UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS

RELATRIO DE AULA PRTICA DA DISCIPLINA DE MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Ana Paula Ferro Bruna Polacchine da Silva Cidnei Marschalk Fabiane Cristina dos Santos Thatiane Rodrigues Mota Vernica Sayuri Nishida Prof Dra. Rosane Marina Peralta

MARING, SETEMBRO DE 2012.

1 Introduo
1.1-Amilase
A -amilase (1,4--D-glicano glicanoidrolase) possui atividade endohidroltica e atua aleatoriamente sobre ligaes glicosdicas -1,4, produzindo uma mistura de glicose, maltose, maltotriose e dextrinas, podendo ser encontrada em animais, plantas, fungos e bactrias. Amilases so membros da famlia das amilases ou famlia 13 das glicosdeo hidrolases (GH13), classificao esta, baseada na similaridade das sequncias de aminocidos (HENRISSAT e BAIROCH, 1996) e cuja relao estrutural e evolucionria com outros membros da famlia das glicosdeo hidrolases vem sendo amplamente investigada (JANEEK, 1997; PUJADAS e PALAU, 2001). As -amilases compartilham a estrutura barril (/)8, similar a encontrada para a triose fosfato isomerase (TIM) e ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), apresentando no entanto, caractersticas distintas em sua estrutura primria que as diferem da TIM e CGTase. O tipo de arranjo estrutural encontrado nas -amilases pode ser evidenciado tambm nas famlias GH-70 e GH-77 das glicosdeo hidrolases, desta forma, as famlias GH-13, GH-70 e GH-77 foram organizadas em um novo grupo, GH-H, que reflete aspectos evolutivos mais prximos entre seus membros, como por exemplo, os resduos catalticos e a disposio espacial dos mesmos (VIEIRA-JUNIOR, 2001).

1.2Mtodo de Bradford
O mtodo de Bradford uma tcnica para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250. Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595nm, tem sido utilizado para a determinao de protenas totais em diversos meios: plasma ou soro sanguneo, lquor, saliva humana, produtos alimentcios, leite humano, tecidos de plantas, suspenses de clulas, avidina e estreptoavidina, urina e detergentes. As metodologias utilizando equipamentos automatizados esto tornando este mtodo mais rpido. Apesar do mtodo de Bradford ser mais rpido, sensvel e estar sujeito a um nmero bem menor de interferentes que o mtodo de Lowry, o mesmo apresenta algumas desvantagens, tais como a variao da absortividade especfica para diferentes protenas, devido baixa solubilidade ou baixo peso molecular das mesmas e fornecimento de resultados nem sempre reprodutveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedncia, sendo recomendvel a padronizao das condies de reao para cada lote de corante adquirido. No caso de amostras com protenas de baixo peso molecular, no recomendado a utilizao deste mtodo.

Existem substncias que so interferentes no mtodo de Bradford, e estes interferentes normalmente reagem com as protenas impedindo a reao com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbncia (Tabela 1).
Tabela1: Algumas substncias que interferem na determinao de protenas totais.

Fonte: ZAIA et. al., 1998.

1.3Mtodo do DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico)

Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o mtodo do DNS. um mtodo rpido e prtico na determinao de acares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicao tem: controle de qualidade na caracterizao das matrias primas para fins de processamento, verificao se determinado produto est dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao, indstria aucareira, no acompanhamento do processo de fermentao, que permite verificar as taxas de consumo de acar pelo microrganismo. A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se na reduo, em meio alcalino, do cido 3,5-dinitrosaliclico (colorao amarela). O produto formado estvel, com colorao laranja-avermelhado (cido 3-amino-5-nitrosaliclico) na proporo estequiomtrica e mxima absoro da luz visvel no comprimento de onda de 540nm. Neste mtodo ocorre a seguinte reao de oxidao (Figura 1):

Figura 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS. Fonte: MILLER, 1959.

1.4 Mtodos de separao de protenas

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As tcnicas de separao de protenas podem ser classificadas em trs categorias: alta produtividade e baixa resoluo; alta resoluo e baixa produtividade; alta resoluo e alta produtividade. As tcnicas de baixa resoluo e alta produtividade so usadas na concentrao das protenas. Em seguida, para o fracionamento das protenas so utilizadas as tcnicas de alta resoluo e baixa produtividade ou alta resoluo e alta produtividade (GHOSH, 2003). Os processos de bioseparao comumente usados na concentrao, purificao e fracionamento de protenas esto apresentados na Tabela 2. A ultrafiltrao listada em duas categorias, sendo que a resoluo do processo depende do produto que ser obtido e da forma que o processo ser operado.
Tabela 2. Tcnicas de bioseparao de protenas.

