Mitosis y Citocinesis

Instructor: Carlos J. Pasiche Lisboa

Ciclo celular
.

La mayor parte del ciclo lo ocupa la interfase y slo una pequea parte lo ocupa las restantes fases que forman la mitosis y citocinesis.

Interfase

Mitosis
Periodo durante el cual los eventos visibles de las divisiones celulares ocurren.

Profase

Cromosoma
Consiste de dos cromtidas que, en las clulas animales, se mantienen unidas por un centrmero
un cromosoma (no duplicado)

dos cromosomas (duplicado)

cromtida cromtida

dos cromtidas hermanas

dos cromosomas (duplicado)

El ciclo celular

cromosoma (no duplicado) clulas en interfase

Cromosoma duplicados en interfase antes de mitosis

mitosis, divisin del citoplasma

cromosoma en la clula hija

Profase
El nucleolo y la membrana nuclear desaparecen, y simultneamente comienza la sntesis del huso mittico.

Metafase

Los cromosomas se unen al huso mittico (o filamentos de protenas) por los centrmeros y se alinean en el plano ecuatorial de la clula. Durante esta etapa el centrmero se divide quedando cada cromtida con su propio centrmero.

Anafase

Se separan los centrmeros y cada cromtida se separa movindose lentamente al polo celular. Al terminar la anafase los cromosomas han formado un grupo en cada polo celular.

Telofase

Divisin del citoplasma

Citocinesis

Meiosis
Es la divisin celular en la que el nmero de cromosomas se reduce a la mitad y se forman gametos. La clula pasa por dos divisiones sucesivas, pero los cromosomas se duplican slo una vez. La dos divisiones resultado cuatro haploides. tienen clulas como hijas

Las etapas de la Meiosis

Meiosis consiste en dos divisiones sucesivas: Meiosis I Meiosis II Cada una de estas divisiones son similares a las fases de la mitosis.

Meiosis I: proceso reductor (De diploide a haploide)

Meiosis II: Proceso mittico

Sinapsis:
Los cromosomas homlogos (que codifican para la misma caracterstica) se aparean

Entrecruzamiento:
Intercambio de los fragmentos cromosmicos entre las cromtidas de los cromosomas homlogos

Metafase I
Las ttradas se alnean a lo largo del ecuador de la clula. stas se alinean en ngulo recto con las fibras del huso. Cada cromosoma est pegado a una de las fibras del huso.

Intercinesis
Es similar a la interfase, pero los cromosomas no se replican. Las fases que siguen, de la segunda divisin celular de meiosis, ocurren en las dos clulas formadas por la primera divisin celular.

GENES que CONTROLAN el CICLO CELULAR en EUCARIOTAS

Presentacin powerpoint original: gentileza de la Dra. (FIL)

Vanesa Gottifredi

2001. Ao del ciclo celular

Premios Nobel 2001 de Fisiologa y Medicina

Leland Hartwell (1939). Fred Hutchinson Cancer Research Council, Seattle, USA Paul Nurse (1949). Imperial Cancer Research Foundation (ICRF), London, UK Timothy Hunt (1943) ICRF, London, UK

Es tan simple realmente? simtrica en general, excepto en S. cereviciae, que es por gemacin (divisin asimtrica: una clula hija ms grande y otra ms pequea)

El ciclo celular

Caractersticas fundamentales: Altamente Ordenado Finamente regulado

Funciona un nmero finito de veces en una poblacin celular en divisin; Despus: senescencia y apoptosis
Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Preguntas frecuentes

Cunto tiempo dura el ciclo celular? Se puede medir el tiempo que dura cada etapa? Se puede saber cul de las etapas estn atravesando las clulas? qu seales inducen la divisin celular?

Clculos (pioneros) de la duracin del ciclo celular entero La duracin del ciclo celular vara de acuerdo al entorno en el
que se encuentra un tipo celular determinado a expensas de la duracin de las distintas fases, excepto M, que es bastante constante = aprox 1 hora. ejemplo: para medir la duracin del ciclo celular de los hepatocitos que forman parte del hgado de un ratn adulto, se prepararon cortes y se los ti con un colorante para que las clulas en mitosis resultaron fcilmente reconocibles al microscopio. Habiendo observado 25.000 clulas en total, se encontraron solamente 3 clulas en mitosis (ndice mittico). duracin del ciclo celular (x) de los hepatocitos en el hgado de un ratn adulto: 1 hora /x = 3 /25000 x = 1 ao

Clculos (pioneros) de la duracin de las fases del ciclo celular En otro experimento, los hepatocitos fueron disgregados
1) 2)

y puestos en condiciones de cultivo (asincrnico). En un momento se agreg timidina radioactiva y a distintos tiempos, se separaron alcuotas para: contar las clulas totales (Fig 1) fijar, teir las clulas y prepararlas para radioautografa, sobre la cual se hicieron dos tipos de anlisis: conteo de clulas en mitosis radioactivas (Fig 2A) medicin de la intensidad de las seales radioactivas (nmero promedio de granos de plata) sobre las clulas mitticas (Fig 2B)

Clculos (pioneros) de la duracin de las fases del ciclo celular (cont.)

