginski, 1991).
Los principios de esta tcnica estn contenidos en la teora celular de Schleiden y Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la clula es capaz de tener autonoma y totipotencia, lo que fue demostrado en clulas somticas con la observacin de la formacin y cicatrizacin de callos en reas donde la planta sufre cortes (Gautheret, 1982).
Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron realizados por el botnico alemn G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret

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1982), quien trabaj con clulas de palizada, pelos glandulares y pelos de estambres de Tradescantia; pero aunque logr que las clulas sobrevivieran entre 20 a 27 das, no tuvo crecimiento celular, probablemente debido a que eligi nutrientes relativamente simples y a que eligi clulas altamente diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recin en 1934, mucho despus que en 1912 Carrel diseara el mtodo para cultivar clulas animales; que Gautheret logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de races de tomate (Dodds y Roberts 1982).
Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formacin de callos indiferenciados, que podan crecer ilimitadamente a travs de subcultivos, por lo que se puso mucho nfasis en la determinacin de los requerimientos nutricionales para el crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para entonces ya se haba descubierto la auxina IAA (Went, 1926, citado por Gautheret, 1982) y en las dcadas siguientes se estudiaron diversas sustancias que favorecan el crecimiento celular de los tejidos cultivados in vitro (Gautheret 1982) se descubri la kinetina y otras hormonas que recibieron el nombre de citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962, Murashigue y Skoog propusieron una solucin de minerales asociada a auxinas y citoquininas que permite el crecimiento de la mayora de tejidos (Gautheret 1982).
Tambin se inici una serie de estudios en organognesis e histognesis, que sentaron las bases de la micropropagacin cuando Ball en 1946 descubri el principio de la propagacin vegetativa determinando cuales eran los tipos de meristemos que eran capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel aplic estos principios en la propagacin clonal de orqudeas. (Gautheret 1982).

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Muir (1953 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontr que los callos que eran trasladados a un medio lquido se convertan en suspensiones celulares, desarrollndose luego muchas tcnicas de cultivo de clulas aisladas y de otro tipo de cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y cultivo de protoplastos y otros. (Dodds y Roberts 1982).
Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:
a) Estudios bsicos de fisiologa, gentica, bioqumica y ciencias afines. b) Bioconversin y produccin de compuestos tiles. c) Incremento de la variabilidad gentica. d) Obtencin de plantas libres de patgenos. e) Propagacin de plantas. f) Conservacin e intercambio de germoplasma. III.3.1.- CULTIVO DE CALLOS El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante usado, y la eleccin de ste depender del objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Para la obtencin de callos se puede utilizar cualquier tipo de explante que contenga clulas nucleadas, y ste se seleccionar en funcin a razones prcticas como disponibilidad, facilidad de manipulacin,
homogeneidad, baja contaminacin, respuesta in vitro; esta respuesta puede variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad ontognica y tamao del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de incubacin empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa amorfa desdiferenciada de clulas parenquimticas de pared delgada (Dodds y Roberts 1982), y sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en otros desintegrndose a medida que el callo crece (Nuez y Ochoa, 2000). Este crecimiento depende de la relacin entre la planta de origen, el medio de cultivo,

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las condiciones ambientales y
el tiempo de incubacin; algunos callos crecen
fuertemente lignificados y de textura dura, mientras otros se rompen fcilmente en pequeos fragmentos, estos callos son llamados friables (Dodds y Roberts, 1995), estos callos son los mejores para la iniciacin de cultivos celulares.
El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en tres fases de desarrollo: Induccin, en la que el metabolismo es estimulado antes de la mitosis; divisin celular en el que las clulas del explante revierten a un estado meristemtico; y por ultimo diferenciacin celular y expresin de algunas vas metablicas que llevan a la formacin de metabolitos secundarios (Dodds y Roberts, 1995).
La formacin de callos en plantas intactas, normalmente est controlada por hormonas endgenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su induccin in vitro en explantes vegetales sin causar estrs, depende de la introduccin de reguladores de crecimientos en el medio de cultivo (Nuez y Ochoa, 2000).
Los otros factores ms importantes para el xito de esta tecnologa son: e l e xplante y el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y opcionales que contenga. Los nutrientes esenciales consisten en las sales inorgnicas, fuentes de carbono y energa, vitaminas y fitohormonas (Gamborg y Shyluk, 1981). Otros componentes como compuestos nitrogenados, cidos orgnicos y sustancias complejas pueden ser importantes pero son opcionales. Despus de que el callo ha crecido por un tiempo en asociacin con el tejido original, es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en el mismo medio por un tiempo prolongado lleva al agotamiento de los