Categorias

Alta produtividade e baixa resoluo

Processos Precipitao Centrifugao Extrao lquido-lquido Microfiltrao Ultrafiltrao Extrao supercrtica Cromatografia em leito empacotado Ultracentrifugao Separao por afinidade Eletroforese Cromatografia com fluido supercrtico Cromatografia em leito fluidizado Cromatografia em membrana Ultrafiltrao Cromatografia de coluna com monlitos

Alta resoluo e baixa produtividade

Alta resoluo e alta produtividade

Adaptada de GHOSH (2003).

1.5 Cromatografia de excluso molecular

Mais recentemente, a cromatografia de excluso molecular (CEM) tem sido empregada, Tempo Tempo n n com sucesso no fracionamento de substncias em diferentes sistemas e em diferentes matrizes (CHIN & GSCHWEND, 1991; SHAW et al., 1994; NOVOTNY et al., 1999). A CEM tem-se caracterizado pela rapidez e confiabilidade na aferio do peso molecular. O uso dessa tcnica baseia-se no princpio de migrao diferenciada do material na coluna cromatogrfica. Molculas de maior peso molecular exibem menor interao com a matriz silicosa que empacota a coluna cromatogrfica, sendo excludas no menor tempo possvel. Molculas de menor peso molecular tm maior tempo de reteno por exibir caminho mais sinuoso, em virtude do maior aprofundamento na estrutura do material que empacota a coluna. Compostos de tamanho molecular intermedirio exibem velocidades de migrao mdias quelas das classes de compostos anteriormente citadas (MEYER, 1993). A cromatografia de excluso molecular um dos mtodos com mais vasta aplicao. frequentemente usada, como o primeiro passo de uma purificao para separar molculas de
Lquido que sae da Lquido coluna que sae da coluna recolhid o em recolhido tubos em tubos de de umum coletor de coletor de fraes fraes

interesse das que tm caractersticas (de tamanho) radicalmente diferentes. Tambm pode ser empregada para mudar o ambiente do tampo ou para retirar o sal de uma amostra de biopolmeros, como por exemplo, a remoo de sal em amostras contendo protenas precipitadas por salting out, sendo um processo menos moroso do que a dilise. Finalmente, a cromatografia pode ser implementada como um meio para determinar parmetros moleculares como o raio hidrodinmico e a comum massa molecular, o que conseguido usando, por exemplo, protenas de peso molecular bem conhecido e traando uma reta de calibrao, como ser descrito a seguir (HUBER, 2000). De acordo com DEUTSCHER et al. (1990) na cromatografia de excluso molecular, um volume de eluio do pico do soluto (Vr) de substncias de peso molecular elevado (MW), tendo um coeficiente de distribuio, aproximadamente, de 1.0 coincide com o volume de espaos vazios, intra partculas da coluna (Vm). Para molculas com um coeficiente de distribuio menor que 1.0, existe uma relao linear entre o log (MW) e o volume ou tempo de eluio do soluto. Assim, em condies ideais, a ordem de eluio pode ser prevista, geralmente, pelo tamanho de molculas uma vez que existe uma relao linear entre o seu volume de eluio e o valor logartmico do seu peso molecular (MIKES, 1988). exibido, esquematicamente, o grfico de calibrao na Figura 2. Em determinadas gamas do peso molecular (MW) de um soluto ou nanopartculas existe uma dependncia linear de log (MW) com o volume de eluio ou o tempo de reteno, intervalo 2. Molculas maiores so excludas e no separadas numa situao como a do intervalo 1. Molculas menores penetram completamente na fase estacionria e no esto separadas na situao do intervalo 3.

Figura 2. Representao esquemtica da dependncia do peso molecular dos solutos (MW) com o tempo de reteno, onde V0 o volume de espaos vazios e Vt o volume total da coluna.