Fig. 2

primeras mitosis marcadas provienen de cl que estaban saliendo de S cuando se agreg la marca G2 = 3hs

Fig. 1 Curva de crecimiento en medio lquido Se mide el tiempo de duplicacin de la poblacin celular. Aqu: aprox = 20 hs S = 7 hs

G1 = 20 (3 + 7) = 10 hs

todo empieza con Factores de crecimiento

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

algunos actores moleculares que promueven el ciclo

algunas reacciones duran miliseg; otras, seg

esto es un ejemplo de lo que se llama transduccin de seales = secuencias (cascadas) de reacciones bioqumicas que convierten el estmulo (seal) externo en un fenotipo celular evidente p. ej. divisin celular

pero como ven, hay muchas vas de transduccin

El ciclo se arresta (G0) debido a: contacto cl-cl (quiescencia) ayuno (quiescencia) linaje celular viejo (senescencia; irreversible apoptosis)
una de las vas, como ejemplo

actores moleculares en el ncleo

loop regulatorio

En el ncleo, las ciclinas se unen a kinasas llamadas CDKs (cyclin-dependent kinases) y las activan. Son su subunidad regulatoria

la unin a ciclinas facilita fosforilaciones activadoras de CDKs en algunas posiciones aminocidicas por parte de kinasas otro mecanismo de activacin es la defosforilacin de CDKs en algunas posiciones aminocidicas por parte de fosfatasas (ej. cdc25)
Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3 th edition

= cdk1

hay cdks y ciclinas especficas para cada etapa del ciclo celular

cada kinasa es activada por una ciclina especfica Las CDKs son reguladores positivos del ciclo

Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

= ciclina B

cdk1

las ciclinas se degradan cuando ya no se necesitan en la etapa correspondiente del ciclo celular

cdk1

cdk4

ciclina E cdk2 = ciclina D Ratones KO en genes de ciclinas tienen problemas neurolgicos

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Las ciclinas oscilan durante el ciclo celular; se degradan en el proteasoma

(fase S) (fase M)

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Por lo tanto, las cdks se vuelven inactivas al final de cada fase promueve la progresin a la siguiente fase del ciclo

La degradacin proteasomadependiente de cyclin B determina (indirectamente) la direccionalidad de la transicin M G1

Si se inhibe artificialmente la degradacin de ciclina B (con inhibidor de proteasoma o versin no-degradable de ciclina B) la progresin de M G1 se ciclina B torna reversible !!!
clulas Hela o inh. proteasoma

Gorbsky, Nature 2006

Checkpoints (Puntos de control)

Pregunta

= momentos del ciclo en los que ocurre control de calidad y decisin del futuro (seguir ciclando o detenerse)

pasado el checkpoint, la progresin del ciclo es irreversible no hay vuelta atrs

Decisin: seguir o detenerse

El DNA est intacto?: Si no lo est, las seales de dao hacen arrestar el ciclo para su reparacin
Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Inhibidores de CDKs (CKIs): protenas que disminuyen la velocidad el ciclo

Cdk1=

Los CKIs son reguladores negativos del ciclo celular

Existen dos tipos de inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas (CKIs)

Regulacin negativa

(citokina)

Regulacin positiva

Rb: otro importante regulador negativo, un alelo mutado somticamente en casos de retinoblastoma
(el otro heredado germinalmente)

E2F libre

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Mirando en detalle, Rb siempre est fosforilada. Est inactiva como secuestradora (de E2F) cuando est moderadamente fosforilada

E2F libre

Los mamferos tenemos dos genes parlogos de Rb: p107 y p130. Por lo tanto, fenotipos visibles (tumores) en ratones KO son evidentes en triples KO

Resumiendo: las CDKs son reguladores positivos del ciclo algunas lo son porque indirectamente liberan a E2F,
que es un regulador positivo

CDK2/ ciclina E CDK2/ ciclina E

(CDK2 inhibe a Rb ..como secuestrador) (Rb secuestra a E2F)

RB

E2F

simplificando.

E2F (libre)

Mltilples genes target de E2F (conocidos mediante ChIP)

genes que codifican a protenas del Origin Recognition Complex (ORC), requisito para replicacin de DNA en fase S Myc (regulador positivo = oncogen) ciclina E (ayuda a CDK2 en fosforilar a Rb) ARF (inhibe a MDM2, que degrada a p53)
Adems, genes implicados en otras fases del ciclo: DNA damage checkpoint and repair pathways chromatin assembly/condensation chromosome segregation, mitotic spindle checkpoint apoptosis differentiation.

