FOGO/ TC

GERAO

ESTERILIDADE APIROGENICIDADE produto estril, potencial/ pirognico

ABRANGNCIA

INJETVEIS EM GERAL (uso humano e veterinrio) CORRELATOS DE INJETVEIS Produtos mdico-hospitalares de uso invasivo Drogas e correlatos INTRATECAIS Produtos implantveis

Originam-se fora do corpo e induzem elevao trmica quando injetados em animais e homem - bactrias G(-) endotoxina / LPS -Bactrias G(+) c. Teicico
-Fungos e vrus -Frmacos e esterides -fraes do plasma

Pirognio leucocitrio: Substncia homognea Sintetizada por diferentes clulas do hospedeiro (leuccitos) aps exposio ao pirognio exgeno T C

ENDOTOXINA Pirognio presente na parede da clula das bactrias G (- ) LPS Lipopolissacride Mlecula quimicamente purificada da endotoxina

ESTRUTURA da PAREDE de G (+) X ESTRUTURA da PAREDE de G (-)

ESTRUTURA do LPS

Parte externa
Protenas
Cadeia O-Especfica Cadeia Fundamental polissacardea Lpide A Fosfolpide Membrana Lipoprotena Externa Peptideoglicano Espao Periplasmtico Membrana Interna Citoplasma celular

LPS

Parte interna

Lipopolissacardeo (LPS)
PM: 20.000 a 30.000 Daltons at 106 Daltons
ext

Cadeia O especfica Cadeia fund.polissacardea Lipdeo A

Sequncias repetidas de acares (manose, galactose, ramnose, dideoxihexoses) Especificidade sorolgica

Polissacardeos Difuso de solutos

int

2 unidades glicosamino, pontes fosfato + cidos graxos de cadeia longa ~ fosfolipdio Ao Biolgica Toxicidade da molcula

EFEITO SOBRE O SISTEMA TERMORREGULADOR AO DIRETA: centro termorregulador do hipotlamo anterior 0,1 g/Kg febre considervel Limites diferentes produtos compndios oficiais AO INDIRETA leuccitos liberao pirognio leucocitrio ao no centro termorregulador hipotlamo anterior

EFEITO SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR Interao LPS c/ leuccitos, plaquetas e protenas plasmticas liberao de aminas vasoativas dbito cardaco miocrdio= Reduo fluxo sanguneo presso arterial CHOQUE

EFEITO SOBRE O SANGUE Leucopenia Alterao da eritropoiese Agregao plaquetria coagulao sg. disseminada

EFEITO SOBRE O SISTEMA ENDCRINO HIPOTLAMO gl. Pituitria ACTH gl. Supra-renal cortisol

EFEITO SOBRE O SISTEMA METABLICO Hiperglicemia seguida de Hipoglicemia Hiperlipidemia

EFEITO SOBRE O SISTEMA IMUNOLGICO PRODUO de Anticorpos IgM, IgG, IgA

CALOR SECO ESTUFAS HIDRLISE CIDO - BASE OXIDAO POR MTODOS QUMICOS ALQUILAO POR AGENTES ALQUILANTES RADIAO IONIZANTE E POLIMIXINA B

LAVAGEM DESTILAO- gua ULTRAFILTRAO Excluso por peso molecular OSMOSE REVERSA Remoo por excluso de tamanho (poros de 10 A) O QUE SO PRODUTOS APIROGNICOS?????