A CEM apresenta a vantagem de requerer pequenas quantidades de material a ser analisado e propicia ainda medies diretas, as quais resultam em avaliaes de propriedades das substncias. Para se conseguir uma boa resoluo fundamental a escolha do gel (matriz), o tamanho da amostra e a qualidade do enchimento da coluna. De um modo geral, deve-se escolher um gel em que as molculas de maior dimenso saiam com o volume de espaos vazios. Na cromatografia em coluna, o slido utilizado na fase fixa deve ser um material insolvel na fase mvel associada (eluente); sendo que os mais empregados so a slica gel
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(SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de p finamente dividido. A mistura a ser separada colocada na coluna com um eluente pouco polar, aumentando-se gradativamente a polaridade do eluente e, consequentemente, o seu poder de arraste de substncias mais polares. O fluxo de eluente deve ser contnuo para no haver o ressecamento do material que preenche a coluna (recheio). Os diferentes componentes da mistura movem-se com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e tambm pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente em relao ao composto. medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou zonas mveis comeam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. De um modo geral, os compostos apolares atravessam a coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros tm menor afinidade com a fase estacionria. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela no se mover. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eludos sem serem separados. Com uma escolha cuidadosa das condies (adsorvente, eluente, tamanho da coluna, velocidade de eluio), praticamente qualquer mistura pode ser separada (Figura 3).
Tempo 0 Tempo 1 Tempo 2 Tempo n

Figura 3. Ilustrao de uma cromatografia de excluso molecular, em que a amostra passada atravs da coluna e separada conforme seus pesos moleculares. As fraes so coletadas e analisadas.

Trs parmetros permitem avaliar a eficincia do processo de purificao de uma protena: - Atividade especfica (AE): a razo entre a quantidade da protena de interesse, medida atravs de sua atividade biolgica, e a quantidade total de protenas presentes em cada etapa de purificao. Esse ndice aumenta ao longo da purificao; - ndice de purificao: indica quantas vezes em relao ao material de partida a protena de interesse foi concentrada. Calcula-se como a razo entre as atividades especficas inicial (material de partida) e final (protena pura); - Rendimento: indica quanto (em %) da protena de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificao. Um certo grau de perda inerente do
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processo de purificao (em cada etapa s devem ser processadas as fraes mais ricas em atividade biolgica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). Tambm podem ocorrer perdas por desnaturao das protenas devido s diferentes condies (pH, sais, etc) a que so submetidas nas diferentes etapas de purificao. Espera-se recuperar o mximo possvel da protena de interesse.

1.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE

Eletroforese o fenmeno de movimentao de uma molcula por um campo eltrico, sendo a velocidade de migrao dependente da intensidade do campo eltrico, da carga global da protena e do coeficiente de atrito (massa e forma da molcula + viscosidade do meio). A movimentao da molcula carregada depende da fora eltrica que a impulsiona para o eletrdio com carga oposta. As separaes eletroforticas so quase sempre executadas em gis, porque o gel serve de peneira molecular que acentua a separao. Molculas que sejam pequenas em relao aos poros no gel movem-se prontamente atravs dele, enquanto molculas muito maiores que os poros so quase imveis. Molculas de tamanhos intermedirios movem-se atravs do gel com graus variveis de facilidade. O sentido do fluxo de cima para baixo. A eletroforese executada em uma fina lmina vertical de poliacrilamida. Os gis de poliacrilamida so meios de suporte preferidos para eletroforese, porque so quimicamente inertes e so prontamente formados pela polimerizao de acrilamida com uma pequena quantidade do agente interligante metileno-bisacrilamida, includo para fazer uma malha tridimensional. A eletroforese difere da filtrao em gel no fato de que todas as molculas, no importa qual o tamanho, so foradas a se moverem atravs da mesma matriz (BERG et al., 2008). As protenas podem ser separadas, principalmente em base de massas, pela eletroforese em gel de poliacrilamida em condies desnaturantes. A mistura de protenas antes dissolvida em uma soluo de dodecil sulfato de sdio (SDS), um detergente aninico que rompe quase todas as interaes no covalentes em protenas nativas. Tambm se adiciona mercaptoetanol (2-tilo-etanol) ou ditiotreitol para reduzir as pontes dissulfetos. Os aniontes do SDS ligam-se s cadeias principais em uma proporo de cerca de um para cada dois aminocidos. Este complexo de SDS com uma protena desnaturada tem grande carga negativa, que aproximadamente proporcional massa da protena. A carga negativa adquirida na ligao ao SDS geralmente muito maior do que aquela na protena nativa, portanto, esta carga nativa torna-se insignificante. Os complexos SDS-protena so ento submetidos eletroforese. Quando esta estiver completa as protenas no gel podem ser visualizadas pela colorao com prata ou com um corante, o azul de Coomassie, que revela uma srie de faixas. Marcaes radioativas, se tiverem sido incorporadas nas protenas, podem ser detectadas, colocando-se uma chapa de raio X sobre o gel, um procedimento chamado de auto-radiografia (BERG et al., 2008). Protenas pequenas movem-se rapidamente atravs do gel, enquanto as grandes permanecem acima, perto do ponto de aplicao da mistura. A mobilidade da maioria das cadeias peptdicas nestas condies diretamente proporcional ao logaritmo de suas massas. Contudo, algumas protenas ricas em glicdeos e as protenas de membranas no obedecem esta
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relao emprica. A tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (muitas vezes referida como SDS-PAGE do ingls sodium dodecyl sulfate-poliacrylamide gel electrophoresis), rpida, sensvel e capaz de alto grau de resoluo. Basta uma quantidade de 0,1g ( 2pmoles) de uma protena para dar uma faixa distinta com azul de Coomassie, e at menos ( 0,02g) pode ser detectado na colorao com prata. Protenas que difiram em massa por cerca de 2% (por exemplo, 50 e 51KDa, provenientes de uma diferena em torno de 10 aminocidos) podem geralmente ser distinguidas. Podemos examinar a eficcia de nosso esquema de purificao, analisando uma parte de cada frao por eletroforese. A frao inicial apresentar de dzias a centenas de protenas. Na medida em que progride a purificao, o nmero de faixas diminui e a salincia de uma das faixas aumenta. Esta faixa corresponde s protenas de interesse (BERG et al., 2008). Para a anlise do gel deve-se medir, com o auxlio de uma rgua, a distncia percorrida pelo corante azul de bromofenol, a dos marcadores de peso molecular e da amostra estudada. Posteriormente deve-se calcular o Rf (mobilidade relativa), dividindo a distncia percorrida por cada marcador pela distncia percorrida pela corante. Assim, constri-se um grfico plotando na abcissa os valores de Rf e na ordenada os logaritmos dos pesos moleculares dos padres. Para a anlise da amostra deve-se interpolar na reta o Rf da amostra, e assim, determinar seu peso molecular (BRACHT et al., 2003).