Resumen: Durante un ciclo celular, el balance de la actividad de reguladores positivos y negativos son responsables de la salida de una fase y entrada a la siguiente. Positivos: CDKs-ciclinas; E2F Negativos: CKIs (que inhiben actividad de CDKs); Rb Rb inhibe la actividad transcripcional de E2F. La fosforilacin de Rb por CDK2 produce la liberacin de E2F. Si el balance es positivo para actividad de CDK2 y para actividad de E2F, la clula entra en fase S y cicla.

Otro importante regulador negativo: p53

Homotetrmero*, Factor de Transcripcin activador de genes reguladores negativos del ciclo

domains:

R175

R248 G245 R249

R273 R282

Activation SH3-like

Basic DNA-binding domain arginine-rich Tetramerization

*1 sola subunidad mutada tetrmero no funcional: mutacin dominante negativa

P53 es un factor transcripcional clave para el ciclo celular p53

Apoptosis Growth arrest Prevention of blood vessel formation P21, Scotin,Fas, Bax, PERP TSP1, BAl1, miR-34, Pig3, Killer/DR5,AIP1, GADD45, Maspin, GD-AIF Noxa, Sepuku
14-3-3-

p53
freno principal del ciclo

MDM2
destruye el freno

El dao en el DNA provoca el arresto del ciclo via fosforilacin de p53 (su forma activa)

DNA breaks

mecanismo de resguardo contra proliferacin excesiva

E2F

ac es reg. neg.

ATM

(una kinasa)

ATR (otra kinasa)

ARF*(P14 humanos:
p19 ratn)

interacta con (inhibiendo)

p53
fosforilada

MDM2

*ARF adems se une a E2F, promoviendo su degradacin en proteasoma (Rizos et al., Cell Cycle, julio 2007)

Mutaciones en genes del ciclo celular implicadas en enfermedades humanas

telang: vasos sang en la piel

Li-Fraumeni Syndrome (LFS; OMIM #151623) is an autosomal dominant cancer predisposition syndrome characterized by early onset tumors including sarcomas, breast cancer, leukemia, brain tumors, and adrenocortical carcinoma. Li-Fraumeni syndrome is primarily attributed to germline mutations in the p53 tumor suppressor gene, In addition to germline p53 mutations, the p53 gene is the most commonly mutated gene in human cancers, with as much as 50% of tumors containing somatic p53 mutations.

Cancer Res. 2003 Oct 15;63(20):6643-50.

cross-talk between Rb and p53 pathways: dos paradigmticos supresores de tumores

CDK2 |
Ciclina E

p21

Modified from Exp Cell Res 2001 Mar 10;264(1):56-66

Resumen: P53 est mutada en 50% de los casos de cncer (germinal y somticamente). P53 es un factor transcripcional que puede inducir arresto del ciclo celular o eventualmente muerte celular programad actuando como guardin del genoma (evita la inestabilidad genmica). Uno de los blancos transcripcionales de p53 es MDM2. Esta protena es una E3 ligasa de ubiquitina para la degradacion de p53 en el proteosoma. Por lo tanto, este feedback negativo regula los niveles de p53. Otro blanco transcripcional de p53 es p21, lo que explica su capacidad de arrestar el ciclo celular en G1 Otro blanco transcripcional de p53 es miR-34, un microRNA que degrada el mRNA CDK2 (paper de seminario)

La actividad de p53 activa (fosforilada) aumenta como consecuencia de la aparicin de seales de dao al ADN

en qu fase del ciclo estn las clulas?

si se usa colorante fluorescente para DNA, p. ej. DAPI

FACS
(Fluorescent activated cell sorter)

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

en qu fase del ciclo estn las clulas?

Go/G1 G2,M

Anlisis esttico FACS

S 2n 4n

Anlisis dinmico para ver si las clulas estn ciclando: agregarles un pulso de BrDU: las que estn atravesando S se vern rojas. Si ciclaron, despus de unas horas se vern rojas las que estn en G2, M y G1 (antes estuvieron en S)

Seales de dao en DNA

plataforma recombinasa exonuecleasa

complejo sensor

focos de dao visibles al microscopio mediante anticuerpos

ayuda en NHEJ Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. van Attikum & Gasser
2009

El dao severo en el DNA (SSBs y DSBs) hacen frenar el ciclo en G1 y G2 (para su reparacin por maquinarias reclutadas por el complejo sensor MRN) por una va dependiente y otra independiente de p53
E2F queda secuestrado por Rb va indep. de p53 (freno accesorio)
fosforilada queda inactiva y no puede fosforilar a Rb

principalmente Chk1

fosforilada se degrada y no puede activarla

fosfatasa de Cdk2

va dep. de p53 (freno principal)

E2F queda secuestrado por Rb inactiva no puede fosforilar a Rb

FEBS Lett 2001 Feb 16;490(3):117-22

p53 protagonista

Los blancos de p53 son p21 y miR-34 (arresto en G1 y G2),

(y Gadd45 y 14-3-3 (en G2)) para facilitar la reparacin del dao

detalle de sus sitios de fosforilacin

G1 and G2

eventualmente
Genes Dev 2001 Sep 1;15(17):2177-96

Mutaciones en genes del ciclo celular implicadas en enfermedades humanas

SENSORS and EFFECTORS

MEDIATORS

* ataxia = incoordinacin de movimientos (cerebelo) telangiectasia = malformaciones arterio-venosas hemorragias

