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Formation du Dimanche 23 novembre 2008

Assurance qualit et performance des milieux de culture : exigences de la norme ISO 11.133-1 et -2 en matire de fabrication et de contrle des milieux de culture et de la verrerie

Objectifs et applications Pratiques et prparation Contrle qualit - Solide Contrle qualit - Solide

Jean-Yves Franois, Quality Partner s.a., Belgique

Objectifs
MILIEU DE CULTURE: mlange de substances, sous forme liquide, semi-liquide ou solide, qui contient des constituants naturels et/ou synthtiques permettant la croissance des microorganismes ou le maintien de leur viabilit Pralable toutes analyses microbiologique Contrles afinde dmontrer Acceptabilit de chaque lot de milieu Milieu rpond au besoin Milieu donne des rsultats constants Applicable : Milieux commerciaux prt lemploi Milieux prpars partir de formules dshydrates commerciales Milieux prpars partir de ses composants individuels

Pratiques
Documentation fournie par le fabricant
Nom du milieu, de ses composants et supplments, et leurs codes produits numro de lot valeur du pH du milieu avant utilisation conditions de stockage et date dexpiration valuation des performances et organismes de contrles utiliss fiche technique certificat de contrle qualit fiche de scurit, si ncessaire Vrification au laboratoire nom du milieu et numro de lot date de rception date dexpiration conditions et intgrits de lemballage

MODULE 1: Hygine

Pratiques
Conservation
Toujours suivre les recommandations du fabricant ! Gestion FEFO nouvelle vrification de ltanchit date de la premire ouverture (< 6 mois) valuation visuelle (couleur (couleur, prise en masse masse, homognit) Milieux prpars 3 mois 5 2 C 1 mois 18 23 C A labri de la lumire et de la dessication sauf spcifications contraires

Pratiques
Conservation
Toujours suivre les recommandations du fabricant ! Gestion FEFO nouvelle vrification de ltanchit date de la premire ouverture (< 6 mois) valuation visuelle (couleur (couleur, prise en masse masse, homognit) Milieux prpars 3 mois 5 2 C 1 mois 18 23 C A labri de la lumire et de la dessication sauf spcifications contraires

Prparation
Traabilit
Peses de chaque composant date de prparation conditions et date de strilisation pH oprateur Eau Eau distille Dchlore avant distillation Matriau inerte Rsistivit > 300 000 Ohm.cm Pauvre en microorganisme Pese Prcision 2 % Protection contre les inhalations Ajout progressif de leau

MODULE 1: Hygine

Prparation
Dissolution
Agitation nergique intervalle rgulier Avant chauffage (surtout glose) Mesure et ajustement du pH Aprs strilisation Milieu 25 C Correction laide de NaOH ou HCL 1N Sans modifier le volume final du milieu Rpartition Prcision 2 %, si ncessaire Rcipient = 1,2 3 fois le volume du milieu

Prparation
Strilisation
Chaleur humide 121 C, 15 min barme adapt en fonction de la charge ! Surchauffe ! Vrification (sonde externe ou papier ractif) Filtration 0,22 m sous vide ou sous pression Filtre strilis

Contrle qualit
Physique
pH mesur 25 C quantit rpartie et/ou paisseur du milieu couleur clart, prsence de dfaut optique stabilit du gel gel, consistance consistance, humidit Microbiologique Strilit Fertilit partir de souches de test de diffrents types Souches robustes montrant des caractres positifs typiques Souches positives poussant faiblement (plus sensible) Souches non ractives Souches inhibes

MODULE 1: Hygine

Contrle qualit - Fertilit


Fertilit - Croissance
3 mthodes Quantitative
Semi-quantitative Qualitative

Photo Modle enregist

Points valuer
Productivit Slectivit Spcificit

Microorganismes pour essais


Souce de rfrence : issue dune collection nationale ou internationale OU souche isole au laboratoire dfinie au moins par son genre et son espce ainsi que par ses caractristiques Stock de rfrence : aliquots obtenus par sous-culture de la souche de rfrence Culture de travail : sous-culture primaire dun aliquot du stock de rfrence

Contrle qualit - Fertilit


Culture de travail
Culture pure En bouillon non slectif En phase stationnaire Inoculum pour essais de productivit Quantitatifs : 102 cfu
Semi-quantitatifs et qualitatifs : 103 104 cfu Milieu liquide : 10 102 cfu

Inoculum pour essais en slectivit


104 106 cfu

Contrle qualit Fertilit (solide)


Mthode quantitative - mthode
Etaler linoculum la surface du milieu tester et du milieu de rfrence (TSA ou TSG) Incuber les botes (selon leur usage) Compter les botes Calculer PR et SF
avec NS = nombre de colonies obtenu sur le milieu de culture tester N0 = nombre de colonies obtenu sur le milieu de culture de rfrence

