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Anticuerpos monoclonales. Aspectos bsicos

Garca Merino, A. Publicado en Neurologia.2011; 26 :301-6 - vol.26 nm 05

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Resumen
Introduccin Los anticuerpos monoclonales son una poderosa herramienta para el diagnstico de laboratorio y un instrumento cada vez ms utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades. Desarrollo El descubrimiento y caracterizacin de los anticuerpos tiene una larga historia, que es la de la propia inmunologa. En este artculo se hace una introduccin histrica sobre la inmunidad humoral hasta el hallazgo de los anticuerpos monoclonales y se revisan conceptos relativos a la estructura y funciones de los anticuerpos, as como a la generacin de diversidad, activacin y maduracin de los linfocitos B. Se mencionan las principales tcnicas de produccin de anticuerpos monoclonales y se enumeran algunas de sus aplicaciones en patologa humana. Conclusiones Los anticuerpos monoclonales han producido desde su descubrimiento una revolucin de gran calado en el diagnstico y el tratamiento de numerosas enfermedades. La utilizacin de anticuerpos monoclonales humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia. La tecnologa actual de fabricacin de estos anticuerpos permite nuevos diseos que pueden ampliar sus posibles aplicaciones en medicina. Palabras clave Inmunidad humoral. Anticuerpos monoclonales.

Texto completo
Introduccin
El descubrimiento y caracterizacin de los anticuerpos tiene una larga historia, que es la de la propia inmunologa, y se remonta a finales del siglo xix . En esa poca, los microbilogos estudiaban los mecanismos de defensa del organismo contra los agentes microbianos, en particular contra las toxinas bacterianas. Von Behring y Kitasato sentaron en los aos noventa del siglo xix las bases de la inmunidad humoral al descubrir que el suero produca sustancias que antagonizaban toxinas como la diftrica o la tetnica. Ehrlich, a finales de siglo, consolid la idea de que las toxinas generaban antitoxinas sricas que se comportaban segn las leyes de la qumica; las clulas de la sangre eran capaces de producir unas cadenas laterales que reaccionaban frente a las toxinas de manera especfica como una llave con su cerradura 1. Por las distintas propiedades de reaccionar las antitoxinas se denominaban de varias maneras: aglutininas, opsoninas, etc. En los aos treinta del siglo xx Landsteiner, el descubridor del sistema ABO, identifica todas esas funciones y las centra en una sola molcula, los anticuerpos, y al tiempo va sustituyndose el nombre de toxina por el de antgeno. Aos ms tarde, este mismo autor, junto con Pauling, desarrolla la teora instruccionista de formacin de los anticuerpos, segn la cual los antgenos determinaran la conformacin de los anticuerpos acomodndola a su estructura. A finales de los cuarenta se descubre el origen celular de los anticuerpos en las

clulas B y plasmticas. Aos ms tarde se describen las cadenas ligeras y se identifican las inmunoglobulinas A, D y E. Frente a la teora instruccionista, Jerne propuso en los aos cincuenta que los anticuerpos preexistan en el organismo y que la funcin de los antgenos sera la seleccin de los ms adecuados 2. Poco despus, Burnett y Talmage adelantan la teora de la seleccin clonal3 que completa y expande las ideas de Jerne, y que presupone que cada clula B produce un solo tipo de anticuerpo con una especificidad concreta, el cual se genera por mutaciones somticas al azar durante el proceso de maduracin celular; ms adelante, la exposicin a los antgenos hace que esas clulas B proliferen. En los aos sesenta se describe el concepto de idiotipo y en los setenta se acua la teora de las redes de idiotipos/antiidiotipos, pero la revolucin en el mundo de los anticuerpos ocurre en 1975 cuando Milstein y Khler decubren en Cambridge los anticuerpos monoclonales. En 1976 Tonegawa describe la recombinacin somtica de los genes de inmunoglobulinas4. Desde entonces la investigacin completa el conocimiento de la gentica molecular de los anticuerpos y los mecanismos de generacin de su diversidad.