Racionalidad de la radioterapia anti-tumoral (en clulas artificialmente

sin el freno p53)

La radiacin en dosis moderadas mata a clulas deficientes en p53, que no pueden arrestar eficientemente en G1 o G2: mitosis catastrfica (imposibilidad de citokinesis
debido al dao de DNA)

KO de p53

Southern
KO

FACS

irradiadas

irradiadas

WT Las clulas que tienen p53 se arrestan en G1 y G2,reparando el dao, mientras que las p53-/- entran en una mitosis abortiva que finalmente las destruye (observar por FACS degradacin de DNA a 72 hs). Las drogas inhibidoras de CHK1 (junto con agentes que daan el DNA) ayudan en los tratamientos anti-cncer p53-/- aprovechando este principio, porque impiden totalmente el arresto por la va independiente de p53, forzndolas a entrar en mitosis catastrfica, no afectando a las normales que pueden usar CHK2 para fosforilar a p53

___

Conclusin del trabajo anterior

Although p53 mutations provide cells with a selective growth advantage, such mutations burden them with a significant G1 or G2 checkpoint deficit; they cannot respond normally to DNA-damaging agents and enter mitosis and subsequently replicate their genomes in the presence of DNA damage, with failure of cytokinesis (analoga con auto sin frenos como para poder detenerlo en el taller y as reparar otros serios defectos; el auto choca). Such checkpoint defects may be exploited to treat the many cancers with abnormalities of p53 function.

Resumen de respuesta de los controladores del ciclo celular al dao en DNA:

El dao al ADN produce una inmediata respuesta celular como consecuencia de la activacin de kinasas sensoras de SSBs y DSBs (DNA con extremos desnudos), que fosforilan a ATM y ATR: Como consecuencia, H2A-X en la regin de dao queda fosforilada en Ser139, que recluta a muchas protenas,formando focos de dao, entre ellas HATs y recombinasas de la familia Rad, que van a facilitar la reparacin una vez que el ciclo est arrestado. Los focos rpidamente activan a CHK1 y CHK2, las cuales fosforilan a p53 y a la fosfatasa cdc25 (va indep. de p53), arrestando el ciclo en los checkpoint de G1, S y G2. La fosforilacin de p53 la libera de su degradador MDM2. Por lo tanto, p53 se acumula y tambin aumentan los niveles de las protenas de sus blancos transcripcionales, p. ej. p21 (y otros como GADD45, 14-3-3, y miR-34), que anulan la actividad de ciclinas B, D y E, ocasionando arresto en G1 y G2.

Diferenciacin Clular y ciclo celular

modelo muy estudiado: msculo

Relacin entre

Las clulas diferenciadas no ciclan clulas musculares

Mol Biol Cell 1998 Jun;9(6):1449-63

Upstream activators Determination MyoD/Myf5

Mesodermal progenitor

Myoblast

Differentiation

Myogenin Maturation MRF4 Myotubes

Myofiber genes

Myofiber

El proceso de diferenciacin celular consiste en una coordinada sucesin de eventos moleculares

Northerns:

(actividad

Marcadores del ciclo celular

GM= growing medium DM = differentiation medium

Marcadores de la diferenciacin muscular

Modified from Mol Biol Cell 1998 Jun;9(6):1449-63

MyoD promueve la transcripcin de p21, regulador negativo del ciclo

(c-Abl es un gen pro-apopttico)

Dev Cell 2002 Dec;3(6):757-8

Las clulas a diferenciarse pasan por un checkpoint de G1 y despus por uno de diferenciacin, que consiste en la activacin de un master gene que le da la potencialidad a la clula de convertirse en una clula diferenciada (p ej stem cell de tejido) . La activacin del master gene produce una salida irreversible del ciclo celular (Go) y la expresin de marcadores especficos de diferenciacin que le cambian la morfologa a la clula y la convierten en diferenciada. Las clulas terminalmente diferenciadas no ciclan (con pocas excepciones). El dao severo al ADN puede,a travs de una seal cAbl-dependiente, regular negativamente la actividad del master gene MyoD, evitando as que clulas con mutaciones masivas diferencien y formen tejidos (Nat. Genet. [2002] 10: 1038)

Mitosis y Citocinesis

Instructor: Carlos J. Pasiche Lisboa

Ciclo celular
.

Las actividades metablicas y fsicas de las clulas pasan a travs de una secuencia de eventos que llamamos el ciclo celular. El ciclo consta de dos fases principales: interfase y mitosis

La mayor parte del ciclo lo ocupa la interfase y slo una pequea parte lo ocupa las restantes fases que forman la mitosis y citocinesis.

