UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUMICA E DE ALIMENTOS DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II ALUNA: BEATRIZ SANTOS

DA SILVA - 11111219

ANLISE MICROBIOLGICA DE LEITE PASTEURIZADO TIPO B

Relatrio apresentado disciplina de Laboratrio Microbiologia de Alimentos II do Departamento Tecnolgico de Qumica e Alimentos. Professora Dr: Janeeyre Ferreira Maciel.

Joo Pessoa Paraba Janeiro de 2013

1. INTRODUO O leite considerado um dos alimentos mais completos, devido ao seu alto teor de protenas e sais minerais, alm de outras caractersticas. Porm, devido a sua riqueza em nutrientes, torna-o susceptvel ao ataque de um grande nmero de microrganismos, provenientes do prprio animal, do homem, assim como tambm dos utenslios usados no momento da ordenha (Leite et al., 2000; Pietrowski et al., 2008). Recebendo, por este motivo, grande ateno dos pesquisadores e autoridades ligadas rea de sade e tecnologia de alimentos, principalmente pelos riscos de veiculao de microrganismos patognicos e deterioradores (MACIEL, 2003). Sabendo-se que o leite no deve ser consumido cru, a Instruo Normativa n63, de 29 de dezembro de 2011 foi criada para estabelecer os padres para o leite pasteurizado. A pasteurizao destri os microrganismos patognicos, porm no recupera um leite de m qualidade, permanecendo uma microbiota vivel de 0,1 a 0,5 % da contagem inicial. Assim, quanto maior a contaminao microbiana antes da pasteurizao, tanto maior ser sua microbiota residual (Oliveira et al., 2006). Apesar de muito eficiente, a pasteurizao deve ser considerada um pr-tratamento trmico uma vez que no destri a microbiota patognica completa do leite e o produto final requer outro mtodo de conservao. Para tanto, aps pasteurizado o leite imediatamente refrigerado com o objetivo de destruir estes microrganismos resistentes e aps processado deve ser conservado em baixas temperaturas. O controle microbiolgico em amostras de leite realizado, principalmente, atravs da pesquisa de microrganismos indicadores que, quando presentes, podem fornecer informaes sobre as condies sanitrias da produo, do processamento, ou armazenamento, assim como a possvel presena de patgenos, e estimativa da vida de prateleira do produto. Os principais grupos de microrganismos indicadores de qualidade do leite so os aerbios mesfilos (AM) e os coliformes (FRANCO; LANGRAF, 1996) Essa anlise microbiolgica foi realizada com o objetivo de avaliar a qualidade do leite pasteurizado conhecendo-se os resultados das provas de contagem de mesfilos aerbicos, coliformes totais e coliformes fecais analisando se o leite apresenta carga microbiana dentro dos limites aceitveis para o consumo humano. 2. MATERIAL Uma amostra de leite pasteurizado tipo B adquirida aleatoriamente em supermercado na cidade de Joo Pessoa PB e em seguida transportada para o laboratrio de Microbiologia da Universidade Federal da Paraba, acondicionada em um recipiente isotrmico, onde foi submetida s anlises. Data de fabricao em 01/12/12 e validade para o dia 06/12/12. A anlise foi realizada no dia 04/12/12.

2.1 Preparao da amostra e diluies seriadas Diluente: 225 ml de gua peptonada 0,1% (H2Op) Tubos de diluio com 9,0ml de H2Op/tubo Pipetas de 1,0 ml 2.2 Contagem total de microrganismos aerbios mesfilos em profundidade Placas de Petri estreis vazias Meio de cultura: 200 ml de gar Padro para Contagem (PCA) Estufa incubadora: regulada a 35 C 2.3 Teste Presuntivo Meio de cultura: Tubos (9) contendo 10 ml de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durhan Estufa para incubao: 35 C 2.4 Contagem de Coliformes Totais Meio de cultura: 9 tubos contendo 10 ml de Caldo Verde Brilhante Bile (VB) com tubos de Durhan. 2.5 Contagem de Coliformes Fecais Meio de cultura: 9 tubos (10 ml) com Caldo E.coli (EC) com tubos de Durhan Cepa padro positiva e negativa com 24 horas Banho - maria de temperatura controlada 45,5 C 3. MTODOS 3.1 Preparo da amostra (higienizao e diluio) Primeiramente a embalagem do leite foi lavada com gua e detergente, depois foi realizada a higienizao da rea externa com etanol 70%, para retirada das impurezas presentes. A amostra foi agitada 25 vezes para o leite ficar distribudo uniformemente, e depois a embalagem foi aberta com uma tesoura esterilizada. Na presena da chama foram transferidos 25 ml da amostra de leite para um erlenmeyer contendo 225 ml de gua peptonada 0,1% (diluio 10-1) e homogeneizado. Da diluio 10-1 foi retirada uma alquota de 1 ml e transferido para um tubo de ensaio contendo 9 ml de gua peptonada 0,1% e depois homogeneizado (diluio 10-2). Foram realizadas diluies sucessivas at a diluio 10-5. 3.2 Contagem Padro em Placas (CCP)