PR = N S / N 0

avec D0 = dilution la plus leve prsentant une croissance dau moins 10 colonies sur le milieu de rfrence DS = dilution la plus leve prsentant une croissance comparable sur le milieu test

SF = D0-DS

MODULE 1: Hygine

Contrle qualit Fertilit (solide)


Mthode quantitative - interprtation
Souche dsire PR > 0,1 Souche non dsire SF 2

Contrle qualit Fertilit (solide)


Mthode semi-quantitative (comtrie) - mthode
Ensemencement en strie lanse de 1 l (milieu tester et milieu de rfrence) Calcul de lindice GI = nombre de stries prsentes

Contrle qualit Fertilit (solide)


Mthode semi-quantitative (comtrie) - interprtation
Souche dsire
GI 6

Souche non dsire


GI 1

MODULE 1: Hygine

Contrle qualit Fertilit (solide)


Mthode qualitative - mthode
Ensemencement en ligne lanse de 1 l (milieu tester et milieu de rfrence) Incubation Evaluation de la croissance 0 = pas de croissance 1 = faible croissance 2 = bonne croissance

Contrle qualit Fertilit (solide)


Mthode qualitative - interprtation
Souche dsire
2

Souche non dsire


0 ou 1

Contrle qualit Fertilit (liquide)


Mthode quantitative - mthode
Ensemencement dun tube de milieu tester et dun tube de milieu de rfrence (TSB, Thio) par microorganisme test organisme dsir : 10-102 cfu organisme non dsir : > 104 cfu Incubation Dnombrement sur glose non slective Calculer PR et SF
PR = NS / N0
avec NS = nombre de colonies obtenu sur le milieu de culture tester N0 = nombre de colonies obtenu sur le milieu de culture de rfrence

SF = D0-DS
avec D0 = dilution la plus leve prsentant une croissance dau moins 10 colonies sur le milieu de rfrence DS = dilution la plus leve prsentant une croissance comparable sur le milieu test

MODULE 1: Hygine

Contrle qualit Fertilit (liquide)


Mthode quantitative - Interprtation
Souche dsire
PR 0,1 Dnombrement 106 cfu/ml

Souche non dsire


SF 2 Dnombrement 104 cfu/ml

Contrle qualit Fertilit (liquide)


Mthode semi-quantitative - Mthode
Ensemencement dun tube de milieu tester avec un mlange des souches (tube 1) organisme dsir : 10-102 cfu organisme non dsir : > 104 cfu Ensemencement dun tube de milieu tester avec une souche (tube 2) organisme non dsir : > 104 cfu Incubation Etalement de 10 l du tube 1 sur milieu spcifique Etalement de 10 l du tube 2 sur milieu non spcifique Incubation des botes Lecture

Contrle qualit Fertilit (liquide)


Mthode semi-quantitative - Interprtation
Souche dsire > 10 cfu isole Souche non dsire < 10 cfu isole

MODULE 1: Hygine

Contrle qualit Fertilit (liquide)


Mthode qualitative - mthode
Ne convient pas au milieu trouble Ensemencer un tube laide dune anse de 1 l Incubation Lecture du trouble apparu dans le milieu 0 = turbidit nulle 1 = turbidit trs faible (< 0,5 McFarland) 2 = turbidit marque (> 0,5 McFarland)

Contrle qualit Fertilit (liquide)


Mthode qualitative - interprtation
Souche dsire 2 Souche non dsire 0 ou 1

Contrle qualit
Anomalies
Pas de solidification de la glose Surchauffage du milieu pendant sa prparation
Faible pH caus par une hydrolyse acide Mauvaise concentration dagar Agar partiellement dissoute Mauvais mlange des composants

pH incorrect Surchauffage du milieu pendant sa prparation


Mauvaise qualit de leau Contamination chimique externe Mesure du pH une mauvaise T Calibration incorrecte du pH-mtre Mauvaise qualit du milieu dshydrat

MODULE 1: Hygine

Contrle qualit
Anomalies (suite)
Couleur anormale Surchauffage du milieu pendant sa prparation
Mauvaise qualit de leau Mauvaise qualit du milieu dshydrat Mauvais pH Contamination externe

Formation de prcipits Surchauffage du milieu pendant sa prparation


Mauvaise qualit de leau Mauvaise qualit du milieu dshydrat Mauvais pH Milieu inhibant Surchauffage du milieu pendant sa prparation Mauvaise qualit du milieu dshydrat Mauvaise qualit de leau Mauvaise composition (vrifier les peses)

Contrle qualit
Anomalies (fin)
Faible slectivit Surchauffage du milieu pendant sa prparation
Mauvaise qualit du milieu dshydrat Mauvaise composition (vrifier les peses) Mauvaise supplmentation (quantit ou temprature)

Merci de votre attention,

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MODULE 1: Hygine