Interfase

Se conoce como la etapa de reposo ya que no hay cambios visibles en la forma de la clula, pero es un periodo de gran actividad metablica ya que est ocurriendo la duplicacin del material cromosmico (DNAcido desoxirribonucleico). En esta fase la clula se prepara para la divisin. La interfase se subdivide en tres etapas
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Mitosis
Periodo durante el cual los eventos visibles de las divisiones celulares ocurren.

Profase

Comienza con la condensacin de filamentos de cromatina que dar lugar a los cromosomas.

Cromosoma
Consiste de dos cromtidas que, en las clulas animales, se mantienen unidas por un centrmero
un cromosoma (no duplicado)

dos cromosomas (duplicado)

cromtida cromtida

dos cromtidas hermanas

dos cromosomas (duplicado)

El ciclo celular

cromosoma (no duplicado) clulas en interfase

Cromosoma duplicados en interfase antes de mitosis

mitosis, divisin del citoplasma

cromosoma en la clula hija

Profase
El nucleolo y la membrana nuclear desaparecen, y simultneamente comienza la sntesis del huso mittico.

Metafase

Los cromosomas se unen al huso mittico (o filamentos de protenas) por los centrmeros y se alinean en el plano ecuatorial de la clula. Durante esta etapa el centrmero se divide quedando cada cromtida con su propio centrmero.

Anafase

Se separan los centrmeros y cada cromtida se separa movindose lentamente al polo celular. Al terminar la anafase los cromosomas han formado un grupo en cada polo celular.

Telofase

Al agruparse los cromosomas en los polos celulares, en las clulas animales comienza a aparecer una constriccin a lo largo del plano ecuatorial que se mueve desde la membrana celular hasta el interior de la clula. Este proceso se llama citocinesis. Los eventos que le siguen son esencialmente contrarios a los de la profase

Divisin del citoplasma

Citocinesis

Meiosis
Es la divisin celular en la que el nmero de cromosomas se reduce a la mitad y se forman gametos. La clula pasa por dos divisiones sucesivas, pero los cromosomas se duplican slo una vez. La dos divisiones resultado cuatro haploides. tienen clulas como hijas

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Las etapas de la Meiosis

Meiosis consiste en dos divisiones sucesivas: Meiosis I Meiosis II Cada una de estas divisiones son similares a las fases de la mitosis.

30

Meiosis I: proceso reductor (De diploide a haploide)

Meiosis II: Proceso mittico

31

Sinapsis:
Los cromosomas homlogos (que codifican para la misma caracterstica) se aparean

33

Entrecruzamiento:
Intercambio de los fragmentos cromosmicos entre las cromtidas de los cromosomas homlogos

34

Metafase I
Las ttradas se alnean a lo largo del ecuador de la clula. stas se alinean en ngulo recto con las fibras del huso. Cada cromosoma est pegado a una de las fibras del huso.

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Intercinesis
Es similar a la interfase, pero los cromosomas no se replican. Las fases que siguen, de la segunda divisin celular de meiosis, ocurren en las dos clulas formadas por la primera divisin celular.

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GENES que CONTROLAN el CICLO CELULAR en EUCARIOTAS

Presentacin powerpoint original: gentileza de la Dra. (FIL)

Vanesa Gottifredi

2001. Ao del ciclo celular

Premios Nobel 2001 de Fisiologa y Medicina

Leland Hartwell (1939). Fred Hutchinson Cancer Research Council, Seattle, USA Paul Nurse (1949). Imperial Cancer Research Foundation (ICRF), London, UK Timothy Hunt (1943) ICRF, London, UK

Es tan simple realmente? simtrica en general, excepto en S. cereviciae, que es por gemacin (divisin asimtrica: una clula hija ms grande y otra ms pequea)

El ciclo celular

Caractersticas fundamentales: Altamente Ordenado Finamente regulado

Funciona un nmero finito de veces en una poblacin celular en divisin; Despus: senescencia y apoptosis
Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Preguntas frecuentes

Cunto tiempo dura el ciclo celular? Se puede medir el tiempo que dura cada etapa? Se puede saber cul de las etapas estn atravesando las clulas? qu seales inducen la divisin celular?

Clculos (pioneros) de la duracin del ciclo celular entero La duracin del ciclo celular vara de acuerdo al entorno en el
que se encuentra un tipo celular determinado a expensas de la duracin de las distintas fases, excepto M, que es bastante constante = aprox 1 hora. ejemplo: para medir la duracin del ciclo celular de los hepatocitos que forman parte del hgado de un ratn adulto, se prepararon cortes y se los ti con un colorante para que las clulas en mitosis resultaron fcilmente reconocibles al microscopio. Habiendo observado 25.000 clulas en total, se encontraron solamente 3 clulas en mitosis (ndice mittico). duracin del ciclo celular (x) de los hepatocitos en el hgado de un ratn adulto: 1 hora /x = 3 /25000 x = 1 ao

Clculos (pioneros) de la duracin de las fases del ciclo celular En otro experimento, los hepatocitos fueron disgregados
1) 2)

y puestos en condiciones de cultivo (asincrnico). En un momento se agreg timidina radioactiva y a distintos tiempos, se separaron alcuotas para: contar las clulas totales (Fig 1) fijar, teir las clulas y prepararlas para radioautografa, sobre la cual se hicieron dos tipos de anlisis: conteo de clulas en mitosis radioactivas (Fig 2A) medicin de la intensidad de las seales radioactivas (nmero promedio de granos de plata) sobre las clulas mitticas (Fig 2B)

Clculos (pioneros) de la duracin de las fases del ciclo celular (cont.)