2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Purificar e caracterizar a amilase pancretica suna comercial.

2.2 Objetivos especficos

Determinar a atividade de uma amilase pancretica suna comercial e avaliar a atividade especfica (U/mg de protenas); Fracionar a amostra fornecida por cromatografia de excluso molecular; Avaliar o produto obtido por cromatografia de excluso molecular por eletroforese de poliacrilamida desnaturante; Avaliar a massa molecular da amilase pancretica.

3 Materiais e Mtodos
3.1 Dosagem de Protenas
As protenas foram dosadas pelo mtodo de Bradford (1976), utilizando-se soro albumina bovina como padro. Amostra: diluio 1:1 (10mg de -amilase em 10mL de tampo fosfato-sdio 20mM com NaCl 100mM, pH 6,9). 3 tubos de ensaio: 1) Branco: 0,25mL de gua destilada + 2,5mL de reagente de Bradford; 2/3) Amostra (duplicata): 0,25mL amostra (1:1) + 2,5mL de reagente de Bradford.
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Esperou-se 5 min a temperatura ambiente e em seguida, a leitura foi realizada em espectrofotmetro (Shimadzu UV 1800) em 595nm. Clculo: fator de Bradford (0,168) x Abs= mg/mL Obs: na preparao da amostra enzimtica, esta foi bem homogeneizada para a total dissoluo. Como isso no ocorreu, a amostra foi submetida a centrifugao a 5000rpm/5min (Jouan BR 4i refrigerada). Aps a preparao da amostra, esta foi mantida sempre em banho de gelo.

3.2 Ensaio para atividade enzimtica em U/mL:

Mtodo de Miller (1959) DNS Substrato: amido 1% em tampo fosfato-sdio 20mM com NaCl 100mM, pH 6,9. A amostra foi diluda em tampo (1:50). A reao ocorreu em 4 tubos: 1) 1mL de amido 1% foi deixado em banho-maria por 2 min/30C, em seguida, adicionou-se 1mL de enzima (amostra 1:50) e a mesma foi agitada. Retirou-se uma alquota de 250l imediatamente para o tubo 2 (previamente com DNS) e aps 5 min de reao em banhomaria 30C, foi transferido 250l do tubo 1 para os tubos 3 e 4 tambm previamente com DNS; 2) Branco: 250l DNS + 250l da reao 1; 3/4) 250l DNS + 250l da reao 1 aps 5 min (em duplicata). Os tubos 2, 3 e 4 foram fervidos por 5min (a gua j deve estar fervendo, pois a reao com o DNS ocorre em temperatura acima de 80 C), em seguida, os mesmos foram transferidos para banho frio afim de diminuir a temperatura, logo depois foi adicionado 2,5mL de gua deionizada em cada tubo. A leitura foi realizada em espectrofotmetro (Shimadzu UV 1800) a 540nm. Clculo: abs/fator DNS (0,1113) x diluio= U/mL