Estructura y caractersticas bsicas de los anticuerpos

Cada molcula de anticuerpo est formada por 4 cadenas, 2 ligeras y 2 pesadas, cada una de ellas idntica, unidas por puentes disulfuro que forman una estructura espacial similar a una Y. Los anticuerpos tienen 2 funciones fundamentales, de reconocimiento y unin a antgenos, que llevan a cabo mediante los extremos aminoterminales de las cadenas, y una funcin efectora, realizada por el extremo carboxiterminal de las cadenas pesadas (Figura 1).

Figura 1. Esquema de la estructura de una molcula de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas aparecen en negro y las ligeras en gris claro. CH: dominios de la regin constante de la cadena pesada; CL: dominio constante de la cadena ligera; COOH: extremo carboxiterminal; Fab y Fc: fragmentos resultantes de protelisis; NH: extremo aminoterminal; VH: dominio variable de la cadena pesada; VL: dominio variable de la cadena ligera; - - -: puentes disulfuro. Las cadenas ligeras tienen una porcin variable, de la que depende la especificidad, y una regin constante que difiere segn se trate de cadenas ligeras o . Las cadenas pesadas poseen, asimismo, una regin variable y una constante, la cual determinar las clases o isotipos principales de inmunoglobulina (Ig): , , . y , que formarn, respectivamente, la IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Adems, la IgA tiene 2 subclases, IgA1 e IgA2, y la IgG se divide en 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las propiedades de las Ig dependen de cada clase y subclase. Una vez secretadas, las Ig son monomricas, con excepcin de la IgA, que forma dmeros, y de la IgM, pentmeros. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas estn yuxtapuestas para formar el sitio de unin al antgeno; por consiguiente, en cada molcula de anticuerpo hay 2 sitios de unin antignica. Dentro de la estructura de las cadenas de las Ig se denominan dominios a estructuras repetidas de 110 aminocidos (AA) con un pliegue beta. Las cadenas ligeras tienen 1 dominio en la regin variable (VL) y 1 en la constante (CL). Las cadenas pesadas tienen, a su vez, 1 dominio en la regin variable (VH) y 3 o 4 en la regin constante (CH) segn la clase de Ig. Entre los dominios CH1 y CH2 se encuentra un rea denominada bisagra de la cadena constante que le da flexibilidad y permite un acoplamiento espacial adaptable. En las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas hay 3 segmentos hipervariables de 10 AA yuxtapuestos que forman el sitio de unin al antgeno, que por ser complementarios a su secuencia se denominan CDR 1, 2 y 3, de los cuales el ms variable es CDR3. Estas estructuras forman bucles en la superficie de los anticuerpos mediante los que interactan con los antgenos. El resto del dominio variable se llama FR.