Fig. 2

primeras mitosis marcadas provienen de cl que estaban saliendo de S cuando se agreg la marca G2 = 3hs

Fig. 1 Curva de crecimiento en medio lquido Se mide el tiempo de duplicacin de la poblacin celular. Aqu: aprox = 20 hs S = 7 hs

G1 = 20 (3 + 7) = 10 hs

todo empieza con Factores de crecimiento

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

algunos actores moleculares que promueven el ciclo

algunas reacciones duran miliseg; otras, seg

esto es un ejemplo de lo que se llama transduccin de seales = secuencias (cascadas) de reacciones bioqumicas que convierten el estmulo (seal) externo en un fenotipo celular evidente p. ej. divisin celular

pero como ven, hay muchas vas de transduccin

El ciclo se arresta (G0) debido a: contacto cl-cl (quiescencia) ayuno (quiescencia) linaje celular viejo (senescencia; irreversible apoptosis)
una de las vas, como ejemplo

actores moleculares en el ncleo

loop regulatorio

En el ncleo, las ciclinas se unen a kinasas llamadas CDKs (cyclin-dependent kinases) y las activan. Son su subunidad regulatoria

la unin a ciclinas facilita fosforilaciones activadoras de CDKs en algunas posiciones aminocidicas por parte de kinasas otro mecanismo de activacin es la defosforilacin de CDKs en algunas posiciones aminocidicas por parte de fosfatasas (ej. cdc25)
Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

= cdk1

hay cdks y ciclinas especficas para cada etapa del ciclo celular

cada kinasa es activada por una ciclina especfica Las CDKs son reguladores positivos del ciclo

Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

= ciclina B

cdk1

las ciclinas se degradan cuando ya no se necesitan en la etapa correspondiente del ciclo celular

cdk1

cdk4

ciclina E cdk2 = ciclina D Ratones KO en genes de ciclinas tienen problemas neurolgicos

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Las ciclinas oscilan durante el ciclo celular; se degradan en el proteasoma

(fase S) (fase M)

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3 th edition

Por lo tanto, las cdks se vuelven inactivas al final de cada fase promueve la progresin a la siguiente fase del ciclo

La degradacin proteasomadependiente de cyclin B determina (indirectamente) la direccionalidad de la transicin M G1

Si se inhibe artificialmente la degradacin de ciclina B (con inhibidor de proteasoma o versin no-degradable de ciclina B) la progresin de M G1 se ciclina B torna reversible !!!
clulas Hela o inh. proteasoma

Gorbsky, Nature 2006

Checkpoints (Puntos de control)

Pregunta

= momentos del ciclo en los que ocurre control de calidad y decisin del futuro (seguir ciclando o detenerse)

pasado el checkpoint, la progresin del ciclo es irreversible no hay vuelta atrs

Decisin: seguir o detenerse

El DNA est intacto?: Si no lo est, las seales de dao hacen arrestar el ciclo para su reparacin
Modified from Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3 th edition

Inhibidores de CDKs (CKIs): protenas que disminuyen la velocidad el ciclo

Cdk1=

Los CKIs son reguladores negativos del ciclo celular

Existen dos tipos de inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas (CKIs)

Regulacin negativa

(citokina)

Regulacin positiva

Rb: otro importante regulador negativo, un alelo mutado somticamente en casos de retinoblastoma
(el otro heredado germinalmente)

E2F libre

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

Mirando en detalle, Rb siempre est fosforilada. Est inactiva como secuestradora (de E2F) cuando est moderadamente fosforilada

E2F libre

Los mamferos tenemos dos genes parlogos de Rb: p107 y p130. Por lo tanto, fenotipos visibles (tumores) en ratones KO son evidentes en triples KO

Resumiendo: las CDKs son reguladores positivos del ciclo algunas lo son porque indirectamente liberan a E2F,
que es un regulador positivo

CDK2/ ciclina E CDK2/ ciclina E

(CDK2 inhibe a Rb ..como secuestrador) (Rb secuestra a E2F)

RB

E2F

simplificando.

E2F (libre)

Mltilples genes target de E2F (conocidos mediante ChIP)

genes que codifican a protenas del Origin Recognition Complex (ORC), requisito para replicacin de DNA en fase S Myc (regulador positivo = oncogen) ciclina E (ayuda a CDK2 en fosforilar a Rb) ARF (inhibe a MDM2, que degrada a p53)
Adems, genes implicados en otras fases del ciclo: DNA damage checkpoint and repair pathways chromatin assembly/condensation chromosome segregation, mitotic spindle checkpoint apoptosis differentiation.

