INSA de ROUEN Laboratoire de Chimie Analytique UV - ANA4

Utilisation dun logiciel doptimisation pour ltdue dune sparation par HPLC sur colonne chirale
I - But du travail propos:
Il s'agit de dterminer les conditions optimales de sparation sur une colonne chirale dun mlange comportant les produits suivants : - Methylparaben (4-hydroxybenzoate de mthyle) - Ethylparaben (4-hydroxybenzoate dthyle) - propylparaben (4-hydroxybenzoate de propyle) - (R)-mthyl mandelate - (S)-mthyl mandelate

OH COOMe

OH COOMe

(R) et (S) mthyl mandelate

On valuera ensuite les conditions de sparation sur une colonne prparative. Caractristique de la colonne chirale : CHIRALCEL OJ-H 0.46 cm (I.D) L=25 cm. Particules 10 m Particules de silice recouvertes de cellulose modifie :

OR O OR O OR gel de Silice n * R= O

CH3

Slecteur chiral : Cellulose tris (4-methylbenzoate)

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Cest une chromatographie en phase normale. Phase mobile compatible avec le support : Heptane / isopropanol. Dbit maximum 1 mL/min, pression maximale 50 bars, Tmax=40C Cot de la colonne 1500 euros.

II - Matriel disposition.
- CHROMATOGRAPHE VARIAN VISTA 5000 permettant l'utilisation d'un gradient ternaire. - Vanne d'injection RHEODYNE (boucle 20 l) - Dtecteur UV Pye Unicam ( variable ; on choisira 254 nm ) - Logiciel dacquisition AZUR (Datalys) notice jointe - Colonne CHIRALCEL OJ-H - Logiciel doptimisation OSIRIS (Datalys) notice jointe

III - Partie exprimentale. III - 1 : Conditions exprimentales:

La colonne est conditionne avec un luant 90% heptane 10% isopropanol. Rgler sur lHPLC la pression maximum 50 bar (Set Cond, voir notice). NB : si vous changez les proportions, il faut dabord conditionner avec 10x le volume mort au moins !!!!. Bien contrler la pression !! Demander lenseignant si problme.

III - 2 : Programmation du logiciel AZUR.

Voir Notice

III - 3: Optimisation de la sparation.

Optimiser la sparation des deux nantiomres en injectant la solution 1 (6 mg de chaque paraben et 50 mg du mlange racmique du mandelate) dans 10mL dun mlange iPrOH/Hept (20/80). Faire une injection du mlange 10/90 Hept/iPrOH. Puis une autre 30/70. Passez ensuite loptimisation sur le logiciel Osiris (voir notice). Enfin, tester les conditions obtenus sur la chaine HPLC.

III - 4: Identification des composs et calcul de lexcs nantiomrique

Dans les conditions obtenues aprs optimisation, injecter: 1 lnantiomre pur le (R)-methyl mandelate (solution 2, 50mg dans 10mL de mlange iPrOH/Hept 20/80) 2 un mlange nantiomriquement enrichi. Dterminer lexcs nantiomrique et la nature de lnantiomre majoritaire. (Solution 3)

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III - 5 : Dtermination des conditions de sparation sur HPLC prparative.

Lobjectif de cette partie est de dterminer les conditions de sparation du mlange racmique sur une colonne prparative. La manipulation trop coteuse ne sera pas effectue ici, nous effectuerons simplement le calcul prvisionnel. Nous allons dabord tudier linfluence de la quantit de matire injecte sur la rsolution. On parle dtude de capacit. Dans les conditions obtenues prcdemment injecter : la solution 1 (dj fait) 50 mg du racmique10mL diPrOH/Hept la solution 4, 500 mg du (R),(S) methyl mandelate dans 10mL diPrOH/Hept

Estimer la concentration de la solution la plus concentre ayant une rsolution suprieure 1.5. On choisira cette solution pour passer en mode prparatif. La chromatographie prparative a pour objectif dobtenir des quantits importantes des natiomres purs. Ltape qui consiste passer de la colonne analytique la colonne prpararive sappelle le scale-up. Lobjectif est dobtenir exactement le mme chromatogramme sur la colonne prparative. On modifie alors les dbits et les quantits dchantillons introduits de la manire suivante : Calcul du facteur de Scale-up F :
d F = 2 d1 o d2 est le diamtre de la colonne prparative et d1 celui de la colonne analytique. Calcul du nouveau dbit : D2=D1xF o D2 est le dbit de la colonne prparative et D1 celui de la colonne analytique. Calcul du volume injecter : V2=FxV1
2

On effectuera le scale up vers une colonne de 5cm de diamtre, de 25 cm de long et comportant exactement la mme phase fixe. Avec ces nouvelles conditions : calculer la quantit de matire que lon peut obtenir de chacun des nantiomres sur la colonne prparative. Calculer la quantit de solvant prcdent lapparition du premier produit et la fin du premier produit.

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