La protelisis de las molculas de Ig da lugar a distintos fragmentos segn la sustancia empleada; el fragmento F(Ab)2 se genera tras tratamiento con pepsina que corta la molcula a la altura de la bisagra dejando la parte superior de la Y con 2 fragmentos F(Ab) unidos entre s. La papana digiere la molcula ms arriba y deja 3 fragmentos, 2 F(Ab) y un fragmento constante, Fc. Se habla de fragmento F(Ab) cuando incluye la regin de la bisagra de la cadena pesada. Los anticuerpos son capaces de generar numerosas respuestas tras su unin a los antgenos. Esas respuestas efectoras dependen del extremo carboxiterminal de cada isotipo que determina el tipo de unin a determinados receptores de membrana de las clulas y la capacidad de fijar complemento. Sntesis de inmunoglobulinas. Generacin de diversidad. Activacin y maduracin de los linfocitos B La produccin de las Ig corre a cargo de las clulas B que en su etapa madura expresan en la membrana molculas de IgM e IgD. Cuando se activan, comienza una produccin de Ig de baja tasa, cambia el isotipo y comienza la maduracin por afinidad. En la etapa de clula plasmtica hay una alta secrecin de Ig de alta afinidad con escasa presencia de Ig de membrana. Los mecanismos que controlan la diversidad de los anticuerpos5 son altamente complejos y han ocupado la actividad de los investigadores durante dcadas. Resumiendo mucho, podemos decir que existen 2 etapas bsicas en este proceso: una recombinacin somtica, en la que se produce la combinacin de distintos segmentos gnicos presentes en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que terminan formando un gen funcional responsable de la secuencia de AA de la porcin variable de la molcula de Ig, que da lugar a una muy elevada diversidad de molculas en lo que se llama repertorio primario de anticuerpos, y una hipermutacin somtica durante la respuesta a antgenos, que corresponde a mutaciones puntuales de la secuencia variable una vez formada sta y que terminan permitiendo una mayor afinidad de unin. Adems, a medida que madura la respuesta inmune tiene lugar un cambio de isotipo mediante el cual el segmento variable reordenado puede combinarse con cualquiera de los segmentos constantes de las Ig y de ello dependern las caractersticas efectoras finales de la molcula de Ig secretada. Los genes de las cadenas ligeras se agrupan en 2 segmentos gnicos de la regin variable, V (variable) y J (unin) y un segmento constante (C) distinto segn se trate de cadenas o . Las cadenas pesadas tienen 3 segmentos en las regiones variables: V, D (diversidad) y J, y un segmento C distinto segn el isotipo de cada Ig. En los seres humanos la cadena ligera depende de una regin en el cromosoma 2 que agrupa los segmentos V, J y C. Los mismos segmentos gnicos responsables de la cadena estn en el cromosoma 22. Los segmentos V, D, J y C de las cadenas pesadas se sitan en un rea del cromosoma 14. El nmero de segmentos V, D, J y C de las cadenas y la probabilidad de combinacin se detallan en la Tabla 1. Tabla 1. Combinaciones posibles en el repertorio primario de anticuerpos

Cadenas Segmentos V 40 Segmentos D 0 Segmentos J 5 Posibilidades de combinacin 200

Cadenas 31 0 4 124

Cadenas pesadas 51 27 6 8.262

Posibilidades de combinacin total: (200+124) x 8.262=2.676.888. Tomado de lvarez-Vallina et al, 2004. Para que las clulas B se activen se necesita el contacto con los antgenos. Es importante resaltar que a diferencia de lo que ocurre con las clulas T, las clulas B reconocen una amplia variedad de antgenos proteicos y no proteicos. Las macromolculas estimulan a los anticuerpos mediante determinantes antignicos o eptopos que pueden ser lineales o conformacionales, esto es, yuxtapuestos en un pliegue de la protena. Si la protena se transforma puede originar nuevos determinantes antignicos. La unin con el antgeno es reversible y la fuerza de su unin se llama afinidad. La fuerza global de unin al antgeno se conoce como avidez, que depende del nmero de puntos de unin disponibles. La especificidad es la capacidad de reconocer en un anticuerpo pequeas diferencias antignicas.