A Inoculao em placas deu-se a partir da diluio 100 at as demais diluies desejadas (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5). Na prtica foram utilizadas duplicatas para as diluies 10-2, 10-3, 10-4 e apenas uma placa para as diluies 10-1 e 10-5 para fazer a mdia da contagem. Pegou-se 1 mL de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis (sempre prximo chama), seguida de 10 15 ml quantidade de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46 48 C. A homogeneizao foi realizada atravs da agitao suave das placas em forma de oito. Aps a solidificao, as placas foram incubadas na temperatura de 35C durante 48 horas. Depois realizou-se a leitura das placas selecionando-as de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes: placas que contivessem entre 25 e 250 colnias. A partir dos dados obtidos, calculou-se o nmero de microrganismos presentes na amostra de leite analisada comparando o resultado obtido com o valor padro estabelecido pela In N63/2011 anexo V, que se encontra entre: 4x104 e 8x104 UFC/ml. O resultado foi expresso em UFC/ ml. 3.3 Nmero Mais Provvel (NMP) Teste presuntivo

Em nove tubos de ensaio foi colocado, em cada um, tubos de tamanho e espessura menor, denominados tubos de Durham, invertidos. Para este teste foram selecionadas trs diluies adequadas da amostra (100, 10-1 e 10-2), inoculou-se uma srie de trs tubos de LST por diluio, adicionando-se 1,0 ml da diluio por tubo com 9,0 ml de LST utilizando uma pipeta, prximo chama. Incubaram-se os tubos de LST por 24h a 35C. Aps as 24 horas ler-se os resultados, e so positivos os tubos de LST que tiverem crescimento e contiverem gs. Os tubos positivos devem ser imediatamente confirmados no Teste Confirmativo. Em caso negativo, os tubos so reincubados por mais 48h, e aps o 2 perodo de incubao ler-se os resultados e se houver novos tubos positivos eles tambm so confirmados no Teste Confirmativo. Contagem de Coliformes Totais - Teste Confirmativo

Com os tubos positivos de LST transfere-se uma alada carregada de cada cultura para os tubos VB, que so incubados por um perodo de 48 horas a 35C. Ler-se os resultados, e caso ocorra a produo de gs nos tubos (confirmativo da presena de coliformes totais) e toma nota do total de nmero de tubos positivos de VB.

Contagem de Coliformes Fecais - Teste Confirmativo

Com todos os tubos positivos de LST transfere-se uma alada de cada cultura para tubos EC, que so incubados por um perodo de 24 horas a 47,2C. Observa-se os resultados, e caso haja o crescimento nos tubos com produo de gs confirmativo para presena de coliformes fecais, ento toma nota do total de tubos positivos de EC.

5. RESULTADOS E DISCUSSES Contagem Padro em Placas para mesfilos aerbios: Diluio 100 incontvel Diluio 10-1- acima de 250 colnias Incontvel Diluio 10-2- acima de 250 colnias incontvel Diluio 10-3 - acima de 250 colnias incontvel Diluio 10-4 1 placa (PCA): 67 colnias 2 placa (PCA): 75 colnias Clculo para o nmero de bactrias: ((67+ 75)/2 x 104 ) = 7,1 x 105 UFC/ml

Diluio 10-5 1 placa (PCA): 25 colnias 2 placa (PCA): 19 colnias Clculo para o nmero de bactrias: ((25+19)/2 x 105 ) = 2,2 x 106 UFC/ml
Na contagem de bactrias aerbias mesfilas, a amostra de leite pasteurizado tipo B apresentou resultados dentro dos padres legais vigentes, representados pela Instruo Normativa N 62/2011 (4x104 a 8x104 UFC/ml).

Nmero mais provvel para coliformes: Negativo para todos os tubos de LST no Teste Presuntivo. Negativo para todos os tubos de VB no Teste Confirmativo para Coliformes Totais. Negativo para todos os tubos de EC no Teste Confirmativo para Coliformes fecais. Verifica-se ento que tanto na fase presuntiva quanto na fase confirmativa todos os tubos foram negativos devido no formao de gases nos tubos de Durham.

6. CONCLUSO
Admitindo-se que todas as bactrias patognicas de origem alimentar so mesfilas, um nmero elevado indicaria que o produto analisado no seria apto para consumo. No entanto, em nossas anlises foram encontradas unidades formadoras de colnias destas bactrias, que fazem parte da flora normal do leite e ao contrrio dos coliformes totais, no leite, nunca devem est ausentes. A ausncia de coliformes totais, assim como a baixa contagem de mesfilas indicam a eficincia da pasteurizao e temperatura em que o mesmo foi mantido aps processado, mas principalmente que a ordenha foi realizada em boas condies higinicas inibindo a multiplicao dos microrganismos. Verificou-se que devido ausncia de coliformes totais e contagem baixa de bactrias mesfilas, o produto analisado atende aos padres microbiolgicos estabelecidos e no oferece riscos a sade do consumidor.

7. REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS

Disponvel em:< http://www.cienciadoleite.com.br/?action=1&a=215&type=0 > Acesso em : 2 de janeiro de 2013 Disponvel em:< http://www.uel.br/revistas/uel/index.php/semagrarias/article/viewFile/2968/2514> Acesso em: 2 de janeiro de 2013 BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Leite: Instruo Normativa n 62 de 29 de dezembro de 2011. Braslia: MAPA. FRANCO, R. M.; Avaliao da qualidade higinico-sanitria de leite e derivados, Revista Higiene Alimentar, So Paulo, v. 14, n68/69, p. 70-77, 2000.