3.3 Atividade Especfica da enzima em U/mg de protena:

Clculo: atividade enzimtica (U/mL) / dosagem de protenas (mg/mL).

3.4 Preparao da coluna e determinao do volume morto

A resina Sephadex G-50 foi hidratada com gua e posteriormente equilibrada com tampo Fosfato de sdio 20mM com NaCl 100mM pH 6,9. Foi adicionado de maneira homognea 200l de blue dextran 2mg/mL em toda a superfcie da resina, para verificar se o empacotamento foi adequado e para determinar o volume morto da coluna, sendo que este refere-se ao volume necessrio para a eluio de partculas que no entram em qualquer poro da resina de filtrao. A quantidade de blue dextran foi determinada a partir do volume total da coluna (25mL), pois o volume do corante deve ser no mximo 1% deste valor. Em seguida, tambm, superfcie da resina, foi adicionado o tampo para a eluio do corante. O material foi coletado em tubos de vidro na parte inferior da coluna, sendo que em cada qual foi adicionado 1mL. A coleta terminou assim que o blue dextran foi retirado completamente nos
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tubos e estes foram levados ao espectrofotmetro para medir a absorbncia a 610nm. Foram lidas somente as amostras que apresentaram indcios de corante (amostras 8 a 12) e a partir das absorbncias o volume morto foi determinado.

3.5 Aplicao e fracionamento da amostra

Foi adicionado 200l da enzima 1mg/mL na coluna e 30 fraes de 1mL cada foram coletadas. medida que as fraes foram retiradas, o tampo foi reposto na parte superior da coluna para evitar o ressecamento da resina. Como se tratava de uma coluna de 25mL, optou-se coletar 30mL de material, visando obter uma margem de segurana de 5mL, tendo em vista que deve-se coletar no mnimo o volume total da coluna utilizada, nesse caso, o volume mnimo 25mL.

3.6 Determinao do perfil proteico e localizao da amilase nas fraes eludas

As fraes coletadas foram unidas aos pares para preencher o volume total da cubeta (2mL) e lidas em espectrofotmetro 280nm. Em seguida, a atividade amiloltica da enzima foi quantificada em todas as fraes pelo mtodo de Miller (1959).

3.7Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE

1 - Preparo do gel (volume final 20 mL) 6,25 mL de acrilamida 40% 5,0 mL de Soluo H (tampo Tris pH 8,8) 200 L de SDS a 10% 8,5 mL de gua deionizada 6,5 L de TEMED 100 L de persulfato a 10% (preparado na hora e colocado por ltimo) Os reagentes foram colocados na ordem acima em um Becker de 50 mL. Aps o preparo, o gel foi colocado entre as placas de vidro. 2 - Tampo da corrida (1,0 L) 9,08g de Tris 14,44 g de glicina 1g de SDS Acertar o pH para 8,7 Esta soluo foi fornecida pronta. 3 - Receita da soluo H para 50 mL 9,08g de Tris
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Ajustar o pH para 8,8

q.s.p. 50 mL de gua destilada. Esta soluo foi fornecida pronta. 4 - Azul de bromofenol a 0,02% em gua 2 g de azul de bromofenol gua suficiente para completar 100 mL. Esta soluo foi fornecida pronta. 5 - Preparo da amostra 50,0 l da amostra 50,0 l de sacarose a 40% preparada em tampo de corrida 5,0 l de azul de bromofenol a 0,02% 6- soluo de fixao do gel 100 mL de cido actico 400 mL de etanol Completar o volume para 1,0 L com gua destilada. 7- soluo de colorao Coomassie Blue G-250 0,5 g de CoomassieBlue G-250