Resumen: Durante un ciclo celular, el balance de la actividad de reguladores positivos y negativos son responsables de la salida de una fase y entrada a la siguiente. Positivos: CDKs-ciclinas; E2F Negativos: CKIs (que inhiben actividad de CDKs); Rb Rb inhibe la actividad transcripcional de E2F. La fosforilacin de Rb por CDK2 produce la liberacin de E2F. Si el balance es positivo para actividad de CDK2 y para actividad de E2F, la clula entra en fase S y cicla.

Otro importante regulador negativo: p53

Homotetrmero*, Factor de Transcripcin activador de genes reguladores negativos del ciclo

domains:

R175

R248 G245 R249

R273 R282

Activation SH3-like

Basic DNA-binding domain arginine-rich Tetramerization

*1 sola subunidad mutada tetrmero no funcional: mutacin dominante negativa

P53 es un factor transcripcional clave para el ciclo celular p53

Apoptosis Growth arrest Prevention of blood vessel formation P21, Scotin,Fas, Bax, PERP TSP1, BAl1, miR-34, Pig3, Killer/DR5,AIP1, GADD45, Maspin, GD-AIF Noxa, Sepuku
14-3-3-

p53
freno principal del ciclo

MDM2
destruye el freno

El dao en el DNA provoca el arresto del ciclo via fosforilacin de p53 (su forma activa)

DNA breaks

mecanismo de resguardo contra proliferacin excesiva

E2F

ac es reg. neg.

ATM

(una kinasa)

ATR (otra kinasa)

ARF*(P14 humanos:
p19 ratn)

interacta con (inhibiendo)

p53
fosforilada

MDM2

*ARF adems se une a E2F, promoviendo su degradacin en proteasoma (Rizos et al., Cell Cycle, julio 2007)

Mutaciones en genes del ciclo celular implicadas en enfermedades humanas

telang: vasos sang en la piel

Li-Fraumeni Syndrome (LFS; OMIM #151623) is an autosomal dominant cancer predisposition syndrome characterized by early onset tumors including sarcomas, breast cancer, leukemia, brain tumors, and adrenocortical carcinoma. Li-Fraumeni syndrome is primarily attributed to germline mutations in the p53 tumor suppressor gene, In addition to germline p53 mutations, the p53 gene is the most commonly mutated gene in human cancers, with as much as 50% of tumors containing somatic p53 mutations.

Cancer Res. 2003 Oct 15;63(20):6643-50.

cross-talk between Rb and p53 pathways: dos paradigmticos supresores de tumores

CDK2 |
Ciclina E

p21

Modified from Exp Cell Res 2001 Mar 10;264(1):56-66

Resumen: P53 est mutada en 50% de los casos de cncer (germinal y somticamente). P53 es un factor transcripcional que puede inducir arresto del ciclo celular o eventualmente muerte celular programad actuando como guardin del genoma (evita la inestabilidad genmica). Uno de los blancos transcripcionales de p53 es MDM2. Esta protena es una E3 ligasa de ubiquitina para la degradacion de p53 en el proteosoma. Por lo tanto, este feedback negativo regula los niveles de p53. Otro blanco transcripcional de p53 es p21, lo que explica su capacidad de arrestar el ciclo celular en G1 Otro blanco transcripcional de p53 es miR-34, un microRNA que degrada el mRNA CDK2 (paper de seminario)

La actividad de p53 activa (fosforilada) aumenta como consecuencia de la aparicin de seales de dao al ADN

en qu fase del ciclo estn las clulas?

si se usa colorante fluorescente para DNA, p. ej. DAPI

FACS
(Fluorescent activated cell sorter)

Molecular biology of the cell, Alberts et al., 3th edition

en qu fase del ciclo estn las clulas?

Go/G1 G2,M

Anlisis esttico FACS

S 2n 4n

Anlisis dinmico para ver si las clulas estn ciclando: agregarles un pulso de BrDU: las que estn atravesando S se vern rojas. Si ciclaron, despus de unas horas se vern rojas las que estn en G2, M y G1 (antes estuvieron en S)

Seales de dao en DNA

plataforma recombinasa exonuecleasa

complejo sensor

focos de dao visibles al microscopio mediante anticuerpos

ayuda en NHEJ Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. van Attikum & Gasser
2009

El dao severo en el DNA (SSBs y DSBs) hacen frenar el ciclo en G1 y G2 (para su reparacin por maquinarias reclutadas por el complejo sensor MRN) por una va dependiente y otra independiente de p53
E2F queda secuestrado por Rb va indep. de p53 (freno accesorio)
fosforilada queda inactiva y no puede fosforilar a Rb

principalmente Chk1

fosforilada se degrada y no puede activarla

fosfatasa de Cdk2

va dep. de p53 (freno principal)