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nutrientes, la gradual desecacin del agente gelificante y a la acumulacin de metabolito que pueden resultar txicos para el callo (Dodds y Roberts, 1995).
Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis semanas, con cultivos mantenidos en medio agar a 25C o ms, pero en realidad este tiempo vara con la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts, 1995).
Carhuaz en 1997 (comunicacin personal),
indujo callos en maca,
utilizando un factorial de cuatro citoquininas (BAP, KIN, ZEA y 2ip) y cuatro auxinas (IIA, IBA, NAA y 2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 M, concluyendo que el 2,4-D en el rango de 0.1 10.0 M el regulador ms efectivo para promover la formacin de callos, coincidiendo con Gamborg y colb. (1981), quienes indican un rango ptimo de 1- 5 M para la accin del 2,4-D y con Flick y colb. (1983), que tambin sealan al 2,4-D y a la kinetina como los reguladores ms efectivos para la induccin de callos en Brassicceas. III.3.2.- HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO Se llama h orm ona o f it oho rmona a a quellas sustancias orgnicas naturales que a bajas concentraciones ejercen una profunda influencia en los procesos fisiolgicos de la planta (Hopkins, 1999), mientras que las sustancias sintticas con las mismas propiedades son llamadas reguladores de crecimiento, y no son consideradas como hormonas vegetales (Dodds y Roberts, 1995).
Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas, cido abscico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son las mas usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con poca frecuencia y generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual

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modo el cido abscico y el etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y Roberts, 1995).
En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies econmicamente importantes, en muchas de ellas se han inducido callos, incluyendo a Brassica oleracea, B. napus y Arabidopsis thaliana, los
requerimientos para inducir callos en esta familia pueden ser cubiertos con m u cha s ho rmo n a s, co n u n a mp lio ra ngo d e con ce nt ra cio n e s, e sta s concentraciones y la hormona a ser elegida, as como la respuesta de crecimiento vara con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se utiliza una auxina y una citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las citoquininas la ms usada es la Kinetina, mientras que la auxina utilizada con ms frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relacin auxina:citoquinina ms eficiente para la induccin de callos es de 1 (Flick y colb. (1983). III.3.2.1- AUXINAS Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por primera vez por Went en 1926, quien describi la accin elongadora del IAA en coleptidos de avena. Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las cuales la ms usada en cultivo de tejidos es el IAA, y otras sintticas o reguladores de crecimiento de las cuales las ms usadas son el 2,4-D, el NAA y el IBA (Krikorian, 1991).
Los efectos de las auxinas ms importantes para el cultivo de tejidos son el crecimiento celular y la elongacin celular. Algunos tejidos slo forman callos en respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas concentraciones de auxina para la iniciacin del callo, aunque en el caso del 2,4D, se ha observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro.

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Este regulador es la auxina ms efectiva para la proliferacin de callos usndose a concentraciones de 10

-7
10
-5
M y an en ausencia de una
citoquinina exgena (Yeoman y Forche, 1980).
Adems de inducir la proliferacin celular, el 2,4-D tiende a suprimir la morfognesis del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de diferenciacin (Yeoman y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea mas estudiada, la auxina mas usada en la obtencin de callos en diferentes explantes es el 2,4-D, sea junto a una citoquinina o a leche de coco (Morris y Altmann, 1994). III.3.2.2.- CITOCININAS En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la promocin de la citocinesis, el que se formaba por la descomposicin parcial de ADN, llamndolo cinetina (Kinetina, KIN) y propusieron el trmino cinina para denominar las sustancias naturales y sintticas que presentaban el mismo tipo de actividad biolgica. Posteriormente para evitar confusiones con la sustancia usada en cultivo de tejidos animales, se opt por el nombre citocinina para estas sustancias (Krikorian, 1991).
Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la divisin celular en el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la divisin celular sincrnica a las 18 h (Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la formacin de brotes e inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).
Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo compuestos sintticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y Roberts, 1995).

Lepidium
Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, as algunos cultivos no requieren de una auxina exgena y otros requieren de una auxina y no de una citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado adems que en todos los casos las citoquininas a altas concentraciones (10 25 mg/l) inhiben la formacin de callos (Yeoman y Forche, 1980). En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicacin personal) utiliz un factorial de medios con cuatro auxinas (IAA, IBA, NAA, y 2,4-D) y cuatro citoquininas ( BAP, KIN, ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100 M, utilizando como explantes, la raz, hoja, peciolo e hipoctilo.
III.3.3.- EL EXPLANTE
Los requerimientos hormonales para la iniciacin del callo dependen del origen del tejido aislado (explante), los explantes que contienen clulas del cambium pueden formar callos sin adicin de reguladores de crecimiento; pero la mayora de los explantes requiere de uno o ms reguladores de crecimiento para iniciar la formacin de callos (Dodds y Roberts, 1995). Esta respuesta tambin depende del estado fisiolgico del tejido y del tiempo de escisin, (Yeoman y Forche, 1980).
Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos exgenos de la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y citoquininas 4) extractos naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995). III.3.4.- CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos secundarios, pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a