- Na prtica = lote contaminado rejeio e descarte - Remoo = no aplicvel custo X efetividade - Processo produtivo GMP obteno de produto apirognio

OBTENO DE PRODUTOS APIROGNICOS

BIOBURDEN

X PYROBURDEN

COELHOS (teste de pirognio)

Aceitao ou reprovao da amostra em teste reao febril do animal Coelhos sistema termorregulador ao humano Cachorros dificuldade no manuseio Cobaios sensibilidade do sist. Termorregulador Espcie Oryctolagus cuniculus, ordem logomorfa (albino , grande orelha)

TESTE PROPRIAMENTE DITO Animais de ambos os sexos, tratados em biotrios c/ isolamento acstico Interrupo de alimentos 3hrs antes do teste (gua livre) contendores especiais Uso de 3 animais (respeitar a dose humana) mL/Kg de peso corporal Tomada da temperatura basal Administrao da amostra veia marginal da orelha (estril e isotnica) Novas medies de TC aps 1,2 e3 horas

COELHOS (teste de pirognio)

INTERPRETAO DO TESTE
CRITRIOS Considerar somente elevaes de temperatura 3 coelhos 1 animal c/ elevao > ou = a 0,6C e/ou TC mx.> 1,4C RETESTE C/ +5 ANIMAIS Os critrios so farmacopicos (USP e Farm.Bras. IV ed.)

COELHOS TC BASAL 1 38,5 2 39 3 39,3

TC 1 39,1 39,3 39,7

TC 2 39,5 39 40

TC 3 VARIAO 37 1 39,2 0,3 39,4 0,7

LISADO dos AMEBCITOS LIMULUS LAL Teste de endotoxina bacteriana

Baseia-se na propriedade das clulas (amebcitos) do carangueijo Limulus polyphemus formarem cogulo na presena de endotoxina

Limulus polyplemus CARCAA FRONTAL

Limulus polyplemus PARTE POSTERIOR

infeco por bact. G(-)

PR-ENZIMA Sg animal

endotoxina Ca+2 / Mg+2

ENZIMA + ATIVADA

COAGULOGNIO Sg animal

hidrlise
cogulo sanguneo polimerizao

rearranjo

PPTIDES

 REAGENTE LAL 1 frasco contendo endotoxina padronizada 1 frasco contendo pr-enzima + coagulognio (distintas sensibilidades- EX: = 0,125UE/mL, 0,200UE/mL, 0,250UE/mL Escolha: de acordo com o pyroburden das amostras - VALIDAO

Puno da regio torcica e retirada da hemolinfa

TESTE PROPRIAMENTE DITO GELIFICAO ou GEL-CLOT Introduo USP XX e 4 ed. Farmacopia Bras. Vol. = de reagente LAL + soluo teste ensaio limite Homogeneizao suave e incubao a 37C por 1 hora INVERSO 180 formao de gel slido AMOSTRA POSITIVA

LISADO dos AMEBCITOS LIMULUS LAL Teste de endotoxina bacteriana

MTODO GEL-CLOT Clculo da Concentrao de Endotoxina na amostra Resultado em EU/UE Sensiblidade do reagente LAL = 0,125 EU/mL () diluies seriadas da amostra
D ilu i o d a A m o s t r a 1 :4 1 :8 1 :1 6

R p lic a s 1 2

1 :2

1 :3 2

+ +

+ +

+ +

+ -

Ponto Final de Gelificao da Amostra 1:16 (0,0625) 1:8 (0,125)

Log10 Ponto Final - 1,204 - 0,903

Mdia = -1,054 Antilog10 da Mdia = 0,088

Concentrao = Sensibilidade LAL = 0,125 EU/ml = 1,42 EU/ml endotoxina antilog10 mdia pto. final 0,088

 TESTE ANIMAL IN VIVO VANTAGENS Animal simula melhor condies fisiolgicas DESVANTAGENS emulso, suspenso, sol. Oleosa no quantitativo natureza do frmaco antitrmicos, anestsicos limitaes quanto re-utilizao (tolerncia)

TESTE Gel clot IN VITRO VANTAGENS Abrangncia Sensibilidade (validao) Especificidade Custo / simplicidade

DESVANTAGENS Natureza do frmaco (validao interferncias) Amostras opacas / leitosas mt. Cromognico

Grande demanda e sensib. mt. Turbidimtrico