E2F queda secuestrado por Rb inactiva no puede fosforilar a Rb

FEBS Lett 2001 Feb 16;490(3):117-22

p53 protagonista

Los blancos de p53 son p21 y miR-34 (arresto en G1 y G2),

(y Gadd45 y 14-3-3 (en G2)) para facilitar la reparacin del dao

detalle de sus sitios de fosforilacin

G1 and G2

eventualmente
Genes Dev 2001 Sep 1;15(17):2177-96

Mutaciones en genes del ciclo celular implicadas en enfermedades humanas

SENSORS and EFFECTORS

MEDIATORS

* ataxia = incoordinacin de movimientos (cerebelo) telangiectasia = malformaciones arterio-venosas hemorragias

Racionalidad de la radioterapia anti-tumoral (en clulas artificialmente

sin el freno p53)

La radiacin en dosis moderadas mata a clulas deficientes en p53, que no pueden arrestar eficientemente en G1 o G2: mitosis catastrfica (imposibilidad de citokinesis
debido al dao de DNA)

KO de p53

Southern
KO

FACS

irradiadas

irradiadas

WT Las clulas que tienen p53 se arrestan en G1 y G2,reparando el dao, mientras que las p53-/- entran en una mitosis abortiva que finalmente las destruye (observar por FACS degradacin de DNA a 72 hs). Las drogas inhibidoras de CHK1 (junto con agentes que daan el DNA) ayudan en los tratamientos anti-cncer p53-/- aprovechando este principio, porque impiden totalmente el arresto por la va independiente de p53, forzndolas a entrar en mitosis catastrfica, no afectando a las normales que pueden usar CHK2 para fosforilar a p53
Science (1998) 282(5393): 1497-1501

___

Conclusin del trabajo anterior

Although p53 mutations provide cells with a selective growth advantage, such mutations burden them with a significant G1 or G2 checkpoint deficit; they cannot respond normally to DNA-damaging agents and enter mitosis and subsequently replicate their genomes in the presence of DNA damage, with failure of cytokinesis (analoga con auto sin frenos como para poder detenerlo en el taller y as reparar otros serios defectos; el auto choca). Such checkpoint defects may be exploited to treat the many cancers with abnormalities of p53 function.

Resumen de respuesta de los controladores del ciclo celular al dao en DNA:

El dao al ADN produce una inmediata respuesta celular como consecuencia de la activacin de kinasas sensoras de SSBs y DSBs (DNA con extremos desnudos), que fosforilan a ATM y ATR: Como consecuencia, H2A-X en la regin de dao queda fosforilada en Ser139, que recluta a muchas protenas,formando focos de dao, entre ellas HATs y recombinasas de la familia Rad, que van a facilitar la reparacin una vez que el ciclo est arrestado. Los focos rpidamente activan a CHK1 y CHK2, las cuales fosforilan a p53 y a la fosfatasa cdc25 (va indep. de p53), arrestando el ciclo en los checkpoint de G1, S y G2. La fosforilacin de p53 la libera de su degradador MDM2. Por lo tanto, p53 se acumula y tambin aumentan los niveles de las protenas de sus blancos transcripcionales, p. ej. p21 (y otros como GADD45, 14-3-3, y miR-34), que anulan la actividad de ciclinas B, D y E, ocasionando arresto en G1 y G2.

Diferenciacin Clular y ciclo celular

modelo muy estudiado: msculo

Relacin entre

Las clulas diferenciadas no ciclan clulas musculares

Mol Biol Cell 1998 Jun;9(6):1449-63

Upstream activators Determination MyoD/Myf5

Mesodermal progenitor

Myoblast

Differentiation

Myogenin Maturation MRF4 Myotubes

Myofiber genes

Myofiber

El proceso de diferenciacin celular consiste en una coordinada sucesin de eventos moleculares

Northerns:

(actividad

Marcadores del ciclo celular

GM= growing medium DM = differentiation medium

Marcadores de la diferenciacin muscular

Modified from Mol Biol Cell 1998 Jun;9(6):1449-63

MyoD promueve la transcripcin de p21, regulador negativo del ciclo

(c-Abl es un gen pro-apopttico)

Dev Cell 2002 Dec;3(6):757-8

Las clulas a diferenciarse pasan por un checkpoint de G1 y despus por uno de diferenciacin, que consiste en la activacin de un master gene que le da la potencialidad a la clula de convertirse en una clula diferenciada (p ej stem cell de tejido) . La activacin del master gene produce una salida irreversible del ciclo celular (Go) y la expresin de marcadores especficos de diferenciacin que le cambian la morfologa a la clula y la convierten en diferenciada. Las clulas terminalmente diferenciadas no ciclan (con pocas excepciones). El dao severo al ADN puede,a travs de una seal cAbl-dependiente, regular negativamente la actividad del master gene MyoD, evitando as que clulas con mutaciones masivas diferencien y formen tejidos (Nat. Genet. [2002] 10: 1038)