gua bi destilada em q.s.p. 10 ml Agitar por alguns minutos. O corante no se dissolvera completamente. Para a realizao da eletroforese desnaturante da protena obtida aps coluna de Sephadex G-50 foi primeiramente montado o sistema de placas de vidro para a aplicao do gel e amostras. As placas foram limpas com lcool e mantidas juntas pelo sistema de suporte e presilhas. Aps o encaixe das placas de vidro no sistema, foi adicionado gua destilada entre as placas para verificao de possveis vazamentos. Com o sistema de placas de vidro montado, foi preparado o gel de poliacrilamida a 40% seguindo protocolo. Foram tomados os cuidados no manuseio da acrilamida, por esta ser neurotxica. O persulfato de amnia foi preparado no momento da aplicao e adicionado por ltimo, pois se decompe em sulfato de amnia, o qual no possui atividade cataltica. Aps o preparo do gel de poliacrilamida, este foi colocado entre as placas de vidro e o pente foi colocado na margem superior, entre as placas, para que fossem formados os poos onde posteriormente se adicionaria as amostras. Aguardou-se a polimerizao do mesmo, sendo este colocado em estufa para acelerar a polimerizao. Com o gel polimerizado, o sistema foi colocado na cuba eletrofortica, com a parte chanfrada para o interior, e adicionado o tampo de corrida.
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Foi adicionado em cada amostra uma soluo contendo sacarose (40%), para conferir densidade, e azul de bromofenol a 0,02%, para marcar as protenas e determinar o fim da corrida. No foi necessrio adicionar ao padro de peso molecular sacarose e azul de bromofenol, pois este foi adquirido comercialmente com o marcador e densidade correta. Com o gel polimerizado, foram adicionados aos poos 50L de amostra (duplicata) e 25L de padro. A cuba eletrofortica, contendo o tampo de corrida, as amostras e o padro, foi conectada a uma fonte de 150V e 50mA. A corrida eletrofortica durou 2 horas e 30 minutos e o azul de bromofenol atingiu a base do sistema, sendo interrompido o fornecimento de energia cuba. Aps o trmino da corrida, o sistema de placas foi desmontado da cuba eletrofortica. O gel foi retirado cuidadosamente e colocado na soluo de fixao (cido actico, etanol e gua) por 30 minutos. Aps a fixao do gel, este permaneceu overnight em soluo de colorao com Coomassie blue G-250 coloidal. Em seguida, o corante foi retirado com lavagens repetidas utilizando gua bi destilada e foi conservado em cido actico para posterior visualizao de suas bandas. A anlise da corrida foi feita medindo-se a distncia entre o ponto de aplicao da amostra e o fronte da corrida e da distncia do ponto de aplicao da amostra e o meio da banda da mesma. Com estes dados, realizou-se o clculo do Rf (distncia da amostra/distncia total da corrida). Fez-se este mesmo clculo para o marcador de peso molecular e assim foi possvel encontrar o peso molecular das amostras aps clculo da reta com os padres e interpolao do Rf da amostra.

4 Resultados e Discusso
4.1 Dosagem de protena
Abs 1: 0,212 Abs 2: 0,213 Mdia das Abs: 0,2125 Clculo: fator de Bradford (0,168) x Abs= mg/mL 0,168 x 0,2125= 0,0357mg/mL Ou: 35,7g/mL quantidade de protena por mL de soluo.

4.2 Ensaio para atividade enzimtica em U/mL

Abs 1: 0,303 Abs 3: 0,286 Abs 2: 0,296 Abs 4: 0,263 descartada. Mdia das 3 primeiras absorbncias: 0,295 Clculo: abs/fator DNS (0,1113) x diluio= U/mL 0,295/0,1113 x 50: 132,52 U/mL

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O mtodo utiliza a quantificao de acares redutores liberados na reao para obter (quantitativamente) atividade amiloltica. Portanto 132,52 U de enzima (-amilase) produziram 1mol de acar redutor por minuto nas condies do ensaio.

4.3 Atividade Especfica da enzima em U/mg de protena

Clculo: atividade enzimtica (U/mL)/ dosagem de protenas (mg/mL) 132,52 U/mL/ 0,0357 mg/mL: 3.712 U/mg Logo h 3.712 unidades de enzima (amilase) em 1mg de protena da soluo.

4.4 Determinao do volume morto

O clculo do volume morto feito, medindo-se o volume de todos os tubos at o tubo onde a A610nm foi mxima. De acordo com o grfico 1, podemos observar que o mximo de absorbncia foi na amostra 2, correspondente ao tubo nmero 9. Como cada tubo tem 1mL de amostra, podemos inferir que o volume morto da coluna foi de 9mL.