Lepidium
programas
intensivos de mejoramiento gentico y se presentan adems
problemas tcnicos y econmicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995).
El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos secundarios cuya extraccin a partir de las plantas que los producen puede resultar difcil o econmicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera necesario, por el riesgo de sobreexplotacin al que se expone el cultivo; por las pequeas cantidades de compuesto presente en la planta o por los controles a los que se someten a las plantas productoras (Robert y colb., 1991). Por otro lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar el cultivo de estas plantas (Dodds y Roberts, 1995).
La nocin de que una lnea celular altamente productiva poda ser seleccionada para generar compuestos tiles fue introducida en la dcada de 1970, en la dcada de los ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en cooperacin con la industria privada, produjeron shikonina de Lithospermum erythrorhyzon y saponinas de ginseng respectivamente (Hara, 1996).
La produccin de shikonina, un pigmento que se extrae de las races de la planta asitica Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del uso del cultivo de tejidos vegetales en la produccin de metabolitos secundarios. En la planta el rendimiento de shikonina, adems de ser muy bajo, depende de la distribucin geogrfica y el clima, habiendo sufrido una rpida disminucin en su poblacin. Luego de establecer una estrategia de produccin in vitro, la empresa petroqumica Mitsui del Japn logr la primera produccin industrial del compuesto, vendiendo a 4000 dlares el kilo de shikonina producida in vitro (Robert y colb., 1991).

Lepidium
En la dcada de los noventa el nmero de compuestos producidos por cultivo de tejidos aument y la mejora de la tecnologa Hara permiti obtener compuestos raros en los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta tecnologa es la produccin comercial, por Kao, de un polisacrido tuberoso usado en cosmticos (Hara, 1996).
Actualmente existen al menos tres programas de bsqueda
de
compuestos con actividad biolgica, llevados a cabo por las industrias farmacuticas, cada ao varios cientos de plantas son colectados y se intenta en ellas la induccin de callos, con un xito de cerca al 50%. Cerca del 10% de los callos muestra alguna forma de actividad ( Schripsema, y colb., 1996).
Todo el proceso desde la coleccin hasta la obtencin de un compuesto puro es estimado entre los 2 y 4 aos. Algunos resultados de estas bsquedas han sido publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los dehidrodiconiferil alcohol glucsidos aislados de cultivos celulares de Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y colb., 1996).
La bsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de reducir el nmero de cultivos de inters, muchas veces el paso de callos a suspensiones celulares representa una reduccin considerable de los niveles de ciertos metabolitos secundarios, ocurriendo algunas veces la prdida completa de productividad para ciertos productos, lo que no significa que los cultivos celulares no sean capaces de producir compuestos de inters, por el contrario, Ruyter y Stckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996) demostraron que los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.
Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la produccin de metabolitos secundarios son las siguientes:

Lepidium
Produccin a escala industrial Produccin de sustancias difciles de obtener por extraccin o por sntesis qumica Reduccin de los costos de produccin a largo plazo Eliminacin de la dependencia en materia de importacin Produccin continua y controlada de sustancias independiente- mente de los factores del medio ambiente. Precios estables Posibilidad de realizar la produccin cerca de las fbricas de procesamiento final y de los mercados.
Se ha estudiado tambin la posibilidad de aumentar significativamente la productividad del cultivo usando un medio de induccin (para la produccin de los metabolitos secundarios) (Becker, 1987).
III.4.- CROMATOGRAFA La cromatografa es la tcnica analtica usada para la separacin de mezclas y sustancias, por adsorcin selectiva ( Microsoft Encarta Online Encyclopedia 2001) y fue descubierta por el botnico ruso Michael Tswett en 1903, quien descubri que los pigmentos de las plantas podan separarse al filtrarlos con ter de petrleo a travs de una columna de carbonato de calcio. Pero el desarrollo de esta tcnica empieza realmente en 1931, cuando, posteriormente otros investigadores introducen otros materiales como las columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).
Actualmente se usa un amplio rango de tcnicas cromatogrficas de acuerdo a los adsorbentes usados, la cromatografa de columna utiliza slica, almina y slica gel; en la cromatografa de capa fina el adsorbente se encuentra