Las molculas de IgM e IgD ancladas en la membrana de las clulas B actan como receptores de antgeno. En el caso de los antgenos proteicos, se requiere la ayuda de las clulas T para activar a las B, lo cual implica el desencadenamiento de seales intracelulares con activacin de factores de transcripcin y expresin de genes, cambio de isotipo y diferenciacin hacia clula productora de anticuerpos. En el caso de los antgenos no proteicos, no dependientes del timo, no se requiere la cooperacin de las clulas T. La activacin cesa a travs de seales inhibitorias complejas cuando la cantidad de anticuerpo producida es suficiente. Durante la activacin y maduracin las clulas B migran a los folculos de ganglios linfticos y del bazo, donde maduran mediante hipermutacin somtica con aumento creciente de afinidad por el antgeno. Al final sobreviven solamente las ms afines al antgeno presentado por clulas dendrticas y, finalmente, migran hacia rganos linfticos secundarios, aunque una pequea parte permanece como clulas B de memoria que recirculan entre ganglios linfticos y del bazo. Cada clon de clulas plasmticas produce un solo tipo de anticuerpo. Produccin de anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se descubrieron en la primera mitad de los aos setenta por Milstein y Khler en el laboratorio de biologa molecular de Cambridge (Reino Unido). Estos autores investigaban los mecanismos moleculares de la generacin de diversidad de los anticuerpos y necesitaban producir una clula B inmortal con especificidad conocida, para as poder analizar en detalle las mutaciones de los genes de las Ig. Para ello fusionaron una lnea de clulas de mieloma murino, sensible a ciertos frmacos, con clulas de bazo de un animal inmunizado. Mediante este procedimiento consiguieron seleccionar solamente las clulas hbridas y los clones con especificidad conocida. Su trabajo fue publicado en Nature en 19756 y 9 aos ms tarde recibieron el premio Nobel por este descubrimiento. Su trascendencia fue enorme, ya que por primera vez era posible disponer de cantidades ilimitadas de anticuerpos con especificidades precisas. Las clulas tumorales de mieloma de ratn procedan todas ellas de una lnea creada por Michael Potter en los aos sesenta denominada MOPC21, deficitarias en enzimas clave para la sntesis de oligonucletidos por la va de rescate. El agente fusionante inicial era el virus Sendai, pero pronto se sustituy por polietilenglicol. Las clulas B provenan de ganglios linfticos o del bazo de ratones inmunizados repetida y eficazmente con el antgeno deseado. Estas clulas se cultivaban con las de mieloma y el agente fusionante en un medio de cultivo de composicin especial (HAT) que no permite la supervivencia de las de mieloma no hibridadas; los linfocitos B no fusionados moran tambin y quedaban las clulas fusionadas. La especificidad se analizaba en los sobrenadantes de los pocillos de las placas de cultivo, seleccionando slo los deseados y al final se llevaba a cabo la clonacin por dilucin lmite u otros medios7, 8. Los hibridomas creados pueden conservarse indefinidamente en dimetil sulfxido y los anticuerpos monoclonales se purifican a partir de los sobrenadantes. El rendimiento en cultivo no es muy alto y por ello se ha desarrollado la tcnica de produccin de ascitis en ratones mediante la inyeccin intraperitoneal de los hibridomas, mtodo no aceptado en todos los pases, o procedimientos in vitro mediante la fermentacin de cultivos de clulas de mamfero utilizando biorreactores y sistemas de cultivo de perfusin continua. El primer uso en terapia humana fue en 1982 para el tratamiento de un linfoma9. Pronto se vio que el uso de monoclonales murinos arrastraba el problema de la tolerancia con produccin de anticuerpos humanos antimurinos que disminuan su eficacia. Para solventar estas dificultades se exploraron diversas alternativas, de las que las ms importantes son la quimerizacin y la humanizacin. La quimerizacin se desarroll en 198410. Por quimerizacin se entiende la produccin de anticuerpos monoclonales en los que solamente la regin variable es de origen murino, y el resto de las cadenas pesadas y ligeras es de origen humano. En los anticuerpos humanizados slo son murinas las regiones hipervariables de las cadenas ligeras y pesadas11, 12. La mitad de los monoclonales utilizados en terapia humana son quimricos o humanizados (Figura 2).