Fra o Tubo 8 Tubo 9 Tubo 10 Tubo 11 Tubo 12

Abs 0,101 0,319 0,246 0,234 0,182

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Grfico 1. Determinao do volume morto.

4.5 Determinao do perfil proteico e localizao da amilase nas fraes eludas

A absorbncia de uma soluo de protenas a 280nm diretamente proporcional ao seu contedo proteico, desde que estas contenham os aminocidos aromticos na sua composio, especialmente triptofano (Figura 4). A vantagem desse mtodo que ele no destrutivo para a protena. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentrao de 1mg/mL.

Absortividade molar

Comprimento de onda

Figura 4. Comprimento de onda em que os aminocidos aromticos apresentam mximo de absoro.

O grfico 2 mostra o perfil protico das 15 fraes eludas da coluna (linha azul) e tambm mostra a atividade amiloltica testada em cada uma delas (linha vermelha). Foram lidas somente 15 amostras, pois as 30 fraes iniciais eludas foram reunidas aos pares. O mesmo grfico nos mostra uma regio, na qual o pico de absoro de protena e o pico de atividade
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amiloltica se sobrepem. Com este resultado, podemos inferir que as fraes eludas correspondentes a esta regio, referem-se a protena de nosso interesse, a amilase. Somente com a leitura a 280nm no possvel tirar nenhuma concluso concreta, j que trs picos sobressaem no grfico. Como o extrato utilizado foi de uma protena comercial, esta somente previamente purificada, apresentando outras protenas no material. Por isso, o resultado no mostrou um nico pico, pois h outras protenas no extrato. O teste da atividade amiloltica importante para determinar quais picos referentes ao perfil proteico correspondem amilase. Dessa forma, foram testadas cada frao com o substrato especfico da amilase, o amido, confirmando a regio em que a amilase se encontra, ou seja, as amostras que a contm. Pela anlise, foram escolhidas quatro fraes, correspondentes aos tubos 5 a 8 e s amostras (9 a 16), pois apresentaram os maiores valores de atividade especfica. No grfico, so os quatro maiores pontos de atividade. Optamos por descartar os demais pontos, e, por conseguinte, as amostras para posterior liofilizao e uso da enzima, para deixa-l o mais pura possvel, eliminando assim, alguns contaminantes que so considerados os outros pontos. Perde-se um pouco de material, mas isso torna-se insignificante, quando pensamos em processos posteriores, nos quais os contaminantes iro interferir.

Fra es 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Abs 0,079 0,074 0,076 0,087 0,256 0,437 0,363 0,259 0,164 0,163 0,126 0,128 0,112 0,101 0,094

Ativida de amilolt ica 0,70 0,66 0,68 0,78 2,30 3,92 3,26 2,32 1,47 1,47 1,13 1,15 1,00 0,90 0,84

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Grfico 2. Determinao do perfil proteico e atividade amiloltica

4.6 Recuperao
Durante os procedimentos de fracionamento protico, o mais importante fator a ser seguido a recuperao da protena em estudo, seja pela atividade enzimtica (enzima), pela bioatividade (protena no-enzimtica) ou por algum mtodo capaz de quantificar o componente desejado, como por exemplo, a anlise eletrofortica. O segundo ponto mais importante o conhecimento da quantidade total de protenas presentes na frao da qual se coletou a protena em estudo. A partir desses dois dados, o percentual de recuperao pode ser calculado. Os resultados obtidos para a amilase esto dispostos nas tabelas 3 e 4, seguem abaixo.
Tabela 3. Resultados detalhados da atividade amiloltica e % de recuperao da protena.

Etapa s Volume

Extrato bruto 0,2 Volume da

Aps Sephadex G-50 8 Escolhemos 4 tubos com a 16

(mL)

Atividade amilase

amostra adicionado na coluna 132,52 em 1 mL, 26,50 mas queremos 4 saber em 0,2 mL 132,52 -1mL x -0,2mL x= 26,504

enzima, cada um continha 2mL (4X2=8) Pegamos os valores referentes aos 4 tubos (5 a 8) e 23,6 multiplicamos por 2, pois so 2 mL em cada tubo 2,3 x 2= 3,92 x 2= 4,6

Recupera o (%)

100%

89%

7,8 4 3,26 x 2= 6,5 2 2,32 x 2= 4,6 4 Agora somamos: 23,6 U/mL 26,504 -100% 23,6 -- x x= 89%

Tabela 4. Resultados apresentados resumidamente da atividade amiloltica e % de recuperao da protena.