Lepidium
sobre un vidrio o una pelcula plstica, mientras que en la cromatografa de papel, una muestra lquida fluye sobre el papel adsorbente. Otras tcnicas cromatogrficas son: la cromatografa gas-lquida, que permite la separacin de sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografa inica donde un gas puede ser descompuesto en iones que interactan con el adsorbente; la cromatografa de permeacin de gel usa un adsorbente con poros de tamao uniforme, y finalmente, la cromatografa lquida de alto perfomance (HPLC)
donde el adsorbente es lquido, esta tcnica es ampliamente usada actualmente (Microsoft Encarta Online Encyclopedia 2001). III.5.- ELECTROFORESIS EN GEL La electroforesis en gel es un mtodo de separacin, en el que las partculas cargadas migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia de un campo elctrico aplicado externamente. Este movimiento se realiza en interaccin con la matriz circundante, la cual acta como un filtro molec ular, generndose como consecuencia, tasas diferenciales de migracin para las protenas contenidas en una muestra (Garfin, 1990).
Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de papel y acetato de celulosa, y se utilizaron p rincipalmente para separar aminocidos, pptidos y mezclas proteicas mal separadas por cromatografa (Freifelder, 1979), los soportes pueden ser relativamente inertes, como papel, acetato de celulosa, silicagel, almina y celulosa y actuar como tamices moleculares como son los geles de almidn, agarosa y poliacrilamida (Hames, 1981, citado por Glvez, 1990). El mtodo ms utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), por proporcionar un tamao de poro controlable, ser repetible y de alta resolucin (Garfin, 1990).

Lepidium
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin del monmero de acrilamida y un co- monmero de ligamiento cruzado, la N,N -metilenbisacrilamida. Esta polimerizacin es catalizada por un sistema generador de radicales libres, compuesto por persulfato de amonio, que acta como iniciador, y un acelerador, el tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formacin de radicales libres a partir del persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la polimerizacin del gel (Garfin, 1990). Otro agente donante de radicales libres es la riboflavina, pero a diferencia del persulfato de amonio requiere de luz y oxgeno, agentes que convierten la convierten a su forma leuco, la cual inicia la polimerizacin (Glvez, 1990).
Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la acrilamida y la bisacrilamida, y su tamao disminuye a medida que la concentracin de acrilamida aumenta, determinando sus propiedades como tamiz.
La separacin por electroforesis en gel esta basada en los tamaos, formas y cargas netas de las macromolculas, los sistemas diseados para protenas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas de protenas; pero no para medir la pureza de una preparacin o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre los efectos del tamao, forma y carga en la movilidad electrofortica, debido a que protenas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante (SDS PAGE)(Garfin, 1990).
La separacin por electroforesis en gel esta basada en los tamaos, formas y cargas netas de las macromolculas, los sistemas diseados para protenas nativas se utilizan principalmente para separar y categorizar mezclas

Lepidium
de protenas; pero no para medir la pureza de una preparacin o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos sistemas no diferencian entre los efectos del tamao, forma y carga en la movilidad electrofortica, debido a que protenas con diferentes pesos moleculares pueden tener la misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante (Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes inicos como el SDS (sodium dodecyl sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la protena de tal forma que las protenas migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este caso deben ser tratadas con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Glvez, 1990).
El mtodo ms popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en 1970 (Garfin, 1990), el cual consiste en un mtodo discontinuo con dos tipos de geles: un gel de separacin y uno de concentra cin, ambos geles tienen diferentes porosidades y pH, sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo, donde la muestra se apila antes de pasar al gel de separacin que se halla inmediatamente debajo y que posee un tamao de poro ms pequeo. Adems, se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos, esta discontinuidad permite concentrar grandes volmenes de muestra en el gel de concentracin, resultando en una mejor resolucin (Laemmli, 1970).

Glucosinolatos en Maca Peruvian

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BI OT E C N O L OG A Y M E T AB O LI T O S SE CU N D A R I O S E N peruvianum Chacn. MACA Angela Renee Arias Ramrez.

Derechos reservados conforme a Ley

CAPITULO III ANTECEDENTES

DIVISION CLASE SUBCLASE : :

ANGIOSPERMAE DICOTYLEDONEAE ARCHICHLAMYDEAE

BI OT E C N O L OG A Y M E T AB O LI T O S SE CU N D A R I O S E N peruvianum Chacn. MACA Angela Renee Arias Ramrez.

ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE

MACA, MACA-MACA, MAINO, AYAK CHICHIRA, AYAC WILLKU, GINSENG PERUANO.

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(Len, 1964 y Aliaga,

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III.1.3.- NMERO DE CROMOSOMAS

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III.1.5.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL

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Los glucosinolatos son una clase tioglucsidos

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La Dra. Gloria Chacn, (1961, 1990) demostr la presencia de alcaloides

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Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:

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las condiciones ambientales y

el tiempo de incubacin; algunos callos crecen

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Carhuaz en 1997 (comunicacin personal),

indujo callos en maca,

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Este regulador es la auxina ms efectiva para la proliferacin de callos usndose a concentraciones de 10

citoquinina exgena (Yeoman y Forche, 1980).

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intensivos de mejoramiento gentico y se presentan adems

problemas tcnicos y econmicos para su cultivo (Dodds y Roberts, 1995).

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Actualmente existen al menos tres programas de bsqueda

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