Figura 2. Quimerizacin y humanizacin de anticuerpos monoclonalesA) Monoclonal murino. B) Monoclonal quimrico, en el que las regiones variables son de origen murino siendo humano el resto de las cadenas.C) Monoclonal humanizado: slo incluye los segmentos hipervariables de origen murino. D) Monoclonal humano. Otra alternativa son los monoclonales humanos que se producen en animales transgnicos portadores de genes de Ig humanas; los transgenes incluyen fragmentos de las regiones variables en lnea germinal, lo que les facilita la capacidad recombinatoria de los anticuerpos humanos. Las vas de introduccin de esos segmentos son los miniloci, los cromosomas artificiales de levadura o humanos, y los vectores P1. Los animales pueden tener inactivados los genes de sus Ig endgenas13, 14. Los monoclonales humanos son ms ventajosos por su menor antigenicidad y mejor tolerancia, y por su mayor tiempo en circulacin en relacin con los quimricos. La tecnologa de fragmentos de bibliotecas de anticuerpo desplegados en protenas de la superficie de fagos filamentosos, introducida en la ltima dcada del pasado siglo, es otra posibilidad de producir grandes repertorios de genes de las regiones variables de las Ig humanas15. Es importante sealar que la tecnologa recombinante disponible permite adems la fabricacin de varios tipos de fragmentos derivados de anticuerpos, entre ellos los F(ab)2 sin regin Fc, los fragmentos Fab, los bivalentes o diabodies, o incluso trmeros o tetrmeros llamados triabodies y tetrabodies. Estos fragmentos permiten solventar algunos de los problemas relacionados con la molcula completa del anticuerpo, mejorar la avidez y facilitar la unin a determinadas dianas. Utilidad y aplicacin en patologa humana de los anticuerpos monoclonales Independientemente de su uso en tcnicas de diagnstico, que han supuesto una revolucin en el campo de la histopatologa o permitido el desarrollo de tcnicas de laboratorio como la citometra de flujo, las posibilidades de aplicacin para tratar enfermedades humanas son amplsimas16. Dependiendo de la regin Fc, la unin del anticuerpo monoclonal al antgeno contra el que est diseado puede facilitar la produccin de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad por la activacin del sistema de complemento. La propia unin al antgeno puede bloquear receptores de la membrana celular, unirse a factores presentes en el suero y evitar su unin a receptores, o inducir seales intracelulares. Las consecuencias finales de estas interacciones son numerosas y han encontrado aplicacin en reas muy diversas. Una manera de modificar la capacidad efectora de los anticuerpos monoclonales es la conjugacin con molculas citotxicas con toxinas, con radiofrmacos o con citocinas; esta ltima ha sido una estrategia utilizada en oncologa mediante la creacin de protenas de fusin que incorporaban genes de IL-2, IL-12 o GM-CSF, entre otras. La conjugacin de enzimas capaces de convertir un profrmaco en frmaco con anticuerpos monoclonales dirigidos a clulas tumorales ha permitido una accin muy selectiva en el tejido tumoral del frmaco en cuestin. La oncologa es, sin duda, el rea de aplicacin teraputica ms importante. Son de amplia utilizacin los anticuerpos dirigidos contra HER2 en cncer de mama, o contra el factor de crecimiento epidrmico (EGF) o el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en varios tipos de tumores, o los anti CD20 o anti CD52 para linfomas/leucemias. Las enfermedades autoinmunes son el grupo siguiente de patologa humana en el que ms se han empleado estos productos y, fundamentalmente, en artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis mltiple, lupus eritematoso, as como en el rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra el husped. Los ms utilizados han sido anticuerpos contra citocinas, sobre todo TNF- y anti VLA4, pero tambin anti CD20 y anti CD25, entre otros.

Los anticuerpos monoclonales se han empleado tambin con otras finalidades, como el tratamiento de la septicemia, la prevencin de complicaciones de enfermedades virales o el tratamiento de intoxicaciones por frmacos. No es el propsito de este artculo una revisin detallada de las aplicaciones actuales de los anticuerpos monoclonales actualmente aprobados y de muchos ms en distintas etapas de desarrollo teraputico. Sin ninguna duda, la disponibilidad de estos anticuerpos y de la tecnologa para su refinamiento constituye ahora y ms an en el futuro una parte fundamental de nuestra teraputica.

Conclusiones

Ms all del impacto en el diagnstico de laboratorio, los anticuerpos monoclonales son una herramienta teraputica poderossima. Su alta especificidad permite el abordaje de dianas muy precisas que pueden determinar cambios celulares muy variados; adems, dependiendo de la regin Fc pueden disearse para facilitar distintos tipos de respuestas efectoras. El empleo de anticuerpos humanizados y humanos ha mejorado notablemente su tolerancia clnica. La manipulacin de los anticuerpos mediante la unin a otras molculas o el diseo de nuevas fragmentos de anticuerpos abren un gran abanico de posibles aplicaciones en medicina.