Etapas

Volum e Protenas (mL) mg/mL 0,2 8,0 0,0357

Extrato bruto Aps Sephadex G-50

Atividade amilase U/mL U.T. U/mg 3.712,0 132,52 26,504 5 23,600

% Recuperao

100% 89%

O percentual de recuperao para a amilase foi de 89%, valor considerado relativamente alto. Isso nos leva a concluir que o mtodo de purificao utilizado para essa protena foi eficaz e com taxa alta de recuperao.

4.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE

A primeira banda do gel representa a enzima sem ferver, a segunda banda o padro de peso molecular e a terceira a amostra fervida. Na anlise do gel, foi verificado que a amostra da -amilase continha duas bandas (figura 5).

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Figura 5 Gel de SDS-PAGE, (1) Enzima no desnaturada (sem ferver), (2) padro de peso molecular, (3) enzima desnatura (fervida).

Pelo resultado da primeira banda, pode se inferir que no apresenta pureza, tendo em vista que a banda obtida foi consideravelmente espessa. Esta impureza foi constatada na terceira amostra, com 3 bandas, provavelmente devido aos contaminante que no processo de fervura se soltaram. A primeira hiptese foi que a enzima em questo dimrica, mas essa hiptese foi descartada, pois como conhecemos que a estrutura da -amilase de sunos monomrica. A segunda hiptese foi que a amostra no estava totalmente pura, e esta hiptese a verdadeira, pois, tendo em vista que uma enzima comercial, ela possui contaminantes proticos e, por isso, apresentou duas bandas, sendo separadas pelo processo de fervura. Esperava-se oito bandas no padro comercial, entretanto apareceram apenas 2 bandas, fato este no elucidado, pois o mesmo encontrava-se dentro do prazo de validade e armazenado adequado. Aps a corrida eletrofortica, mediu-se, com o auxlio de uma rgua, a corrida total (a partir do ponto de aplicao da amostra at o fronte da corrida), sendo esta igual a 9,1 cm de comprimento, da enzima desnaturada (do ponto de aplicao at o meio da banda obtida) e 3,5 cm da enzima no desnaturada 2,8 cm.
Tabela 6 Valores de pesos moleculares do padro, log do peso molecular, distncia dos padres e Rf.

Padro de peso molecular

Massa molecular

Log do peso

Distncia percorrida

Rf
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(KDa) Albumina Ovalbumina G3PD Anidrase carbnica tripsinognio Inibidor da tripsina de soja - lactoalbumina aprotinina 66.000 45.000 36.000 29.000 24.000 20.000 14.200 6.500

molecular 4,82 4,65 4,56 4,46 4,38 4,30 4,15 3,81 2,7 3,9 4,7 5,1 5,6 6,0 7,1 8,4 0,30 0,44 0,53 0,57 0,63 0,68 0,80 0,94

Aps a anlise do gel o grfico foi plotado (grfico 3) e o peso molecular das protenas em questo obtido pelo clculo do Rf de cada amostra e interpolao na equao da reta. O Rf da amostra 1 foi de 0,3076 e o da amostra 3 foi de 0,3846.

6 LogPes o Molecula r (k D a ) 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0 0,2 0,4 R f 0,6 0,8 1 Srie1 Linear (Srie1) y =-1,5441x +5,3351 R =0,981
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Grfico 3 - Curva de calibrao usada para determinar o peso molecular da protena.

Para a amostra 1 temos: Rf da amostra1: 2,8/9,1 = 0,3076 Amostra1: -1,5441 x + 5,3351 Amostra1: - 1,5441 . 0,3076 + 5,3351 Amostra1: 4,860 Amostra1: antilog = 104,860 = 72.443 KDa Para a amostra 3 temos: Rf da amostra2: 3,5/9,1 =0,3846 Amostra2: -1,5441 x + 5,3351
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Amostra2: - 1,5441 . 0,3846+ 5,3351 Amostra2: 4,741 Amostra1: antilog = 104,741 = 55.080 KDa O resultado do gel de forma geral foi bom porque este apresentou um fundo lmpido e bandas ntidas. As amostras apresentaram os pesos moleculares de 72.443 KDa para a amostra 1 e 55080 KDa para a amostra 3. Esta diferena de valores pode ser atribuda a impurezas presentes na amostra visto que a amostra 1 no foi fervida, permanecendo os contaminantes, j em 3, temos apenas a enzima de interesse.

5 Referncias
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